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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALCENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
“Establecimiento de un sistema de producción de bioetanol 2G a partir de
rastrojo de maíz”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
DULCE PAOLA BELTRÁN ORDUÑO
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO. JUNIO DE 2019
i
ii
iii
iv
AGRADECIMIENTOS A PROYECTOS
El trabajo de tesis se desarrolló en el laboratorio de Bioenergéticos del Departamento
de Biotecnología Agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación para el
Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional
(IPN). Bajo la dirección de los Dres. Claudia Castro Martínez e Ignacio Eduardo
Maldonado Mendoza. El presente trabajo fue apoyado económicamente a través del
proyecto SAGARPA-CONACyT 291142, así como los proyectos SIP20170347,
SIP20180302 y SIP20180446. La alumna Beltrán Orduño fue apoyada con una beca
CONACYT con clave 829301 y una beca institucional del IPN.
v
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a mi niño guapo Santiago Ismael por
llenar de felicidad cada segundo de mi vida desde su llegada y por
ser mi inspiración para salir adelante.
A Dios por darme salud y bienestar para lograr un reto más en la
vida.
A mi abuelo Bartolo que ayudó a la llegada de Santiago y aunque
ya no está físicamente, siempre me acompaña su valioso ser.
A mi hermana Glenda por su apoyo desde el proceso de admisión
al posgrado.
A mi familia que me apoyó para que siga adelante.
Y especialmente a mi más grande amor, mi fortaleza y mi otra mitad Gerardo Sánchez Bon por su apoyo incondicional de principio a fin.
vi
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por permitirme llegar hasta el final de un reto más en mi vida
profesional.
Al Centro Interdisciplinario de Investigación para el desarrollo Integral Regional
(CIIDIR-IPN Sinaloa) y al laboratorio de Bioenergéticos del Departamento de
Biotecnología Agrícola por permitirme el uso de sus instalaciones para
desarrollar el presente trabajo y por aceptarme como alumna del programa de
maestría.
A mis directores de tesis la Dra. Claudia Castro Martínez y el Dr. Ignacio
Eduardo Maldonado Mendoza por guiarme en cada etapa de mi maestría y su
excelente dirección.
A mi comité tutorial, Dra. Lelie Denise Castro Ochoa, Dra. Melina López Meyer
y Dr. Hervey Rodríguez González por su atento apoyo en cada presentación
tutorial y por sus valiosas correcciones en el transcurso de la maestría.
Agradezco también a mis compañeros de laboratorio Melina, Jacqueline,
Yolani, Candelario, Ángel, Xiomara, Itzel, por su amistad y su apoyo.
A mis amigos Uriel y Pedro por sus consejos y apoyo incondicional desde
licenciatura.
Gracias infinitas a las mejores Maestras en Ciencias que haya conocido: Laura
Beltrán y Sandy Hernández por sus enseñanzas, consejos y estar siempre
presentes.
Gracias al laboratorio de Alimentos Funcionales, Ecología Molecular de la
Rizósfera, Bioinsecticidas y al laboratorio de Nutrición Acuícola del
Departamento de Acuacultura por permitirme el uso de sus equipos para
desarrollar este trabajo.
vii
ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS...............................................................................................................ix
ÍNDICE DE CUADROS............................................................................................................xi
GLOSARIO...............................................................................................................................xii
ABREVIATURAS....................................................................................................................xiv
RESUMEN.................................................................................................................................xv
ABSTRACT.............................................................................................................................xvii
1. INTRODUCCIÓN...............................................................................................................1
2. ANTECEDENTES.............................................................................................................3
2.1 La situación energética global.............................................................................3
2.2 La situación energética en México.....................................................................3
2.3 Generalidades de los biocombustibles.............................................................4
2.3.1 Biocombustibles de primera generación (1G).............................................5
2.3.2 Biocombustibles de segunda generación (2G)...........................................6
2.4 Composición de la biomasa lignocelulósica.....................................................9
2.4.1 Celulosa...................................................................................................................9
2.4.2 Hemicelulosa........................................................................................................10
2.4.3 Lignina....................................................................................................................11
2.5 Etapas de producción de bioetanol 2G.................................................................12
2.5.1 Pretratamiento de biomasa...............................................................................12
2.5.2 Sacarificación (Hidrólisis enzimática)............................................................15
2.5.2.1 Enzimas celulolíticas.......................................................................................16
2.5.2 Aplicaciones Industriales de Celulasas.............................................................17
2.5.2.1 Hongos degradadores de biomasa lignocelulósica....................................18
• Penicillium funiculosum......................................................................................18
• Cladosporium cladosporioides..........................................................................19
2.5.3 Fermentación............................................................................................................202.6 Antecedentes realizados en el Laboratorio de Bioenergéticos del IPN-CIIDIR Sinaloa....................................................................................................................21
3 JUSTIFICACIÓN..................................................................................................................23
4 HIPÓTESIS......................................................................................................................24
5 OBJETIVOS..........................................................................................................................25
5.1 General.....................................................................................................................25
5.2 Específicos..............................................................................................................25
6 MATERIALES Y MÉTODOS..............................................................................................26
6.1 Estrategia general de trabajo.............................................................................26
6.2 Pretratamiento de rastrojo de maíz..................................................................26
viii
6.2.1 Limpieza de rastrojo de maíz......................................................................27
6.2.2 Pretratamiento de rastrojo de maíz químico..........................................27
6.3 Determinación de compuestos estructurales................................................29
6.3.2 Celulosa...........................................................................................................30
6.4 Producción de extractos enzimáticos..............................................................30
6.4.1 Crecimiento de microorganismos.............................................................31
6.4.2 Producción de celulasas.................................................................................31
6.4.3 Determinación de actividad enzimática...................................................33
6.4.3.1 Actividad endo β-1,4, glucanasa...........................................................33
6.4.3.2 Actividad exo β-1,4, glucanasa..............................................................33
6.4.3.3 Actividad β-1, 4, glucosidasa.................................................................34
6.5 Sacarificación de rastrojo de maíz pretratado...............................................34
6.5.1 Determinación de azúcares reductores por método de DNS.............35
6.6 Fermentación alcohólica.....................................................................................35
6.6.1 Microorganismo productor de etanol.......................................................35
6.6.2 Inóculo..............................................................................................................36
6.6.4 Determinaciones analíticas.............................................................................36
6.6.4.1 Determinación de biomasa.....................................................................36
6.6.4.2 Cuantificación de bioetanol....................................................................37
6.7 Análisis estadístico...............................................................................................37
7 RESULTADOS................................................................................................................38
7.1 Pretratamiento químico de rastrojo de maíz.......................................................38
7.2 Determinación de compuestos estructurales................................................40
7.3 Determinación de actividades enzimáticas....................................................42
7.4 Sacarificación (hidrólisis enzimática)...................................................................42
7.5 Fermentación alcohólica..........................................................................................46
7.5 Protocolo de producción de bioetanol 2G......................................................50
8. DISCUSIÓN.........................................................................................................................52
8.1 Pre-tratamiento químico de rastrojo de maíz.................................................528.2 Determinación de composición estructural de la biomasa lignocelulósica...................................................................................................................53
8.3 Determinación de actividades enzimáticas....................................................54
8.4 Sacarificación (hidrólisis enzimática)...................................................................56
8.5 Fermentación alcohólica.....................................................................................58
9. CONCLUSIONES...............................................................................................................60
10. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................61
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Producción de gasolina, importación y demanda periodo 2004-2014 (Galicia-Medina et al., 2018)………...………………………………..…
4
Figura 2 Esquema de los principales componentes de la biomasa lignocelulósica (U.S. DOE., 2014)…………..………………………….
7
Figura 3 Estructura de celulosa (Bajpai, 2016)………………………………….
10
Figura 4 Estructura de hemicelulosa (Bajpai, 2016)…………………………….
11
Figura 5 Principales componentes de lignina (Han y Rowell, 2008)…………..
11
Figura 6 Etapas de producción de bioetanol de segunda generación (2G) a partir de biomasa lignocelulósica (Rodríguez Droguett, 2012)……...
12
Figura 7
Efecto del pretratamiento químico sobre la biomasa (Haghighi et al., 2013)…………………………………………………………………..
13
Figura 8 Mecanismo de sinergia de las enzimas endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa………………………………………….
16
Figura 9
Estrategia general de trabajo………………………………..………….
26
Figura 10 Rastrojo de maíz entero (A) y triturado (B)…………………………….
27
Figura 11 Proceso de pretratamiento ácido (Pesado, reacción en ácido y lavados)..............................................................................................
28
Figura 12 Rastrojo de maíz pretratado con ácido sulfúrico (A) y peróxido de hidrógeno (B)……………………………………………………………...
28
Figura 13 Determinación de lignina removida en rastrojo de maíz pretratado………………………………………………………………….
30
Figura 14 A) Cultivo de Penicillium funiculosum. B) Cultivo de Cladosporium cladosporioides……………………………………………………………
31
Figura 15 Obtención de extractos celulolíticos a partir de las cepas de hongos P. funiculosum y C. cladosporioides……………………………………
33
Figura 16
Sacarificación de rastrojo de maíz pretratado químicamente utilizando extractos enzimáticos de P. funiculosum, C. cladosporioides y T. viride……………………………………………….
34
Figura 17 Crecimiento de la levadura S. cerevisiae, análisis de biomasa y determinación de azúcares reductores………………………………...
37
Figura 18
Gráfica de Pareto de las variables evaluadas sobre la remoción de lignina en el rastrojo de maíz……………………………………………
40
Figura 19
Comparación de los componentes del rastrojo de maíz sin pre-tratar y pre-tratado con H2O2.…………………………………………...
41
x
Figura 20 Porcentaje de sacarificación de los tres microorganismos
empleados en la hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado con H2O2.
43
Figura 21 Gráfica de Pareto de los factores evaluados sobre el porcentaje de sacarificación, usando P. funiculosum…………...…………………….
44
Figura 22
Gráfica de Pareto de los factores evaluados sobre el porcentaje de sacarificación, usando el extracto enzimático producido por C. cladosporioides……………………………………………………………
45
Figura 23
Gráfica de Pareto de los factores evaluados sobre el porcentaje de sacarificación, usando T. viride…………………………………………
46
Figura 24 Perfil cinético de producción de biomasa, consumo de azúcares reductores y producción de etanol por la levadura S. cerevisiae ITV01 con azúcares producidos por P. funiculosum en la etapa de sacarificación……………………………………………………………...
47
Figura 25 Perfil cinético de producción de biomasa, consumo de azúcares reductores y producción de etanol por la levadura S. cerevisiae ITV01 con azucares producidos por C. cladosporioides en la etapa de sacarificación………………………………………………………….
48
Figura 26
Perfil cinético de producción de biomasa, consumo de azúcares reductores y producción de etanol por la levadura S. cerevisiae ITV01 con azucares producidos por T. viride en la etapa de sacarificación………………………………………………………………
49
Figura 27 Propuesta de protocolo de producción de bioetanol 2G a partir de rastrojo de maíz y microorganismos autóctonos………………………
51
xi
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1 Composición química de algunos materiales lignocelulósicos.......................................................................
8
Cuadro 2 Principales aplicaciones industriales de celulasas…………. 17
Cuadro 3 Microorganismos productores de celulasas…………………..
18
Cuadro 4 Valores y niveles del diseño experimental 23 para la sacarificación (hidrólisis enzimática)………………….……….
35
Cuadro 5 Niveles y valores reales del diseño factorial 22.………………
38
Cuadro 6 Análisis estadístico de los datos obtenidos con un nivel de significancia del 95%……………………………………………
39
Cuadro 7 Determinación de los principales componentes de la biomasa lignocelulósica………………………………………...
41
Cuadro 8 Actividad enzimática (UI/mL) de los extractos celulolíticos producidos por P. funiculosum y C. cladosporioides………...
42
Cuadro 9 Análisis estadístico de los datos obtenidos con un nivel de significancia del 95 %.............................................................
43
Cuadro 10
Determinación de parámetros cinéticos durante la producción de etanol 2G empleando celulasas producidos por diferentes hongos P. funiculosum, C. cladosporioides y T. viride durante el proceso de sacarificación……………..….
50
Cuadro 11 Comparación de resultados de la composición estructural del rastrojo de maíz……………………………………………...
54
Cuadro 12 Resumen de las actividades enzimáticas celulolíticas de cada microorganismos y comparación de resultados con otros autores……………………………………………………...
55
xii
GLOSARIO
Actividad enzimática: Es una medida de la cantidad de enzima activa
presente y del nivel de actividad de la misma, se expresa en unidades
internacionales (UI) por mL, considerando una unidad como la cantidad de
enzima que libera un µmol de sustrato por minuto.
Azúcares fermentables: Moléculas pequeñas de cinco o seis carbonos
(pentosas y hexosas) que pueden ser metabolizadas por microorganismos
celulolíticos para la producción de bioetanol y otros metabolitos secundarios.
Azúcar reductor: Monosacárido o disacárido que puede ceder electrones a
otra molécula y por lo tanto actuar como agente reductor.
Biocombustible: Son los combustibles obtenidos a partir de biomasa, pueden
ser sólidos como carbón de leña y madera, líquidos como etanol, biodiesel y
aceites de la pirólisis, o gaseosos como el biogás (metano).
Bioetanol: Alcohol etílico deshidratado al 99.4% de pureza que se produce
mediante fermentación de azúcares presentes en la caña de azúcar, maíz,
trigo, sorgo y otros cultivos así como también de residuos industriales.
Biomasa: Materia orgánica originada de procesos biológicos, espontáneos o
provocados, utilizada como fuente de energía.
Biomasa lignocelulósica: Materia orgánica de origen vegetal cuya pared
celular se encuentra compuesta por una matriz de lignina-celulosa-
hemicelulosa principalmente.
Celulosa: Carbohidrato compuesto de unidades de D-glucosa unidas en una
larga cadena lineal por enlaces glucosídicos β en los átomos de carbono 1 y 4
de la molécula de azúcar.
Enzimas: Catalizadores biológicos complejos de gran especificidad,
producidos por células de organismos vivos, que aumentan la velocidad de
reacciones biológicas.
Fermentación: Procesos catabólico de oxidación incompleta que no requiere
la presencia de oxígeno y como producto final se obtiene un compuesto
orgánico.
xiii
Glucanasas: Enzimas que actúan sobre la cadena de carbohidratos para la
degradación de β- glucanos.
Hemicelulosa: Polímero formado por diversos azúcares unidos entre sí por
enlaces β principalmente glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa y manosa.
Lignina: Sustancia amorfa y aromática que brinda rigidez a la pared celular
vegetal y comúnmente se encuentra en maderas.
Pretratamiento de biomasa: Procedimiento físico, químico o biológico que
recibe la biomasa lignocelulósica haciendo los enlaces glucosídicos más
accesibles para las enzimas hidrolíticas.
Rastrojo de maíz: Residuo post-cultivo de la planta de maíz, utilizado como
forraje en la dieta del ganado.
xiv
ABREVIATURAS
°C: Grados centígrados
2G: Segunda Generación
CMC: Carboxil-metil-celulosa
DNS: Ácido Di-Nitro-Salicílico
DO: Densidad Óptica
DP: Grado de polimerización
FPA: Actividad en Papel Filtro
FPU: Unidades de Papel Filtro
g/L: Gramos por litro
g: Gramos
GHs: Glucosil hidrolasas
h: Horas
HPLC: High Performance Liquid Cromatography (Cromatografía líquida de alta eficacia)
mg: Miligramos
mL: Mililitros
mM: Milimolar
nm: Nanómetros
pH: Potencial de hidrógeno
rpm: Revoluciones por minuto
UI/mL: Unidades internacionales por mililitro
β: Beta
μL: Micro litros
xv
RESUMEN
El bioetanol con fines de carburante se puede obtener a partir de residuos
agrícolas, tales como: rastrojos de maíz, trigo, soya y frijol, bagazo de caña,
entre otros, y es conocido como bioetanol de segunda generación (2G). El
proceso para la obtención de bioetanol 2G consiste en tres etapas principales:
1) pre-tratamiento (hidrólisis ácida/alcalina) que permite el rompimiento de la
matriz lignocelulósica para un mayor acceso a la celulosa, 2) sacarificación, la
cual es una hidrólisis enzimática de biomasa para obtener azúcares
fermentables (glucosa) y 3) fermentación, que consiste en la transformación de
azúcares a etanol. El objetivo del presente trabajo fue producir bioetanol 2G a
partir de rastrojo de maíz empleando extractos enzimáticos celulolíticos de
Penicillium funiculosum y Cladosporium cladosporioides hongos nativos del
estado de Sinaloa, y como control una celulasa comercial de Trichoderma
viride.
Primero, se realizó un pretratamiento químico empleando ácido sulfúrico al 2%
a 121 °C por 60 min. Posteriormente, se llevó a cabo una hidrólisis alcalina, a
diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (H2O2): 1, 3 y 5% y
diferentes tiempo de reacción: 20, 30 y 40 h, la variable de respuesta fue la
remoción de lignina. Se empleó un diseño factorial para determinar el mejor
tratamiento. Los resultados mostraron una diferencia significativa entre los
tratamientos, el mejor tratamiento fue: 5% de H2O2 por 20 h, obteniendo un
porcentaje de remoción de lignina de 80.6%. Enseguida, para el proceso de
sacarificación, fueron producidas las enzimas celulolíticas por P. funiculosum y
C. cladosporioides empleando rastrojo de maíz como sustrato. Fueron
determinadas las actividades celulolíticas: endoglucanasa, exoglucanasa y ß-
glucosidasa, presentando valores entre 0.1 y 1.0 UI/mL. Los resultados
mostraron las tres actividades celulolíticas en los dos hongos evaluados.
Además, durante la etapa de sacarificación del rastrojo de maíz pre-tratado
(ácido/alcalino) se evaluó el efecto de la temperatura (40-60 °C), pH (4-6) y
velocidad de agitación (0-100 rpm) sobre el porcentaje de sacarificación
obtenido, empleando un diseño factorial 23 con cuatro puntos centrales. Se
mostró que no existe diferencia significativa entre los extractos celulolíticos
obtenidos por P. funiculosum y las celulasas comerciales (21% para P.
xvi
funiculosum y T. viride, 16.53% para C. cladosporioides) en la obtención de
azúcares fermentables. Adicionalmente, los azúcares obtenidos de la hidrólisis
fueron fermentados empleando la levadura nativa Saccharomyces cerevisiae
ITVER01. Se obtuvieron los perfiles y parámetros cinéticos de cada proceso,
con rendimientos de 0.39 g etanol/g de glucosa lo que representa alrededor del
80% del máximo teórico producido. Finalmente, fue posible establecer un
sistema de producción de bioetanol a partir de rastrojo de maíz, que consiste
en: pre-tratamiento combinado ácido/alcalino (H2SO4: 2%, 121 °C, 60 min;
H2O2: 5%, 20 h); sacarificación (temperatura: 45 °C, pH: 4.5, agitación: 100
rpm); fermentación (temperatura: 30 °C, agitación: 150 rpm) que puede ser
escalado a nivel fermentador y planta piloto.
Palabras clave: rastrojo de maíz, pretratamiento, sacarificación, fermentación,
etanol, celulasas.
xvii
ABSTRACT
Bioethanol for fuel purposes can be obtained from agricultural residues, such
as: corn stover, wheat, soy and bean straw, bagasse, among others, and is
known as second generation bioethanol (2G). The process to obtain 2G
bioethanol consists of three main stages: 1) pre-treatment (acid/alkaline
hydrolysis) that allows the breaking of the lignocellulosic matrix for greater
access to cellulose, 2) saccharification, which is an enzymatic hydrolysis of
biomass for obtains fermentable sugars (glucose) and 3) fermentation, which is
the transformation of sugars to ethanol. The aim of the present work was to
produce 2G bioethanol from corn stover using cellulolytic enzymatic extracts of
Penicillium funiculosum and Cladosporium cladosporioides native fungi from
Sinaloa state, and as a control a commercial cellulase from Trichoderma viride.
First, chemical pretreatment was performed using 2% sulfuric acid at 121 °C for
60 min. Subsequently, an alkaline hydrolysis was carried out, at different
concentrations of hydrogen peroxide (H2O2): 1, 3 and 5% and different reaction
times: 20, 30 and 40 h, the response variable was the removal of lignin. A
factorial design was used to determine the best treatment. The results showed
a significant difference between the treatments, the best treatment was: 5%
H2O2 for 20 h, obtaining a percentage of lignin removal of 80.6%. Afterwards,
for the saccharification process, the cellulolytic enzymes were produced by P.
funiculosum and C. cladosporioides using maize stover as a substrate. The
cellulolytic activities were determined: endoglucanase, exoglucanase and ß-
glucosidase, presenting values between 0.1 and 1.0 IU / mL. The results
showed the three cellulolytic activities in the two native fungi evaluated.
In addition, during the saccharification stage of the pre-treated corn stover (acid/
alkaline), the effect of temperature (40-60 ° C), pH (4-6) and stirring speed (0-
100 rpm) was evaluated on the percentage of saccharification obtained, using a
factorial design 23 with four central points. The results showed that there is no
significant difference between cellulolytic extracts obtained by P. funiculosum
and commercial cellulases (21% for P. funiculosum and T. viride, 16.53% for C.
cladosporioides) in the production of fermentable sugars. Additionally, the
sugars obtained from the hydrolysis were fermented using the native yeast
Saccharomyces cerevisiae ITVER01. The profiles and kinetic parameters of
xviii
each process were obtained, with yields of 0.39 g ethanol/g of glucose which
represents around 80% of the theoretical maximum produced. Finally, it was
possible to establish a bioethanol production system from corn stover, which
consists of: acid/ alkaline combined pretreatment (H2SO4: 2%, 121 °C, 60 min,
H2O2: 5%, 20 h); saccharification (temperature: 45 °C, pH: 4.5, stirring speed:
100 rpm); fermentation (temperature: 30 °C, agitation: 150 rpm) that can be
scaled up to bioreactors and pilot plants.
Keywords: corn stover, pretreatment, saccharification, fermentation, ethanol,
cellulases.
1
1. INTRODUCCIÓN
En el mundo existe una alta dependencia por los combustibles fósiles como
fuente de energía, esto ha llevado al drástico aumento de las emisiones de
gases de efecto invernadero principalmente en las zonas urbanas. El uso de
biocombustibles en el sector transporte puede ayudar a disminuir la gran
demanda de energía fósil de manera global (Sarkar et al., 2012; Zhao et al.,
2018).
Los biocombustibles se definen como combustibles orgánicos derivados de la
biomasa lignocelulósica, producidos a través de procesos biológicos modernos
y aplicables en la generación de energía térmica mediante combustión o
mediante el uso de otra tecnología. El bioetanol es un combustible que puede
utilizarse como sustituto de la gasolina y de esta manera disminuir las
emisiones de CO2 y ayudar a mejorar la calidad del aire (Kumari y Singh, 2018).
Actualmente, países como Brasil y Estados Unidos producen bioetanol a partir
de caña de azúcar y maíz como fuente de energía renovable que beneficia al
sector transporte como una alternativa a la gasolina. En México, el uso de este
tipo de materia prima se ha prohibido para garantizar la seguridad alimentaria,
lo que ha impulsado estudios hacia tecnologías de segunda generación a base
de biomasa lignocelulósica (Secretaría de Energía, 2009; Zhao et al., 2018).
Los residuos agroindustriales son considerados como la fuente de biomasa
renovable más abundante en el mundo, son conocidos como materiales
lignocelulósicos por su composición de celulosa, hemicelulosa y lignina; los
cuales para ser aprovechados en la producción de bioetanol es necesario
hacer una hidrólisis de biomasa que permite obtener acceso a azúcares
fermentables para la obtención de bioetanol a partir del uso de
microorganismos (Elgharbawy et al., 2016; Sigoillot y Faulds, 2016).
Por otra parte, el estado de Sinaloa es el mayor productor de maíz en México,
al mes de diciembre del 2018 alcanzó una producción de 5 642 221 toneladas
sobre una superficie cosechada de 503 435 hectáreas, lo cual genera grandes
cantidades de residuo agrícola, esta biomasa puede utilizarse en la producción
de bioetanol de segunda generación sin afectar la productividad destinada a la
alimentación humana (SIAP, 2019).
2
Por lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivo proponer un sistema de
producción de bioetanol de segunda generación a partir de biomasa
lignocelulósica de maíz, fueron realizadas los tres principales procesos: 1)
Pretratamiento, 2) Sacarificación: utilizando extractos enzimáticos celulolíticos
obtenidos a partir de hongos nativos del estado de Sinaloa y 3) Fermentación,
empleando la cepa autóctona Saccharomyces cerevisiae ITV01.
3
2. ANTECEDENTES
2.1 La situación energética global
La creciente demanda mundial de energía obtenida a partir de combustibles
fósiles juega un papel importante en el incremento de las emisiones de gases
de efecto invernadero (GEI). En los países en desarrollo la demanda energética
aumenta como consecuencia del crecimiento poblacional, particularmente en
países de Asia y África, siendo China el principal emisor de dióxido de carbono
(CO2) seguido de Estados Unidos e India (Shahsavari y Akmari, 2018).
Del suministro total de energía primaria en el mundo, el 80% lo representan los
combustibles fósiles; en 2016 la producción mundial de energía fue de 13,
760.81 millones de toneladas equivalentes de petróleo, los países de mayor
producción fueron China, Estados Unidos y Rusia con 17.2, 13.9 y 10%
respectivamente, donde el petróleo crudo y productos refinados fueron los
energéticos de mayor producción (Senol et al., 2016; Secretaría de Energía,
2018).
Diversos estudios han estimado el crecimiento del sector transporte en los
próximos años, en el periodo 2014-2029 aumentará un 58%, donde el uso de
vehículos que funcionan con gasolina protagonizarán este incremento con
55.6%.
Con la finalidad de disminuir el uso del petróleo, son necesarias fuentes
alternativas de energía sostenibles, que se encuentran ampliamente
disponibles en diversas partes del mundo, cuyo beneficio principal es la
reducción de la contaminación ambiental principalmente las emisiones de GEI
(Senol et al., 2016; Shahsavari y Akmari, 2018).
2.2 La situación energética en México En México, el suministro de energía depende en su mayoría de los
hidrocarburos, el crecimiento poblacional ha ido en aumento y al mismo tiempo
se aumentan los requerimientos energéticos. El consumo nacional de energía
ha incrementado un 47.1% en los últimos 25 años, siendo el sector transporte
el de mayor demanda energética, donde destacan los vehículos de transporte
terrestre como los de mayor consumo energético principalmente de gasolina
4
(Comisión Económica para América Latina y el Caribe, 2018). De acuerdo a la
Secretaría de Energía en 2017, México importó 4,417.61 petajouls (PJ) de
gasolinas, naftas y gas seco, lo que representa un aumento en el 1.2% de la
oferta interna bruta (Secretaría de Energía, 2018).
En la Figura 1 se observa cómo en el periodo 2004-2014 la demanda de
gasolina aumentó 22.2%, así como también se incrementaron las
importaciones considerablemente de 27.3 a 47% y la producción disminuyó
12.2% (Galicia-Medina et al., 2018).
Así mismo, las emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) han
incrementado en las últimas décadas, provocando una mayor contaminación
ambiental. En el 2017 México emitió 473.4 millones de toneladas de dióxido de
carbono (CO2); del suministro total de energía primaria, los combustibles fósiles
ocupan el 90%, sin embargo se espera que éstas emisiones sean reducidas en
un 50% para el año 2050 (IEA, 2017; Group Bp, 2018).
Figura 1. Producción de gasolina, importación y demanda, 2004-2014 (Galicia-
Medina et al., 2018).
2.3 Generalidades de los biocombustibles
Los biocombustibles son los combustibles sólidos, líquidos o gaseosos que son
principalmente producidos a partir de materias primas renovables o también
llamadas biorenovables (Ortiz-Ojeda, 2012). Es decir, pueden ser producidos a
partir de la biomasa. Se pueden clasificar en biocombustibles sólidos (leña,
5
carbón vegetal, residuos forestales), líquidos (bioetanol, biodiesel,
bioturbosina), y gaseosos (biogás, biometano) (García y Macera, 2016). Se
consideran como el principal recurso ecológico para cubrir la demanda
energética global en el sector transporte (Mollahoseini et al., 2015)
Por otro lado, los biocombustibles también se clasifican según el tipo de
materia prima utilizada para su producción, como son: de primera generación
(1G) a partir de almidón y granos de cultivos de interés agrícola (Kapasi et al.,
2010), los biocombustibles de segunda generación (2G) a partir de biomasa
lignocelulósica y los de tercera generación (3G) a partir de extractos de algas y
pirólisis de cultivos de algas, así como también los de cuarta generación (4G) a
partir de algas genéticamente modificadas para la mejora de los
biocombustibles que se obtienen a partir de procesos termoquímicos y fijación
y captura de carbono (Renzaho et al., 2017).
2.3.1 Biocombustibles de primera generación (1G)
Los biocombustibles de primera generación se obtienen por fermentación de
cultivos como la caña de azúcar o remolacha, el almidón de maíz o trigo, se
caracterizan por mejorar la combustión debido a su alto octanaje en
comparación con la gasolina y consume menos energía, por lo que reducen las
emisiones de contaminantes al ambiente (Araujo et al., 2017).
El bioetanol es uno de los biocombustibles más prometedores ya que su
energía equivalente es 68% más baja que la del petróleo y la combustión
resulta más limpia por su contenido de oxígeno (Vohra et al., 2014). Sin
embargo, el incremento en la demanda de bioetanol de primera generación
requiere de grandes cantidades de materia prima y a la vez de mayor
disponibilidad de tierra para su cultivo, llevando a la competencia de producción
de bioetanol contra la producción de alimentos (Bezerra et al., 2016).
En México la producción de bioetanol de primera generación a partir de maíz
requiere de la importación de 7 millones de toneladas al año para cubrir la
demanda del grano como alimento y como materia prima para la obtención del
biocombustible, por esta razón el maíz no se considera como una opción viable
para esta finalidad (Galicia-Medina et al., 2018). Además, según la Ley de
6
Promoción de Biocombustibles publicada en el 2009, está prohibido el uso de
granos para la producción de biocombustibles (SENER, 2009).
2.3.2 Biocombustibles de segunda generación (2G)
El debate entre los biocombustibles contra el alimento, ha rezagado al
bioetanol de primera generación desde su origen, debido a que los granos y
sustratos para su elaboración no están disponibles en cantidades suficientes
para cumplir con la ambición de reemplazar totalmente los combustibles fósiles
por los biocombustibles. Por lo que, la investigación se ha centrado en la
producción de bioetanol a partir de materia lignocelulósica (Ferreira et al.,
2018).
El uso de materiales lignocelulósicos agrega complejidad al esquema general
de producción de etanol a partir de sustratos azucarados o a base de almidón,
ya que se necesita un paso de tratamiento previo que requiera un alto consumo
de energía para desempacar la estructura recalcitrante de la lignina, dando
acceso a su estructura de interés, la celulosa (Ferreira et al., 2018).
Se ha reportado que la biomasa lignocelulósica puede producir 442 mil millones
de litros de bioetanol al año. Principalmente la biomasa generada a partir de la
madera, podría generar entre 120 y 300 L de bioetanol/tonelada de materia
seca (Elgharbawy et al., 2016).
La biomasa vegetal o lignocelulósica constituye la fuente de materia orgánica
más abundante sobre la tierra generando alrededor de 200 millones de
toneladas al año lo cual la hace una materia prima atractiva para la producción
de biocombustibles de segunda generación, además de ser un recurso
renovable de bajo costo (Chandel y Singh, 2011).
En general, la biomasa lignocelulósica para la producción de bioetanol se
divide en seis grupos principales: residuos de cultivos (bagazo de caña, rastrojo
de maíz, paja de trigo, paja de arroz, etc.), madera dura (álamo), madera
blanda (pino, abeto), desechos de celulosa (papel de periódico, papel de
desperdicio), biomasa herbácea (heno de alfalfa, pastos) y desechos sólidos
municipales (Sigoillot y Faulds, 2016).
7
Los principales componentes de la biomasa vegetal son celulosa, hemicelulosa
y lignina (Figura 2), los cuales se encuentran en la pared celular de las plantas
como una mezcla compleja de polisacáridos, pectina y lignina cuyos
porcentajes pueden variar según la especie de planta (Rodl, 2018). Han y
Rowell (1957) mencionan que la composición de la biomasa varía de planta a
planta y dentro de las partes de la misma planta así como también entre
plantas de distinta ubicación geográfica, edad, clima y condiciones de suelo. En
el Cuadro 1 se presenta la composición química de algunos materiales
lignocelulósicos reportados en la literatura.
Figura 2. Esquema de los principales componentes de la biomasa
lignocelulósica (U.S. DOE., 2014).
8
Cuadro 1. Composición química de algunos materiales lignocelulósicos.
Material Celulosa (%)
Hemicelulosa (%)
Lignina (%) Autor y año
Rastrojo de arroz 32.1 24 18 Anwar et al.,
(2014) Paja de trigo 33.0-45.0 20.0-32.0 8.0-20.0 Tye et al., (2016) Rastrojo de
maíz 37.4 21.1 18.1 Dhiman et al., (2017)
Rastrojo de sorgo 39.58 20.15 21.72 Omer et al., (2017)
Paja de cebada 39.4 27.1 20.7 Kumari y Singh,
(2018) Bagazo de
caña 34-42 29-43 19-21 Rodl, (2018)
Rastrojo de maíz
38.34 ± 1.05 18.95 ± 0.27 22.57 ±
2.13 Su et al., (2018)
Rastrojo de maíz 35.1 ± 0.4 21.9 ± 0.8 20.5 ± 0.4 An et al., (2019)
Rastrojo de maíz 30.36 14.68 16.10 Yu et al., (2019)
2.3.3 Biocombustibles de tercera generación (3G) y cuarta generación (4G)
La tercera generación de biocombustibles se basa en el cultivo de microoalgas
o microorganismo unicelulares derivados de eucariotas y procariotas
principalmente cianobacterias como Cyanidium caldarium o Synechococcus
(Koller et al., 2012). La producción de biocombustibles 3G puede ayudar a
minimizar los flujos de residuos de muchas industrias, debido al secuestro
biológico de CO2 de la combustión de los recursos fósiles por las microalgas y
la conversión de CO2 en biocombustibles contribuyendo a la reducción de los
niveles de GEI en la atmósfera, ayudando a cumplir los objetivos globales para
la prevención del cambio climático (Robak y Balcerek, 2018). Una ventaja que
presenta este tipo de biocombustible radica principalmente en que las algas se
pueden cultivar en aguas residuales y en agua de mar, así como en tierras
secas improductivas y en tierras agrícolas marginales. Por lo tanto, no
compiten con los cultivos alimentarios en tierras cultivables o en entornos de
agua dulce (Abdullah et al., 2019).
9
Por otra parte, el biocombustible de cuarta generación (FGB) utiliza algas
genéticamente modificadas (GM) para mejorar la producción de
biocombustibles. Aunque el biocombustible de algas GM es una alternativa
bien conocida a los combustibles fósiles, los riesgos potenciales relacionados
con la salud y el medio ambiente siguen siendo una gran preocupación
(Abdullah et al., 2019).
2.4 Composición de la biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica se considera como la principal alternativa para
emplearse como materia prima en la obtención de bioetanol de segunda
generación (Jianming et al., 2019) ya que su uso a gran escala no compite con
los requerimientos alimenticios de las personas (Liu et al., 2019).
La biomasa lignocelulósica consiste en un complejo de polímeros como son: la
celulosa, la hemicelulosa y la lignina principalmente (Yu et al., 2019). La
biomasa presenta una estructura recalcitrante que la protege del ataque de
microorganismos patógenos (hongos y bacterias) y plagas de insectos, lo que
dificulta que la celulosa sea de fácil acceso para las enzimas celulolíticas, por
lo que es necesario realizar un pretratamiento para la remoción de lignina y
hemicelulosa. Posteriormente la biomasa pretratada se hidroliza
enzimáticamente a azúcares fermentables, que después se fermentan para
producir el bioetanol.
2.4.1 Celulosa
La celulosa es el componente más abundante en la tierra; consiste en
polímeros que se encuentran unidos por fuerzas de Van Der Waals y enlaces
de hidrógeno; entre una molécula de glucosa y otra se encuentran los enlaces
β-1-4, lo que se refiere a que la cadena tiene un plegamiento en zig-zag y
utiliza los carbonos 1 y 4 para cerrar el enlace intermolecular (Figura 3), siendo
estos últimos los que favorecen el agrupamiento de cadenas de celulosa para
la formación de microfibrillas y determinan la rectitud de las mismas (Han y
Rowell, 2008; Bajpai, 2016).
10
Figura 3. Estructura de celulosa, obsérvese cómo se unen las moléculas de
glucosa a través del enlace β-1-4 (Bajpai, 2016).
De manera natural, las cadenas de celulosa se encuentran formadas por
dímeros de celobiosa mismos que se componen de dos moléculas de glucosa.
Por su parte, las moléculas de glucosa se componen de 6 átomos de carbono y
uno de oxígeno en su forma hexagonal y utiliza los grupos OH para formar
enlaces intermoleculares; además, el número de unidades de glucosa
determinan el grado de polimerización (DP) de la celulosa que en general es de
8,000 a 10,000 dependiendo del método con el que se determine. La celulosa
se encuentra en dos formas distintas: cristalina y amorfa la primera representa
del 60 al 90%. Aunque la forma cristalina representa la mayor proporción de
celulosa, la forma amorfa se distingue de ésta por encontrarse con una
densidad en menor empaquetamiento (Han y Rowell, 2008; Bajpai, 2016).
2.4.2 Hemicelulosa
Es un polímero compuesto por xilosa, galactosa, arabinosa, manosa y ácido
glucopiranosil úrico cuya función es consolidar la rigidez de la madera. De
éstos la glucosa y la manosa forman el polímero principal con ramificaciones de
galactosa principalmente. Al igual que la celulosa, contiene enlaces β-1-4 pero
difiere en su bajo grado de polimerización y en sus ramificaciones con enlaces
1-2, 1-3 o 1-6 (Figura 4). Su representación estructural consiste en un
heteropolímero con ramificaciones cortas y en ocasiones con cierto grado de
acetilación, si se compara con la celulosa presenta menor peso molecular.
Destaca el xilano si se trata de hemicelulosa de vegetales de origen agrícola y
si es hemicelulosa proveniente de maderas blandas predomina el glucomanano
(Bajpai, 2016).
11
Por otra parte, dependiendo del tipo de pretratamiento que se utilice sobre la
biomasa, la hemicelulosa se obtendrá en la fracción sólida o en ambas
fracciones sólida y líquida (Bajpai, 2016).
Figura 4. Estructura de hemicelulosa (Bajpai, 2016).
2.4.3 Lignina
La lignina es el polímero aromático de mayor abundancia, de alta complejidad y
amorfa (Bezerra et al., 2016). Se encuentra al interior de la pared celular
alrededor de la celulosa y hemicelulosa, ya que su principal función es
protegerla de la degradación así como también brindar rigidez a la estructura
de la biomasa (Tye et al., 2016).
Se compone de tres partes estructurales principalmente: unidades de alcohol
coniferilo, sinapilo y ρ-cumarilo (Figura 5). Dependiendo de la especie de
planta, la composición estructural puede variar, por ejemplo: la lignina del maíz
que contienen unidades de vainilina y siringil-aldehido. La lignina puede llegar a
formar complejos lignina-hemicelulosa los cuales suelen ser resistentes a la
degradación (Han y Rowell, 1997; Saccarello, 2010).
Figura 5. Principales componentes de lignina (Han y Rowell, 2008).
12
2.5 Etapas de producción de bioetanol 2G
El proceso de obtención de bioetanol 2G a partir de la biomasa lignocelulósica
se divide en tres etapas principalmente: 1) la primera denominada
pretratamiento, rompe la pared celular de la biomasa e hidroliza la
hemicelulosa, 2) la segunda etapa, denominada sacarificación o hidrólisis
enzimática, depolimeriza los polisacáridos presentes en la celulosa. Y por
último una 3) tercera etapa denominada fermentación, en la que los azúcares
simples liberados en la etapa de la hidrólisis enzimática son transformados por
los microorganismos, principalmente levaduras, para la obtención del producto
final, el bioetanol (Figura 6).
Figura 6. Etapas de producción de bioetanol 2G a partir de biomasa lignocelulósica (Lange, 2017).
2.5.1 Pretratamiento de biomasa
El pretratamiento previo de la biomasa lignocelulósica es un paso esencial en
la producción de bioetanol, debido a la complejidad de la biomasa se requiere
para alterar la estructura de los residuos de biomasa y facilitar el acceso de
celulosa a las enzimas celulolíticas durante la hidrólisis enzimática,
aumentando de esta manera el rendimiento de los azúcares reductores (Kumar
y Sharma, 2017) (Figura 7).
13
Figura 7. Efecto del pretratamiento químico sobre la biomasa lignocelulósica
(Rodríguez Droguett, 2012).
Algunos de los objetivos principales de pretratamiento consisten en la
reducción del grado de polimerización de la celulosa para mejorar el
rendimiento de azúcares en la hidrólisis enzimática, minimizar la formación de
productos inhibidores que puedan afectar el proceso de fermentación así como
también la minimización del gasto energético para hacer del pretratamiento un
proceso rentable y fácil de operar (Bajpai, 2016; Kim, et al., 2016; Rastogi y
Shrivastava, 2017).
Se han reportado diversos métodos para pretratar la biomasa lignocelulósica,
éstos se clasifican en cuatro diferentes grupos: físicos, biológicos,
fisicoquímicos y químicos a continuación se mencionan algunos de ellos:
v Métodos físicos
Molienda: Es un método que consiste en la reducción de tamaño de
biomasa y cristalinidad, lo cual resulta muy efectivo en el pretratamiento para
incrementar el acceso enzimático debido al aumento del área de superficie
específica y disminución del grado de polimerización (Behera et al., 2014;
Rastogi y Shrivastava, 2017).
Pirólisis: Se trata de la exposición de la biomasa a altas temperaturas
(500-800°C) en ausencia de un agente oxidante, bajo estas condiciones la
celulosa se descompone fácilmente, sin embargo se forman algunos productos
como lo son sustancias gaseosas y carbón vegetal (Rastogi y Shrivastava,
2017).
14
v Métodos biológicos
Los pretratamientos biológicos suelen tener ventaja sobre los
pretratamientos químicos debido a su bajo costo y poco gasto energético así
como también un moderado impacto ambiental. Para su aplicación se utilizan
microorganismos sobre la biomasa lignocelulósica entre ellos destacan:
Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus, Trametes villosa, Ceriporiopsis
subvermispora, Trametes reesei o Cyathus stercoreus los cuales producen
enzimas que descomponen principalmente lignina, sin embargo el tiempo de
reacción requerido es de larga duración ya que depende del crecimiento del
microorganismo y aun así no se modifica con eficiencia la biomasa
lignocelulósica ya que requiere el uso de enzimas comerciales para mejorar el
proceso lo cual conduce a un aumento en los costos de producción (Rastogi y
Shrivastava, 2017; Guo et al., 2018).
v Métodos químicos
Pretratamiento con ácido sulfúrico: se utiliza ácido sulfúrico (H2SO4) en
dos formas, una de ellas es a altas concentraciones (75%), temperaturas y
presión, como resultado se obtiene una concentración de celulosa del 95%
aproximadamente; sin embargo se producen sustancias tóxicas para la
levadura que se utiliza en procesos posteriores; otra manera de utilizarse es en
bajas concentraciones a temperaturas relativamente bajas y sin obtención de
compuestos inhibidores para levaduras, es un método altamente efectivo y de
bajo costo. Según Rastogi y Shrivastava (2017), también se pueden utilizar
otros ácidos inorgánicos y orgánicos como lo son el ácido clorhídrico, ácido
nitroso, ácido fosfórico, ácido málico, ácido nítrico, ácido acético y ácido
fórmico.
Pretratamiento alcalino: Éste tipo de pretratamiento produce un
hinchamiento sobre la estructura de celulosa, aumento en la porosidad de la
biomasa y deja un libre acceso a la hidrólisis enzimática debido a la
solubilización de polisacáridos, sin embargo, su aplicación en exceso puede
causar inhibición de la hidrólisis enzimática. Comúnmente se emplea hidróxido
de sodio (NaOH), hidróxido de calcio (CaOH), hidróxido de potasio (KOH) y
amoníaco (NH3), de los cuales el NaOH es el más utilizado (Kumari y Sing,
2018).
15
Pretratamiento con solventes orgánicos: También es conocido como
“organosolv”, se basa en el empleo de solventes como alcoholes alifáticos de
cadena corta (metanol o etanol), ácidos orgánicos, acetona, etilenglicol,
trietilenglicol o glicerol. El mecanismo de acción consiste en el rompimiento de
enlaces éster en lignina y su solubilización mediante la formación de
fragmentos de bajo peso molecular, también hidroliza enlaces internos entre
lignina y hemicelulosa, sin embargo al finalizar el proceso requiere la
recuperación completa del solvente, lo cual conduce a un aumento en los
costos de operación que hacen del pretratamiento un proceso de baja
rentabilidad (Behera et al., 2014; Zhang et al., 2016).
Las condiciones de tiempo, temperatura, presión y las concentraciones de
reactivos pueden ser lo suficientemente efectivas para la eliminación de
hemicelulosa y lignina en biomasa lignocelulósica, sin embargo se promueve la
degradación de algunos azúcares y compuestos solubles, por lo anterior, la
selección de las condiciones adecuadas de pretratamiento es un elemento
clave para la obtención de una hidrólisis enzimática eficiente (Kim, et al., 2016).
2.5.2 Sacarificación (Hidrólisis enzimática)
La sacarificación es el término que se la da a la etapa en la cual las moléculas
de celulosa son desarticuladas en sus unidades básicas de glucosa (Guo et al.,
2018). El empleo de la biomasa lignocelulósica en el proceso de obtención de
bioetanol se dificulta, debido a su composición ya que los complejos lignina-
celulosa resultan sumamente difíciles de degradar y solo un grupo pequeño de
microorganismos son capaces de hacerlo mediante la producción de celulasas
(Simmons et al., 2008; Callejas et al., 2009; Energy, 2006).
El sistema consiste de 3 enzimas que actúan sinérgicamente: endoglucanasas,
exoglucanasas y β–glucosidasas. Las endoglucanasas actúan sobre la celulosa
causando cortes al azar, liberando glucosas y xilo-oligosacáridos; las
exoglucanasas actúan sobre celulosa microcristalina, impartiendo un ataque en
el extremo no-reducido de la celulosa, liberando celobiosas. Finalmente las
celobiosas son hidrolizadas por las β-glucosidasas a monómeros de glucosa.
16
2.5.2.1 Enzimas celulolíticas
Las celulasas son enzimas inducibles sintetizadas por diversos
microorganismos (hongos y bacterias) durante su crecimiento sobre material
lignocelulósico (Kuhad et al., 2011), pertenecen a la familia de las glucosil
hidrolasas (GH) debido a su capacidad de hidrolizar enlaces glucosídicos entre
carbohidratos (Fülöp y Ponyi, 2015), en el mercado mundial ocupan el tercer
lugar en importancia por su capacidad para hidrolizar celulosa en azúcares
fermentables, mediante la acción sinérgica de tres enzimas (Figura 8):
endoglucanasas (EC 3.2.1.4) que hidroliza aleatoriamente regiones amorfas de
celulosa generando nuevos extremos de cadena que son hidrolizados por las
exoglucanasas (EC 3.2.1.91), las cuales cortan los extremos reductores y no
reductores de las cadenas generadas y conduce a la obtención de celobiosa
que se hidrolizan a unidades de glucosa con la acción de las β- glucosidasas
(EC 3.2.1.21) (Marques et al., 2018).
Figura 8. Mecanismo de sinergia de las enzimas endoglucanasas,
exoglucanasas y β-glucosidasas.
Desafortunadamente el proceso para hidrólisis enzimática resulta poco rentable
ya que se requiere de altas cantidades de enzimas (al menos 15 unidades de
papel filtro por gramo de celulosa) para obtener cantidades de azúcar
aceptables para la producción de bioetanol 2G, lo que se traduce en 30 g de
enzima por cada litro de etanol producido (Yang et al., 2011).
17
2.5.2 Aplicaciones Industriales de Celulasas
Las celulasas han tenido gran impacto en diversas industrias por sus
numerosas aplicaciones en combinación con otras enzimas o de manera
individual (Singh et al., 2016), en el Cuadro 2 se presenta un ejemplo de
aplicaciones industriales de celulasas.
Cuadro 2. Principales aplicaciones industriales de celulasas.
INDUSTRIA
APLICACIÓN
REFERENCIA
Agrícola
Control de enfermedades mediante
degradación de la pared celular de
patógenos de plantas y mejoramiento de
cultivos.
Kuhad et al., 2011
Vinícola y
cervecera
Fermentación de bebidas alcohólicas,
mejoran la calidad y el rendimiento del
producto e intervienen en la reducción de
la viscosidad del mosto.
Kuhad et al., 2011
Papelera
Eliminación de métodos no
ecológicos en la elaboración de toallas de
papel biodegradable, papel sanitario y
cartón.
Singh et al., 2016
Textil
Sustitución de algunos métodos
químicos en procesos de limpieza, pulido
y carbonización.
Singh et al., 2016
El potencial uso de celulasas también se extiende a diferentes industrias no
mencionadas anteriormente como lo es la producción de alimentos de
animales, de detergentes, extracción de aceite de oliva y extracción de
carotenoides (Kuhad et al., 2011).
18
2.5.2.1 Hongos degradadores de biomasa lignocelulósica
Los hongos filamentosos son los degradadores de biomasa vegetal más
eficientes; existen reportes sobre la actividad celulolítica de hongos del género
Penicillium y Cladosporium como candidatos para la producción de enzimas
industriales e impulsar la bioconversión de biomasa lignocelulósica (Andersen
et al., 2016).
Anteriormente en el laboratorio de bioenergéticos de CIIDIR Sinaloa, Vázquez-
Montoya (2016) aisló microorganismos principalmente hongos de residuos de
Moringa oleífera que presentaban a nivel cualitativo un halo de hidrólisis,
indicando la presencia de enzimas celulolíticas utilizando carboxilmetilcelulosa
(CMC) y avicel como fuente de carbono y mediante técnicas moleculares
fueron identificados como Cladosporium cladosporioides y Penicillium
funiculosum, sin embargo en la literatura se han reportado diversas especies
productoras de celulasas, en el Cuadro 3 se presenta un ejemplo de algunos
hongos y bacterias que tienen esa capacidad.
Cuadro 3. Microorganismos productores de celulasas.
Microorganismo Autor y año Bacillus subtillis Beltrán-Arredondo, 2013
Cladosporium cladosporioides Ji et al., 2014
Penicillium digitatum Abe et al., 2015
Penicillium chrysogenum Andersen et al., 2016
Geobacillus stearothermophilus Alrumman, 2016
Aspergillus niger Bergadi et al., 2016
Trichoderma viridae Marqués, et al., 2018
Trichoderma reesei Sun, et al., 2018
• Penicillium funiculosum
Los hongos del género Penicillium pertenecen al filum Ascomycota (Sharaf et
al., 2016), se encuentran distribuidos en todo el mundo, tienen una gran
variedad de hábitats entre los que destacan el aire, suelo, plantas y algunos
productos alimenticios (Yadav et al., 2018).
19
Se han reportado más de 300 especies y se consideran los más importantes
del reino fungi debido a su amplia aplicación en la biotecnología, ya que se han
empleado para la obtención de enzimas, vitaminas, micotoxinas, hidrógeno,
gas metano y moléculas orgánicas así como también en la industria de los
alimentos en la elaboración del pan y la producción de queso. Son importantes
en la biorremediación biológica ya que ayudan a eliminar compuestos
xenobióticos de agua, suelo y aire (Saraf et al., 2016), tienen importancia
médica debido a la producción de penicilina para tratar algunas enfermedades
(Yadav et al., 2018), sin embargo su principal función en la naturaleza es
descomponer materiales orgánicos a través de la producción de enzimas
(Visagie et al., 2014).
La morfología de este tipo de hongos consiste en un micelio formado por hifas
multinucleadas, incoloras y septadas, tienen reproducción sexual y asexual
mediante ascosporas y conidiosporas (Sharaf et al., 2016).
• Cladosporium cladosporioides
Los microorganismos del género Cladosporium son hongos cosmopolitas con
aspecto filamentoso que producen esporas las cuales se encuentran fácilmente
en el suelo, aire y agua; se caracterizan por su coloración oscura y requieren
de ambientes húmedos para su crecimiento. Algunas especies como C.
cladosporioides y C. herbarum pueden ser patógenas para las personas ya
que producen alergias; otras son patógenas para cultivos de interés agrícola
como cereales, tomate y especies del género Cucurbita (Ogórek et al., 2012).
Estos hongos son considerados como agentes de deterioro o de enfermedad a
las plantas y animales, se consideran importantes en la investigación en
distintas áreas debido a que pueden causar impacto ambiental y además tienen
la capacidad de producir lipasas, celulasas y proteasas (Abe et al., 2015).
El futuro de la materia lignocelulósica está ligado al mejoramiento de la
biomasa de las plantas, ingeniería metabólica para la producción de bioetanol y
microorganismos productores de enzimas celulolíticas, así como la mejora de
la infraestructura tecnológica para la producción del biocombustible a nivel
industrial (Chandel y Singh, 2011).
20
2.5.3 Fermentación
La fermentación es el proceso por el cual un sustrato es convertido en
productos como resultado del crecimiento y actividades metabólicas de un
microorganismo endógeno o exógeno (Batt, 2016). Comúnmente se conoce
como fermentación a la conversión de un azúcar en un ácido orgánico o un
alcohol, en otro sentido, es el uso de microorganismos (bacterias, hongos y
levaduras) para la elaboración de un producto de utilidad para las personas
como biomasa, enzimas, metabolitos primarios y secundarios, productos
recombinantes y productos de biotransformación (Paulová et al., 2013).
En el proceso de obtención de bioetanol, los azúcares obtenidos por hidrólisis
enzimática son empleados en la etapa de fermentación (Rastogi y Shrivastava,
2017), la cual puede ser por sacarificación simultánea y fermentación (SSF) o
por hidrólisis separada y fermentación (SHF), ésta última tiene la ventaja de
poder controlar las condiciones óptimas paso a paso como lo es la temperatura
de hidrólisis y la de fermentación (30°C), en cambio la SSF ofrece la ventaja de
reducir la acumulación de moléculas de glucosa mediante la fermentación y de
esta manera aumentar el rendimiento del proceso. La SSF es más fácil de
operar pero difícil de controlar en comparación con la SHF y requiere mayor
cantidad de enzimas (Sigoillot y Faulds, 2016).
Cualquier ahorro de energía en la etapa de recuperación del producto afectaría
el análisis técnico-económico del proceso general y reduciría el precio de venta
mínimo de etanol (Dhiman et al., 2017). Se ha reportado que Saccharomyces
cerevisiae es considerada una levadura etanologénica por su capacidad de
fermentar fácilmente azúcares para la obtención de alcohol (Walker y Stewart,
2016). Posterior a la fermentación, el etanol obtenido se pasa a un proceso de
destilación, con el fin de eliminar el contenido de agua y obtener etanol anhidro,
durante el proceso el etanol es calentado a 78.2 °C y al finalizar se obtiene una
concentración de etanol al 99.5%, se han reportado diversas técnicas para
llevar a cabo la deshidratación como: destilación extractiva, adsorción,
deshidratación química, destilación por difusión o destilación por membranas
(Aditiya et al., 2016).
21
La levadura Saccharomyces cerevisiae es la que se emplea mayormente para
la producción de alcohol en la industria de la cerveza y el vino, sin embargo, ha
sido propuesta como la principal levadura para la producción de etanol
combustible por su tolerancia a un amplio rango de pH (4.0-5.0), fermenta
hexosas pero no pentosas (Mohd Azhar et al., 2017).
2.6 Antecedentes realizados en el Laboratorio de Bioenergéticos del IPN-CIIDIR Sinaloa.
En el laboratorio de Bioenergéticos de CIIDIR Sinaloa se han realizado
investigaciones con relación al proceso de obtención de bioetanol de segunda
generación; a continuación se mencionan los más destacados:
Beltrán-Arredondo, (2013) generó una colección de microorganismos aislados
de rastrojo y rizósfera de maíz nativos del estado de Sinaloa, donde a partir de
pruebas cualitativas y cuantitativas seleccionó los 5 mejores aislados que
mostraron actividad celulolítica sobresaliente (RS315, RZ164, RS241, RS273 y
RS351) destacando la cepa RS351 identificada como Bacillus subtilis.
Jiménez-Leyva, (2015) caracterizó mediante herramientas bioinformáticas los
genes que codifican para la actividad celulolítica en bacterias del género
Bacillus (RZ164, RS273 y RS351) donde se encontró que el gen eglS está
implicado en la actividad celulolítica de bacterias de este género.
Vázquez-Montoya, (2016) aisló e identificó hongos celulolíticos nativos del
estado de Sinaloa a partir de muestras de Moringa oleifera, donde además
realizó trabajos en el pretratamiento e hidrólisis enzimática de la moringa.
Como resultados reporta tres aislados que presentaron la mayor actividad y de
acuerdo a la identificación molecular pertenecen al género Penicillium,
Cladosporium y Fusarium.
Castro-Ochoa, (2017) caracterizó e identificó las celulasas de los
microorganismos nativos aislados por Vázquez-Montoya y estandarizó la
obtención de extractos celulolíticos para su uso en la sacarificación de rastrojos
agroindustriales de la región.
López-Zamora, (2018) realizó la optimización de las condiciones de obtención
de azúcares fermentables a partir de rastrojo de maíz y trigo empleando
22
microorganismos celulolíticos nativos del estado de Sinaloa, reportando un
31.06% de sacarificación en rastrojo de maíz y 31.67% en rastrojo de trigo.
Guerra-Martínez, (2018) realizó el pretratamiento y la hidrólisis enzimática de
los rastrojos de maíz y trigo para la obtención de azúcares fermentables. En su
análisis reportó un rendimiento de sacarificación de 314.178 mg/g de biomasa.
23
3 JUSTIFICACIÓN
El consumo de combustible fósil en los últimos años ha ido en aumento
considerablemente, por lo que las emisiones de gases de efecto invernadero a
la atmósfera también han incrementado contribuyendo al progresivo
calentamiento del planeta; lo cual ha motivado a la búsqueda y uso de energías
renovables como una alternativa al uso de combustibles derivados del petróleo.
La obtención de biocombustibles, particularmente el bioetanol, se clasifica en
diferentes generaciones dependiendo de la materia prima utilizada, el bioetanol
de primera generación se obtiene a partir de cultivos agrícolas como lo es trigo,
sorgo, maíz o caña de azúcar, en cambio el bioetanol de segunda generación
(2G) se basa en el uso de biomasa lignocelulósica (residuos agroindustriales)
como materia prima; siendo considerada como una tecnología atractiva y
eficiente para su obtención. Sin embargo, las características estructurales y
químicas de los residuos lignocelulósicos, permiten su degradación a través de
procesos físicos, químicos y enzimáticos, que convierten la biomasa en
azúcares fermentables, que son utilizables por microorganismos para la
producción de bioetanol.
El uso de enzimas capaces de degradar estructuras lignocelulósicas es una
etapa crítica, por lo que su obtención por medios comerciales obstaculiza la
producción de bioetanol debido a su alto costo, sin embargo se ha reportado
que las enzimas (celulasas) producidas por diversos microorganismos son
capaces de hidrolizar biomasa lignocelulósica.
En estudios anteriores en el grupo de trabajo del laboratorio de Bioenergéticos
se ha demostrado que los hongos P. funiculosum y C. cladosporioides tienen la
capacidad de producir enzimas celulasas, es por ello que en el presente trabajo
se emplearon las cepas antes mencionadas para la producción de extractos
enzimáticos, donde se empleó como fuente de carbono rastrojo de maíz. De
esta manera se buscó que el proceso sea más económico mediante el empleo
de estos extractos así como también se aprovecharon los avances para
mejorar las condiciones de sacarificación y fermentación empleando la cepa
nativa de Veracruz, Saccharomyces cerevisiae ITV01.
24
4 HIPÓTESIS
Es posible obtener al menos un sistema de producción de bioetanol de
segunda generación (2G) con rendimientos mínimos del 50% del teórico
empleando celulasas de hongos nativos.
25
5 OBJETIVOS
5.1 General
Proponer un sistema de producción de bioetanol de segunda generación a
partir de biomasa lignocelulósica de maíz empleando extractos enzimáticos de
Penicillium funiculosum y Cladosporium cladosporioides nativos del estado de
Sinaloa.
5.2 Específicos
• Evaluar diferentes condiciones de pretratamiento químico empleando un
ácido, diferentes concentraciones y tiempos de un álcali que permita
obtener la mayor disponibilidad de celulosa.
• Realizar la sacarificación de rastrojo de maíz pretratado utilizando dos
extractos celulolíticos de microorganismos nativos y evaluar el efecto de
variables del proceso sobre el porcentaje de sacarificación.
• Establecer un protocolo de obtención de bioetanol a partir de biomasa
de rastrojo de maíz.
26
6 MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Estrategia general de trabajo
Con el fin de cumplir las diferentes actividades del presente trabajo se planteó
la siguiente estrategia general de trabajo (Figura 9).
Figura 9. Estrategia general de trabajo.
Como materiales de trabajo se emplearon rastrojo de maíz y los hongos
celulolíticos P. funiculosum y C. cladosporioides nativos del estado de Sinaloa,
aislados a partir de residuos de M. oleifera, así como también la levadura
Saccharomyces cereviasae ITVE01 proveniente del Instituto Tecnológico de
Veracruz.
6.2 Pretratamiento de rastrojo de maíz
Para llevar a cabo el pretratamiento, a las muestras de rastrojo se le realizó un
lavado y posteriormente se trituro para reducir el tamaño de partícula y tener un
mejor manejo de la misma.
27
6.2.1 Limpieza de rastrojo de maíz
Para el pretratamiento de la biomasa se empleó rastrojo de maíz como materia
prima, las muestras fueron colectadas de la zona norte del estado de Sinaloa,
posteriormente se lavaron con agua y se secaron en horno de convección
forzada (marca Binder) a 40 °C por 48 horas, una vez realizado el lavado y
secado del rastrojo, se aplicó un tratamiento mecánico al rastrojo de maíz
mediante trituración con una licuadora industrial para reducir el tamaño de
partícula (Figura 10).
Figura 10. (A) Rastrojo de maíz entero. (B) Rastrojo de maíz triturado.
6.2.2 Pretratamiento de rastrojo de maíz químico
En base a estudios previos realizados por Beltrán- Arredondo (2017) en el
laboratorio de Bioenergéticos, se establecieron las condiciones óptimas para el
pretratamiento ácido. Para este ensayo se preparó H2SO4 al 2%, empleando
una relación sólido-líquido 1:10 (p/v) 10 mL de ácido por cada gramo de
rastrojo), la mezcla anterior se sometió a un proceso de esterilización en una
autoclave (marca Quimilab) a una temperatura de 121 °C, 15 Lb y 60 minutos.
Posteriormente se realizaron una serie de lavados (los primeros con agua
corriente y un último con agua destilada) y se procedió al secado del rastrojo
pretratado en horno de convección a 50°C (Figura 11). Una vez secado el
rastrojo, se llevó a cabo la fase del pretratamiento alcalino con peróxido de
hidrógeno.
A B
28
Figura 11. Proceso de pretratamiento ácido de rastrojo de maíz (pesado del rastrojo, reacción en ácido y lavados).
Al rastrojo de maíz pretratado con H2SO4 anteriormente se le adicionó H2O2 a
diferentes concentraciones (1, 3 y 5%) en agitación (100 rpm), se ajustó el pH a
11 con perlas de hidróxido de sodio y se incubó a un tiempo de 20, 30 y 40
horas. Pasado el tiempo de incubación se pasó a realizar los lavados del
rastrojo con agua corriente y un último lavado con agua destilada hasta
neutralizar el pH (Figura 12).
Figura 12. (A) Rastrojo de maíz pretratado con H2SO4. (B) Rastrojo de maíz
pretratado con H2O2
Las muestras fueron secadas en un horno de convección a 50°C y
almacenadas para análisis posteriores de contenido de celulosa y lignina
removida.
Con la finalidad de establecer las mejores condiciones de pre-tratamiento
alcalino se aplicó un diseño factorial 22 con tres puntos centrales, los factores
fueron diferentes concentraciones de H2O2 y el tiempo de reacción a un nivel
bajo (-1) y uno alto (+1), las concentraciones de los puntos centrales fueron
representados en valor óptimo (0). Las variables de estudio fueron la
concentración de peróxido de hidrógeno y el tiempo medido en horas, mientras
que la variable de respuesta fue el porcentaje de la remoción de lignina. El
A BA
29
diseño se realizó en el Software Design Expert Versión 7, a un nivel de
significancia del 95%.
6.3 Determinación de compuestos estructurales
6.3.1 Lignina
La cuantificación de lignina se realizó por la metodología proporcionada por el
Laboratorio Nacional de Energía Renovable (NREL) (Sluiter et al., 2008). Del
rastrojo de maíz pretratado anteriormente se tomó una muestra de 0.15 g por
duplicado para determinar el porcentaje de lignina removida de la biomasa. Se
emplearon crisoles de fondo poroso a peso constante con papel filtro para la
etapa de filtración en bomba de vacío.
Primero se adicionaron 1.5 mL de ácido sulfúrico al 72% a la muestra y se
mantuvo en baño María a 30 ºC por 60 minutos con intervalos de agitación
cada 10 minutos. Posteriormente se adicionaron 42 mL de agua desionizada
para diluir la concentración de ácido y se mantuvo en autoclave a 121 ºC, 15 Lb
por 60 minutos, enseguida se pasó a la etapa de filtrado, cada muestra se filtró
utilizando una bomba de vacío y crisoles de fondo poroso a peso constante de
los cuales se anotó previamente el peso del crisol y peso del crisol + filtro.
Se tomó una alícuota del filtrado de la muestra para determinar lignina soluble
en ácido, las muestras se centrifugaron a 15 000 rpm por un tiempo de 10
minutos a temperatura ambiente, se midió absorbancia del líquido filtrado a 320
nm en un espectrofotómetro Multiskan Go (marca Thermo ScientificTM),
colocando una muestra que contenía solamente agua desionizada como
blanco.
Después del filtrado, los crisoles que contenían la muestra sólida se pasaron a
un horno de convección a 105 ºC por 2 horas. Después se dejaron enfriar en
un desecador y se registró el peso de crisol + lignina ácido- insoluble.
Finalmente se pasaron a una mufla (marca Felisa) a una temperatura de 575
ºC por 3 horas (Figura 13). Los crisoles se enfriaron en un desecador y se
anotó el peso de cada crisol y las cenizas ácido- insolubles.
30
Figura 13. Determinación de lignina removida en rastrojo de maíz pretratado.
6.3.2 Celulosa
La celulosa se determinó utilizando el método de Kurshner y Hoffer (1933). Se
pesó 1.5 g de muestra y se lavó con 70 mL de agua desionizada en un
extractor Soxhlet por un periodo de 8 horas en una placa de calentamiento,
posteriormente se realizó otro lavado con alcohol etílico absoluto en un tiempo
de 16 horas. Las muestras se secaron a temperatura ambiente. Se tomaron 0.5
g de muestra libre de extraíbles y se le adicionaron 2.5 mL de HNO3
concentrado y 10 mL de etanol absoluto. Se pusieron en baño María por 30
minutos, se centrifugó a 4500 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente y por
último se decantó. Se realizó una segunda digestión con el procedimiento
anteriormente mencionado, a la cual se le adicionaron 40 mL de agua
destilada, se puso en baño María por una hora, se volvió a centrifugar a 4500
rpm por 15 minutos. Cuidadosamente se retiró el sobrenadante y se lavó el
sólido con 30 mL de solución de acetato de sodio empleando papel filtro y un
embudo Buchner de porosidad fina. Una vez retenido el sólido se lavó con 200
mL de agua destilada caliente. El sólido se dejó secar sobre el papel filtro a 105
°C por 12 horas en horno de convección.
La cantidad de celulosa se determinó mediante la siguiente fórmula:
𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎(%) =𝑃𝑒𝑠𝑜𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎
𝑃𝑒𝑠𝑜𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑑𝑒𝑙𝑎𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑥100
6.4 Producción de extractos enzimáticos
Los microorganismos utilizados en este estudio, fueron las cepas identificadas
como P. funiculosum y C. cladosporioides, las cuales fueron obtenidos de la
31
colección de microorganismos aislados de muestras de moringa (Moringa
oleifera) del Laboratorio de Bioenergéticos, ubicado en el Departamento de
Biotecnología Agrícola del CIIDIR-Sinaloa. Ambas cepas fueron reactivadas y crecidas en medio sólido agar papa dextrosa (PDA).
6.4.1 Crecimiento de microorganismos
La cepa de P. funiculosum se reactivó en medio sólido PDA en placas Petri y
se incubaron a 30°C en una estufa bacteriológica con ventana de observación
(marca YAMATO) por un período de 7 días (Figura 14 A). El hongo C.
cladosporioides se resembró utilizando placas Petri sobre medio de cultivo PDA
a 25°C por 15 días, posteriormente se emplearon para la producción de celulasas (Figura 14 B).
Figura 14. A) Cultivo de P. funiculosum. B) Cultivo de C. cladosporioides.
6.4.2 Producción de celulasas
Para la producción de celulasas se emplearon diferentes medios de cultivo
para cada cepa, así como diferente método de inoculación. Para P.
funiculosum se utilizaron esporas y para C. cladosporioides se utilizaron discos
de 5 mm de diámetro. Para el hongo P. funiculosum se llevó a cabo una
cosecha de esporas, para la que se preparó una solución de Tween 80 al
0.01%, se utilizó un porta objetos para facilitar la recolección de las esporas a
partir del cultivo en caja Petri, se realizó un conteo en cámara de recuento
Thoma. Una vez realizado el conteo de esporas, se inoculó a una
concentración de 1x106 esporas/mL en matraces Erlenmeyer de 500 mL con
200 mL de medio mínimo con la siguiente composición: (g/L) 1.0, KH2PO4; 0.7,
MgSO4·7H2O; 0.5, NaCl·2H2O; 0.7, FeSO4; 0.3, NH4NO3; 0.3, MnSO4 y rastrojo
A B
32
de maíz (1%) como única fuente de carbono. Se incubó en una incubadora
orbital con agitación (marca Thermo Scientific) a 30 °C y 200 rpm por 5 días,
posteriormente se le determinó actividad enzimática endoglucanasa (CMCasa),
exoglucanasa (FPAsa) y β–glucosidasa utilizando el método del ácido 3, 5-
dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959).
Para la producción de celulasas del hongo C. cladosporioides se colocaron en
matraces Erlenmeyer de 500 mL, 200 mL de medio mineral descrito por
Mendels y Weber (1969) con la siguiente composición (g/L) 1.0 KH2PO4, 0.2
CaCl·2H2O, 0.15 urea, 0.125 peptona, 0.125 extracto de levadura, 0.7 (NH4)2
SO4, 0.15 MgSO4·7H2O, 0.0025 FeSO4·7H2O, 0.008 MnSO4·H2O, 0.007
ZnSO4·7H2O, 0.01 CoCl2·6H2O y rastrojo de maíz (1%) como fuente de
carbono. Se inocularon 5 discos de 5 mm de diámetro del cultivo de hongo por
cada 50 mL de medio mineral. Se incubó por un período de 5 días en una
incubadora orbital con agitación (marca Thermo Scientific) a una temperatura
de 30 °C y 150 rpm. Pasado el tiempo de incubación, se tomó una muestra y se
le midió actividad enzimática endoglucanasa (CMCasa), exoglucanasa (FPAsa) y β–glucosidasa por DNS.
Una vez pasado el tiempo de incubación y medida la actividad enzimática de
cada una de las cepas, se filtró cada fermentación en un embudo Buchner con
bomba de vacío para obtener un extracto enzimático libre de biomasa.
Después del filtrado, las muestras fueron congeladas en recipientes de plástico
con capacidad de 500 mL para su posterior liofilización. Las muestras
previamente congeladas, se sometieron a liofilización, para la eliminación total
de agua de las muestras y poder concentrarlas, el sobrenadante se liofilizó a -
70°C, a una presión de 0.070 milibares en una liofilizadora marca Labconco®
del Laboratorio de Alimentos Funcionales del IPN-CIIDIR Sinaloa, durante un
tiempo de 72 horas (Figura 15).
33
Figura 15. Obtención de extractos celulolíticos a partir de las cepas de P. funiculosum y C. cladosporioides.
6.4.3 Determinación de actividad enzimática
6.4.3.1 Actividad endo β-1,4, glucanasa
La determinación de la actividad endo β-1,4, glucanasa se realizó en base al
método de Stutzenberger (1972), se preparó buffer de acetato de sodio a pH 5
en el que se disolvió el 1% de carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato de la
enzima. La reacción se realizó en tubo Eppendorf de 1.6 mL, al cual se
adicionaron 200 µL de buffer y se adicionaron 50 µL de sobrenadante, se
incubó en un termoblock (Thermo Scientific) a 50 °C por 10 minutos, enseguida
se adicionaron 250 µL de reactivo DNS para detener la reacción, se incubó por
10 minutos a 100 °C y se enfrió a -20 °C por 10 minutos. Se determinó la
liberación de azúcares reductores leyendo absorbancia en placa de formato 96
pozos en un espectrofotómetro a 540 nm.
6.4.3.2 Actividad exo β-1,4, glucanasa
Para determinar la actividad exo β-1,4, glucanasa se determinó por la
metodología descrita en el apartado 6.4.1.1 de este trabajo, con modificación
en el sustrato utilizado. El ensayo consistió en colocar en un tubo eppendorf
12.5 mg de papel filtro Whatman no. 1, se le adicionó 200 µL de Buffer acetato
de sodio pH 5 y 50 µL de sobrenadante, la reacción se incubó a 50 °C por 10
minutos, posteriormente se adicionaron 250 µL de DNS, se incubó a 100 °C por
10 min, se enfrió a -20 °C por 10 min y se tomaron 200 µL para leer
absorbancia en espectrofotómetro en placa de formato de 96 pozos a 540 nm.
34
Para ambas actividades, previamente se realizó una curva estándar de glucosa
a una concentración de 1 mg/mL.
6.4.3.3 Actividad β-1, 4, glucosidasa
En la determinación de la actividad β-1, 4, glucosidasa se utilizaron 450 µL de
solución buffer de acetato de sodio a pH 5 con el 1% (p/v) de sustrato 4-
nitrofenol β-D-glucopiranósido (Sigma Aldrich No. Cat. N7006), enseguida se
adicionaron 50 µL del sobrenadante y se incubó por 10 min a 50 °C, se
agregaron 250 µL de una solución de carbonato de sodio 0.2 M para detener
la reacción y se tomó una alícuota de 200 µL para leer la absorbancia en un
espectrofotómetro a 420 nm.
Para la cuantificación de la actividad enzimática, se realizó una curva estándar
de una solución de 4-Nitrofenol (Sigma- Aldrich No. Cat. N7660) a una
concentración de 1 μmol/mL.
6.5 Sacarificación de rastrojo de maíz pretratado Los residuos sólidos pretratados deslignificados se utilizaron como sustratos
para la hidrólisis enzimática. Con el fin de obtener las mejores condiciones de
sacarificación, se realizó un diseño factorial 23 con cuatro puntos centrales.
Se utilizó una relación sólido-líquido 1:20, colocando 1 g del sustrato pretratado
en matraces Erlenmeyer de 50 mL con 20 mL de buffer de acetato de sodio 50
mM y 300 mg de extracto enzimático obtenido a partir de P. funiculosum y C.
cladosporioides, además se colocó un tratamiento control de una enzima
comercial Trichoderma viride (Sigma Aldrich No. Cat. C2730) (Figura 16).
Figura 16. Sacarificación de rastrojo de maíz pretratado químicamente utilizando extractos enzimáticos de P. funiculosum, C. cladosporioides y T.
viride.
35
Los niveles empleados para la temperatura, pH y agitación se presentan en el
Cuadro 4, el tiempo de sacarificación fue de 48 horas y al finalizar se
determinaron azúcares reductores por el método DNS.
Cuadro 4. Valores y niveles del diseño experimental 23 para hidrólisis enzimática.
Variable de estudio
Valores y niveles Valor bajo (-1) Valor central (0) Valor alto (1)
Temperatura (°C) 30 45 60
pH 3 4.5 6
Agitación (rpm) 0 100 200
6.5.1 Determinación de azúcares reductores por método de DNS
Después de la hidrólisis enzimática, se tomó una alícuota de 200 µL que
posteriormente se centrifugó a 10 000 rpm por 10 minutos. En un tubo
Eppendorf de 1.6 mL se adicionaron 25 µL de muestra de una dilución 1:10,
más 250 µL del reactivo DNS, la mezcla se llevó a un bloque de temperatura a
100 °C por 10 minutos, posteriormente se pasó a enfriar en hielo durante 10
minutos y se leyó absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm en placa de
formato 96 pozos. El valor de absorbancia se sustituyó en la fórmula de la
ecuación de la curva estándar de glucosa, una vez obtenido el valor, se
multiplicó por el factor de dilución y el resultado de la cantidad de azúcares
reductores liberados durante de la sacarificación se determinó en la siguiente
fórmula:
Sacarificación (%) = 78ú:;<=><=?@:AB<=>(CD/CF)G@>A<;AB(HI
HJ)𝑥100
6.6 Fermentación alcohólica
6.6.1 Microorganismo productor de etanol
Para la fermentación alcohólica de los azúcares obtenidos en la sacarificación,
se empleó la levadura S. cerevisiae ITV01, proporcionada por el Laboratorio de
Bioprocesos del Instituto Tecnológico de Veracruz. La cepa de S. cerevisiae
36
ITV01 se conservó a 4 °C en medio sólido con la siguiente composición (g/L):
150 de glucosa, 20 de extracto de levadura y 20 de agar.
6.6.2 Inóculo
Se preparó un inóculo en matraz Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de medio
de cultivo que contenía 10 g/L de glucosa y 1 g/L de extracto, con agitación
constante a 200 rpm, 30 °C por 12 horas. Se prepararon dos precultivos con la
finalidad de adaptar el microorganismo a las condiciones deseadas para la
fermentación (Ortiz- Zamora et al., 2010).
6.6.3 Fermentación
Para las fermentaciones se preparó medio basal con los siguientes
componentes (g/L): 10 glucosa, 1.0 extracto de levadura, 8.0 KH2PO4, 5.0
(NH4)2SO4, 1.0 MgSO4·7H2O. El pH del medio de cultivo se ajustó a 4.5
utilizando una solución de ácido fosfórico al 10% (v/v) y se esterilizó en
autoclave durante 15 min a 121 °C (Ortiz et al., 2009). Los azúcares
fermentables obtenidos en la etapa de sacarificación fueron adicionados al
medio de cultivo previamente esterilizado.El pre-cultivo se inoculó cuando se
alcanzó un crecimiento de 6 X 106 células viables/mL. Las fermentaciones se
realizaron en matraces Erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio de cultivo.
Las condiciones de crecimiento utilizadas fueron 30 °C, 150 rpm y pH 4.5. Se
tomaron alícuotas de 1 mL para realizar los análisis de crecimiento de biomasa,
cuantificación de azúcares y cuantificación de etanol por HPLC.
6.6.4 Determinaciones analíticas
6.6.4.1 Determinación de biomasa
El crecimiento de la levadura se midió mediante dos técnicas. La primera
técnica fue por Densidad Óptica (DO) medida a 620 nm en un
espectrofotómetro. Ésta medida está basada en el porcentaje de luz no
transmitida por la suspensión de microorganismos; siendo la absorbancia
proporcional a la cantidad de biomasa presente en la muestra. Para determinar
la DO se tomaron alícuotas de 200 μl y se colocaron en placas de 96 pozos a y
se midió absorbancia en espectrofotómetro a 420 nm (Strehaiano, 1984). La
37
segunda técnica consistió en el conteo directo de las levaduras utilizando una
cámara de Thoma. La viabilidad de la levadura se obtuvo utilizando el método
de azul de metileno. Posteriormente, el medio de cultivo fue centrifugado
durante 10 min a 10,000 rpm (Figura 17). El sobrenadante se almacenó a -20
°C para posteriores análisis.
Figura 17. Crecimiento de la levadura S. cerevisiae, análisis de biomasa y determinación de azúcares reductores.
6.6.4.2 Cuantificación de bioetanol
La cuantificación de etanol se realizó mediante HPLC (Waters 2414) con una
columna Shodex SH1011 que utiliza como fase móvil H2SO4 a una
concentración de 5 mM a un flujo de 0.6 mL/min a 55 °C. El detector empleado
fue de índice de refracción.
6.7 Análisis estadístico
Para el análisis del pretratamiento químico, se aplicó un diseño factorial 22 con
tres puntos centrales. Para el proceso de sacarificación se aplicó un diseño
factorial 23 con cuatro puntos centrales. Los datos arrojados por cada
experimento se analizaron mediante el Software Design Expert Version 7, a un
nivel de significancia del 95%.
38
7 RESULTADOS
7.1 Pretratamiento químico de rastrojo de maíz
El pre-tratamiento es una de las principales etapas de la producción de
bioetanol de segunda generación, debido a que permite la eliminación de la
lignina, componente de la biomasa que posee una reactividad muy diferente al
resto de los componentes, generando una fácil accesibilidad a la celulosa. El
pre-tratamiento de la biomasa es necesario para reducir el tamaño de la
materia prima, limitar la formación de productos de degradación que inhiben el
crecimiento de microorganismos necesarios en los procesos biológicos,
minimizar la demanda energética de las reacciones posteriores y por lo tanto
limitar su costo.
A partir de la optimización obtenida por Beltrán-Arredondo (2017) para el pre-
tratamiento ácido usando ácido sulfúrico a una concentración de 2%, a la
muestra de rastrojo de maíz se le aplicó adicionalmente un pre-tratamiento
alcalino utilizando diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno y
diferentes tiempos de reacción. Para determinar el efecto de los factores sobre
la variable de respuesta, se aplicó un diseño factorial 22 con tres puntos
centrales. Las variables de estudio fueron la concentración de H2O2 (%) y el
tiempo (h), mientras que la variable de respuesta fue la remoción de lignina
(%). Los datos se analizaron a un nivel de significancia del 95%. Los valores de
los factores se presentan en el Cuadro 5.
Cuadro 5. Niveles y valores reales para el diseño factorial 22.
Variables de estudio Valores y niveles
Valor bajo (-1) Valor alto (+1) Concentración de H2O2
(%) 1 5
Tiempo (h) 20 40
En el Cuadro 6, se muestran los valores obtenidos por tratamiento para la
variable de respuesta. Como se observa, la mayor remoción de lignina fue del
80.18% utilizando la mayor concentración de peróxido de hidrógeno (5%) y el
menor tiempo de reacción (20 h).
39
Cuadro 6. Análisis estadístico de los datos obtenidos con un nivel de
significancia del 95 %. Tratamiento
/ Variable
Tiempo (h)
H2O2 (%)
Remoción de lignina (%)
X1 X2 Y – variable de respuesta 1 20 1 54.43 2 40 1 41.93 3 30 3 68.94 4 20 5 80.18
5 40 5 64.72 6 30 3 67.19 7 30 3 69.00
En la Figura 18 se presenta un gráfico de Pareto sobre la evaluación de la
remoción de lignina. Como se observa, la concentración de peróxido de
hidrógeno tiene un efecto significativo positivo sobre la variable de respuesta,
es decir, a mayor concentración de peróxido de hidrógeno sea expuesto el
rastrojo, mayor será la remoción de lignina. Por otro lado, el tiempo y la
concentración de peróxido de hidrogeno al cuadrado (H2O2)2 tienen un efecto
significativo negativo sobre el porcentaje de remoción de lignina, es decir, a
mayor tiempo de reacción y una mayor concentración de peróxido de hidrógeno
la remoción de lignina será menor. En cuanto a la interacción entre el tiempo y
la concentración (H2O2* t) y el tiempo al cuadrado (t)2 no mostraron un efecto
significativo sobre la variable analizada.
El modelo lineal arrojado por el programa estadístico, fue el siguiente:
Y= 68.37 + 6.99 X1 + 12.135 X2 – 8.06 (X2)2
El valor del coeficiente de determinación R2 (0.99) indica que el modelo de
respuesta puede explicar el 99% de las variaciones totales.
40
Figura 18. Gráfica de Pareto de las variables evaluadas sobre la remoción de lignina en el rastrojo de maíz.
7.2 Determinación de compuestos estructurales
Para utilizar los residuos lignocelulósicos como materia prima en la producción
de bioetanol 2G, es necesario conocer sus principales componentes
estructurales (lignina, hemicelulosa y celulosa), puesto que estos varían según
la especie de planta, condiciones climáticas y el tipo de suelo. La celulosa
representa el 40-60% del peso seco de la biomasa lignocelulósica.
Una vez obtenida la muestra resultante del pre-tratamiento, se llevó a cabo la
composición estructural de la biomasa. En esta etapa el principal objetivo fue la
cuantificación de la celulosa. En el Cuadro 7, se observan los componentes
estructurales de la muestra de rastrojo a la que se le aplicó un pre-tratamiento
químico (ácido-alcalino) y una muestra sin pre-tratar.
La muestra sin pre-tratar contiene 32.99 % de celulosa y 18.69 % de lignina.
Una vez que se le aplica el pre-tratamiento, se logró remover en un 80% el
contenido de lignina, es decir, del 18.69 % que presentaba la muestra
inicialmente, el 14.95 % fue removido.
41
Cuadro 7. Determinación de los principales componentes de la biomasa lignocelulósica.
Pre-tratamiento
Componente Sin pretratar (%)
H2O2 (%)
Lignina 18.69 3.47 Celulosa 32.99 61.13
Hemicelulosa 38.48 30.4 Cenizas 7.72 3.7
Extractivos 2.1 1.3
En cuanto al contenido de celulosa, se observa que la disposición de la misma
aumentó en relación a la que contenía la muestra no pre-tratada, de un 32.99%
a un 61.13% cuando se le aplicó el pre-tratamiento químico. Para los demás
componentes se refiere, hemicelulosa, cenizas y extractivos, disminuyeron de
38.48, 7.72 y 2.1% a 30.4, 3.7 y 1.3% (Figura 19).
Figura 19. Comparación de los componentes del rastrojo de maíz sin pre-tratar y pre-tratado con H2O2.
42
7.3 Determinación de actividades enzimáticas
Una vez obtenidos los extractos enzimáticos de las fermentaciones de los
hongos P. funiculosum y C. cladosporioides en medios selectivos para cada
uno de ellos, se procedió a medirle las actividades enzimáticas de
endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa.
En el Cuadro 8 se presentan los resultados obtenidos de las actividades
enzimáticas, se observa que la actividad exoglucanasa (FPAasa) para ambos
hongos fue de 0.583 y 0.589 UI/mL respectivamente. Por otro lado los valores
obtenidos en la actividad endoglucanasa usando CMC como sustrato, fueron
de 1.049 y 0.667 UI/mL para C. cladosporioides y P. funiculosum
respectivamente. Por último se determinó la actividad β-glucosidasa, siendo C. cladosporioides el que obtuvo un valor mayor al obtenido con P. funiculosum,
0.047 y 0.021 UI/mL respectivamente.
Cuadro 8. Actividad enzimática (UI/mL) de los extractos producidos por P. funiculosum y C. cladosporioides.
Endoglucanasa Exoglucanasa β-glucosidasa
P. funiculosum 0.66±0.203 0.58±0.202 0.021±0.008
C. cladosporioides 1.05±0.167 0.59±0.094 0.047±0.013
7.4 Sacarificación (hidrólisis enzimática)
El proceso de sacarificación tiene como propósito convertir la celulosa en
glucosa con el uso de enzimas hidrolíticas. A la muestra de maíz previamente
pretratada, se le realizó una hidrólisis enzimática donde se aplicó un diseño
factorial 23 con 4 puntos centrales (Cuadro 9). Este proceso se llevó a cabo con
los extractos de P. funiculosum, C. cladosporioides y una celulasa comercial T.
viride como control.
43
Cuadro 9. Análisis estadístico de los datos obtenidos con un nivel de significancia del 95 %.
Diseño factorial Sacarificación (%) No.
Experimento T(°C) pH Agitación (rpm) P. funiculosum C. cladosporoides T. viride
1 30 3 0 4.504 3.870 4.4112 60 3 0 3.913 4.185 3.7583 30 6 0 4.267 11.103 9.3264 60 6 0 7.506 2.943 3.7595 30 3 200 5.030 4.883 2.1926 60 3 200 2.278 2.701 3.9507 30 6 200 4.041 2.076 2.7708 60 6 200 6.167 9.448 3.3569 45 4.5 100 21.18 16.53 21.48
Como se observa en la Figura 20 y Cuadro 9, el mayor porcentaje de
sacarificación se obtuvo con el tratamiento 9 para los tres microorganismos
empleados, es decir, 45 °C de temperatura, con un pH de 4.5 y una velocidad
de agitación de 100 rpm, arrojando un porcentaje de 21.48% de sacarificación.
Figura 20. Porcentaje de sacarificación de los tres microorganismos empleados en la hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado con H2O2.
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Sacarificación(%
)
Tratamiento
P.funiculosum C.cladosporoides T.viride
44
La Figura 21 se refiere al porcentaje de sacarificación cuando se usó el
extracto de P. funiculosum y como se observa, el factor de pH presenta el
mayor efecto significativo negativo sobre la variable de respuesta, es decir, a
menor pH menor será el porcentaje de sacarificación, así como también lo
presentaron la velocidad de agitación y la interacción entre temperatura y
velocidad de agitación. La interacción entre la temperatura y el pH, la
temperatura y el pH presentaron un efecto positivo sobre la variable de
respuesta.
El modelo lineal arrojado por el programa estadístico, fue el siguiente:
𝐘 = 𝟐𝟏. 𝟒𝟑 + 𝟎. 𝟐𝟓𝟐 𝐗𝟏 + 𝟎. 𝟕𝟖𝟐 𝐗𝟐 − 𝟎. 𝟑𝟑𝟒 𝐗𝟑 + 𝟏. 𝟎𝟖 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟐 − 𝟎. 𝟒𝟎𝟗 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟑− 𝟏𝟔. 𝟕𝟐(𝐗𝟐)𝟐
El valor del coeficiente de determinación R2 (0.99) indica que el modelo de
respuesta puede explicar el 99% de las variaciones totales.
Figura 21. Gráfica de Pareto de los factores evaluados sobre el porcentaje de sacarificación, usando P. funiculosum.
La Figura 22 se refiere4 al porcentaje de sacarificación cuando se usó el
extracto de C. cladosporioides y como se observa, el factor de pH presenta el
mayor efecto significativo negativo sobre la variable de respuesta, es decir, a
45
menor pH menor será el porcentaje de sacarificación, así como también lo
presentaron la velocidad de agitación, la temperatura y la interacción entre
temperatura y velocidad de agitación. Las interacciones entre la temperatura, el
pH y la velocidad de agitación (T*pH*Ag), la temperatura y el pH (T*pH)
presentaron un efecto positivo sobre la variable de respuesta.
El modelo lineal arrojado por el programa estadístico, fue el siguiente:
𝐘 = 𝟏𝟔. 𝟓𝟐 − 𝟎. 𝟑𝟑𝟏 𝐗𝟏 + 𝟏. 𝟐𝟒 𝐗𝟐 − 𝟎. 𝟑𝟕𝟒 𝐗𝟑 + 𝟎. 𝟏𝟑𝟒 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟐 + 𝟏. 𝟔𝟐𝟗 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟑
− 𝟎. 𝟐𝟓𝟐 𝐗𝟐 ∗ 𝐗𝟑 + 𝟐. 𝟐𝟓𝟑 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟐 ∗ 𝐗𝟑 − 𝟏𝟏. 𝟑𝟕(𝐗𝟐)𝟐
El valor del coeficiente de determinación R2 (0.99) indica que el modelo de respuesta puede explicar el 99% de las variaciones totales.
Figura 22. Gráfica de Pareto de los factores evaluados sobre el porcentaje de sacarificación, usando el extracto enzimático producido por C. cladosporioides.
La Figura 23 se refiere al porcentaje de sacarificación cuando se usó el
extracto de T. viride y como se observa al igual que en los dos casos
anteriores, el factor de pH presenta el mayor efecto significativo negativo sobre
la variable de respuesta, es decir, a menor pH menor será el porcentaje de
sacarificación, así como también lo presentaron la velocidad de agitación, la
temperatura y las interacciones entre la temperatura y el pH (T*pH) y el pH y la
46
velocidad de agitación (pH*Ag). Las interacciones entre la temperatura, el pH y
la velocidad de agitación (T*pH*Ag), la temperatura y velocidad de agitación
(T*Ag) presentaron un efecto positivo sobre la variable de respuesta.
El modelo lineal arrojado por el programa estadístico, fue el siguiente:
𝐘 = 𝟐𝟏. 𝟒𝟕 − 𝟎. 𝟒𝟖𝟒 𝐗𝟏 + 𝟎. 𝟔𝟏𝟐 𝐗𝟐 − 𝟏. 𝟏𝟐𝟑 𝐗𝟑 − 𝟎. 𝟕𝟔𝟎 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟐 + 𝟏. 𝟎𝟕𝟎 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟑
− 𝟎. 𝟔𝟏𝟔 𝐗𝟐 ∗ 𝐗𝟑 + 𝟎. 𝟒𝟔𝟕 𝐗𝟏 ∗ 𝐗𝟐 ∗ 𝐗𝟑 − 𝟏𝟕. 𝟐𝟖𝟓(𝐗𝟐)𝟐
El valor del coeficiente de determinación R2 (0.99) indica que el modelo de
respuesta puede explicar el 99% de las variaciones totales.
Figura 23. Gráfica de Pareto de los factores evaluados sobre el porcentaje de
sacarificación, usando T. viride.
7.5 Fermentación alcohólica
Para llevar a cabo la fermentación de los azúcares obtenidos en la
sacarificación del rastrojo de maíz pretratado, se utilizó la levadura S.
cerevisiae ITVE01. Se realizó el perfil cinético de la levadura utilizando los
azúcares obtenidos en la sacarificación de ambos hongos y de la celulasa
comercial de T. viride.
47
En la Figura 24 se muestra el crecimiento de la levadura, con los azúcares
reductores producidos en el proceso de sacarificación de P. funiculosum, se
consideraron dos métodos de determinación de crecimiento microbiano (DO y
conteo directo en cámara de Thoma) y observamos que el final de su fase
exponencial es a las 24 horas de incubación con una DO de 0.892 y una
biomasa de 2.428 g/L, así como también se observa el consumo de glucosa, el
cual inició con una concentración de 13.28 g/L y termina con una concentración
de 1.89 g/L de glucosa, además presentó una producción de 3.91 g/L de
etanol.
Figura 24. Perfil cinético de producción de biomasa, consumo de azúcares reductores y producción de etanol por la levadura S. cerevisiae ITV01 con
azúcares producidos por P. funiculosum en la etapa de sacarificación.
En la Figura 25 se muestra el crecimiento de S. cerevisiae, con los azúcares
reductores producidos en el proceso de sacarificación de C. cladosporioides, la
gráfica muestra una DO de 1.117 y una biomasa de 3.090 g/L a las 24 horas de
incubación, así como también se observa el consumo de glucosa, el cual inició
con una concentración de 13.34 g/L y termina con una concentración de 2.169
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Azúc
ares
redu
ctor
es, e
tano
l (g/
L)
Biom
asa
(g/L
)
Tiempo de incubación (horas)
Biomasa Azúcares reductores Etanol
48
g/L de glucosa a las 36 horas de incubación. Además S. cerevisiae presentó
una producción de 3.42 g/L de etanol.
Figura 25. Perfil cinético de producción de biomasa, consumo de azúcares reductores y producción de etanol por la levadura S. cerevisiae ITV01 con azucares producidos por C. cladosporioides en la etapa de sacarificación.
Por último, en la Figura 26 se muestra el crecimiento de S. cerevisiae, con los
azúcares reductores producidos en el proceso de sacarificación por la celulasa
comercial T. viride, la gráfica muestra una DO de 0.947 y una biomasa de
2.589 g/L a las 24 horas de incubación, así como también se observa el
consumo de glucosa, el cual inició con una concentración de 13.238 g/L y
termina con una concentración de 3.289 g/L de glucosa y presentó una
producción de 3.57 g/L de etanol.
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Azúc
ares
redu
ctor
es, e
tano
l (g/
L)
Biom
asa
(g/L
)
Tiempo de incubación (horas)
Biomasa Azúcares reductores Etanol
49
Figura 26. Perfil cinético de producción de biomasa, consumo de azúcares reductores y producción de etanol por la levadura S. cerevisiae ITV01 con
azucares producidos por T. viride en la etapa de sacarificación. Se determinó la cantidad de etanol producido por S. cerevisiae con los
diferentes azúcares producidos por las distintas cepas y la celulasa comercial.
Las muestras se cuantificaron por medio de HPLC en el Laboratorio de
Bioprocesos del Instituto Tecnológico de Veracruz. Los resultados se resumen
en el Cuadro 10.
La mayor producción de etanol se presenta con los azúcares producidos por P.
funiculosum con 3.91 g/L de etanol y un rendimiento de 0.391 g etanol/g azúcar
y una velocidad específica de crecimiento (µmax) de 0.1222 h-1. Para C. cladosporioides se registró la producción de 3.42 g/L de etanol con un
rendimiento de 0.3407 g etanol/g azúcar y una velocidad específica (µmax) de
0.1306 h-1, a pesar de presentar una mayor cantidad de biomasa, no presentó
un buen rendimiento de etanol. Por último la celulasa comercial T. viride
presentó una producción de 3.57 g/L de etanol, con un rendimiento de 0.3970 g
etanol/g azúcar y una velocidad específica de crecimiento µmax de 0.1411 h-1.
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0 10 20 30 40
Azúc
ares
redu
ctor
es, e
tano
l (g/
L)
Biom
asa
(g/L
)
Tiempo de incubación (horas)
Biomasa Azúcares reductores Etanol
50
Cuadro 10. Determinación de parámetros cinéticos durante la producción de etanol 2G empleando celulasas producidas por P. funiculosum, C.
cladosporioides y T. viride durante el proceso de sacarificación
Microorganismo Etanol (g/L)
Rendimiento (g etanol/g
azúcar) Biomasa
(g/L)
Velocidadespecíficadecrecimientoµmax (h-1)
P. funiculosum 3.91 0.3917 2.428 0.1222 C. cladosporioides 3.42 0.3407 3.090 0.1306 T. viride 3.57 0.3970 2.589 0.1411
Con lo anterior, se sugiere que el mejor microorganismo para la producción de
azúcares fermentables para la producción de etanol de 2G en esta
investigación fue P. funiculosum.
7.5 Protocolo de producción de bioetanol 2G
Se propone el siguiente protocolo de producción de bioetanol 2G a partir de
rastrojo de maíz (Figura 26) y el empleo de microorganismos autóctonos en
base a los resultados obtenidos en esta investigación.
El rastrojo de maíz limpio, seco y molido se somete a pre-tratamiento
combinado ácido – alcalino. En este trabajo se estandarizó el siguiente
protocolo para el tratamiento, el cual consiste en el empleo de ácido sulfúrico
(2%) a una relación sólido líquido (RSL) 1:10, mantener en autoclave 121 °C
por 1 hora para que se realice la hidrólisis ácida, enseguida lavar y secar el
rastrojo pretratado para someterlo a hidrólisis alcalina con peróxido de
hidrógeno al 5%, RSL 1:15, ajustar el pH a 11 con hidróxido de sodio y
mantener en reacción por 20 horas. Posterior a la reacción, lavar y secar. Para
la hidrólisis enzimática el rastrojo pretratado se somete a sacarificación con el
empleo de extractos enzimáticos. Para el extracto de P. funiculosum utilizar
buffer de acetato de sodio 50 mM con pH ajustado a 4.5, (RSL) 1:20, 45 °C y
agitar a 100 rpm. Para el uso del extracto enzimático de C. cladosporioides
emplear buffer de acetato de sodio 50 mM a pH 6, RSL 1:20, 30 °C y 200 rpm.
En la fermentación, adicionar a los azúcares obtenidos en hidrólisis enzimática
un medio basal para el crecimiento de levaduras que consiste en g/L: extracto
de levadura, 1; KH2PO4, 8.0; (NH4)2SO4, 5.0; y MgSO4.7H2O, 1.0. Ajustar pH a
51
4.5 con ácido fosfórico al 10%. Inocular la levadura S. cerevisiae ITVE01 con
una concentración de inóculo de 6 x 10 6 células viables/mL. Incubar a 30 °C,
150 rpm por 24. Cuantificar etanol por cromatografía líquida de alta resolución.
Figura 27. Propuesta de protocolo de producción de bioetanol 2G a partir de
rastrojo de maíz y microorganismos autóctonos.
52
8. DISCUSIÓN
8.1 Pre-tratamiento químico de rastrojo de maíz
Aplicar un método de tratamiento previo a la biomasa lignocelulósica es
esencial para alterar su estructura y de esta manera hacer que la celulosa sea
más accesible a las enzimas que convertirán los polímeros de carbohidratos en
azúcares fermentables para la producción de bioetanol (Liu et al., 2018). En la
variedad de pre-tratamientos de biomasa, destacan los pre-tratamientos ácido y
alcalino, ambos son considerados como los más eficientes en cuanto a
remoción de hemicelulosa y lignina (Mittal et al., 2017).
Diversos autores han reportado el porcentaje de remoción de lignina utilizando
diferentes métodos de pre-tratamiento. Mittal et al., (2017) realizó el pre-
tratamiento de rastrojo de maíz, utilizando diferentes concentraciones de
peróxido de hidrógeno, reportando un porcentaje de remoción de lignina entre
el 80-90% a una concentración de 250-500 mg de H2O2 a una temperatura de
50 °C por 3 horas. Por otro lado, Liu et al., (2018), realizó una comparación de
tratamientos alcalinos en rastrojo de maíz, reportando que el mayor porcentaje
de remoción de lignina se presentó cuando el rastrojo de maíz fue expuesto a
99 °C con una concentración de NaOH de 0.06 g/g de biomasa, una relación
sólido/líquido de 1:2 y un tiempo de incubación de 1 h, reportando un 20.49%
de lignina en materia seca, lo que equivale al 79.51% de lignina removida.
Estos resultados coinciden con lo obtenido en este trabajo, debido a que a
mayor concentración de peróxido de hidrógeno sea expuesto el rastrojo de
maíz, mayor será la remoción de la lignina. Esto puede deberse a lo que
mencionan Gong et al., (2015) donde en condiciones alcalinas, el H2O2 además
de actuar sobre las partes alifáticas, también ataca los anillos fenólicos de
lignina, lo cual hace que se solubilice y se promueva su remoción con mayor
facilidad.
En un estudio realizado por Su et al., (2018), en el cual realiza un pre-
tratamiento biológico con el hongo Myrothecium verrucaria, variando la
concentración de inóculo del 1 al 3%, reportan un 44.26% de remoción de
lignina en un tiempo de incubación de 14 días cuando se inocula a una
concentración del 3%.
53
Raveendran et al.,(2016) menciona que el pre-tratamiento biológico utilizando
los metabolitos de un microorganismo para la producción de etanol a partir de
biomasa es una tecnología prometedora debido a sus diversas ventajas, como
la estrategia ecológica y económicamente viable para mejorar la tasa de
sacarificación enzimática. Dado que no se utilizaron productos químicos en
este proceso, no hay necesidad de reciclar productos químicos y no libera
compuestos tóxicos al medio ambiente, sin embargo los tiempos de operación
son más prolongados, lo que comparado con los otros pre-tratamientos es
considerado una desventaja.
Por otra parte, Wang et al., (2018) realizó el pre-tratamiento de rastrojo de maíz
utilizando diferentes concentraciones de urea y harina de soya incubando a 80
°C por seis días, cuantificaron la composición estructural y reportaron un
15.86% de lignina removida, valor que es 5 veces menor que lo reportado en
este trabajo.
8.2 Determinación de composición estructural de la biomasa lignocelulósica
Clásicamente, los polisacáridos de la pared celular se han agrupado en tres
fracciones: lignina, hemicelulosa y celulosa en mayor cantidad, así como
proteínas y otros compuestos misceláneos en pequeñas cantidades. La
celulosa, el principal componente estructural en la pared celular de la planta, es
un homopolisacárido lineal que consiste en unidades de glucosa anhidras que
están unidas por enlaces β-1,4-glicosídicos, con la celobiosa como la unidad
repetitiva más pequeña. La orientación β-1,4 de los enlaces glucosídicos da
como resultado la formación potencial de enlaces de hidrógeno
intramoleculares e intermoleculares, que hacen que la celulosa nativa sea
altamente cristalina, insoluble y resistente al ataque de enzimas (Kumar et al.,
2015). Estudios realizados por Su et al., (2018) reportan la composición
estructural del rastrojo de maíz, usando previamente un pre-tratamiento
alcalino, reporta un aumento en el porcentaje de celulosa en rastrojo pre-
tratado con un valor que va de 38.34%(muestra sin pretratar) a 48.79%
(muestra pretratada), misma tendencia que se obtuvo en este trabajo, ya que,
se obtuvo 63.13% de celulosa en muestra pre-tratada iniciando con un valor del
54
32.99%. Por otra parte menciona el porcentaje de hemicelulosa, el cual
presentó un aumento de la muestra no pre-tratada a la pre-tratada, con un valor
de 18.95 a 24.60% respectivamente, valores diferentes a lo obtenido en esta
investigación, con 38.48% en muestra sin pre-tratar a 30.4% en la muestra pre-
tratada. Lo anterior puede deberse a que la muestra fue previamente pre-
tratada con ácido sulfúrico, debido a que el H2SO4 busca romper principalmente
la estructura de la hemicelulosa para tener un fácil acceso a la celulosa (López-
Bojórquez, 2015).
Los resultados de este trabajo concuerdan con lo reportado por Beltrán-
Arredondo (2017), quien realizó el pre-tratamiento químico (ácido- alcalino) de
muestras de rastrojo de maíz (Cuadro 11).
Cuadro 11. Comparación de resultados de la composición proximal de rastrojo
de maíz pre-tratado químicamente.
Lignina Celulosa Hemicelulosa Cenizas Extractivos
Beltrán-Arredondo 4 70 22 3 1.1
Este trabajo 3.47 61.13 30.4 3.7 1.2
Debido al alto grado de recalcitrancia, se requieren pasos de pre-tratamiento
para la fermentación. El tratamiento previo incluye cualquier paso para romper
la celulosa, la hemicelulosa, la matriz de lignina por métodos como la
temperatura, el ácido o el tratamiento enzimático (Barten, 2013).
8.3 Determinación de actividades enzimáticas
Los hongos son agentes bien conocidos de descomposición de la materia
orgánica en general y del sustrato celulósico en particular (Lynd et al., 2002).
Los microorganismos productores de enzimas celulasas más comunes y
potentes son pertenecientes a los géneros, Aspergillus, Trichoderma,
Penicillium, Paecilomyces y Fusarium.
A continuación se presenta un resumen de las actividades enzimáticas
celulolíticas obtenidas en cada microorganismo (Cuadro 11), además se
55
comparan los resultados con otros autores que han reportado actividades
enzimáticas en diferentes microorganismos.
Cuadro 12. Resumen de las actividades enzimáticas celulolíticas de cada microorganismo y comparación de resultados con otros autores.
Autor/ año Microorganismo Actividad
endoglucanasa (UI/mL)
Actividad exoglucanasa
(UI/mL)
Actividad β-glucosidasa
(UI/mL) Beltrán-Orduño
(2019) P. funiculosum 0.66 0.58 0.021
Beltrán- Orduño (2019) C. cladosporioides 1.05 0.59 0.047
Bergadi et al. (2016)
M. racemosus A. niger
A. oryzae
0.256 0.236 0.216
NP NP
Sun et al. (2018) P. oxalicum 0.63 0.20 1.55
Nargotra et al. (2016) Bacillus subtilis 2.201 0.221 NP
Bergadi et al. (2016) reporta actividad endoglucanasa en tres distintas cepas de
hongos (M. racemosus, A. niger, A. oryzae) y reporta valores de 0.256, 0.236 y
0.216 UI/mL de actividad endoglucanasa utilizando CMC como fuente de
carbono cultivando por 10 días a una temperatura de 25 °C y un pH de 5. Estos
resultados son tres veces menores que lo obtenido en este trabajo para ambos
hongos.
Sun et al. (2018) realizó la optimización para la obtención de la máxima
actividad de endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa en P. oxalicum,
variando la concentración de la fuente de carbono y nitrógeno (rastrojo de maíz
y peptona) y reporta valores de actividades enzimáticas de 0.63, 0.20 y 1.55
UI/mL respectivamente. Estos resultados son similares a lo obtenido es este
trabajo con el hongo P. funiculosum para la actividad endoglucanasa (0.667
UI/mL), para exoglucanasa, en este trabajo se obtuvo 2.5 veces más que lo
reportado por Sun et al. (2018). Sin embargo, la actividad β- glucosidasa es
mayor para P. oxalicum que lo obtenido en este trabajo para ambos
microorganismos.
Por otro lado, Andersen et al. (2016), evaluaron la actividad β-glucosidasa
utilizando para-nitrofenil-β-D-glucopiranósido como sustrato en condiciones de
50 °C y pH 4.5 en diversas especies de hongos filamentosos, reportando
56
actividades que oscilan entre 0.008 y 0.154 UI/mL hasta actividades de 7.23 y
7.65 UI/mL en los hongos identificados como Chaetomium y Stachybotrys y P.
cryspgenum y C. sphaerospermum respectivamente. Este resultado es muy
variado a lo obtenido en este trabajo, debido a las variadas condiciones de
crecimiento de los microorganismos, ya que emplean un medio semi-sólido
preparado con salvado de trigo a diferencia de este trabajo que se realizó con
rastrojo de maíz como fuente de carbono en medio líquido.
Diversos trabajos se han centrado en la investigación y selección de nuevas
cepas microbianas especialmente en lo que se refiere a los hongos
filamentosos que son excelentes secretores de enzimas celulasas, debido al
potencial que presentan en las aplicaciones biotecnológicas, además se ha
demostrado que el hábitat original de una cepa es importante para obtener un
perfil de enzima tan específico como sea posible (Andersen et al., 2016), tal
como se planteó en el presente trabajo ya que los aislados inicialmente se
aislaron de desechos de M. oleifera (Vázquez-Montoya et al., 2019).
8.4 Sacarificación (hidrólisis enzimática)
La sacarificación y las etapas de fermentación se pueden realizar por separado
o simultáneamente. La separación de hidrólisis y fermentación ofrece ventajas
de procesamiento. Permite que las enzimas y los microorganismos funcionen a
su temperatura óptima para aumentar el rendimiento, optimizando la utilización
de los azúcares. La hidrólisis enzimática juega un papel muy importante en la
producción de biocombustibles (Haldar et al., 2016).
En el estudio de Tamboli et al. (2017) reportaron la hidrólisis de celulosa
microcristalina con celulasas comerciales de Aspergillus sp. y T. reesei
reportando un 22% de sacarificación con la celulasa de T. reesei y un 27.8% en
la hidrólisis para Aspergillus sp. resultado que coincide con lo obtenido en este
trabajo (21% de sacarificación) en el empleo de celulasas comerciales de T.
viride. Sin embargo, difiere con lo reportado por Huang et al., (2018) quien
realizó la sacarificación en rastrojo de maíz pre-tratado previamente (pre-
tratamiento biológico y alcalino) añadiendo un coctel enzimático en presencia y
ausencia de carbonato de sodio (Na2CO3), reportando un 88.7 y 88.7% de
57
sacarificación respectivamente, en un periodo de incubación de 72 h. Por otro
lado, en un estudio realizado por Zheng et al. (2018) se realizó la sacarificación
de rastrojo de trigo utilizando una combinación de celulasas comerciales (T.
reesei y A. niger) reportando un porcentaje de 87.2% de sacarificación, valores
4 veces mayor a lo obtenido en este trabajo. Sin embargo, Zheng et al. (2018)
hacen referencia a que la alta conversión de celulosa a azúcares fermentables,
se le podría atribuir a la eficiente degradación de la hemicelulosa y la lignina
después del pre-tratamiento, en el que se utilizó un pre-tratamiento combinado
4% de H2SO4 y 4% de NaOH.
Su et al. (2018), realizaron la hidrólisis enzimática en rastrojo de maíz pre-
tratado previamente con un pre-tratamiento biológico (M. verrucaria) seguido
de uno alcalino (NaOH 0.1%), reportando un 55.20% de sacarificación en la
muestra pre-tratada y un 25.95% de sacarificación en rastrojo no pretratado,
valor 2.6 mayor que lo obtenido en este trabajo, lo que sugiere que es
necesario un tratamiento alcalino del rastrojo antes de la hidrólisis enzimática,
además los datos indicaron que el tratamiento biológico aumentó el porcentaje
de sacarificación, lo que puede deberse al agotamiento de la lignina después
del tratamiento biológico previo. La alta eficiencia del pre-tratamiento biológico
se debe principalmente a que M. verrucaria ha sido reportado como un nuevo
hongo degradador de lignina (Wang et al., 2017) con valores de degradación
de lignina de 45.50 ± 2.12% en muestras de aserrín.
La hidrólisis enzimática es considerada un método prometedor para la
obtención de azúcares fermentables a partir de celulosa debido a sus
condiciones de procesamiento y su alta selectividad. Sin embargo, la celulosa
es difícil de digerir debido a las interacciones covalentes y los vínculos entre la
lignina y la hemicelulosa (Kumar et al., 2015). Es esencial aplicar un método de
tratamiento previo eficiente para facilitar la conversión de celulosa a azúcares u
otros productos de alto valor (Saha et al., 2016). Lo anterior se debe a que la
lignina proporciona una barrera física que limita la accesibilidad de la celulasa a
la celulosa, por lo que reduce la eficiencia de la hidrólisis enzimática.
58
8.5 Fermentación alcohólica
Actualmente, el bioetanol es producido por fermentación alcohólica de los
azúcares presentes en materiales renovables. Dicha fermentación está
influenciada por factores como la concentración de azúcares del sustrato y el
microorganismo fermentador que se emplee. La bioconversión de la biomasa
lignocelulósica en etanol implica con frecuencia un método de tratamiento
termoquímico seguido de la sacarificación ácida y/o enzimática del residuo pre-
tratado para liberar la mayor cantidad de azúcares fermentables, finalmente se
realiza la fermentación de los azúcares liberados por una levadura.
Son diversos los autores que han determinado el rendimiento de etanol
producido a partir de diferentes biomasas lignocelulósicas, entre los que se
destaca Banoth et al. (2017), quien determinó el rendimiento de una enzima
comercial, usando como sustrato rastrojo de arroz, la biomasa fue pretratada
con un tratamiento alcalino, reportando un rendimiento de etanol de 0.44 g
etanol/g glucosa utilizando S. cerevisiae en la fermentación. Kumar et al.,
(2018) realizó el proceso de bioetanol, reportando un rendimiento de 0.47 g
etanol/g glucosa utilizando S. stiptis durante una fermentación por 48 horas.
Estos resultados se asemejan con los rendimiento obtenidos en esta
investigación, utilizando los azúcares fermentables de P. funiculosum
reportando un rendimiento de 0.3917 g etanol/g glucosa a las 24 horas de
incubación utilizando a S. cerevisiae durante la etapa de fermentación.
Existen reportes previos que mencionan que cuando S. cerevisiae se encuentra
cultivada a altas concentraciones de azúcar (menores a 30 – 40%) se
incrementa la producción de etanol. Cuando S. cerevisiae se encuentra bajo
condiciones de alta concentración de oxígeno disuelto (0.16 g/L) y la
concentración de azúcares supera 9 g/L, la levadura convierte su metabolismo
oxidativo a oxidoreductivo o fermentativo incrementándose la producción de
etanol y se presenta el llamado efecto Crabtree. El efecto Crabtree se describe
como el fenómeno a través del cual la levadura S. cerevisiae produce alcohol
en condiciones aerobias y con una gran concentración de glucosa, en lugar de
producir biomasa mediante el ciclo de Krebs. Incrementando las
concentraciones de glucosa se acelera la glucólisis, lo que da lugar a la
59
producción de grandes cantidades de ATP a través de una fosforilación a nivel
de sustrato (Herrera et al., 2014).
Hay varios factores que influyen en la producción de bioetanol, incluidos la
temperatura, la concentración de azúcar, el pH del medio, el tiempo de
fermentación, la velocidad de agitación, así como la concentración de inóculo
(Zabed et al., 2014).
Naunpeng et al. (2018) realizó la producción de etanol en un sistema batch a
partir de sorgo dulce utilizando una cepa inmovilizada termotolerante de S.
cerevisiae en la fermentación, reportando valores de rendimiento de etanol que
oscilan entre 0.40 y 0.44 g etanol/ g de glucosa, estos valores son similares a lo
obtenido en este trabajo. Sin embargo Phukoetphim et al., (2017) sugiere que
la concentración de etanol y la productividad de etanol aumenta hasta un 51%
en una fermentación fed-batch comparada con una fermentación batch.
60
9. CONCLUSIONES
Se logró una eficiente remoción de la lignina de muestras de rastrojo de maíz
con un pre-tratamiento químico (ácido-alcalino) con un 80.18% bajo las
siguientes condiciones: 5% de peróxido de hidrógeno y 20 horas de reacción.
El pre-tratamiento ácido/alcalino permitió la cuantificación de los componentes
estructurales de la biomasa lignocelulósica: lignina 3.47%, celulosa 61.13%,
hemicelulosa 30.4%, cenizas 3.7% y extractivos 1.3 %.
Se obtuvieron extractos enzimáticos celulolíticos de las dos cepas empleadas.
Ambos hongos presentaron actividades enzimáticas CMCasa, FPAsa y β-
glucosidasa, 0.667, 0.583, 0.021 UI/mL y 1.049, 0.589, 0.047 UI/mL para P.
funiculosum y C. cladosporioides respectivamente.
Se logró sacarificar rastrojo de maíz pre-tratado empleando celulasas
obtenidas a partir de P. funiculosum; las cuales mostraron un porcentaje de
sacarificación similar (20-21%) al obtenido por las celulasas de T. viride
(celulasas comerciales). Para C. cladosporioides el porcentaje de
sacarificación fue el 30% menos comparado con los otros experimentos
realizados.
Fue posible establecer un sistema de producción de bioetanol 2G empleando
como fuente de carbono rastrojo de maíz pre-tratado y extractos celulolíticos de
dos cepas de hongos nativas del estado de Sinaloa. P. funiculosum presentó la
mayor producción de etanol (3.91 g/L) con un rendimiento de 0.3917 g/g, lo que
lo hace atractivo para la producción de bioetanol de 2G a escala piloto y
comercial.
61
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