2.5 ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA.

Mientras que la mayoría de las técnicas espectroscópicas se utilizan para el estudio y caracterización de moléculas o iones en su entorno cristalino, la espectroscopía de emisión y absorción atómica se usa casi exclusivamente para el análisis de átomos. Por consiguiente, la técnica resulta casi insuperable como método de análisis elemental de metales. En principio, la espectroscopía de emisión puede utilizarse para la identificación y para la determinación cuantitativa de todos los elementos de la tabla periódica.

Cuando la transición se produce desde el estado fundamental hasta un estado excitado del átomo mediante la absorción de radiación de una determinada frecuencia (característica para cada átomo), estamos en el caso de las técnicas de absorción. En el caso en que los átomos se lleven previamente a un estado excitado y se mide la intensidad de la radiación emitida a la frecuencia característica correspondiente a la transición desde el estado excitado al estado fundamental, hablamos de técnicas espectrofotométricas de emisión. A continuación se tratan las técnicas espectrofotométricas de absorción atómica, de fotometría de llama y de emisión por plasma.

Pueden identificarse tres clases diferentes de procesos de emisión que difieren en cómo la sustancia alcanza el estado excitado previo a la emisión.

a) Emisión a partir de una excitación electromagnética.

b) Emisión a partir de excitación térmica.

c) Emisión a partir de excitación eléctrica.

Los tipos más importantes de espectros de emisión se basan en la utilización de energía no electromagnética para llevar a un átomo o a una molécula al estado excitado.

La espectroscopia de absorción atómica (a menudo llamada AA) es un método instrumental de la química analítica que determina una gran variedad de elementos al estado fundamental como analitos.

Los principios teóricos de la absorción atómica fueron establecidos en 1840 por Kirchhoff y Bunsen en sus estudios del fenómeno de autoabsorción en el espectro de los metales alcalinos y alcalinos térreos.

La base de la espectroscopia de absorción atómica (EAA) la entregó Kirchhoff al formular su ley general: « cualquier materia que pueda emitir luz a una cierta longitud de onda también absorberá luz a esa longitud de onda». El significado práctico de esto fue recién desarrollado en 1955 por el australiano Walsh, apareciendo los primeros instrumentos comerciales a principios de 1960.

El átomo consiste de un núcleo y de un número determinado de electrones que llenan ciertos niveles cuánticos. La configuración electrónica más estable de un átomo corresponde a la de menor contenido energético conocido como “estado fundamental”.

Si un átomo que se encuentra en un estado fundamental absorbe una determinada energía, éste experimenta una transición hacia un estado particular de mayor energía. Como este estado es inestable, el átomo regresa a su configuración inicial, emitiendo una radiación de una determinada frecuencia.

La frecuencia de la energía radiante emitida corresponde a la diferencia de energía entre el estado excitado (E1) y el estado fundamental (Eo) como se encuentra descrito en la ecuación de Planck:

h = constante de Planck

υ = frecuencia

c = velocidad de luz

λ = longitud de onda

Según la teoría atómica, el átomo puede alcanzar diferentes estados (E1, E2, E3,…) y de cada uno de ellos emitir una radiación (λ1, λ2, λ3,…) característica, obteniéndose así un espectro atómico, caracterizado por presentar un gran número de líneas discretas. En absorción atómica es relevante solamente aquella longitud de onda correspondiente a una transición entre el estado fundamental de un átomo y el primer estado excitado y se conoce como longitud de onda de resonancia.

De la ecuación de Planck, se tiene que un átomo podrá absorber solamente radiación de una longitud de onda (frecuencia) específica. En absorción atómica interesa medir la absorción de esta radiación de resonancia al hacerla pasar a través de una población de átomos libres en estado fundamental. Estos absorberán parte de la radiación en forma proporcional a su concentración atómica.

La relación entre absorción y concentración se encuentra definida en la Ley de Lambert-Beer.

Como la trayectoria de la radiación permanece constante y el coeficiente de absorción es característico para cada elemento, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de las especies absorbentes.

2.5.1 APLICACIÓN.

La EAA constituye una de las técnicas más empleadas para la determinación de más de 60 elementos, principalmente en el rango de μg/ml-ng/ml en una gran variedad de muestras. Entre algunas de sus múltiples aplicaciones tenemos el análisis de: aguas, muestras geológicas, muestras orgánicas, metales y aleaciones, petróleo y sus subproductos; y de amplia gama de muestras de industrias químicas y farmacéuticas.

La espectroscopia de absorción atómica con llama es el método más empleado para la determinación de metales en una amplia variedad de matrices. Su popularidad se debe a su especificidad, sensibilidad y facilidad de operación. En este método la solución muestra es directamente aspirada a una llama de flujo laminar. La llama tiene como función generar átomos en su estado fundamental, de los elementos presentes en la solución muestra. Temperaturas cercanas a los 1,500–3,000°C son suficientes para producir la atomización de un gran número de elementos, los que absorberán parte de la radiación proveniente de la fuente luminosa.

Otros sistemas han sido descritos con el fin de mejorar la eficiencia de la atomización, en los cuales de deposita la muestra sólida o como suspensión en un accesorio especial para introducirlo a la llama (navecilla de tantalio, cubeta de Delves).

Desde el inicio, en 1955, de la espectroscopia de absorción atómica como método de análisis, hubo un nuevo ímpetu de desarrollar sistemas de atomización con llama, además de existir un interés continuo en conocer el mecanismo mediante el cual la solución muestra es convertida a vapor atómico en la llama. El resultado fue el desarrollo de un quemador con un cabezal de ranura, obteniéndose de este modo un camino óptico alargado a través de la llama, lo que proporciona una mayor sensibilidad al método. Estos quemadores emplean generalmente una cámara de premezclado de combustible/oxidante en combinación con un sistema para aspirar la solución muestra a la llama. En la Figura 4.1. Se observan los procesos que experimenta una solución muestra con estos sistemas de atomización en la llama.

Figura 4.1. Diagrama del proceso de atomización en una llama

El número de átomos generados en su estado fundamental en la etapa de atomización determinará la cantidad de radiación absorbida.

El quemador del premezclado, que consiste en la combinación de un nebulizador con un quemador. En este sistema continuo la solución muestra es aspirada por arrastre con el gas comburente a través de un nebulizador para generar un aerosol fino dentro de una cámara donde se mezcla con los gases combustible y comburente auxiliar. Un deflector de flujo, ubicado en la cámara de premezclado, permite que las gotitas más grandes impacten contra él, caigan al fondo de la cámara y se escurran por el tubo de drenaje. El aerosol compuesto por las gotitas más finas es transportado hacia el cabezal del quemador, donde ocurre la combustión y la atomización de la muestra. Una entrada de gas oxidante auxiliar directa a la cámara de premezclado permite que los ajustes del flujo del oxidante sean efectuados por medio de la línea auxiliar, mientras que el flujo a través del nebulizador permanece constante. De esta forma la velocidad de aspiración de la muestra es independiente de las condiciones de la llama.

Los nebulizadores pueden ser regulados para variar la velocidad de aspiración de la solución muestra (1–4 ml/min). Estos están hechos de un material resistente a la corrosión.

Diferentes tipos de cabezales son utilizados dependiendo del tipo de llama a emplear. Estos se construyen de titanio para darle una resistencia al calor y a la corrosión, siendo los más empleados de 10 cm de ranura simple (llama acetileno/aire), 10 cm de ranura triple para soluciones con alto contenido de sólidos y cabezal de 5 cm (llama acetileno/óxido nitroso).

El tiempo necesario para la atomización de una muestra dependerá de la velocidad de entrada de los gases en la llama y se expresa con altura de la llama, de modo que la medición de la absorbancia se debe realizar en una zona en que la atomización sea completa.

La llama debe ser en lo posible transparente, es decir, no debe absorber parte de la radiación proveniente de la lámpara. En general, la llama debe poseer una lata eficiencia en la producción de átomos libres y ésta debe evitar que ocurran reacciones del elemento a determinar con productos de la combustión de los gases empleados o con otros componentes de la muestra. Al respecto, la temperatura de la llama tiene un cierto grado de importancia, siendo a veces más valiosas las propiedades reductoras u oxidantes (según relación entre gases combustible/comburente) de ella. La razón óptima combustible/comburente dependerá:

del tipo de quemador; de los gases (combustible/comburente); del elemento a determinar.

Tabla 4.1. Temperatura máxima (°C) de distintas llamasCombustible Aire OxígenoGas alumbrado 1,700 2,700Propano 1,930 2,800Butano 1,900 2,900Hidrógeno 2,100 2,780Acetileno 2,300 3,100Cianógeno 2,300 4,300

La llama aire/acetileno es la más empleada, debido a que ofrece para muchos elementos un medio ambiente y temperatura suficientes para la atomización. La llama es completamente transparente y solamente muestra autoabsorción bajo los 230 nm.

La introducción de la llama óxido nitroso/acetileno (2,900 – 3,000°C) permite la determinación de aquellos elementos que nos dejan determinar con llama aire/acetileno como Al, Si, Ti, etc… Como producto de su baja velocidad de combustión, esta llama energética ofrece un medio ambiente químico, térmico y óptimo favorable, pero posee dos desventajas: numerosos elementos son ionizados y muestran una emisión relativamente fuerte.

La llama hidrógeno/argón es utilizada en la determinación de As, Se, Cd y Zn. Su gran ventaja es su alta transparencia en el ultravioleta ideal para la determinación de As y Se. Sin embargo, se debe contar con grandes interferencias, debido a la menor temperatura de llama.

En espectroscopia de absorción atómica la concentración de un elemento en una muestra se determina por comparación de la absorbancia de la solución muestra con la absorbancia de soluciones estándar de concentración conocida.

Si cualquier constituyente de la muestra altera uno o más pasos en el proceso de formación de átomos en su estado fundamental en la llama, llevará a un error en la medición de la concentración. Las interferencias que se pueden producir en espectroscopia de absorción atómica se clasifican en: físicas químicas, de ionización y espectrales.

2.5.2 INSTRUMENTACIÓN.

Instrumentos de un solo haz

Un instrumento típico de haz sencillo consiste de una lámpara de cátodo hueco, una lámpara de deuterio para corrección por absorción no atómica, un modulador (chopper), un atomizador, un monocromador y un transductor (ver Figura 50).

Figura 50. Partes principales de un espectrómetro de absorción atómica de un solo haz.

Este instrumento es utilizado y está basado en los mismos principios teóricos que un espectrofotómetro convencional. Primero se aspira el blanco y se ajusta la lectura a 100%de Transmitancia; posteriormente se aspira la muestra problema y se hace la lectura de absorbancia o transmitancia.

La radiación de la lámpara de deuterio pasa en forma alterna con la radiación de la lámpara de cátodo hueco, para que el detector perciba alternadamente las dos señales. El chopper o cortador, consiste de cuadrantes huecos y cuadrantes con espejos, y es el mecanismo a través del cual es posible que el detector reciba en forma alterna la señal de la lámpara de cátodo hueco y la de la lámpara de deuterio, con respecto al tiempo y compara las dos absorbancias.

Instrumentos de doble haz

En un instrumento de doble haz, la radiación emitida por la fuente es dividida por un modulador con espejos. Este consiste de una pieza circular con secciones alternadas de espejo y partes huecas; esta pieza está girando, de manera que el haz de la fuente pasa alternadamente por el hueco del modulador y llega a la llama o choca con una sección de espejo del mismo y es reflejado.

Estos dos haces son recombinados en un espejo especial (half-silvered mirror) pasan a través de un monocromador y finalmente la señal es enviada por medio de un fotomultiplicador. Esta señal recibida por el sistema de lectura es la relación entre la señal de referencia y la señal de la muestra misma. Aún y cuando no se encuentre la lámpara de deuterio para corrección por absorción no atómica, el instrumento de doble haz la puede contener como accesorio opcional. La Figura 53 es representativa de un instrumento de doble haz.

Figura 51. Sistema de doble haz de un espectrómetro de absorción atómica

Como se dijo anteriormente los componentes básicos de un espectrómetro de absorción atómica son:

Una fuente de radiación que emita la línea espectral del elemento de interés.

Un sistema de atomización, que suministre energía suficiente para la disociación del analito y la formación de átomos libres.

Un monocromador para aislar la línea espectral medida. Un detector acoplado con un sistema medidor o de registro de los datos

obtenidos. Fuentes de radiación

La parte más crítica de un instrumento de absorción atómica es la fuente, ya que es muy difícil medir con buena exactitud líneas de absorción tan estrechas como las que presentan los átomos. El problema se ha resuelto aplicando el principio de que cada especie química es capaz en condiciones adecuadas, de absorber sus propias radiaciones. Bajo esta premisa se han desarrollado las lámparas de cátodo hueco y las lámparas de descarga sin electrodos.

Lámparas de cátodo hueco

Consiste en un tubo de vidrio conteniendo argón o neón a baja presión (1-5 torr) y dos electrodos. El ánodo suele ser tungsteno, y el cátodo, de forma cilíndrica, está construido con el metal que se desea determinar (ver Figura 52).

Figura 52. Lámpara de cátodo hueco.

Cuando se aplica una diferencia de potencial suficiente entre los dos electrodos tiene lugar la ionización del gas y los cationes gaseosos son acelerados hacia el cátodo, adquiriendo la suficiente energía cinética para arrancar algunos átomos metálicos del material catódico. Algunos de estos átomos metálicos son excitado al chocar con los iones gaseosos, y al retornar a su estado fundamental emiten radiación característica (ver Figura 53).

Al apagar la lámpara, los átomos metálicos vaporizados tienden a depositarse sobre las paredes del cátodo o sobre las paredes de vidrio del tubo, siendo mínima la posibilidad, por el diseño cilíndrico del cátodo. El hecho de que los diferentes elementos tengan que ser determinados de uno en uno hace que la absorción atómica sea una técnica de análisis cuantitativo nos siendo efectiva para la identificación de los elementos presentes en una muestra.

Figura 53. Esquema de la emisión de radiación en el cátodo.

Ordinariamente, para cada elemento se utiliza una lámpara, si bien se han comercializado lámparas de cátodo hueco multielementales. Estas lámparas se construyen con aleaciones de diferentes metales procurando que tengan similares puntos de fusión y volatilidad, como por ejemplo, Ca/Mg, Ag/Au, Cu/Pb/Zn, Co/Cr/Cu/Fe/Mn/Ni.

Lámparas de descarga sin electrodos

Consisten en un tubo de cuarzo herméticamente cerrado conteniendo unos pocos miligramos del elemento de interés y un gas inerte a baja presión. La activación se lleva a cabo mediante un intenso campo de radiofrecuencias (100 kHz - 100 MHz) o radiación de microondas (>100 MHz). Cuando opera, el gas noble se ioniza, y los iones producidos son acelerados por el campo de radiofrecuencia hasta que adquieren la energía suficiente para excitar a los átomos del metal.

Sistemas de atomización

Históricamente la llama ha desempeñado un papel importante en absorción atómica para la generación de vapor atómico a partir de disoluciones, o incluso de muestras sólidas. Actualmente, y a pesar de sus limitaciones, todavía se utiliza muy extensamente, debido a su sencillez, bajo coste del equipo y su versatilidad para varios elementos de diferente naturaleza. En cuanto al quemador el más utilizado es el de pre-mezcla, que opera en régimen laminar y que esquemáticamente se ha representado en la Figura 53.

 

Monocromadores

La única finalidad del monocromador es aislar la línea de resonancia del elemento de interés. Para la mayor parte de los elementos, el problema suele ser sencillo, pues las diferentes líneas suelen estar bastante separadas. Ello hace que no sea necesario un monocromador de alta resolución, y en consecuencia, no demasiado costoso, siendo este uno de los factores que han contribuido a que la técnica sea muy utilizada en la práctica ordinaria del análisis.

Las anchuras de rendija juegan un papel importante, al determinar la fracción del espectro que incide en el detector. La rendija deberá ser lo más estrecha posible, con objeto de reducir la cantidad de radiación emitida por la llama que llega al detector. Algunos instrumentos comerciales están provistos de dos tipos de rendijas, para usarlas con llama o con atomización electrotérmica respectivamente.

Detectores

El detector universalmente usado en absorción atómica es el tubo fotomultiplicador, ya que ningún otro sistema ofrece la misma sensibilidad en el margen de longitudes de onda utilizado en esta técnica.

Función y condiciones de las llamas

La llama tiene tres funciones básicas: permite pasar la muestra a analizar del estado líquido a estado gaseoso; descompone los compuestos moleculares del

elemento de interés en átomos individuales o en moléculas sencillas y excita estos átomos o moléculas.

Las condiciones que debe cumplir una llama para considerarla satisfactoria es que tenga la temperatura adecuada y que en ella se forme un ambiente gaseoso que permita las funciones mencionadas. Además, el ruido de fondo de la llama no debe interferir las observaciones a efectuar.

Una llama típica consta de: cono interno, cono externo y zona entre conos como podemos observar en la siguiente figura.

El cono interno es la zona en que tiene lugar, generalmente, una combustión parcial, es decir sin equilibrio térmico. Esta zona se calienta por conducción y radiación a partir de la región más caliente que se encuentra sobre ella. En ella se forman los productos de oxidación intermedios, se produce una gran emisión de luz (a partir del combustible y no de la muestra), una elevada ionización y una gran concentración de radicales libres. Es muy poco utilizada para trabajo analítico.

Inmediatamente encima de la región del cono interno se encuentra la zona interconal Es la llamada parte caliente de la llama y en ella tiene lugar una combustión completa y se alcanza casi un equilibrio termodinámico. Esta llama es la que se utiliza prácticamente en análisis por fotometría de llama y espectroscopía de absorción atómica. La altura de esta zona sobre el quemador varía considerablemente con el tipo de quemador, la naturaleza de los gases utilizados y su velocidad de flujo.

La región del cono externo es una zona de combustión secundaria en la que los productos parcialmente oxidados como el monóxido de carbono pueden completar su combustión. Esta región se enfría por el aire circundante y es, en general, una región poco útil.

Fenómenos que tienen lugar en la llama

1. - Se evapora el agua o los otros disolventes dejando como residuo diminutas partículas de sal seca.

2. - La sal seca se vaporiza, es decir, pasa al estado gaseoso.

3. - Las moléculas gaseosas, o una parte de ellas, se disocian progresivamente dando lugar a átomos neutros o radicales. Estos átomos neutros son las especies absorbentes en espectroscopía de absorción atómica y son las especies emisoras en fotometría de llama.

4. - Parte de los átomos neutros se excitan térmicamente o se ionizan. La fracción excitada térmicamente es importante en análisis por fotometría de llama ya que el retorno al estado fundamental de los electrones excitados es el responsable de la emisión de la luz que se mide.

5. - Parte de los átomos neutros o de los radicales que se encuentran en la llama pueden combinarse para formar nuevos compuestos gaseosos. La formación de estos compuestos reduce la población de los átomos neutros en las llamas y constituye las llamadas interferencias químicas que se presentan en los métodos de análisis que utilizan llamas.

La eficacia con que las llamas producen átomos neutros tiene mucha importancia. La llama de óxido nitroso-acetileno, que es más caliente que la de aire acetileno, parece ser más efectiva para la formación de átomos neutros. Los metales alcalinos son una excepción, probablemente debido a que la ionización es apreciable en la llama caliente. En cualquier caso, estos dos tipos de llama son los más adecuados para fotometría de llama y absorción atómica.

A las temperaturas ordinarias de llamas es relativamente baja la fracción de átomos del estado fundamental que se excita. Únicamente si la temperatura de la llama es muy elevada la fracción de átomos excitados empieza a ser apreciable. Este hecho pone de manifiesto la necesidad de controlar la temperatura de la llama cuidadosamente para fotometría de emisión. Por el contrario, la fracción de átomos en el estado fundamental es muy elevada y, por lo tanto, pequeñas fluctuaciones en la temperatura de la llama no son importantes para el análisis por absorción atómica.

La ionización que tiene lugar en las llamas produce normalmente la pérdida de un sólo electrón y se puede representar:

A = A+ + e-

A = átomo neutro

A+ = su ion positivo

e- = electrón libre

Este proceso de disociación depende de la concentración o de la presión, ya que una especie se disocia en dos. Al aumentar la presión parcial de los átomos en la llama, el porcentaje de ionización disminuye tal como debe esperarse de la aplicación de la ley de Le Chátelier.

A la temperatura de la llama acetileno-oxígeno la mayor parte de los elementos se encuentran apreciablemente ionizados. El grado de ionización del elemento a analizar puede disminuirse por adición de una elevada concentración de otro elemento que sea más fácilmente ionizable (tampón de radiación o supresor de ionización).

Es preferible, por lo general, suprimir de este modo la ionización a utilizar temperaturas de llama más bajas que hacen aumentar las interferencias químicas.

2.5.3 TÉCNICAS ANALÍTICAS.

La espectrometría atómica, en términos generales, está basada en la absorción, emisión o fluorescencia por átomos o iones elementales. Hay dos regiones del espectro que dan información atómica: la ultravioleta/visible y la de rayos X. En la primera región tienen su fundamento los instrumentos disponibles en el Servicio de Espectrometría Atómica de los Servicios de Investigación.Los espectros atómicos ultravioleta y visible se obtienen mediante un adecuado tratamiento térmico que convierte los componentes de una muestra en átomos o iones elementales gaseosos. La emisión, absorción o fluorescencia de la mezcla gaseosa resultante sirve a continuación para la determinación cualitativa y cuantitativa de uno o varios de los elementos presentes en la muestra.

El espectrómetro de absorción atómica con cámara de grafito (GFAAS) permite trabajar con muestras de volumen muy reducido (inferior a 100 µL) o directamente sobre muestras orgánicas líquidas. Habitualmente se analizan muestras de

material biológico de origen clínico (sangre, suero, orina, biopsias hepáticas, etc.). Por su elevada sensibilidad (niveles de ppb), la técnica se aplica en la detección de metales en productos de alta pureza, como por ejemplo fármacos, alimentos (peces y carne) y productos industriales, y también en aguas de bebida y de acuíferos (determinación de la presencia de Cu, Cd, Pb, As, Hg, etc.).

El espectrómetro de absorción atómica de llama (FAAS) permite la detección y determinación de metales en cualquier tipo de muestra industrial siempre y cuando pueda ser solubilizada. Los límites de detección en este caso son del orden de la ppm (partes por millón).

Esta técnica analítica está especialmente indicada para determinar elementos alcalinos, alcalinotérreos y metales pesados presentes en cualquier tipo de muestra susceptible de ser disuelta. Los niveles de concentración que se pueden analizar van desde % hasta ppb (partes por billón ó 1 mg/Tm).

Actualmente se dispone de un equipo de absorción atómica de última generación modelo AAnalyst 800 de la firma Perkin-Elmer cuyas características principales son:

Doble sistema de atomización con intercambio totalmente automatizado. Mechero para atomización por llama. Horno de grafito para atomización electrotérmica. Horno de grafito de calentamiento transversal con tecnología de

estabilización de temperatura. Corrección de fondo por efecto Zeeman para la atomización electrotérmica. Correción de deuterio para la atomización por llama. Automuestreador. Detector de fotodiodos en fila segmentados.

De pendiendo de las disponibilidades de lámparas de cátodo hueco y de la naturaleza de las muestras, se pueden desarrollar metodologías de análisis que permiten la determinación, en unl rango que va desde las ppm (mg/kg) a las ppb (µg/Kg) de un gran número de elementos del sistema periódico:

Ag, Al, As, Au, B, Ba, Be, Bi, Ca, Cd, Co, Cr, Cs, Cu, Dy, Er, Eu, Fe, Ga, Gd, Ge, Hg, Ho, In, Ir, K, La, Li, Lu, Mg, Mn, Mo, Na, Nd, Ni, P, Pb, Pd, Pr, Pt, Rb, Rh, Ru, Sb, Se, Si, Sm, Sn, Sr, Te, Ti, Tl, Tm, U, V, Y, Yb, Zn.

Interferencias:

Se llaman interferencias a la influencia que ejerce uno o más elementos presentes en la muestra sobre el elemento que se pretende analizar. La clasificación de los distintos tipos de interferencias se muestra a continuación:

Interferencias físicas: Efectos causados por las propiedades físicas de la muestra en disolución.

Interferencias espectrales: Producida por radiaciones que alcanzan al detector a una longitud de onda muy próxima del elemento que se investiga.

Interferencias químicas: Influencia que ejercen unos elementos sobre otros por formar, entre ambos, compuestos estables.

Interferencia por efecto de matriz: Debidas a la influencia que tiene el entorno que rodea a los átomos en estado fundamental que se pretende analizar.

Interferencias por absorción inespecíficas: Se presenta un aumento de la señal originado por la dispersión de las radiaciones de la lámpara.

Interferencias por ionización: Debida a que parte de los átomos pasan al estado excitado. Para evitar al máximo estas interferencias habrá que optimizar el equipo eligiendo las condiciones más adecuadas para cada elemento.

Métodos:

Para el análisis de una muestra, lo primero que habrá que hacer será poner las condiciones específicas del elemento que vamos a analizar. Estas condiciones vienen especificadas por el fabricante. Una vez elegidas las condiciones de trabajo para el elemento en cuestión habrá que calibrar el aparato. Parta ello se pueden seguir dos procedimientos, la realización de una curva de calibrado o bien el método de adición.

• Curva de calibrado.

Se utilizan soluciones patrones, que contienen el elemento a determinar de concentraciones conocidas. Se representan la absorbancia de cada solución patrón frente a la concentración. Se procura trabajar en el intervalo lineal de la curva. Una vez obtenida la curva patrón, se atomiza la muestra problema y se mide la absorción de la misma, utilizando idénticas condiciones a las usadas

cuando se preparó la curva patrón. De la medida de la absorbancia del problema se puede determinar su concentración a partir de la curva de calibrado por extrapolación.

• Método de adición.

Este método se emplea cuando existen interferencias. El método consiste en añadir un volumen conocido de la muestra problema a cuatro matraces aforados. Al primer matraz no se le añade nada. Al segundo se le añade por ejemplo 1ppm.

Al tercer matraz se le añade un volumen doble del mismo patrón, de forma que contenga una concentración añadida de 2ppm. Y al cuarto matraz se le añade 3ppm.

Una vez hecho esto, se procede a realizar las medidas de absorbancia de cada matraz. El primer matraz dará una lectura, el segundo matraz dará la misma lectura que el anterior más la señal propia de 1ppm. Extrapolando sobre el eje negativo de las X se encuentra el valor de la concentración de la muestra desconocida. Para que este método sea válido se debe obtener una curva de calibrado perfectamente recta.

2.6 ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades químicas de moléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeñas (algunos pmoles) de muestra y obtener información característica como el peso y algunas veces la estructura del analito.

En todos los casos, alguna forma de energía es transferida a las moléculas a analizar para afectar la ionización. En la técnica clásica de impacto electrónico (electron ionization EI), algunas de las moléculas ionizadas del analito “explotan” en una variedad de fragmentos ionizados, el patrón de fragmentación resultante así como los iones residuales constituyen el espectro de masas.

En principio, el espectro de masas de cada compuesto es único y puede ser usado como se “huella química” para caracterizar el analito.

LOS INICIOS DE LA ESPECTROSCOPIA DE MASAS

Corría el año 1912 cuando el científico J. J. Thomson (Premio Nobel en 1906) empujado por su afán de descubrir los secretos más profundos de la química, se las ingenió para crear el primer espectrómetro de masa y obtener de él los primeros espectros de elementos como O2, N2, CO y COCl2.

Pero el mérito no fue solo de él, ya que la espectrometría de masas comenzó a ver la luz en el año 1886 cuando Goldstein descubrió los iones positivos, siguió cogiendo forma con W. Wien que consiguó analizarlos por deflección magnética en 1898 y que dio un paso definitivo cuando W. Kaufmam consguió analizar los rayos catódicos usando campos eléctricos y magnéticos paralelos en 1901. Todos estos avances permitieron a la

privilegiada mente de J. J. Thomson idear el primer espectrómetro de masas (Skoog, Hiller, Nieman, 2000, 182).

A partir de ese día se comenzó a usar en los laboratorios de química para separar iones atómicos y moleculares en función del cociente masa/carga con la unidad Thomson (Th) como unidad fundamental. Y aunque su avance era firme, su uso para analizar macromoléculas no fue posible hasta la década de los 80, cuando el profesor J. B. Fenn utilizó el método de ionización por electropulverización ("electrospray") de una solución acuosa de proteínas. De esta forma consiguió producir pequeñas gotas de una muestra que se reducen de tamaño al evaporarse el agua que las transporta, mientras los iones de proteínas permanecen en forma de suspensión libre. La relación masa/carga de los iones así obtenidos permite su análisis en cualquier espectrómetro de masas. Biólogos

y químicos pueden ahora rápidamente identificar las proteínas y obtener su imagen tridimensional (Rubinson, Rubinson, 2000, pg. 289).

La espectrometría de masas atómicas es una herramienta muy versátil y util para identificar los elementos presentes en una muestra y determinar las concentraciones de cada una de las materias que la componen. Esta técnica nos permite determinar prácticamente todos los elementos del sistema periódico.

Esta técnica ofrece numerosas ventajas frente a las técnicas espectofotométricas ya que:

Los límites de detección que son, para muchos elementos, tres órdenes de magnitud más sensibles frente a los métodos ópticos.

Espectros notablemente más sencillos, generalmente únicos y con frecuencia fácilmente interpretables.

Capacidad para medir relaciones isotópicas atómicas. En cambio, también tienen una serie de desventajas que no podemos

obviar como: El coste del instrumento es de dos a tres veces el de los instrumentos

ópticos atómicos. La deriva del instrumento puede ser del orden del 5 o 10%/hora. Contiene unas determinadas interferencias.

Con la espectrometría de masas somos capaces de proporcionar información acerca de:

La composición elemental de las muestras: de esta se encarga la espectrometría de masas atómico.

De la composición de las moléculas inorgánicas, orgánicas y biológicas. De la composición cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas. De la estructura y composición de superficies sólidas. De las relaciones isotópicas de átomos en las muestras.

Hoy en día se continúa avanzando y cabe citar al científico japonés K. Tanaka, que bombardeando muestras de macromoléculas biológicas en estado sólido o viscoso con rayos láser, consiguió su dispersión en porciones ionizadas de pequeñísimo tamaño, aptas para su análisis por espectrometría de masas. Un método para determinar la masa de macromoléculas en espectrometría es acelerarlas en una cámara de vacío y medir su "tiempo de vuelo". Los blancos del espectrómetro son alcanzados por las moléculas en un orden determinado por sus unidades Thomson. Las más rápidas son las más ligeras y de mayor carga (Rubinson, Rubinson, 2000, pg.291)

Estos métodos poseen muchas aplicaciones como son el desarrollo de productos farmacéuticos, control de sustancias nutritivas y diagnósticos precoces de enfermedades como la malaria, cáncer de mama, cáncer de próstata, etc.

FUNDAMENTOS TEÓRICO- TÉCNICOS DE E.M.

Hoy en día, esta técnica continúa teniendo los mismos fundamentos que en su origen, aunque el espectrómetro de hoy en día poco tenga que ver con su predecesor.La espectrometría de masas se fundamenta en la separación de partículas moleculares o atómicas por su diferente masa.

El proceso de la espectrometría de masas comprende básicamente cuatro etapas:

Ionización de la muestra. Aceleración de los iones por un campo eléctrico. Dispersión de los iones según su masa/carga. Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica.

Fig.1: Esquematización del paso de una muestra por los principales componentes de un instrumento de espectroscopia de masas.

Ionización de la muestra (Oriol, 1998, 312-313)

2.6.1 CONCEPTO DE: ESPECTRO DE MASAS, ION MOLECULAR O PROGENITOR DE PICO BASE.

Espectro de masas: Un espectro de masas es una gráfica de intensidad relativa del ion como función de la relación masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado como un histograma simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades sirven para establecer el peso molecular y estructura del compuesto a ser analizado. Debido a que ocurre la fragmentación del analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro a valores m/z menores que la molécula completa ionizada (ion molecular) a partir de estos datos se deduce la estructura y peso molecular de la molécula completa.

Ion molecular: El ion molecular resulta de la ionización de la molécula a analizar. Este ion representa la molécula intacta y es el último precursor de todos los iones fragmentados que componen el espectro de masas. El pico del ion molecular aparece a un valor m/z numéricamente igual al peso molecular del compuesto.

Pico base: Es el pico más intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%.

Relación masa/carga: Esta expresión, abreviada m/z, es la relación del número de masa (m) de una partícula dada entre el número (z) de unidades cargadas electrostáticamente (e) que posee la partícula. Así, m/z es una relación adimensional que es el parámetro medido por el analizador de masas. La masa de una partícula dada es igual a la suma de sus masas atómicas (en Daltons) de todos los elementos que componen la partícula. El símbolo para las unidad de masa es u, y corresponde a 1/12 de la masa del 12C, al que se la ha asignado un valor de 12.000000 por convención.

Iones doblemente cargados: Es posible para una molécula perder dos electrones durante el proceso de ionización. Estos iones que están doblemente cargados producirán un pico en el espectro de masas en un valor m/z numéricamente igual a la mitad de la masa molecular del ion. Los iones doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masa para la mayoría de los compuestos. Sin embargo, para aquellas moléculas que los produzcan en forma estable, los picos correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la interpretación de datos.

Intensidad relativa: La intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparación con el pico base. Se representa como % respecto al pico base que es 100%. Por convención, este dato se indica en la izquierda del espectro de masas.

Porcentaje total de ionización: Este término expresa la abundancia de un ion individual comparado con la suma de las abundancias de todos los iones en un rango de masa especifico. La escala de porcentaje total de ionización esta representada a la derecha del espectro de masas con el símbolo (%Sn), este dato puede ser utilizado para comparar diferentes espectros de masas de diferentes compuestos.

2.6.2 PARTES FUNDAMENTALES DE UN ESPECTRO DE MASAS.

Básicamente un espectrómetro de masas costa esencialmente de las siguientes partes:

Sistema de entrada de muestras. Cámara de ionización. Acelerador. Analizadores. Detector. Sistema de entrada de muestras.

En el sistema de entrada de muestras, un micromol o menos de muestra se convierte al estado gaseoso por calentamiento a unos 400ºC y se introduce lentamente en la cámara de ionización.

La finalidad del sistema de entrada es permitir la introducción de una muestra representativa en la fuente de iones con la mínima perdida de vacío. En los espectrómetros de masas más modernos encontramos diferentes tipos de sistemas de entrada:

Sistemas indirectos de entrada: es el sistema más clásico y el más simple, en el cual la muestra se volatiliza externamente y se introduce en la región de ionización que esta a baja presión. El sistema de entrada es normalmente de vidrio para evitar posibles pérdidas por adsorción.

Entrada por sonda indirecta: los líquidos y los sólidos no volátiles se pueden introducir en la región de ionización mediante un soporte para muestra o sonda, el cual se inserta a través de un cierre de vacío. El sistema de cierre se utiliza para controlar la cantidad de aire que entra después de la inserción de la sonda en la región de ionización. Las sondas también se usan cuando la cantidad de muestra es limitada ya que se pierde mucha menos cantidad.

Sistemas de entrada cromatrográficos y de electroforesis capilar 1: es un tipo de sistema de entrada especial, esta indicado su uso cuando al espectrómetro de masa va acoplado un sistema de cromatrografía de gases o de líquidos de alta eficacia o a columnas de electroforesis capilar que permiten la separación y determinación de los componentes de mezclas complejas (Métodos, 2006)

Cámara de ionización

Las fuentes de iones de los espectrómetros de masas, tienen todas unas características comunes, pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas transforman los componentes de una muestra en iones.En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones están combinados en un único componente. En todos los casos, se obtiene un haz de iones positivos o negativos (normalmente positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior del analizador de masas o sistema separador a través del acelerador.(Skoog, Hiller, Hieman, 2000, 212).

La formación de iones del analito es el punto de arranque de arranque de un análisis por espectrometría de masas. El aspecto de los espectros de masas para distintas especies moleculares, depende en gran medida del método utilizado para la formación de los iones. Estos métodos los podemos dividir en dos categorías:

Fuentes de fase gaseosa: en estas primero se volatiliza la muestra y luego se ioniza.

Están generalmente restringidas a compuestos térmicamente estables que tengan puntos de ebullición menores de unos 500ºC. En la mayoría de los casos, estos requerimientos limitan la utilización de las fuentes de fase gaseosa a compuestos con pesos moleculares menores de unos 103 Daltons.

Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey, 2002, 486) Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes.

Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 1000 Daltons.

Fuentes de desorción 2: es estas la muestra en estado sólido o líquido, se transforman directamente en iones gaseosos.

Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables (Harvey, 2002, 486) Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes.

Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 100000 Daltons.

Las fuentes de iones se pueden clasificar también en fuentes duras y fuentes blandas.

Fuentes duras: comunican suficiente energía a las moléculas para que estén en un estado de energía altamente excitado. La relajación posterior, implica la rotura de las uniones produciendo iones fragmentados. Su espectro da lugar a muchos picos y nos da información acerca de la naturaleza de los grupos funcionales e información estructural de los analitos.

Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentación y el resultado es un espectro con muy pocos picos dándonos información útil ya que nos permite la determinación exacta del peso molecular de la molécula o moléculas

TIPO NOMBRE Y ACRÓNIMO AGENTE IONIZANTEImpacto de electrones (EI) electrones energéticos

Fase Gaseosa

Ionización química (CI) iones gaseosos reactivos

Ionización por campo (FI) electrodo de elevado potencial

Desorción por campo (FD) electrodo de elevado potencial

Ionización por electronebulización (ESI)

campo eléctrico elevado

Desorción/ionización asistida por una matriz (MALDI)

haz de láser

Desorción Desorción por plasma (PD) fragmentos de fisión del 252Cf

Bombardeo con átomos rápidos (FAB) haz de átomos energéticos

Espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS)

haz de iones energéticos

Ionización por termonebulización (TS) elevada temperatura

Fig. 1: Clasificación de los distintos tipos de camaras de ionización, indicandosus nombres y acrónimos y especificando cada sus agentes ionizantes.

Sistema acelerador.

En el sistema acelerador las partículas ionizadas producidas por el impacto de los electrones son obligados a atravesar una primera ranura aceleradora por una pequeña diferencia de potencial. Entre esta primera y una segunda ranura existe una diferencia de potencial muy elevada que imprime a las partículas su velocidad final. Una tercera ranura actúa como colimador del haz de partículas.

Analizadores de masa.

Para la separación de iones con diferente relación m/e se dispone de varios dispositivos. Lo ideal es que el analizador fuera capaz de distinguir entre diferencias muy pequeñas de masa. Además, los analizadores deberían de permitir el paso del número suficiente para producir corrientes iónicas fáciles de medir. Al igual que sucede con los monocromadores 4 ópticos, a los que los analizadores son análogos, estas dos propiedades no son compatibles y se debe de llegar a un equilibrio que esta regido por la resolución del espectrómetro de masa (Skoog D., Holler J., Nieman T., 2000, pág. 412).

Existen diferentes tipos de analizadores de masas:

Analizadores de sector magnético: los analizadores de sector magnético utilizan un imán permanente o un electroimán para hacer que el haz procedente de la fuente de iones se desplace con una trayectoria circular de 180, 90 o 60º. Estos analizadores también son llamados de enfoque simple.

Fig.3: Diagrama esquemático de un analizador de masas de sector

magnético equivalente a los utilizados en espectrometría de masas,recalcar la ubicación del sector magnético (laminated magnet).

Espectrómetros de doble enfoque: este término se usa en los espectrómetros en los cuales las aberraciones direccionales y las aberraciones de energía de una población de iones se minimizan simultáneamente. El doble enfoque se consigue utilizando combinaciones de campos magnéticos y electrostáticos cuidadosamente seleccionados.

Espectrómetro de masa cuadrupolar: son normalmente menos caros y más robustos que los de sector magnético, además también ofrecen la ventaja de emplear tiempos de barrido pequeños (<100ms), lo cual es particularmente útil para realizar barridos de picos cromatrográficos en tiempo real. Son, con diferencia los más utilizados hoy en día (Plasencia, 2003, 15).

Fig.4: Diagrama de un espectrómetro de masa cuadrupolar,que es uno de los tipos de analizadores de masa más utilizados enespectrometria de masas dado su bajo precio y robustez.

Analizadores de masas de tiempo de vuelo (TOF): en estos aparatos se producen los iones positivos periódicamente por bombardeo de la muestra con impulsos de electrones, de iones secundarios o de fotones generados por láser. Los iones producidos de esta forma son acelerados en un tubo analizador libre de campo mediante un campo eléctrico pulsante de 103 a 104 V. La separación de los iones en función de la masa se produce durante su recorrido hacia el detector, situado al final del tubo. Estos aparatos presentan ventajas como la robustez, simplicidad, fácil acceso a las fuentes de iones y el virtualmente ilimitado intervalo de masas, pero tienen no obstante una sensibilidad y una resolución limitadas.

Analizadores de trampa de iones: es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos pueden formarse y quedar confinados durante largos periodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos. Los espectrómetros

de trampa de iones son más robustos, compactos y más económicos que los anteriores.

Transformada de Fourier (FT): Como sucede con los instrumentos de infrarrojo y de resonancia magnética nuclear, los espectrómetros de masas de transformada de Fourier proporcionan mejores relaciones señal/ruido, velocidades mayores y sensibilidad y resolución más elevadas.

La parte fundamental de un instrumento de transformada de Fourier es una trampa de iones en la cual los iones circulan en órbitas bien definidas durante largos periodos. Tales cavidades se construyen aprovechando el fenómeno de resonancia iónica ciclotrónica.

La resolución es espectrometría de masas de transformada de Fourier está limitada por la precisión en la medida de la frecuencia más que por las rendijas o las medidas de campo (Plasencia, 2003, 16-17).

Es posible alcanzar una resolución extremadamente elevada (superior a 106) dado que las medidas de frecuencia se pueden realizar con elevada precisión.

Detectores.

Los iones procedentes del sistema acelerador llegan al detector el cual generalmente esta constituido por un cátodo emisor que al recibir el impacto producido por las partículas cargadas emite electrones. Estos electrones son acelerados hacia un dínodo el cual emite varios electrones más al recibir el impacto de cada electrón. Este proceso se repite varias veces hasta obtenerse una cascada de electrones que llega al colector lográndose una corriente fuertemente amplificada, por un procedimiento muy similar al que se utiliza en los tubos fotomultiplicadores. La corriente obtenida puede amplificarse de nuevo por procedimientos electrónicos y se lleva a un sistema registrador.

2.6.3 DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR Y DE LA FORMULA MOLECULAR POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS.