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ESTANDARIZACIÓN Y PRODUCCIÓN A ESCALA INDUSTRIAL DE UNA
PRUEBA RÁPIDA DE UREASA PARA LA DETECCIÓN DE Helicobacter
pylori
ANDREA BAZZANI PRADERE
ADRIANA ROCÍO BRIÑEZ VERA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTA, D. C.
2001
ESTANDARIZACIÓN Y PRODUCCIÓN A ESCALA INDUSTRIAL DE UNA
PRUEBA RÁPIDA DE UREASA PARA LA DETECCIÓN DE Helicobacter
pylori
ANDREA BAZZANI PRADERE
ADRIANA ROCÍO BRIÑEZ VERA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Director ÓSCAR OROZCO DÍAZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTA, D. C.
2001
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946. ”La Universidad no se
hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis
de grado”.
NOTA DE ACEPTACIÓN
ESTANDARIZACIÓN Y PRODUCCIÓN A ESCALA INDUSTRIAL DE UNA
PRUEBA RÁPIDA DE UREASA PARA LA DETECCIÓN DE Helicobacter
pylori
ANDREA BAZZANI PRADERE
ADRIANA ROCÍO BRIÑEZ VERA
APROBADO
___________________________ DR. ÓSCAR OROZCO DÍAZ Director del Trabajo ___________________________ Dra. JANNETH ARIAS Asesora ___________________________ Dr. JAIME ALVARADO BESTENE Jurado ___________________________ Dr. WALTER OCAMPO Jurado
TABLA DE CONTENIDO
pág INTRODUCCIÓN 1 1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 4 2 OBJETIVOS 9 3 REVISIÓN DE L ITERATURA 10 3.1 CARACTERIZACIÓN DE LA BACTERIA Helicobacter pylori 10 3.1.1 Taxonomía 12 3.1.2 Genética 14 3.2 EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori 15 3.3 PATOGENICIDAD 18 3.3.1 Factores de colonización y persistencia 18 3.3.2 Factores inductores de enfermedad 21 3.4 PATOLOGÍAS ASOCIADAS A LA INFECCIÓN 27 3.4.1 Gastritis 27 3.4.2 Úlcera péptica 30 3.4.3 Úlcera duodenal 31 3.4.4 Úlcera gástrica 32
3.4.5 Cáncer gástrico 33 3.4.6 Linfoma tipo malt 34 3.5 DIAGNÓSTICO 34 3.6 TRATAMIENTO 44 4 TEST RÁPIDO DE UREASA 47 4.1 ENZIMAUREASA DE Helicobacter pylori 47 4.2 FUNDAMENTO DEL TEST RÁPIDO DE URESA 50 4.3 PROCEDIMIENTO PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRUEBA 51 4.4 ALGUNAS PRUEBAS EXISTENTES EN EL MERCADO MUNDIAL 52 5 PLANEAMIENTO Y CONTROL DE LA PRODUCCIÓN 59 5.1 FUNCIONES DEL CONTROL DE LA PRODUCCIÓN 59 5.2 PLANEAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN 61 5.2.1 Principio del planeamiento 61 5.2.2 Factores que determinan procedimientos de planeamiento y control 62 5.2.3 Tipos de planes de producción 62 5.2.4 Técnica de planeamiento 63 5.3 ANÁLISIS DE LA PRODUCCIÓN 65 5.3.1 Análisis para determinar el tamaño económico de los lotes 66 5.3.2 Método tabular para calcular los lotes económicos 67 5.4 CICLO DE FABRICACIÓN DEL PRODUCTO 67 5.5 COSTOS DE FABRICACIÓN 69
6 MATERIALES Y MÉTODOS 70 6.1 PLANEAMIENTO PARA EL DESARROLLO DE
LAS FASES 72 6.2 ESTUDIO DE PREFACTIBILIDAD 72 6.3 PRODUCCIÓN DEL PROTOTIPO A NIVEL DE LABORATORIO 73 6.3.1 Estandarización de la prueba 73 6.3.2 Prueba de estabilidad térmica acelerada 77 6.4 PRODUCCIÓN DE PROTOTIPO INDUSTRIAL 78 6.5 ESTUDIO ESTADÍSTICO DEL TEST RÁPIDO
DE URESA PARA LA VALIDACIÓN DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD 82
7 RESULTADOS 84 7.1 FACTIBILIDAD DEL DISEÑO DE LA PRUEBA 84 7.2 PRODUCCIÓN DEL PROTOTIPO A NIVEL DE LABORATORIO 90 7.2.1 Estandarización de la prueba 90 7.2.2 Tiempo de vida útil del test Rápido de Ureasa 99 7.3 PRODUCCIÓN DEL PROTOTIPO A NIVEL INDUSTRIAL 100 8 ESTUDIO DE MERCADO DEL TEST DE UREASA PARA LA DETECCIÓN DE LA BACTERIA Helicobacter pylori 102 8.1 NECESIDAD DEL MERCADO 102 8.2 ANTECEDENTES DE LAS PRUEBAS DE DETECCIÓN PARA Helicobacter pylori 106 8.3 DESCRIPCIÓN DEL MERCADEO 107 8.4 COMPETENCIA 108
8.5 OBJETIVOS DE MERCADEO 109 8.5.1 Objetivos generales 109 8.5.2 Objetivos específicos 109 8.6 ESTRATEGIAS DE MERCADEO 110 8.7 TÁCTICAS DE MERCADEO 111 8.8 MARKETING MIX 112 8.8.1 Producto 112 8.8.2 Canales de distribución y venta 113 8.8.3 Precios 115 8.8.4 Promoción 115 8.9 COSTOS DIRECTOS PARA FABRICACIÓN DE UN LOTE DE PRUEBA 116 9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 118 10 PERSPECTIVAS 121 BIBLIOGRAFÍA 123 ANEXOS 132
LISTA DE FIGURAS
pág Figura 1. Aspecto de Helicobacter pylori, microscopia electrónica 11 Figura 2. Imagen de Helicobacter pylori en tinción de gram 11 Figura 3. Representación gráfica, genoma Helicobacter pylori 26695 15 Figura 4. Esquema de los mecanismos involucrados en la transmisión de la infección 17 Figura 5. Principales mecanismos de virulencia 20 Figura 6. Imagen del efecto vacuolizante producido por la toxina en cultivos celulares 23 Figura 7. Aspecto endoscópico de la gastritis 28 Figura 8. Patologías asociadas a la infección por H pylori 30 Figura 9. Secuencia de eventos que conducen al linfoma tipo malt 34 Figura 10. Métodos de detección de Helicobacter pylori 35 Figura 11. Toma de la biopsia 38 Figura 12. Imagen de colonia de Helicobacter pylori en cultivo 39 Figura 13. Tinción wartin-starry de Helicobacter pylori 40 Figura 14. Diagrama plan de tratamiento 46 Figura 15. Principio prueba de Ureasa 50 Figura 16. PYLORITEK® 52
Figura 17. PYLORITEK®. Paso 1 53 Figura 18. PYLORITEK®. Paso 2 54 Figura 19. PYLORITEK®. Pasos 3 y 4 54 Figura 20. PYLORITEK®. Resultados positivos 55 Figura 21. PYLORITEK®. Resultados negativos 56 Figura 22. CLOtest 57 Figura 23. Envase primario de SENSIBACTER pylori – TEST 85 Figura 24. Envase secundario y terciario de SENSIBACTER pylori-TEST 87 Figura 25. Etiqueta 88
Figura 26. Envase preliminar de SENSIBACTER pylori-TEST 89 Figura 27. Selección del preservante y estándar de enzima 91 Figura 28. Estandarización del buffer con concentración constante del preservante 92 Figura 29. Concentración óptima del sustrato 93 Figura 30. Sensibilidad de la formulación 94 Figura 31. Soporte físico de la prueba 96 Figura 32. Comparación con tres diferentes formulaciones 97 Figura 33. Tiempo de vida útil del test rápido de Ureasa 99
LISTA DE CUADROS pág Cuadro 1. Especies del género Helicobacter relacionada con el huésped habitual y la patología asociada 13 Cuadro 2. Factores que deterioran la integridad de la mucosa 25 Cuadro 3. Técnicas diagnóstica ante la infección por Helicobacter pylori según sensibilidad y especificidad 36
LISTA DE ANEXOS
pág Anexo A. Estandarización y comercialización del Test rápido de Ureasa 133 Anexo B. Formato de recolección de datos. Prueba de estabilidad 137 Anexo C. Diagrama de etapas de fabricación del lote 138 Anexo D. Formato de control de la producción 140 Anexo E. Tamizaje para la prueba rápida de Ureasa 142 Anexo F. Estudio estadístico del test rápido de Ureasa para la validación de sensibilidad y especificidad 144 Anexo G. Proyecto de Régimen Sanitario, Vigilancia y Control en relación con los productos y reactivos para el diagnóstico In Vitro en el desarrollo de la Ley 09 de 1979 150 Anexo H. Inserto 151
RESUMEN
La prueba rápida de ureasa en biopsia de mucosa gástrica constituye el
método más rápido y práctico para la detección de la bacteria Helicobacter
pylori. La infección por este microorganismo está asociado a enfermedades
ácido-pépticas como gastritis, ulcera, adenocarcinoma y linfoma gástrico. El
fundamento de esta prueba, se basa en la poderosa acción de la enzima
ureasa que posee el microorganismo en altas concentraciones y le permite
rodearse de amonio por medio de la hidrólisis de la urea y protegerse del
medio ácido del estomago, esta reacción, es evidenciada en la prueba de
ureasa por el cambio de color de amarillo a rojo al incrementarse el pH. El
objetivo primordial fue estandarizar y producir a escala industrial, una prueba
rápida de ureasa para la detección de Helicobacter pylori. El desarrollo del
trabajo de tipo experimental, se dividió en cuatro partes: En la etapa inicial,
se realizó el estudio de prefactibilidad para conocer las necesidades de los
Gastroenterólogos-Endoscopistas; la segunda etapa, corresponde a la
estandarización y verificación de los diferentes componentes y características
de la prueba de ureasa para la detección de la bacteria, definiéndose las
condiciones de elaboración de un prototipo de laboratorio. En la tercera
etapa, se procedió a planear las condiciones de elaboración de un lote
comercial, determinando para el escalamiento la manera de preparar los
reactivos, los controles de calidad de los mismos, la forma de presentación y
envase, definiendo, en general, todos los procesos para la producción
industrial de la prueba. Al producto así elaborado, se le dio el nombre de
SENSIBACTER pylori - TEST, validando su sensibilidad y especificidad
relativa a otro tipo de pruebas como la detección histopatológica
(considerada Patrón de Oro). En la etapa final, se realizó un plan de
mercadeo que al ejecutarlo permita garantizar el éxito comercial del producto.
Se formuló la composición de la prueba de la siguiente manera: Buffer
Fosfato pH 5.5 0.002M, Sustrato 0.4% p/v, Indicador de pH 0.005% p/v,
Preservativo 0.01% p/v. De acuerdo con los resultados presentados, se
pudo interpretar que la estabilidad del producto a temperatura ambiente (18-
22° C) no sobrepasa los tres meses, por tal razón, su fecha de expiración no
excede este periodo de tiempo. El estudio de mercadeo para la
comercialización del producto, logró establecer de forma precisa las
expectativas y necesidades de los usuarios, ofreciendo soluciones eficientes
para cada una de ellas, proporcionando además, puntos de partida para
creación de empresa. Finalmente, se logró la estandarización de un método
rápido, sencillo y práctico para la detección de Helicobacter pylori,
constituyéndose en material indispensable para continuar con los estudios de
optimización de esta prueba y lograr incentivar el avance en la elaboración
de productos de interés en el área de Microbiología Industrial. Es importante
continuar la investigación, para lograr mejorar los niveles de sensibilidad y
especificidad y a la vez, determinar la estabilidad final de los reactivos,
prolongando los tiempos de observación para darle una fecha de expiración
lo más amplia y confiable posible.
INTRODUCCIÓN
La Universidad Javeriana a través de la Facultad de Ciencias y la carrera de
Microbiología Industrial, forma profesionales capacitados para la
manipulación, control y aplicación industrial de los microorganismos,
ampliando así experiencias en el campo biotecnológico y participando de una
manera activa en el desarrollo y la investigación de nuevos productos y
procesos, que incrementan el potencial que hoy constituye la biotecnología
en el país.
En el estudio de la enfermedad ácido-péptica es indispensable evaluar la
presencia del Helicobacter pylori, para orientar el manejo y establecer el
tratamiento apropiado a la luz del conocimiento científico. La necesidad de
establecer la presencia de este microorganismo en la mucosa gástrica, de
una forma rápida, sencilla y de bajo costo, ha estimulado recientemente el
desarrollo de técnicas que cuenten con una sensibilidad y especificidad
cercana a las que demandan mayor tecnología y que se constituyan en un
apoyo práctico en el diagnóstico, como es la Prueba Rápida de ureasa
En el área de escalamiento de productos microbiológicos, se necesitan
pruebas de apoyo diagnóstico, como lo es la prueba rápida de ureasa, que
en la actualidad, aunque existe en otros países del mundo, en Colombia
tiene un acceso limitado.
Lo anterior debido principalmente a:
§ Sus elevados costos,
§ Exigentes trámites para su importación,
§ Condiciones de almacenamiento difíciles de controlar, tanto en su
transporte como en su conservación.
§ Falta de recurso profesional idóneo, enfocado y motivado para la
realización de pruebas de apoyo diagnóstico.
De esta manera, impera una limitada adquisición del producto entre los
profesionales y prestadores de salud, afectando en última instancia, obtener
diagnósticos acertados y rápidos de las enfermedades asociadas con la
infección por Helicobacter pylori.
El objetivo primordial de este trabajo, es formular el Test Rápido de Ureasa y
llevar a cabo su escalamiento industrial, con el fin, de obtener un producto
apropiado y disponible para comercializar; éste, incluye características como
facilidad de uso y resultados rápidos; se busca así mismo, realizar una
evaluación de sus características de sensibilidad y especificidad, para
posteriormente analizar la manera de obtener niveles comparables frente a
las pruebas disponibles en el mercado. Además, obtener una prueba estable
a temperatura ambiente, condición de almacenamiento que facilitará su uso
en cualquier consulta endoscópica.
El presente trabajo abarca aspectos tales como: el desarrollo técnico de la
prueba, escalamiento industrial, validación de sensibilidad y especificidad,
diseño del plan de mercadeo y finalmente, producción de un lote comercial
del producto terminado. Lo anterior, constituye una contribución a la
prevención o detección precoz de las enfermedades que están relacionadas
con la infección causada por Helicobacter pylori, lo que resulta benéfico para
el desarrollo posterior de otros métodos diagnósticos.
1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
El cáncer gástrico, es una de las neoplasias más comunes a nivel mundial y
en Colombia se ha reportado una incidencia cercana a 80 por cada 100 mil
habitantes. El pronóstico de esta enfermedad es deficiente, generalmente, no
se logra un diagnóstico temprano y en la mayoría de los casos sólo es
posible una terapia paliativa.
Recientes publicaciones confirman la asociación entre la infección por
Helicobacter pylori y el cáncer gástrico con un riesgo relativo que oscila
entre 2.6 y 6 (Loffeld, 1990). A partir de estudios realizados en Colombia,
se ha determinado que el 50% de los niños de clase media, están infectados
a los 10 años de edad por Helicobacter pylori y en algunas poblaciones muy
pobres, el 80% tiene infección a los 8 años (Gutiérrez, 1997). Numerosos
ensayos clínicos y estudios observacionales, muestran que la evolución
natural de la enfermedad cambia radicalmente con la erradicación de H
pylori, convirtiendo una enfermedad tradicionalmente considerada como
crónica, en una enfermedad aguda susceptible de ser completamente curada
con tratamientos cada vez más sencillos y eficaces, la erradicación por lo
tanto, no sólo es más efectiva que la no erradicación, sino que supone un
ahorro de costos para el sistema de salud. (Sierra,1990).
Se constata, además, que los tratamientos de erradicación son poco
utilizados por atención primaria ya que su prescripción está condicionada a
información diagnóstica que se ve limitada por diversas causas, en general,
por las listas de espera en el caso de pruebas basadas en endoscopia y por
la falta de acceso en pruebas rápidas de determinación de H pylori.
Existen varios métodos para establecer la presencia del H. pylori, entre
invasivos y no invasivos. Los primeros: cultivo, test rápido de ureasa y
colaboraciones histológicas que implica una endoscopia, son los más usados
por haber sido los primeros en desarrollarse. Los segundos: niveles de
anticuerpos IgA e IgG y el test de urea espirada UBT (siglas del término en
inglés, Urea Breath Test), marcada con C13, son utilizados fundamentalmente
en estudios epidemiológicos y en seguimientos de erradicación. (Megraud,
1997).
La prueba rápida de ureasa ha sido utilizada frecuentemente, ya que es
sencillo su manejo y ofrece resultados rápidos. Adicionalmente, un factor
que cabe anotar, lo constituye el rango de sensibilidad de estas pruebas que
están entre 86 y 98 % con una especificidad alrededor del 95%, logrando que
esta prueba de diagnóstico se considere competitiva frente a las otras. Sin
embargo, en Colombia existe gran dificultad para adquirirla ya que no existe
un distribuidor local, lo cual, conlleva a su importación aumentando
considerablemente su costo.
Una encuesta preliminar a este estudio, realizada a 36 gastroenterólogos
pertenecientes a 25 instituciones que cuentan con unidad de endoscopia
tanto públicas como privadas de la ciudad de Bogotá, indagó sobre la
necesidad que constituye el hecho de disponer en la consulta endoscópica
de una prueba de detección rápida y económica de gran ayuda para el
diagnóstico del paciente.
La información se recolectó mediante un instrumento (Véase Anexo A) que
aporto los siguientes datos:
• En primer lugar, se pudo establecer que en dichas instituciones,
mensualmente se realizan en promedio 73 endoscopias, de acuerdo con
esta cantidad considerable, es necesario tener acceso a una prueba
rápida de Ureasa ya que se justifica tanto para la institución, si de costos
se trata, como para el médico, ya que su diagnóstico es más eficiente,
rápido y confiable.
• Se conoció, además, que en la ciudad de Bogotá los Gastroenterólogos-
Endoscopistas solo adquieren estas pruebas de forma esporádica,
cuando dan muestra gratis los laboratorios que producen los antibióticos
para la terapia de tratamiento; son insuficientes y de muy corta vida útil,
siendo indispensable la refrigeración para ser conservadas, condición con
la que no se dispone generalmente en muchas unidades de
Gastroenterología, de esta forma, no es posible ofrecer garantía de
calidad para su uso.
• Finalmente, el tiempo de obtención del resultado, es otro punto muy
importante, éste se estima entre 2 y 20 minutos, pero ello, no garantiza,
sin embargo, resultados suficientemente confiables.
Teniendo en cuenta los anteriores resultados arrojados en la encuesta, se
hace evidente la necesidad de elaborar una prueba tamiz con el objeto de
estandarizar la formulación de la prueba rápida de Ureasa y obtener un
producto que más adelante pueda estar disponible en el mercado local, lo
cual, beneficiaría al usuario siendo posible obtener fácilmente y a un precio
competitivo, grandes o pequeños lotes dependiendo de las necesidades de
cada caso.
A su vez, se proporciona un período de vida útil suficiente, sin que sea
necesario tener refrigerado el producto. Garantizando valores de sensibilidad
y especificidad, comparables con los de las diferentes pruebas disponibles
actualmente en el mercado internacional.
Con la realización de este trabajo, se busca incentivar de manera directa a
los estudiantes de Microbiología Industrial, para desarrollar proyectos en el
área de fabricación de productos útiles para la microbiología y afines,
posibilitando la generación de industria, necesaria para aportar soluciones a
la situación por la que atraviesa la economía de país.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un prototipo a escala comercial, del test de ureasa para la
detección rápida de Helicobacter pylori.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Estandarizar la formulación de la prueba para detectar la actividad ureasa
en biopsias de mucosa gástrica.
• Obtener una prueba con un diseño práctico, que brinde al usuario
facilidad de uso, resultados rápidos y de útil aplicación en la consulta
endoscópica.
• Elaborar un plan de mercadeo para la comercialización de la prueba, para
que el usuario pueda adquirirla fácilmente.
• Fabricar un lote comercial de la prueba para la detección de Helicobacter
pylori, con el fin, de validarla en cuanto a su sensibilidad y especificidad.
3 REVISIÓN DE LITERATURA
3.1 CARACTERIZACIÓN DE LA BACTERIA HELICOBACTER PYLORI
El descubrimiento de Helicobacter pylori, se constituyó en uno de los aportes
recientes más importantes en la medicina, gracias a los estudios de Marshall
y otros (1983), quienes comprobaron la presencia de dicha bacteria en el
antro y cuerpo gástrico, evidenciando por primera vez, su relación con
enfermedades del primer tramo del intestino (úlcera duodenal y gástrica). A
partir de este hecho, se intensificaron las investigaciones acerca de la
fisiopatología de la infección, tratamiento, erradicación, y diagnóstico
microbiológico.
Basados en características morfológicas, bioquímicas y genéticas, el
microorganismo se ha clasificado como bacilo gramnegativo (0.5µ x 2.5µ –
4µ) curvo, espirilar, microaerofílico, con aspecto de coma al microscopio
óptico.
Figura 1. Aspecto de Helicobacter pylori. microscopía electrónica
Figura 2. Imagen de Helicobacter pylori en tinción de gram
En medio sólido, forma colonias brillantes y traslúcidas de 1-2 mm.
Bioquímicamente se caracteriza por ser catalasa, oxidasa, ureasa, fosfatasa
alcalina, DNasa, leucina y arginina arilamidasa: positivas. La Hidrólisis del
hipurato y reducción de nitratos son negativas.
Posee de 1 a 8 flagelos unipolares envainados, con un ensanchamiento en el
extremo distal. No es un microorganismo invasivo. Vive en el epitelio
gástrico antral y en las criptas gástricas; también, puede hacerlo en el epitelio
gástrico, vive de forma libre en el mucus, en la superficie de las células
epiteliales o en intersticio celular (Jones, 1985).
3.1.1 Taxonomía. Desde su cultivo en 1983, ha recibido diferentes
denominaciones hasta adquirir el nombre definitivo:
• CLO (Campylobacter like organism). (Owen, 1993)
• GCLO (Gastric Campylobacter organism). (Marshall, 1983)
• Campylobacter pyloridis. (Marshall, 1984)
• Campylobacter pylori. (Marshall .1987)
• Goodwin, en 1989, creó el género Helicobacter y desde entonces, se
denomina Helicobacter pylori aislándose diferentes especies, tanto
gástricas como no gástricas.
Las especies del género Helicobacter, se han dividido en las que viven en
el estómago y las que viven en el intestino, tanto del ser humano como de
animales. (Véase Cuadro 1).
El cultivo de la bacteria, se ha realizado en una amplia variedad de medios
sólidos y líquidos. Algunos autores, reportan buenos resultados utilizando
Agar Base Columbia, Agar Infusión Cerebro corazón o Agar Chocolate
suplementado con carbón activado y/o suero.
Cuadro 1. Especies del género Helicobacter relacionada con el huésped habitual y la patología asociada.
ESPECIE HUÉSPED
HABITUAL PATOLOGÍA ASOCIADA
Helicobacter pylori Hombre Gastritis crónica activa, asociación
con úlcera péptica y cáncer gástrico.
Helicobacter
mustelae Hurón No patógena o gastritis y úlcera
Helicobacter
nemestrinae Macacos No patógeno
Helicobacter
acinonyx Leopardo Gastritis
Helicobacter felis Gato Gastritis leve
3.1.2 Genética. Con las nuevas técnicas de estudios genéticos se logró en
1999, que fuera la primera bacteria, de la cual, se tienen dos secuencias
genómicas completas.
Posee 1.600 genes y, sólo un 7% de su secuencia está presente en una
cepa, pero, no en la otra (Alm, 1989).
Helicobacter pylori tiene gran variación genética e inicialmente, se
identificaron dos fenotipos básicos: el Tipo I que produce citotoxina
vacuolizante VacA y, el Tipo II que no la produce. (Parsonnet,1998. Axon,
1999).
Algunos investigadores, han encontrado que el tipo I se asocia más
frecuentemente a úlceras o carcinomas (Covacci, 1993), pero otros, han
encontrado igual prevalencia en pacientes con gastritis simple, úlceras
pépticas o cáncer. (Breuert, 1997).
El ADN de diferentes cepas de Helicobacter pylori contienen
aproximadamente un 34 a 38% de guanina y citosina. El tamaño del genoma
varía entre 1.6 y 1.72Mb y del 35 al 50% de las cepas de Helicobacter pylori,
contienen dos o más plásmidos usualmente pequeños (1.8 a 2.2 pKb) que no
han sido asociados con ninguna característica biológica de la bacteria.
(Tomb, 1997).
Se han clonado varios genes específicos entre los cuales, están los dos que
codifican las subunidades de la enzima ureasa; dos que codifican flagelina
llamados flaA y flaB; el gene productor de citotoxina VacA; un gene asociado
a la producción de citotoxina llamado CagA; un gene que codifica superóxido
dismutasa y un gene que codifica una proteína de shock térmico. (Tomb,
1997).
Figura 3. Representación gráfica, genoma Helicobacter pylori 26695. (Tomb nature, 1997; 388: 539-547)
3.2 EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori
Los estudios epidemiológicos sugieren que la infección por Helicobacter
pylori, está distribuida por todo el mundo pero, es mucho más común en los
países en desarrollo, donde más de la mitad de la población está infectada a
los 10 años y la prevalencia de la infección se eleva a más del 80% en los
adultos jóvenes. En los países desarrollados, hay un aumento gradual de la
prevalencia durante la vida, hasta llegar al 70% en la séptima década.
(Blazer,1990).
El factor de riesgo más importante relacionado con la diseminación de
Helicobacter pylori, además de la edad, es la precariedad socioeconómica.
El hacinamiento, la infravivienda, el agua contaminada y las familias
numerosas, han colaborado para la transmisión de H pylori.
La residencia en comunidades cerradas como hogares de discapacitados,
hospitales para enfermos crónicos u hogares infantiles, donde el contacto
entre los individuos es más estrecho de lo normal y las condiciones
higiénicas son deficientes, constituyen un factor más para la transmisión del
microorganismo
Figura 4. Esquema de los mecanismos involucrados en la transmisión de la infección (Klein, 1991).
Se ha postulado el agua y los animales como fuente transmisión de
Helicobacter pylori. La mucosa gástrica de personas y del mono, son los
reservorios naturales del microorganismo. La transmisión se da por vía oral.
Diseminación de persona a persona. (Klein,1991).
Pruebas a favor de la transmisión fecal- oral:
v Eliminación de H. pylori en heces.
v Capacidad de sobrevivencia en el agua.
v Evidencia epidemiológica de transmisión por agua.
Pruebas a favor de la transmisión oral-fecal:
v Capacidad de H pylori de colonizar la cavidad bucal.
Por sus diferentes condiciones geográficas, demográficas y
socioeconómicas, América Latina constituye una región especialmente rica
para estudios sobre la infección por H pylori. El índice de conservación de la
infección en el continente latinoamericano es alto, alrededor del 60%,
variando de 30 a 90%, dependiendo de las condiciones socioeconómicas de
la población. (Gonzaga,1999).
3.3 PATOGENICIDAD
Al tratarse de un microorganismo no invasivo, en su patogenia están
implicados factores difusibles generados por éste o por el huésped, en
respuesta a su presencia. Dichos factores, pueden dividirse en:
q Factores de persistencia que llevan a la colonización prolongada y la
supervivencia de la bacteria
q Factores inductores de la enfermedad, que causan el daño tisular.
(Moran,1996).
3.3.1 Factores de colonización y persistencia. Son aquellos que le permiten al microorganismo adaptarse y sobrevivir en la mucosa gástrica del hospedero, superando las condiciones adversas del medio.
• Motilidad
La bacteria es móvil debido a la forma helicoidal que se acentúa al moverse
a través del medio, lo cual, parece ser ventajoso para la colonización de la
mucosa gástrica. Sumado a ésto, la bacteria utiliza sus flagelos para
penetrar en la capa mucosa y adherirse al epitelio, ubicándose en la interfase
entre el epitelio y el moco. Los flagelos están formados por un filamento
central con una cubierta flagelar cuya función se desconoce, pero está
implicada en la persistencia y transporte. (Lee, 1993).
• Adhesión
El H. Pylori, generalmente, sobrevive dentro de la mucosa gástrica y no ataca
a las células del huésped. Una gran variedad de potenciales receptores
epiteliales para las adhesinas bacterianas ha sido descrita, y el reciente
análisis del genoma del H. pylori 26695 (Tomb,1997), ha revelado muchas
lipoproteínas y proteínas de la membrana externa, con un probado rol en los
mecanismos de adhesión.
El H. pylori puede usar al menos cinco diferentes adhesinas para un ataque
exitoso a la célula del epitelio gástrico. Una atractiva teoría dice que “la
diversidad genética del huésped y el H. pylori generan varias combinaciones
de adhesinas y receptores adentro y entre las personas infectadas, que
determinan si el H. pylori ataca al epitelio o se mantiene en el mucus
gástrico”. La mayoría parece estar libres en la capa mucosa; algunas,
parecen adherirse a las células epiteliales de la mucosa y otras se observan
en las uniones intercelulares (Tomb, 1997).
La preferencia de H. pylori por ciertas áreas puede representar micro
ambientes específicos caracterizados por diferentes receptores, con las
cuales, puede interactuar la bacteria. (Hessey, 1990). En la actualidad, se
han identificado una variedad de moléculas que probablemente actúan como
adhesinas, entre ellas, una hemaglutinina fibrilar, una proteína de 31 kD y
una proteína de 1906KD. (Kamisago, 1996).
Figura 5. Principales mecanismos de virulencia
• Actividad ureasa:
La enzima consta de dos subunidades (61 y 27 Kd) y está localizada sobre la
superficie del organismo (mediante iones divalentes) y en el citoplasma.
Aparentemente, posee dos valores de pH óptimos, uno de los cuales,
corresponde al pH gástrico pH (3.0); tiene una alta afinidad por el sustrato,
cataliza rápidamente la hidrólisis de la urea y es sensible a los inhibidores de
ureasa conocidos. Gracias a ello, la bacteria es capaz de rodearse de NH4+,
protegiéndose del medio ambiente, una vez dentro de la capa de mucosa
gástrica, continúa produciendo ureasa y por ende NH4+, lo cual, puede ser
tóxico para la mucosa induciendo vacuolización del epitelio. (Meyer –
Rosberg, 1994). Esta actividad, es la base de varias pruebas diagnósticas.
3.3.2 Factores inductores de enfermedad
• Citotoxina Vacuolizante
Los determinantes de la virulencia de H. Pylori, incluyen la citotoxina
vacuolizante vac A (codificado por el gen vacA ) con 3864 pb que codifica
una proteína de 139 Kd (Leunk, 1991), la cual, sufre un clivaje amino y
carboxilo terminal y se convierte en la citoxina de (90 Kd), que se organiza en
un complejo de 12 monómeros, inductor de vacuolización.
La proteína se activa a pH bajo y es resistente a varias proteasas. Interactúa
con varias ATPasas de las células parietales y puede alterar la secreción de
ácido gástrico. (Cover, 1992).
Todas las cepas de H. pylori, presentan el gen vagA, pero sólo, alrededor del
50% produce la citotoxina que induce vacuolización de células eucariotas
(tox +).
Sin embargo, solo una minoría de infectados desarrolla enfermedad
ulcerosa. Ésto, podría ser debido a que el gen vacA que codifica la citotoxina
tiene una estructura en mosaico con tres posibles formas de presentación en
la secuencia señal (S1a, S1b, S2) y, dos en la región media (m1 y m2) y de
su combinación, se podrían generar determinados genotipos que tendrían un
comportamiento más agresivo, (Atherton, 1995). Todos los aislamientos
clínicos de H. pylori presentan una de las seis posibles combinaciones en
mosaico del gen, a excepción de S2/m1 que hasta el momento, no ha sido
descrita por ningún grupo de trabajo. (Atherton, 1995).
Existen diferencias individuales en la sensibilidad del huésped a una
determinada cepa de H. pylori. Las cepas de H. pylori difieren en su
capacidad para colonizar el huésped atendiendo a su genotipo; así, las
cepas S1/m1 son más citotóxicas que las S1/m2, no habiéndose detectado
citotoxicidad en las cepas S2/m2, las cepas S1/m1, especialmente S1a, se
aíslan con más frecuencia en enfermos con úlcera péptica y también, están
relacionadas con la expresión del gen cagA, considerado como marcador de
Patogenicidad. (Ito, 1997).
Figura 6. Imagen del efecto vacuolizante producido por la toxina en cultivos celulares. (Atherton, 1997).
La citotoxina induce la formación in Vitro de vacuolas intracitoplasmáticas en
células de mamíferos debido al estímulo de la bomba de protones. La diana
de la citotoxina de H. pylori es una ATPasa intracelular que debido a su
estimulación produce un gradiente de pH, atrayendo sustancias alcalinas
que, al ser tamponadas en el interior de la célula, captan agua por ósmosis,
lo que origina en un principio la vacuolización alrededor del núcleo y
finalmente, el estallido y la muerte celular (Atherton, 1997). Sustancias
básicas como el amonio y la nicotina potencian la actividad vacuolizante in
vitro de la citotoxina, lo que podría explicar la mayor prevalencia de úlcera
duodenal en pacientes fumadores.
• Proteína CagA
La presencia de la actividad citotóxica vacuolizante, está frecuentemente
asociada con un antígeno cuyo peso varía entre 110 y 128 KD denominado
CagA (codificado por el gen cagA). (Xiang,1995).
Diversos estudios de biología molecular (Van Door,1998), demuestran que
entre el 60 y el 70% de las cepas de H. pylori poseen el gen cagA y de este
porcentaje, prácticamente, todas expresan la proteína codificada por este
gen.
A diferencia de la secuencia señal y del marcador de Patogenicidad cagA, la
región media no se ha demostrado implicada en un mayor poder
gastrolesivo. (Strobel,1998).
• Islote de Patogenicidad (PAI)
Recientemente, se ha reportado que las bacterias aisladas de pacientes con
cáncer gástrico y úlcera péptica, contienen una inserción de DNA, que ha
sido denominada islote de Patogenicidad (PAI) que no está presente en
bacterias aisladas de individuos con la infección asintomática (Segal,1997).
Este fragmento, contiene 22 marcos de lectura abierta (ORF) codificadas en
40 KD e incluye la secuencia codificadora de Cag A. La mayoría de las
proteínas que presumiblemente están codificadas en este segmento,
parecen estar asociadas a las membranas y tienen características similares a
sistemas de secreción de toxinas conocidas.
Cuadro 2. Factores que deterioran la integridad de la mucosa (Dunn, 1990)
• Otros mecanismos Patogénicos
La mucosa gástrica formada por células epiteliales y un gel de mucina,
representa una barrera que protege al tejido submucoso del ácido gástrico.
La disminución en la integridad de la mucosa permite la difusión de iones H+,
que ocasiona daños en el tejido submucoso y formación de úlceras. Los dos
principales mecanismos que llevan a una disminución de la integridad
mucosa incluyen la elaboración de citotóxicas y la inducción de la
inflamación. (Dunn,1990).
• Respuesta Inmune Humoral
Se ha documentado, que los individuos infectados producen Anticuerpos (Ac)
específicos que reconocen e inactivan dichos componentes antigénicos; la
presencia de Ac es un reflejo de la interacción entre el huésped y la bacteria,
así, que el análisis del papel Ac sirve como un indicativo del papel
patogénico de H. pylori.
Existe una respuesta de Ac específicos contra la bacteria (medible en suero)
que se ha utilizado como diagnóstico en los estudios epidemiológicos,
inclusive, se ha descrito una correlación entre los niveles de IgG específicos
contra la bacteria y la severidad de la gastritis antral y la densidad de la
colonización. También, se ha encontrado que las concentraciones de Ac
hacia H. pylori están asociadas con una alta prevalencia de ulceración
duodenal y un mayor riesgo de desarrollar carcinoma gástrico.
En pacientes con gastritis atrófica, meteplasia intestinal o carcinoma, la
seropositividad es un indicativo de infección previa, aunque histológicamente
no se detecte la bacteria. En estos casos, se mantiene una respuesta de IgA
de mucosa debida probablemente a estimulo no específico mediado por
citoquinas como (IL-6) en respuesta a otros Gram. negativos que colonizan el
estómago con hipoclorhidria . Otra hipótesis, es que existen epítopes de
reacción cruzada entre la mucosa y las bacterias que mantienen la respuesta
especifica contra la bacteria, cuando incluso ésta, se encuentra ausente
debido a la atrofia gástrica. (Loffeld,1990).
La respuesta específica de IgA, tanto local como sistémica, consiste
principalmente de la subclase uno (IgA1). La respuesta IgG sistémica
involucra las cuatro subclases de IgG y aunque se ha observado que los
pacientes con gastritis y úlcera responden con diferentes subclases de IgG,
se desconoce si esto, se relaciona con el hospedero a la cepa bacteriana.
(Eurogast Study Group,1993).
3.4 PATOLOGIAS ASOCIADAS A LA INFECCIÓN
3.4.1 Gastritis. Después de la ingestión del microorganismo, hay un
periodo de intensa proliferación bacteriana e inflamación gástrica
acompañada de hipoclorhidria. Estos eventos pueden durar meses. Según
modelos animales, durante este período hay eliminación fecal facilitando su
transmisión, luego la respuesta inflamatoria disminuye hasta alcanzar un
nivel que se estabiliza como gastritis crónica, inicialmente, es de tipo
superficial “Gastritis crónica superficial” (GCS). (Correa,1994).
El hospedero monta una respuesta no humoral que no es efectiva, se
restaura el pH gástrico normal y las personas infectadas se hacen
asintomáticas a pesar de mantener una población bacteriana activa. Ésta, es
la forma persistente por años o décadas y parece predominar en la
población. (Gonzaga, 1999).
Figura 7. Aspecto endoscópico de la gastritis (Graham, 1994)
GASTRITIS CRÓNICA PROFUNDA
Con el pasar del tiempo, la infiltración celular de la gastritis penetra
profundamente entre las glándulas gástricas ocasionando una “gastritis
crónica profunda“(GCP). El hospedero monta una respuesta no humoral que
no es efectiva, se restaura el pH gástrico normal y las personas infectadas se
hacen asintomáticas a pesar de mantener una población bacteriana activa.
Ésta, es la forma persistente por años o décadas y parece predominar en la
población (Graham,1994). Cuando GCS y GCP afectan particularmente el
antro gástrico, las células D, secretoras de somatostatina, son más
intensamente destruidas que las células G, productoras de gastrina, llevando
a hipergastrinémia.
Tipo A: Que se localiza fundamentalmente a nivel del cuerpo gástrico
y suele acompañar a la anemia perniciosa. Ésta, respondería en su
génesis a mecanismos autoinmunes.
Tipo B: De localización antral (antritis), que suele asociarse a úlcera
duodenal y presenta una fuerte asociación con la infección con
Helicobacter pylori.
Este descontrol entre la producción de gastrina y somatostatina parece
conducir a la siguiente secuencia de eventos: Secreción gástrica preservada
o menos elevada, aumento de la cantidad de ácido que entra en el duodeno,
metaplasia gástrica en la mucosa duodenal que es, entonces, colonizada por
H. Pylori proveniente del estómago, lesión del epitelio mucoso del duodeno
(como se describió anteriormente para la mucosa gástrica), difusión de iones
de hidrógeno, duodenitis y úlcera duodenal (Hatz, 1996).
Tanto la GCS como la GCP corresponden a etapas no atróficas de la
gastritis. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, ellas pueden progresar
para la “gastritis crónica atrófica”, (GCA). En esta secuencia, la GCP pasa a
ser la etapa intermediaria entre las GCS y GCA. Semejante, a lo que se
había visto en la etapa anterior, preatrófica de la gastritis autoinmune
abarcando el cuerpo del estómago, se observa que los linfocitos, presentes
en el infiltrado inflamatorio de la GCP, del tipo citotóxico, adhieren a las
glándulas gástricas y la destruyen, llevando a la GCA (Hatz, 1996).
FIGURA 8. PATOLOGÍAS ASOCIADAS A LA INFECCIÓN POR H. PYLORI
(CHEN, 1994)
3.4.2 Úlcera péptica. Al momento actual, la mayor evidencia de que el
Helicobacter sería un agente de peso en la génesis de la úlcera péptica,
estaría dada por diversos estudios que se han seguido a pacientes que
padecían de enfermedad ulcerosa, a quienes además de realizárseles el
tratamiento convencional para su enfermedad, se les administró un esquema
terapéutico utilizando drogas bactericidas y/o bacteriostáticas, con el fin, de
eliminar el germen (Chen, 1994).
Sin embargo, no puede asegurarse que el microorganismo sea el
responsable directo y/o único factor involucrado.
Los estudios hasta el momento realizados, revelan una fuerte asociación
entre la colonización por el Helicobacter pylori y la gastritis antral crónica
(mayor del 80%), así como entre ésta y la úlcera duodena l o su recidiva (casi
100 %) y la úlcera gástrica. (Valenzuela, 996).
3.4.3 Ulcera Duodenal. En ausencia de medicamentos ulcerogénicos, la
úlcera duodenal ocurre casi exclusivamente en personas infectadas por H.
pylori. Algunos estudios sugieren que H. pylori y la úlcera duodenal están
asociadas a través de una producción excesiva de gastrina que ocurre
durante la infección y trae como consecuencia un aumento en la producción
de ácido. (Valenzuela,1996).
Además, todos los pacientes con úlcera duodenal tienen metaplasia gástrica
en el duodeno, lo cual, provoca daños en las células pluripotenciales para
que se diferencien en epitelio gástrico en lugar de diferenciarse en epitelio
Intestinal. Los cambios inflamatorios del epitelio metaplásico en el duodeno
(Urakami, 1997); las lesiones ocasionadas por la presencia de la bacteria y
otras alteraciones descritas en úlcera duodenal como la hipersecreción basal
y/o estimulada de ácido, (Sachs, 1997); el aumento en los niveles de gastrina
y pepsinógeno (Beales, 1997); la menor producción de bicarbonato y la
susceptibilidad genética, serían los factores más importantes implicados en la
génesis de la úlcera. (Gutiérrez,1993).
3.4.4 Úlcera gástrica. Los estudios publicados entre 1984 y 1989 reportan
prevalencia de infección entre un 44 y un 100% de los casos de úlcera
gástrica (O´connor,1992). A pesar de que la bacteria está asociada
directamente con úlcera duodenal y gastritis, se ha sugerido que su papel en
la ulceración gástrica es indirecto y está mediado por la atrofia gástrica.
Leunk (1991), propone que el daño epitelial inducido por Helicobacter es una
“lesión precursora de la úlcera gástrica y que la gastritis crónica atrófica y la
úlcera gástrica son parte de un mismo espectro patológico”. El proceso
comienza probablemente, cuando la bacteria coloniza y ataca la mucosa
gástrica. Su primer efecto patológico, es el daño a los segmentos mucosos
apicales de las células epiteliales.
Esto, va seguido por la pérdida de algunas células y por microerosiones, que
ocasionan inflamación y la gastritis crónica consecuente. El proceso
ulcerativo probablemente comienza en el foco (o focos) donde el daño
epitelial es más severo; la probabilidad de ulceración aumenta con la
densidad bacteriana, durante la colonización por Helicobacter y la severidad
local de la degeneración epitelial. (LeunK, 1991).
3.4.5 Cáncer gástrico Desde el punto de vista histopatológico el carcinoma
gástrico puede clasificarse en dos tipos:
1. El intestinal, cuya etiopatogenia esta relacionada con Helicobacter
2. El difuso (menos frecuente), cuya etiopatogenia es desconocida.
La infección con Helicobacter, resulta ser un determinante en la aparición de
gastritis crónica que evoluciona hacia la atrofia y eventualmente hacia la
metaplasia intestinal y, si se considera ésta, como lesión pre-neoplásica
(sobre la que podrían acentuar distintos grados de neoplasias) se podría
asumir que la presencia del microorganismo estaría más o menos
relacionada con la mayor probabilidad de desarrollar una neoplásia gástrica
de tipo intestinal. (Kuipers, 1996).
Figura 9. Secuencia de eventos que conducen al linfoma tipo malt
3.4.6 Linfoma tipo malt. El estómago normalmente no contiene
tejido linfoide organizado, pero, en respuesta a la infección por
helicobacter aparece un tejido linfoide asociado a la mucosa gástrica
(malt) que es semejante a las placas de peyer del intestino. Este tejido,
puede convertirse en un linfoma gástrico de células B de bajo grado, se
ha demostrado que casi el 90% de tales linfomas están asociados con
infección por la bacteria y se ha observado que hay regresión del tumor
después de la erradicación de la infección(Kuipers, 1996).
3.5 DIAGNÓSTICO
Actualmente, se dispone de varias técnicas para el diagnóstico de la
infección; en general, se podría diferenciar en dos grupos: las hospitalarias y
las disponibles en atención primaria. En las primeras, se utilizan biopsias de
estómago obtenidas por endoscopia (Véase Figura 10), las cuales, son
sometidas a exámenes diagnósticos tales como: histología, cultivo bacteriano
o la prueba rápida de la ureasa, prueba en la que se fundamenta este trabajo
dentro del cual tiene un capítulo aparte donde se amplía y se presenta en
detalle su descripción. . Las segundas, se refieren a exámenes no invasivos
como lo son: serología, prueba del aliento, técnicas de biología molecular,
determinación serológica del 13C – bicarbonato, cultivo en heces.
Figura 10. Métodos de detención de Helicobacter pylori (Drumm, 1990)
Cuadro 3 Técnicas diagnósticas ante la infección por Helicobacter pylori según sensibilidad y especificidad (Cuttler, 1995) TÉCNICA SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD
HISTOLOGÍA 93 - 96% 98 - 99%
CULTIVO 80 - 98% 100%
TEST DE UREASA 88 - 95% 95 - 100%
SEROLOGÍA (ELISA) 86 - 94% 78 - 95%
TEST DE ALIENTO CON UREA 90 - 96% 88 - 98%
PCR 95 – 100% 95 - 100%
En la práctica, la elección de una prueba viene determinada por su
accesibilidad, pertinencia y costo. En este caso, la endoscopia con biopsia es
utilizada mayoritariamente para el diagnóstico de la infección por
Helicobacter pylori, seguida por el Test del aliento con urea y la serología del
laboratorio. Son precisamente la endoscopia con biopsia y el test del aliento,
las pruebas consideradas como gold standard para determinar la infección
por Helicobacter pylori y valorar la curación y erradicación.
En la actualidad, ante un paciente dispéptico el estudio diagnóstico puede
incluir la realización de una endoscopia o bien un proceso de "test and treat"
(prueba indirecta y tratamiento específico), aunque debe recordarse que la
investigación del Helicobacter pylori debe realizarse exclusivamente en
aquellos pacientes que vayan a recibir terapia erradicadora si se confirma su
positividad. Un paciente dispéptico con historia de úlcera duodenal previa
conocida podría recibir terapia erradicadora empírica, dada la prevalencia de
infección por H. pylori, aunque clásicamente se incluye la recomendación de
realizar en estos casos, al menos una prueba indirecta, como serología o
prueba del aliento. Un paciente dispéptico con úlcera gástrica conocida
previa debería someterse a un estudio endoscópico para delimitar la
organicidad del cuadro y excluir un posible proceso neoplásico.
En todo caso donde las pruebas directas fuesen negativas o no estuviesen
indicadas, las alternativas serían los métodos indirectos como la serología o
la prueba del aliento . Uno de los aspectos debatidos en la literatura es la
necesidad de la comprobación del éxito de la terapia erradicadora prescrita.
Se ha señalado que en los casos de úlcera duodenal no complicada y en
pacientes dispépticos con resolución clínica, no sería precisa la confirmación
del estado post-erradicación, mientras que en úlceras complicadas,
ulceración gástrica, linfoma tipo MALT, dudas en la adherencia terapéutica
del paciente, pauta erradicadora de discutible eficacia o ante situaciones de
infección por H. pylori resistentes sería ineludible dicha comprobación
posterradicación. La confirmación del éxito erradicador tiene como prueba
de elección al Test del aliento, aunque en casos de complicaciones del
cuadro clínico (por ejemplo. Hemorragia en úlcera duodenal), úlcera gástrica
y linfoma MALT es imprescindible el estudio endoscópico.
Figura 11. Toma de la biopsia
• Pruebas Invasivas
Cultivo: Inicialmente se sugirió el cultivo como patrón de oro (Cuttler,1995),
pero, el valor predictivo negativo es bajo, con una alta tasa de los falsos
negativos, por la probabilidad de tomar la biopsia en una zona de la mucosa
no colonizada, o con bacterias con reducida viabilidad, por la lidocaina
utilizada habitualmente en la endoscopia (Godwin, 1990). Además, la
muestra requiere condiciones especiales de transporte e incubación, de difícil
cumplimiento que pocos laboratorios pueden asumir (Iegg,1995).
Por otro lado, el resultado que puede tardar hasta 12 días, lo inhabilita para
el diagnóstico rápido. La utilidad del cultivo radica, a nivel experimental, en
determinar la resistencia bacteriana a los antibióticos usados en el
tratamiento, que lamentablemente se hace cada vez más frecuente. Se ha
informado de resistencia hasta del 15% para claritromicina (Mégraud,1997),
en algunas partes del mundo y cifras mayores para los imidazoles, que
puede ser completa en países en desarrollo, como lo afirman algunos
reportes clínicos (Glupczinsky,1992),
Figura 12. Imagen de colonia de Helicobacter pylori, en cultivo
Histología: Después de la reunión de consenso de Sydney (Mobley, 1998) y
de la revisión posterior de 1994 (Dixon,1996), la clasificación conocida con el
nombre de esta ciudad, ha facilitado el análisis histológico de las lesiones de
la mucosa gástrica y ha establecido los parámetros para informar la
presencia de H. pylori, clasificándola en cuanto a su densidad, en leve,
moderada e intensa.
Para su identificación, existen numerosos métodos especiales de tinción,
todos con un índice de sensibilidad, cercanos al 95% en promedio
dependiendo en alguna medida de la experiencia del patólogo (Koits,1993).
Las más utilizadas por su costo, son hematoxilina-eosina y Giemsa, esta
última, con una excelente sensibilidad y especificidad. Otras, como la de
Warthing-starry (Cuttler, 1995 y Genta, 1994), que han demostrado gran
precisión, son de mayor costo, más elaboradas e implican la manipulación de
reactivos de alta toxicidad.
Figura 13 Tinción wartin-starry de helicobacter pylori (Cutter, 1995)
La coloración habitual de Hematoxilina-Eosina, que es la más económica,
además de identificar al H. pylori, simultáneamente da información sobre el
grado del compromiso inflamatorio y en adultos la evolución de procesos
atróficos o malignos, es la de menor sensibilidad y especificidad para
detectar H. pylori y la experiencia del patólogo es más determinante
(Koits,1993)
Reacción en cadena de Polimerasa PCR. La PCR es un método de alta
sensibilidad y especificidad, capaz de detectar cantidades tan bajas como
una sola bacteria. Es por esto, que se ha sugerido como patrón de oro, pero
hasta el momento solo se dispone de ella a nivel experimental. Tiene varias
limitaciones: es costosa, el resultado no es inmediato, requiere una solución
buffer especial para depositar la muestra de tejido y congelarla hasta su
determinación y exige un laboratorio de alta tecnología. A su favor, cuenta
con la ventaja de poderla utilizar también con muestras de jugo gástrico,
saliva, placa dentaria y heces, convirtiéndola en una prueba no invasiva.
(Mégraud,1997).
• PRUEBAS NO INVASIVAS
La ventaja de evitar una endoscopia, disminuir el costo del procesamiento de
las muestras o acelerar un resultado, (excepción hecha con el test de
ureasa), hace que estas pruebas sean de gran aceptación para detectar la
presencia del H. pylori, sobretodo en pediatría, pero, limitadas solo a
estudios epidemiológicos y a la confirmación de la erradicación de la bacteria
después del tratamiento específico, y no deben utilizarse para el diagnóstico
de la enfermedad ácido-péptica. La principal característica de las dos
pruebas existentes, es la de detectar globalmente la presencia del H. pylori,
evitando los falsos negativos de los métodos invasivos basados en la
biopsia.
Serología: A pesar de que H. pylori no hace contacto con el tejido, es capaz
de desencadenar una severa inflamación en la mucosa gástrica y provocar
en sangre una reacción de anticuerpos de diferente intensidad y cuantificable
en forma viable. La sensibilidad y especificidad depende del antígeno
utilizado, de la mezcla de las cepas empleadas en su preparación y de la
respuesta inmunológica que logre generar en el huésped (Mégrad,1997).
Las numerosas pruebas disponibles, se basan en una técnica de ELISA que
detecta niveles de IgG, inmunoglobulina que tiene una respuesta más
intensa, que la de IgA o IgM. El resultado rápido y la fácil realización son las
principales ventajas de esta prueba. La variable respuesta en cada paciente
y la heterogeneidad de las cepas constituyen sus limitaciones.
Su utilidad radica en el estudio epidemiológico de grupos poblacionales y en
el seguimiento después de tratamiento (Mégraud,1997), con una sensibilidad
y especificidad cercana al 91% en promedio para ambas( Cutter, 1995).
Test de Urea Espirada: Al igual que el test de ureasa, éste se basa también
en la hidrólisis de la urea; al administrar urea marcada con 13C o 14C, la
ureasa de H. pylori, si está presente en la mucosa gástrica, la descompone y
el CO2 liberado y marcado, difunde a través de la mucosa, se elimina por el
alvéolo y el carbono presente en el aire espirado se detecta por
espectrofotometría de absorción atómica (Gasbarrini,1998). La prueba sin
riesgo para el paciente, se realiza con 13C, no radiactivo, presente en
cantidades mínimas pero variables en los alimentos en forma natural, por lo
que al realizar la prueba, antes de administrar la urea marcada, se debe
tomar una muestra basal. La prueba es positiva cuando la diferencia o delta
entre las dos determinaciones es mayor de cinco (Hamilton,1998). Su
principal uso, fuera de los estudios epidemiológicos, se circunscribe al
seguimiento de pacientes después de tratamiento. En la teoría, es una
prueba que se acerca a lo ideal; no se necesita endoscopia, evalúa la
presencia del H. pylori globalmente evitando los falsos negativos del
muestreo por biopsia, y determina el estatus de H. pylori a las cuatro
semanas de terminado el tratamiento (Mégraud,1997) aventajando a la
serología que lo hace solo después de 6 meses (Figueroa,1996).
La decisión de renunciar o no a la biopsia depende de el concepto emitido
por cada gastroenterólogo, aunque el estómago sea macroscópicamente
normal. Si se diagnostica infección por H. pylori en un paciente con dispepsia
funcional, es difícil retrasar la terapéutica de erradicación con el argumento
que la gastritis superficial no causará daño alguno. Lo más probable es que
no lo cause, pero nunca puede darse una seguridad absoluta.
3.6 TRATAMIENTO
Algunos médicos ofrecerán tratamiento de erradicación a los pacientes que
reciben AINE o que van a empezar a recibirlos, aunque no se dispone de
pruebas formales sobre su eficacia.
Es preciso confirmar los informes de aumento de la incidencia de gastritis
atrófica con los inhibidores de la bomba de protones (IBP) administrados a
largo plazo para la enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE) antes de
aceptarla como indicación definida del tratamiento contra H. pylori.
El cáncer gástrico precoz, los antecedentes familiares de cáncer gástrico o la
presencia de anomalías de la mucosa gástrica como metaplasia intestinal,
displasia, hipertrofia rugal gigante o gastritis erosiva, también puede impulsar
a administrar el tratamiento para H. pylori.
El Helicobacter pylori in vitro es sensible a los beta lactámicos, macrólidos,
nitrofuranos, quinolonas, metronidazol y tinidazol, pero los resultados in vivo
difieren. El antimicrobiano ideal probablemente sea aquel que tenga acción
sistémica y local gástrica, que sea estable dentro de una amplia variación de
pH y que pueda penetrar el mucus.
La inhibición de la secreción ácida por ejemplo con inhibidores de la bomba
de protones (IBP) eleva el pH intragástrico a cinco o más y reduce
notablemente la concentración inhibitoria mínima del 50% CIM50 de algunos
antibióticos (como la claritromicina), lo que hace que sean más eficaces.
Regímenes terapéuticos. A semejanza con lo observado en otras regiones
del mundo, entre las combinaciones terapéuticas con mejor eficacia, diversos
estudios realizados en Latinoamérica confirman que la combinación de un
inhibidor de bomba protónica, asociado a la claritromicina y amoxicilina, de
acuerdo con el esquema a seguir, es el que produce mejores índices de
erradicación. (Correa,1994).
Figura 14. Diagrama plan de tratamiento
4 Test rápido de ureasa
El método mas generalizado por lo práctico, rápido sensible, especifico y
poco costoso, (excluyendo la endoscopia), es la determinación de la
actividad de ureasa en material de biopsia, en el mismo momento de la
endoscopia.
4.1 ENZIMA UREASA DE Helicobacter pylori
Las ureasas, son metaloenzimas que contienen níquel y catalizan la hidrólisis
de urea para formar ácido carbónico y amonio, constituyendo este último una
fuente preferencial de nitrógeno para muchas bacterias.
Debido a la generalizada presencia de urea en la naturaleza, la capacidad de
sintetizar ureasas, está ampliamente extendida entre microorganismos de la
familia Enterobacteriaceae. Actualmente, se conoce la secuencia completa
de la agrupación génica de cinco especies, incluyendo Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis, y Helicobacter pylori y, parcialmente, en otras
bacterias. En las especies estudiadas hasta ahora, la síntesis de ureasa
requiere al menos siete genes que se localizan agrupados en el genoma
(Sachs, 200).
Los genes ureA, ureB y ureC codifican las subunidades estructurales α, β y
gamma de la ureasa, respectivamente. Los genes ureD, ureE, ureF y ureG
codifican proteínas accesorias cuya función exacta no se conoce, aunque
parecen estar implicadas en la incorporación de níquel en la apoenzima
(Sachs, 200).
La ureasa extracelular purificada a partir de H. pylori tiene un pH óptimo
entre 7 y 8, pierde toda actividad a pH 5.0; en contraste, las bacterias vivas
tienen una actividad de ureasa intracitoplasmática, con baja actividad a pH 7,
pero, que muestran un progresivo incremento en la producción de CO2 o
amonio en ambientes con niveles de pH menores de 5.0 o aun hasta 3.0.
Este fenómeno desaparece cuando la bacteria muere o es afectada la
integridad de su membrana (Sachs, 2000).
La urea en concentraciones fisiológicas (1-3 mml/L) penetra pobremente en
el H pylori vivo en medios con pH neutral, pero, muy eficientemente en
medios con pH ácido. Existen fuertes evidencias de que la entrada de urea
es facilitada por la producción de una proteína de membrana sensible al pH,
codificada por un miembro de la familia de genes de la ureasa conocida
como UreI. Es así, como los H. Pylori con deleción de UreI no pueden
sobrevivir en un medio ácido.
UreI es una proteína de membrana interna con 6 segmentos
transmembranales, los cuales, son visibles por transcripción/traducción in
vitro y por separación de membrana. El transporte mediado por UreI es
específico para urea, pasivo, no saturable, no electrogénico e independiente
de la temperatura.(Sachs, 2000).
UreI, funciona como un canal de transporte de la membrana para la urea,
dependiendo de la concentración de hidrógeno, el cual, regula la ureasa
citoplasmática que es esencial para la colonización y supervivencia de H.
pylori en el estómago (Walsh, 2000).
UreI a pH bajos, permite el paso de urea del exterior hasta el citoplasma,
permite que se active la ureasa intraciplasmática, con la cual, se neutraliza
este bajo pH. Este canal, es mucho menos activo en pH neutro (baja
concentración de hidrógeno, por ejemplo durante la digestión, de manera que
se evita la alcalinización excesiva. Lo anterior, explica cómo la bacteria
puede habitar en un medio como el estómago humano y sugiere que la
inhibición efectiva de Urel podría llevar a la erradicación del microorganismo
en el estómago normal secretor de ácido.
4.2 FUNDAMENTO DEL TEST RÁPIDO DE UREASA
En esta prueba se aprovecha la capacidad del H pylori para producir ureasa,
una de sus principales características, que al hidrolizar la urea presente en la
mucosa gástrica, la convierte finalmente en CO2 y NH3; este último,
alcaliniza el medio y el cambio de pH es detectado por un indicador de color
(rojo fenol), que acondicionado al medio, hace virar el amarillo inicial del agar
al magenta (Hazell, 1987).
Figura 15. Principio prueba de Ureasa
Al evidenciar la actividad de ureasa, se está demostrando indirectamente la
presencia de la bacteria en el tejido. El tiempo de aparición y la intensidad
del color, son directamente proporcionales a la cantidad de bacterias
(densidad), presentes en la muestra (Rieg,1995).
La densidad de Helicobacter pylori en la mucosa aumenta con la edad;
generalmente, los adultos presentan concentraciones altas de ureasa y la
reacción se establece en término de minutos y el color es intenso; pero, en
niños debe esperarse 24 horas, antes de concluir, con cualquier cambio de
color, que la prueba es negativa.
La sensibilidad está entre 86 y 98% y la especificidad entre el 95% - 100%
(Cuttler, 1995), lo que determina que sea también alta la probabilidad; que
una prueba positiva esté identificando a los realmente colonizados y que los
casos falsos negativos, se presenten al tomar muestra de tejido sano en las
que está ausente el H pylori, a causa de las características de la colonización
segmentaría o en parches, como ocurre en el cultivo; los pocos falsos
positivos se dan por la presencia, poco probable, de bacterias contaminantes
como el Proteus que tienen también ureasa, aunque menos potente (Mobley,
1988).
4.3 PROCEDIMIENTO PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRUEBA
Para la toma de la muestra, la biopsia gástrica se suspende en 200 µl de una
solución de urea y rojo fenol; la actividad ureasa en las muestras de biopsia
es detectada por un incremento del pH, causado cuando la enzima por medio
de la hidrólisis convierte la urea en amoniaco y CO2.
Lo anterior, induce a un cambio de color del indicador rojo fenol, en cultivo
amarillo a rojo, que define la reacción como positiva; el viraje ocurre
generalmente dentro de la primera hora, pero, puede retrasarse hasta el día
siguiente, su sensibilidad y especificidad son comparables con otras pruebas
diagnósticas siempre y cuando se tome la muestra en forma adecuada; Un
problema adicional, lo constituye la posibilidad de falsos positivos debido a
pinzas de biopsia o endoscopios contaminados.
4.4 ALGUNAS PRUEBAS EXISTENTES EN EL MERCADO MUNDIAL
Actualmente, se trabaja con pruebas optimizadas como el CLOtest y
PYLORITEK, las que funcionan de forma similar, básicamente, se trata de
unas tiras que contienen el sustrato que reacciona con la adición del
espécimen gástrico evidenciando de esta manera el ión amonio con el
cambio de color.
Figura 16. PYLORITEK®
La prueba de PYLORITEK® es una prueba rápida de ureasa basada en la
tecnología patentizada de reactivos secos. La prueba PYLORITEK®, detecta
la ureasa, la cual, es producida en grandes cantidades por Helicobacter
pylori. En la almohadilla de sustrato de la prueba PYLORITEK® la urea
reacciona con ureasa en una biopsia positiva de H. Pylori para crear el gas
amoniaco El gas amoniaco pasa a través de la membrana semi-porosa y
ocasiona que un color azul oscuro o púrpura aparezca en el papel amarillo
de pH directamente sobre la biopsia infectada con H. pylori.
Procedimiento para la realización de la prueba
1. Escriba el nombre del paciente y la hora en la tira del reactivo. De vuelta a
la tira. Agregue 4 gotas del Reactivo Hidratado a la almohadilla de
substrato.
2.
Figura 17. PYLORITEK®. Paso 1.
3. Poner las muestras en la almohadilla de reacción, dejando ¼" o más del
punto rojo, el cual, es el control positivo.
Figura 18. PYLORITEK®. Paso 2
4. Doble la almohadilla de sustrato de manera que quede sobre la
almohadilla de reacción, con la parte amarilla hacia afuera.
5. En 60 minutos, observe en la almohadilla de reacción color amarilla una
mancha azul intenso, el cual, es el control positivo.
Figura 19. PYLORITEK®. Paso 3
Figura 20. PYLORITECK®. Resultados positivos
Resultados Negativos
El resultado negativo, es confirmado solamente al final de una hora.
Figura 21. PYLORITEK®. Resultados negativos
Esta prueba, se caracteriza por:
• Tener control positivo y negativo en cada tira de prueba.
• Resultados finales en una hora.
• En cada tira de prueba se pueden tomar 1, 2 y hasta 3 biopsias del
mismo paciente.
• La prueba puede estar hasta 3 meses a temperatura ambiente. La
prueba se realiza a temperatura ambiente.
• El promedio de especificidad es 97% y sensitividad de 96% en cuatro
importantes estudios efectuados (565pacientes) (Wash, 200).
Figura 22. CLOtest (sigla del termino en ingles Campylobacter like organism)
El CLOtest, se basa en la acción de la potente enzima ureasa producida por
H. pylori, que hidroliza la Urea para dar amoniaco. Se coloca una sola
biopsia gástrica en el pocillo de un portaobjetos de prueba de CLOtest
(Figura 22). Un cambio del colorante indicador del pH de amarillo a rosa en
una hora indica un resultado positivo. Pueden producirse falsos positivos a
causa de otros microorganismos que producen Ureasa Streptococos y
Staphylococos.
5 PLANEAMIENTO Y CONTROL DE LA PRODUCCIÒN
El control de la producción comprende la organización, el planeamiento, la
comprobación, de los materiales, los métodos, las herramientas, los tiempos
de las operaciones, la formulación de programas su despacho o distribución.
Se garantiza que el suministro y el movimiento de los materiales, las
operaciones de mano de obra, la utilización de las maquinas y las
actividades afines de los departamentos de la fábrica, como quiera que se
hayan subdividido, produzcan los resultados de fabricación apetecidos desde
el cuádruple punto de vista de la cantidad, la calidad, el tiempo y el lugar
(Alford,1953).
5.1 FUNCIONES DEL CONTROL DE LA PRODUCCIÓN
Puesto que no hay dos fábricas que estén organizadas de la misma manera,
y como en muchos casos no existe una distinción clara entre el control de la
producción y la fabricación o el funcionamiento real, estando ambas con el
mismo personal, es necesario definir primero concretamente qué funciones
caen dentro de la categoría de control de la producción.
El control organizado de la producción es necesario para conseguir el éxito
en la industria, por los métodos implantados, tiene que crearse siguiendo
líneas funcionales adecuadas y adaptarse de manera definida a la fábrica
particular en que se empleará.
El control de la producción, es un servicio que facilita la fabricación y
prepara el camino al mismo tiempo que suministra toda la ayuda y la
información necesaria sobre la producción, incluyendo, los métodos, los
tiempos, los materiales y las herramientas, digiriendo y comprobando el
curso y el progreso del trabajo y cerrando los registros una vez terminadas
las tareas o cumplido las ordenes de fabricación (Alford,1953).
Una amplia lista de funciones y deberes que pueden caer bajo control de la
producción comprende las siguientes actividades;
1. Planteamiento de los trabajos
2. Preparación de las órdenes de trabajo.
3. Llevar registros.
• Solicitudes de compra para:
• Reponer las existencias normales.
4. Obtener artículos especiales comprados fuera.
5. Métodos de ingeniería.
6. Lista de las operaciones.
7. Instrumentos adecuados para el trabajo a realizar.
8. Estudios de tiempo y movimiento.
9. Fijación y jornales.
10. Control de calidad del producto terminado.
11. Estandarización de las operaciones.
5.2 PLANEAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN
La fase de planeamiento en el control de la producción, consiste en la
determinación sistemática previa de los fines productivos productos y
servicios y de los medios métodos y procedimientos necesarios para la
consecución de esos fines de la manera más económica. Supone el gasto
más eficaz, en combinación, de tiempo, energía humana y recursos
materiales.
5.2.1 Principio del planeamiento. El planeamiento puede definirse como,
la técnica de prever o imaginar de antemano cada paso de una larga serie de
operaciones separadas, teniendo que efectuarse cada una de ellas, con la
máxima eficiencia, e indicar cada paso de manera que las disposiciones de
rutina basten para que se realice en el lugar adecuado y el momento
oportuno (Alford,1953)
5.2.2 Factores que determinan los procedimientos de planeamiento y
de control. El procedimiento de planeamiento y control de la producción
depende de diversos factores condicionales.
1. El plan general de organización con referencia al grado de
descentralización de la ejecución
2. Índole de los procesos de fabricación.
3. Variedad y carácter repetitivo de las operaciones.
4. Magnitud de las operaciones.
5.2.3 Tipos de planes de producción. Entre los diferentes tipos de planes
de producción, se encuentran:
1. Los que se refieren a las cantidades y a la sincronización de las
operaciones de producción con las necesidades de la venta.
2. Los que se refieren al método.
3. Los que se refieren a la fijación del detalle de los tiempos necesarios en
las diferentes operaciones elementales para alcanzar el resultado final
perseguido.
El primer tipo esta relacionado con el presupuesto de producción, mientras el
segundo y el tercero, lo están con las operaciones corrientes de la
producción que implican la puesta en practica del presupuesto (Alford,1953
5.2.4 Técnica de planeamiento. La técnica de planeamiento de la
producción consiste, primero, en obtener, antes de comenzar la producción
real, una información tan completa como sea posible sobre los factores que
intervienen en el procedimiento de fabricación y planear luego el curso de
las operaciones y el tiempo que llevará cada una de ellas, con el fin de
realizar todo el trabajo de la manera más directa y en el menor tiempo
posible para conseguir que se terminen en la fecha calculada de antemano.
En la numeración que sigue, se indican la información necesaria, su
procedencia y el uso de hacerse de ella (Alford,1953)
1. Materiales de fabricación. Clase de material. Calidad de material.
Cantidad de material. Datos reducidos del análisis del producto en sus
componentes y unidades diferentes
2. Materiales disponibles. Existencias aun no consignadas o distribuidas a
determinados trabajos. Tiempo necesario para recibir el material aun
cuando este no exista en el almacén. Datos deducidos de los registros de
almacén y compras.
3. Estándar de calidad para cada unidad. Dato deducido de los diseños o
las especificaciones, o de la experiencia practica en esta clase de trabajo.
Expresado en forma de límites y tolerancias en el trabajo a máquina.
4. Producción de cada máquina o capacidad de la instalación. Unidades
de trabajo por hora que puede manipular cada máquina o cada proceso.
Datos deducidos del análisis de la capacidad de las máquinas.
5. Método de trabajo. Procedimiento más eficaz para realizar cada
operación en cada unidad del producto. Agrupamiento de las unidades
del producto en submontajes y montajes. Datos deducidos de la
experiencia técnica, pero, basados en el estudio de la capacidad de los
equipos.
6. Orden de sucesión de las operaciones. Determinación del orden en
que se realizarán las operaciones en cada unidad. Datos deducidos de la
experiencia técnica con la ayuda del conocimiento exacto de la
disposición de los equipos y de los registros referentes a trabajos
anteriores.
7. Tiempo asignado para ejecutar cada operación en cada unidad de
producto. Dato deducido del estudio de tiempos y movimientos de las
tablas que contienen los resultados de análisis de las máquinas y de la
experiencia técnica.
Los datos reunidos en los puntos 5, 6,y 7 se incorporan en las hojas de
trabajo y las tarjetas de instrucción.
8. Fijación de las fechas de ejecución. Se asignan fechas para el
comienzo y terminación de cada operación en cada unidad del producto
y, para el montaje final, ésto es, la terminación de la orden de trabajo.
5.3 ANÁLISIS DE LA PRODUCCIÓN
Estudio de la fabricación. El estudio de las operaciones necesarias para la
fabricación, es un proceso altamente técnico y que sólo puede confiarse a
personas cuya instrucción técnica y experiencia les hayan familiarizado con
los problemas de la producción de la clase de trabajo realizado en la fábrica.
Las preguntas que hay que contestar por medio de este estudio de la
fabricación son, en general las siguientes:
1. ¿Cuál es el mejor método para hacer este producto?. Esta pregunta
implica a veces, la selección de un material apropiado, de acuerdo con el
proceso que se haya decido adoptar
2. ¿Qué proceso o procesos definidos se emplearán?. La respuesta a esta
pregunta incluirá, por lo general, la especificación del empleo de
determinados equipos para realizar el trabajo.
3. ¿Es conveniente especificar un orden fijo o definido para las sucesivas
operaciones que haya que realizar con ese producto?. Puede suceder a
menudo que dos o más procesos o todos ellos, a los que haya que
someter un producto dado, tengan que realizarse en un orden
determinado por razones técnicas.
4. ¿Qué plantillas, dispositivo o herramientas son necesarios?. Éstos, son
imprescindibles o lo realizan de manera más económica (Alford,1953)
5.3.1 Análisis para determinar el tamaño económico de los lotes. En la
fabricación a partir de repetición en la que la producción anual se compone,
la fabricación de grandes tirajes de productos idénticos, el problema del
tamaño máximo y mínimo de los lotes exige alguna atención. Desde el punto
de vista económico, tiene una gran importancia mucho mayor de lo que suele
creerse. En términos concisos, puede decirse que han de producirse un
numero de piezas, en cada partida que se trabaje, cada vez suficiente para
compensar el costo del planeamiento, la confección de las ordenes, la
preparación de las herramientas, el movimiento de los materiales y la
disposición del trabajo y del equipo, pero, no tan grande que conduzca a
cargas evitables debidas a productos que permanezcan inmovilizados, es
evidente que existe un punto en el que esas dos influencias sobre el costo se
equilibran. Dadas determinadas condiciones, el problema puede resolverse
por el análisis matemático (Alford,1953)
• Capacidad anual de producción de la fábrica.
• Demanda con que se cuenta actualmente
• Costo de la preparación para empezar a trabajar en el lote.
• Costo de la materia prima, por producto
• Costo del producto terminado
• Costo de la mano de obra por producto, incluidos los gastos generales
pero no las cargas por intereses sobre los materiales.
5.3.2 Método tabular para calcular los lotes económicos. En este
método de análisis, se hace tabulación de las partidas variables del costo
para varios números supuestos de lotes fabricados por año.
El costo más bajo indica el número económico anual de lotes, y dividiendo
por el consumo anual, se obtiene el número de productos que pueden
colocarse en un lote (Alford,1953)
5.4 CICLO DE FABRICACIÓN DEL PRODUCTO
El tratamiento de la materia prima en la industria se planeará en las gráficas
o los programas, con el fin, de completarse en el tiempo total más corto
posible, que sea compatible con las demás órdenes de fabricación y con la
utilización más económica de la capacidad de la maquinaria.
Si se sabe que el tratamiento de algunos productos o submontajes o
montajes para otras órdenes harán que se retrase la nueva orden en un
punto, con el efecto de detenerlo por completo, este tiempo deberá añadirse
considerándolo como una parte de fabricación, puesto que las órdenes de
fabricación relativas a productos y procesos se ajustara a:
1. La capacidad libre y disponible de los equipos.
2. Las fechas en que puede obtenerse la materia prima.
3. El orden en que se necesitarán los productos
4. La coordinación del programa de submontajes y montaje final.
Se producirá un solapamiento considerable de los trabajos, de forma que un
gran número de productos estará, por lo general, en proceso al mismo
tiempo. La gráfica o el programa que abarque la relación guía de toda la
orden en la industria, dará el tiempo neto total de fabricación desde que se
comienza la fabricación del primer producto hasta terminar (Alford,1953).
Si este tiempo de fabricación se solapa o superpone con el de
almacenamiento de algunos productos o componentes del submontaje,
puede reducirse el de este último o cualquier otro que sea afectado en
aquella cantidad, o se puede deducir del tiempo neto de fabricación el de
solapamiento (Alford,1953).
5.5 COSTOS DE FABRICACIÓN
El costo de fabricación representa la suma total de gastos incurridos para
convertir una materia prima en un producto acabado. Estos gastos
comprenden, además, del costo del material, toda la mano de obra directa y
todos los gastos generales resultantes de los medios empleados para la
producción. Estos costos pueden computarse de diferentes maneras
• Por los métodos corrientes de la contabilidad de costos.
• Empleando la técnica de la contabilidad de costos.
• Por diversos procedimientos de cálculo o estimación.
Estados a tener en cuenta en una producción:
• Materiales directos.
• Materiales indirectos empleados
• Mano de obra.
• Total de gastos generales de fabrica.
• Cargos de producción originados desde el principio de la producción,
mensualmente.
• Inventario de trabajos en curso de fabricación (Alford,1953)
6 MATERIALES Y MÉTODOS
El desarrollo de este trabajo de tipo experimental, se llevó a cabo para el
estudio y el diseño de una prueba tamiz, para la detección de la bacteria
Helicobacter pylori y adicionalmente, elaborar el plan de mercadeo para la
comercialización de lotes industriales de la misma.
La fabricación de una prueba de apoyo para el diagnóstico clínico de la
enfermedad ácido péptica, nace de la idea de un grupo de trabajo y del
principal anhelo de un investigador que es lograr que el resultado de sus
esfuerzos, se pongan al servicio de la resolución práctica de problemas
reales, que beneficien la labor médica y finalmente, se conviertan en
herramientas que permitan mejorar la calidad de vida de los seres humanos.
La Metodología a seguir se dividió en cuatro fases:
1. Estudio de Prefactibilidad
2. Producción del Prototipo a nivel de Laboratorio.
3. Producción del Prototipo Industrial.
4. Validación y plan de mercadeo para la comercialización de la prueba.
6.1 PLANEAMIENTO PARA EL DESARROLLO DE LAS FASES
Cada una de las fases, se inició con un estudio preliminar, tanto para
profundizar el conocimiento del estado actual de la prueba como para
ampliar aspectos relacionados con su diseño y establecer las expectativas de
los usuarios. A continuación, se desarrolló el trabajo de laboratorio tendiente
a estandarizar la formulación y la fabricación del lote piloto, para llevar a
cabo el estudio de estabilidad de los componentes de la formulación y
finalmente, diseñar y desarrollar el método de validación en cuanto a
sensibilidad y especificidad de la prueba, Todo lo anterior, con el propósito
de obtener una prueba tamiz para la detección rápida de la bacteria
Helicobacter pylori.
10 6.2 ESTUDIO DE PREFACTIBILIDAD
La primera fase consistió en conocer las expectativas de los endoscopistas
de la ciudad de Bogotá, indagando acerca de las posibilidades con las que
cuentan para acceder a una prueba rápida de ureasa, cuál es su costo, de
cuánto tiempo de vida útil y tiempo de obtención de resultados se dispone y
finalmente, conocer la demanda del producto y las ventajas que tiene sobre
el resto de métodos de detección de Helicobacter pylori. A partir de esta
información, se inició el estudio de Prefactibilidad para la comercialización de
la prueba y se establecieron las ventajas que se debían ofrecer en la
fabricación de una nueva prueba, para que sea competitiva en cuanto a
precio y calidad, respecto a las existentes.
Simultáneo al estudio de Prefactibilidad, se realizó una completa revisión
bibliográfica y documental para conocer en detalle todos los aspectos
relacionados con el microorganismo, su relación con la enfermedad ácido
péptica, sus mecanismos de Patogenicidad, y en especial, la enzima ureasa,
la cual, fundamenta el método de detección de la bacteria a partir de biopsia
gástrica. Adicionalmente, fue importante conocer cada una de las pruebas
disponibles en el mercado internacional, ya que en Colombia no se fabrica la
prueba de Uresa.
Siguiendo con la metodología de trabajo, en la fase siguiente, se realizó la
práctica de laboratorio, que consistió en experimentar con una formulación
para preparar, de forma sencilla, el reactivo de prueba y estandarizar las
concentraciones de cada uno de los componentes hasta lograr que su
actividad fuera óptima y estable.
6. 3 PRODUCCIÓN DEL PROTOTIPO A NIVEL DE LABORATORIO
La prueba de ureasa es una solución que consta de urea, que es el sustrato,
un indicador de color: rojo fenol que evidencia la hidrólisis del sustrato, al
adicionar la enzima y un buffer que mantiene la solución a pH 5.5
indispensable para activar la enzima; adicionalmente, es necesario agregar
un preservante para conservar estable la solución y evitar que se contamine
o pierda sus propiedades.
6.3.1 Estandarización de la prueba. Con el fin de estandarizar la
composición de la prueba rápida de ureasa, fue necesario tomar como
referencia una formulación ya existente reportada en la literatura (Lee y
Megraud, 1996), la cual, se describe a continuación.
Reactivo de ureasa, urea al 2% p/v, rojo fenol 0,05% p/v, Azida de sodio
0,02%, Buffer fosfato 1mM. pH 5.5.
A partir de las concentraciones de cada uno de los anteriores reactivos, se
realizaron ensayos con el fin de obtener una formulación para evidenciar el
viraje del indicador: rojo fenol, como resultado del incremento en el pH que
se produce por la liberación de amonio debido a la reacción enzimática, y
encontrar las concentraciones suficientes que den paso a la hidrólisis de la
urea. En búsqueda de lograr ese objetivo se llevaron a cabo cinco ensayos
en los que se modificó cada uno de los componentes con miras a determinar
finalmente cuáles serían las condiciones óptimas
ENSAYO 1
En primer lugar, se seleccionó el preservante mediante la preparación de
tres soluciones como sigue:
§ Solución 1. urea, buffer fosfato, rojo fenol (control)
§ Solución 2. urea, buffer, rojo fenol y azida de sodio al 0,01%
§ Solución 3. urea, buffer, rojo fenol y timerosal al o,1%
Cada una de estas tres soluciones fue probada para evidenciar la hidrólisis
de la urea, adicionando enzima en diferentes concentraciones y la solución
número 1, fue usada como control sin preservante; se recolectaron los datos
de tiempo de reacción en cada caso, estableciendo además, las
proporciones tanto de enzima como del medio que tiene el sustrato, para
propiciar un rápido cambio en él cuando ocurre la reacción.
Este ensayo además aportó datos sobre la estabilidad de las tres soluciones
preparadas, ya que fueron conservadas (durante 2 meses) a temperatura
ambiente, protegidas de la exposición directa de la luz, para evitar que el
colorante se viera afectado por ésta.
ENSAYO 2
Concentración adecuada de Enzima. El procedimiento siguiente estuvo
dirigido a buscar que la reacción ocurriera de forma rápida variando la
concentración de enzima adicionada y, al mismo tiempo, se prepararon 10
diluciones del buffer fosfato, con la idea de elegir aquella que conservando el
pH 5,5 óptimo para la enzima, permitiera en el menor tiempo la hidrólisis del
sustrato.
ENSAYO. 3
Concentración Óptima de Sustrato. Posterior a la estandarización de enzima
y buffer, fue posible también optimizar la cantidad de urea (sustrato) en la
formulación, para lo cual, se prepararon soluciones del medio diluyendo la
urea, estableciendo los rangos máximo y mínimo necesarios para acción de
la enzima, adicionalmente; se estableció la sensibilidad de la nueva
formulación, utilizando como fuente de enzima tres cepas de referencia
(NCTC11637, NCTC11638, NCTC43579). Se partió de un recuento inicial de
3 x 107 UFC/ml para realizar diluciones y estimar la densidad poblacional
mínima para detectar indirectamente la presencia del microorganismo, de
acuerdo con la capacidad de producir la enzima en concentraciones
suficientes para evidenciar cambios en el medio.
ENSAYO. 4
Determinación del Soporte Físico de la Reacción. Todos los ensayos
anteriores, fueron realizados utilizando el medio en forma líquida, pero se
intentó probar un soporte semisólido como la agarosa buscando que la
muestra pudiera ser difundida de forma fácil, evitando que se corriera el
riesgo de derramarse al realizar esa operación.
ENSAYO. 5
Modificación del Buffer para disminuir el Tiempo de Reacción. Como último
paso en la estandarización de la prueba, fue necesario experimentar con
especímenes obtenidos por endoscopia y evaluar el desempeño del nuevo
producto, comparando sus resultados con las pruebas de ureasa que se
dispone en las unidades de diagnóstico endoscópico.
De esta forma, se llevaron a cabo tres sesiones de toma de biopsia así:
• 13 de marzo de 2000, Hospital Universitario San Ignacio. Se recogieron
10 muestras de pacientes que asistían a la consulta del doctor Jaime
Alvarado
• 20 de mayo de 2000, Clínica Santa Bibiana; 9 biopsias extraídas en
consulta endoscópica del doctor Alberto Reyes.
• 19 de junio de 2000, Hospital Universitario San Ignacio. Se obtuvieron 9
muestras, consulta del doctor Jaime Alvarado.
Durante estas experiencias se utilizó la nueva prueba de ureasa
SENSIBACTER Pylori -TEST, con el fin de detectar la presencia de la
bacteria en pacientes que asistían a consulta endoscópica y evaluar el
tiempo en que se obtenía el resultado, comparando éste con el tiempo que
se tardaban las pruebas utilizadas en las unidades de endoscopia
mencionadas anteriormente, las cuales, fueron elaboradas por Laboratorios
SYNTHESIS y LUTECIA, dicha metodología permitió establecer el nivel de
sensibilidad de la formulación cuando ésta se usaba para evidenciar la
actividad ureasa provocada por la presencia de Helicobacter pylori, en
muestras de pacientes que se sospechaba presentaban infección producida
por la bacteria.
6.3.2 Prueba de estabilidad térmica acelerada. Con el fin de establecer
el tiempo de vida media del producto para la detección de Helicobacter pylori,
se diseñó una prueba de estabilidad acelerada, que consistió en exponer a
tres temperaturas diferentes un lote de pruebas y recolectar cada mes,
información acerca del estado de ésta. Este ensayo, se realizó durante tres
meses y la información fue reunida mediante un formato (Véase Anexo B).
En este formato se registró información del estado de la prueba mes por mes, en cuanto a sus características físicas, químicas y microbiológicas y el principio activo, y al final, conocer qué tiempo de vida media es posible asignar al producto y sus condiciones óptimas de almacenamiento.
6.4 PRODUCCION DEL PROTOTIPO INDUSTRIAL
PLANEAMIENTO Y CONTROL DE LA PRODUCCIÓN DE UN LOTE COMERCIAL DE
PRUEBA
Determinación del tamaño del lote a producir. Un lote comercial de la
prueba rápida de ureasa comprende la fabricación del producto listo para ser
comercializado, cuyo tamaño se ha establecido, con un número total de
1.000 unidades.
El lote cuenta con dos tipos de presentación establecida de la siguiente
manera:
• Caja x 50 unidades, corresponde a 22 cajas. Presentación 1
• Caja x 25 unidades, corresponde a 40 cajas. Presentación 2
Materia prima para la fabricación. Para la elaboración de 1.000 unidades
de prueba, se requieren los siguientes componentes:
• Agua destilada 160ml
• Buffer fosfato 40ml
• Indicador de pH 100mg
• Preservante 200mg
• Sustrato 0,8g
• Envase primario 1000 unidades
• Etiqueta autoadhesiva
- Presentación 1 50 unidades
-Presentación 2 25 unidades
• Empaque de Polietileno de aluminio 1000 unidades
• Silicona 100g
• Caja de icopor
-Presentación 1 50 unidades
-Presentación 2 25 unidades
• Caja de agar Sangre 2 unidades
• Caldo TS 2 unidades.
Áreas de trabajo, procedimiento y cuantificación de tiempos de
fabricación.
1. Área con poco flujo de personal y condiciones asépticas.
2. Cámara de flujo laminar.
3. Área sometida a esterilización con luz ultravioleta.
4. Cuarto de envase.
5. Cuarto de almacenamiento.
Diagrama de Etapas de Fabricación del Lote. ( Véase Anexo C)
Formato de control de la producción. ( Véase Anexo D).
Disposición de equipos adecuados.
1. Microprocesador de medición de valor-pH. CG 840B.
§ Marca SCHOTT GER “A”TE.
§ Rango de medición “un dígito”
§ pH 0,00... 14,00 (pH = 0,01)
§ U -1000... + 1700mv (1 mv)
§ T -199... + 199 °C (0,1K)
§ Electrodo SCHOTT- GER “A”TE. Serie N 2042 A
2. Balanza de precisión
§ Serie LT – 120
§ Capacidad 120 gr
3. Maquina Móvil Termoencogible
§ Marca QUICKPACK LTDA
§ Modelo QP 75
§ Dimensión máxima del área de sellado 300 x 450 mn
4. Stirrining Hot Plate: (Plato calentador con agitación)
§ Marca THERMOLYNE- CIMAREC 3
§ Modelo SP 47235-60
§ Top Plate Size 12” x 12”
Entrenamiento del personal de producción.
• Buenas prácticas de manufactura.
• Manejo y cuidado de equipo.
• Conocimiento de cada una de las etapas de fabricación.
• Conocimiento de los procesos de control de la prueba
- Microbiológicos
- Físico - químicos
- Producto terminado
Establecimiento de jornadas de trabajo y remuneración. Para la
fabricación de 1.000 unidades, se requieren 5 horas las cuales se multiplican
de acuerdo al número de pedidos. La remuneración del operario
corresponde a $3.500 hora.
6.5 ESTUDIO ESTADÍSTICO DEL TEST RÁPIDO DE UREASA PARA LA
VALIDACIÓN DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Después de lograr la formulación final de la prueba rápida de ureasa, se le
asignó un nombre comercial haciendo mención de la bacteria que detecta
esta prueba teniendo en cuenta los altos valores de sensibilidad.
La especificidad y la sensibilidad de la prueba, son variables estadísticas que
lograron obtenerse a través de un estudio de validación que se realizó
gracias a la colaboración de la Asociación Colombiana de endoscopia
digestiva y a su Expresidente el doctor William Otero Regino, quien en
compañía de las investigadoras realizó el estudio. Para éste, se le
proporcionaron tres lotes de pruebas SENSIBACTER pylori- TEST y a partir
de un protocolo ya establecido, se reclutaron los pacientes para el estudio y
los datos fueron recolectados mediante un formato (Véase Anexo E). Para
este estudio se tuvo en cuenta las condiciones que pudieran alterar los
resultados de esta prueba como lo son: lavado previo y desinfección de la
pinza de endoscopia, seguimiento paso a paso del protocolo de realización
del estudio, buen manejo de la prueba evitando algún tipo de contacto con
materiales que alteren el resultado.
Posteriormente, a la toma de biopsias, el tejido extraído se envió a patología
con dos de los más reconocidos especialistas en este campo, doctores
Carlos Orozco y Juan Carlos Mejía, quienes reportaron el resultado de
histopatología tomada como gold stándar en la validación de la prueba rápida
de Ureasa y de esta forma llevar a cabo el estudio que se elaboró como un
paso complementario al la elaboración del producto, en compañía de un
grupo de trabajo experto en el área, la validación de SENSIBACTER pylori –
TEST, se describe en el artículo: EVALUACIÓN PROSPECTIVA DE UNA
PRUEBA RÁPIDA DE UREASA PARA LA DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN
POR Helicobacter pylori. (Véase Anexo F)
11 7 PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
7.1 FACTIBILIDAD DEL DISEÑO DE LA PRUEBA
A partir de la necesidad de los gastroenterólogos - endoscopistas de contar
en la consulta endoscópica, con un método rápido, fácil y económico para la
detección de Helicobacter pylori, se tomó la decisión de elaborar una prueba
que supla estas necesidades y sirva de apoyo para el diagnóstico de
pacientes que padecen enfermedad ácido-péptica, en quienes es importante
determinar la presencia de este microorganismo.
La ausencia total de dichas pruebas, en el país, y la alta prevalencia de la
infección en la población colombiana, son razones importantes que
impulsaron a desarrollar un estudio de factibilidad para la creación de un
método de detección, de fabricación nacional, con un diseño que permita
responder a las expectativas del usuario, clasificándola de esta manera como
una prueba rápida, simple y confiable para ser utilizada en cualquier unidad
de gastroenterología.
Con el fin de ofrecer al mercado objetivo una propuesta eficiente se logró un
diseño practico para un producto de alta calidad que cuente con un
procedimiento simple, rápidos resultados y la propiedad de conservarse en
condiciones poco exigentes; de esta manera, reunir todas las características
deseadas, para el usuario, sirviendo como prototipo iniciador de un producto
exitoso.
Este formato comercial consta de un reactivo compuesto por un sustrato, un
indicador de pH y un preservante, esta solución presenta un color amarillo
claro, el cual, indica el buen estado del mismo, con un volumen total de
200µL.
Figura 23. Envase primario. SENSIBACTER pylori – TEST
El envase primario (Veáse Anexo G), consiste en una camisa que contiene el
reactivo, con su respectiva aguja hipodérmica, cuya función es dirigir el
espécimen de biopsia desde el endoscopio hasta el contenido del líquido de
la prueba. Este diseño presenta la ventaja de evitar la contaminación de las
muestras y posible alteración de resultados.
El envase secundario, consta de una bolsa de polietileno de aluminio en la
que se introduce el envase con el contenido de la prueba, ofreciéndole
protección contra la exposición directa de luz, que puede ser la causante de
cambio de color de la prueba, arrojando falsos positivos. Además, este
empaque evita el paso de la humedad al interior del envase.
El envase terciario, se compone de una caja de icopor, en la cual, se
introducen las unidades de prueba, de acuerdo al tipo de presentación:
Presentación 1: x 50 unidades, Presentación 2: x 25 unidades.
La etiqueta es autoadhesiva y en ella se incluye el nombre comercial y
genérico de la prueba, un logotipo que consiste en una lupa donde se
visualiza la detección de Helicobacter pylori, con lo cual, se quiere destacar
como característica principal de la prueba la detección eficaz del
microorganismo; cuenta además, con una banda patrón de colores que
ayuda en la interpretación de los resultados. Tiene destinado un espacio para
la numeración del lote y su fecha de vencimiento. Adicionalmente, se ha
incluido el logotipo del laboratorio fabricante, con su dirección y teléfono.
Temperatura de almacenamiento.
Figura 24. Envase secundario y terciario. SENSIBACTER pylori- TEST
Figura 25. Etiqueta
Dentro del envase terciario, se incluye el inserto de la prueba, el cual, reúne
la información necesaria sobre: principio del procedimiento, instrucciones de
uso, componentes, precauciones, interpretación de resultados, valores de
sensibilidad y especificidad, control de calidad y limitaciones de la prueba,
finalmente, número de registro y datos del fabricante. (Véase Anexo H)
Este formato resultó ser el más apropiado, debido a que después de probar
con microplacas y pozos individuales demostraron no ser eficientes ya que
no podían ser selladas totalmente, dificultándose así el transporte y
permitiendo una rápida deshidratación del reactivo, lo que disminuye el
tiempo de vida útil.
Figura 26. Envase preliminar de Sensibacter pylori-TEST en pozos
individuales
Por otra parte, presentaba la desventaja de carecer de un instrumento que facilite la introducción del espécimen dentro del reactivo, provocando la alteración de resultados de los pacientes
El formato actual de la prueba ha sido ventajoso para el usuario y a su vez
para el fabricante, aunque aún presenta deficiencias en cuanto a comodidad
para el envasado y sellado; éste, además, no es totalmente hermético por lo
que es necesario encontrar un envase que resulte económico y que supere
las deficiencias que presenta el actual, que contribuya también con una
presentación visualmente más atractiva. En general, se puede señalar que
el resto del diseño es adecuado para la presentación final de la prueba.
7.2 PRODUCCION DEL PROTOTIPO A NIVEL DE LABORATORIO
7.2.1 Estandarización de la prueba. En primera instancia, se llegó a
estandarizar una fórmula para la prueba rápida de ureasa, con la que se
consiguió obtener un producto apropiado para detectar la bacteria
Helicobacter pylori, mediante una reacción enzimática que se dá, al poner en
contacto el espécimen de biopsia con el reactivo, evidenciándose un
resultado positivo por medio del viraje de amarillo a rojo en el medio, de
acuerdo con los siguientes resultados.
Variación del pH Vs. TiempoFormulación Inicial, Enzima 0.5mg/ml
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
Solución No. 1 Solución No. 2 Solución No. 3
Figura 27. Selección del preservante y estándar de enzima
A partir de los ensayos con cinco concentraciones de Enzima ureasa (Figuras: 27), se decidió utilizar como mínima concentración de la misma 5mg/ml, ya que con ésta fue posible evidenciar reacciones con el sustrato a partir de 10 minutos, por medio de un cambio de color en el medio y se determinó usar para todos los ensayos esta misma concentración de ureasa.
Con el fin, de conservar el buen estado de los componentes de la prueba.
Se eligió como preservante Azida de Sodio al 0,01% (solución No. 3), ya que
durante los ensayos con las diferentes concentraciones de enzima y en
especial, cuando se usó Ureasa 5mg/ml, fue con la que se observaron
rápidos resultados (Figuras 27). En contraste, la solución que contenía
timerosal en diferentes concentraciones nunca registró cambios de color en
el medio de prueba en tiempos menores a 30 minutos.
Variación del pH Vs. TiempoAzida 0,01%, Buffer Diluido
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
0,01 M 0,009 M 0,008 M 0,007 M 0,006 M
Figura 28 a. Estandarización del buffer con concentración constante del
preservante
Variación del pH Vs. TiempoAzida al 0,01%, Buffer Diluido
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
0,005 0,004 M 0,003 M 0,002 M 0,001 M
Figura 28 b.
Se pudo establecer que al diluir el buffer, no se afectaba el pH 5.5 del reactivo, que es indispensable para que actúe la enzima (Figuras 28 a, b) y de acuerdo con los resultados obtenidos en las sesiones realizadas en dos unidades de endoscopia, donde se usó la prueba de ureasa con buffer 0.005 M para detectar presencia de la bacteria a partir de muestras de biopsia, se decidió, disminuir dicha concentración, llevándola a 0.002M, la cual,
favoreció un cambio más rápido en el medio de amarillo a rojo, siendo evidente esta reacción antes de 15 minutos.
Variación del pH Vs. TiempoSustrato en diferentes Concentraciones
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
Urea 0,1% Urea 0,2% Urea 0,3%Urea 0,4% Urea 0,5%
Figura 29 a. Concentración óptima del sustrato
Variación del pH Vs. TiempoSustrato en Difentes Concentraciones
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
Urea 1% Urea 2% Urea 3%Urea 4% Urea 5%
Figura 29 b. Posterior a la obtención de concentraciones óptimas de enzima, buffer y
preservativo, se logró estandarizar el sustrato (urea), ya que al probarse
concentraciones tales como 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%
y 5%, se obtuvieron los siguientes resultados (Figuras 29 a, b). Se pudo
evidenciar que la concentración óptima necesaria para la formulación final,
fue 0,4% puesto que ésta requiere poco sustrato y arroja resultados positivos
a partir de 10 minutos.
Variación del pH Vs. TiempoUrea 0,4%, Cepa 1. En 3 Dilusiónes
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
7.5 x 10 UFC/ml 3.7 x 10 UFC/ml 1.8 x 10 UFC/ml
Figura 30 a. Sensibilidad de la formulación
Variación del pH Vs. TiempoUrea0,4%, con cepa 2 y 3. Primera dilusión
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3
Figura 30 b.
Se logro establecer la sensibilidad de la prueba, la cual corresponde a una
densidad poblacional de 3x105 UFC/200uL teniendo en cuenta que para la
realización de la prueba solo se deposita una muestra de biopsia, en el
volumen final correspondiente a 200uL, estas bacterias suministran enzima
que debe ser equivalente a la mínima que requiere el sustrato para ser
evidente la hidrólisis de la urea, a través del cambio de color (amarillo – rojo)
del medio de prueba. (Figuras 30 a y b).
Las Figuras 30 a y b, muestran que al probar la Cepa No. 1, en 3 diluciones a partir de un recuento inicial de 3X107UFC/ml, éstas lograron evidenciar cambios de pH antes de 20 minutos, motivo por el cual, esta Cepa fue tomada como referencia para establecer la mínima densidad poblacional que requiere la prueba para hacer el viraje de color. La Cepa 2 y 3 con solo su primera dilución, lograron producir un cambio de color en el medio a los 10 minutos, por esta razón, no fueron escogidos, para determinar la sensibilidad de la prueba.
Variación del pH Vs. TiempoReactivo en Agarosa, Cepa No.1
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
Agarosa 0,5% Agarosa 0,25%Agarosa 0,125% Agarosa 0,0625%
Figura 31 a. Soporte físico de la prueba
Variación del pH Vs. TiempoReactivo en Agarosa, Cepa No. 2
55,5
66,5
77,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
Agarosa 0,5% Agarosa 0,25%Agarosa 0,125% Agarosa 0,0625%
Figura 31 b.
El soporte físico de la fórmula estandarizada, es líquido. Cuando se ensayó con agarosa para lograr que el soporte físico fuera semisólido, implicó someterlo al calor para su disolución, lo que afectó el pH, y provocó la rápida deshidratación del medio almacenado por un corto período de tiempo en el envase primario, lo que significó la pérdida de la estabilidad de los componentes. (Figuras 31 a y b).
Figura 32. Comparación con tres diferentes formulaciones
Variación del pH Vs. TiempoComparación de 3 pruebas de Ureasa
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
0 5 10 15 20 25 30Tiempo
pH
Synthesis Lutecia SensiBacter
A través de este ensayo, en el cual se agregó la misma cantidad de enzima
(20 µL) a los 3 productos (Synthesis, Lutecia, SENSIBACTER pylori – TEST),
se pudo determinar que transcurridos los primeros 5 minutos, tanto
SENSIBACTER como Synthesis, presentaban un viraje de amarillo a rojo que
se interpreta como positivo.
Sin embargo, Sensibacter requiere 10 minutos más que Synthesis para
alcanzar a pH 8.0, que significa su positividad. Lutecia, solo logra un primer
cambio a pH 7.0 a los primeros 10 minutos, dando así su positividad.
A través de esta comparación, se evaluó la formulación establecida para
SENSIBACTER pylori - TEST, de la siguiente manera: Buffer fosfato pH 5.5:
0.002M; Sustrato:0.4% p/v; Indicador de pH: 0.05%p/v; Preservativo: 0.01%
p/v, siendo ésta ventajosa por el hecho de conservar sus características de
pH 55 (color amarillo) siempre que se ensayó su desempeño, lo que no
ocurría con los de Synthesis y Lutecia, las cuales, durante estos ensayos no
conservan al momento de usarse, su color inicial óptimo para el buen
desempeño, esto puede explicarse muy probablemente porque requieren
condiciones de almacenamiento exigentes.
Sensibacter se viene evaluando mediante una Prueba de estabilidad
térmica, donde hasta el momento se ha completado información de tres
meses a 3 diferentes temperaturas y se continúa hasta que el porcentaje de
pruebas en deficiente estado supere el permitido dentro de un lote de las
mismas. considerándose esta fecha para el vencimiento del producto y
estableciendo el tiempo de vida útil, es decir el periodo durante el cual el
producto tiene un funcionamiento óptimo garantizado por el fabricante.
7.2.2 Tiempo de vida útil del Test Rápido de ureasa.
Figura 33. Tiempo de vida útil del test rápido de Ureasa.
La prueba de estabilidad térmica estuvo dirigida a conocer el tiempo de vida útil de SENSIBACTER pylori – TEST y a través de ésta, se pudo establecer que la mayoría de las pruebas que se conservaron tanto a 4°C como a temperatura ambiente (18 y 22°C) permanecieron estables en cuanto al color inicial, lo que sugiere que el pH 5.5 no se modificó, al igual se probó su
principio activo y las pruebas están aptas para el uso, las que se almacenan a 4° C requieren ser atemperadas antes de su utilización para obtener resultados antes de 15 minutos. De acuerdo con lo anterior, se estableció que al menos por tres meses las pruebas pueden se conservadas a temperatura ambiente. Las pruebas que se almacenaron a 37°C, nos dan información del estado de las mismas, interpretando que un mes a dicha temperatura corresponde aproximadamente a un año a temperatura ambiente; de acuerdo a los resultados antes de finalizar los tres meses el mayor porcentaje de ellas se encuentran deficientes, por lo cual se hace necesario corroborar que las pruebas permanecerán estables por lo menos dos años a temperatura ambiente, teniendo en cuenta que a 37°C un gran porcentaje de pruebas no superaron un tiempo mayor a dos meses en buen estado.
7.3 PRODUCCION DEL PROTOTIPO A NIVEL INDUSTRIAL
A partir de la producción del prototipo a nivel laboratorio, se realizó un
análisis para la producción a escala industrial, donde se determinaron los
siguientes puntos: En primera instancia, se estableció que un lote comercial
de la prueba esta constituido por 1.000 unidades de prueba, cantidad que se
definió de acuerdo a la demanda del mercado potencial, sugerido a través
de los resultados obtenidos en el estudio de mercadeo para la
comercialización de dicha prueba.
La fabricación del número de lotes mensual varía de acuerdo a la demanda del producto, y de la misma manera, se presenta variación en el tipo de presentación del lote, x25 unidades o x50 unidades, adecuándose a las necesidades requeridas por el cliente.
En el desarrollo de una producción exitosa se debe contar en primer lugar, con el personal entrenado adecuadamente, para cada una de las etapas de
producción, a su vez, es necesario tener un stock de materia prima requerida para la producción del lote de prueba. Posteriormente, llevar a cabo, de forma correcta cada una de las etapas descritas en el diagrama de producción (Véase Anexo C).
8 ESTUDIO DE MERCADO DEL TEST DE UREASA PARA
LA DETECCION DE LA BACTERIA Helicobacter pylori.
SENSIBACTER pylori – TEST
PLAN DE MERCADEO
Este documento resume todas las decisiones estratégicas de mercadeo
proyectadas a un periodo de un año, encaminadas a la comercialización de
la prueba rápida de ureasa, cuyo propósito principal es conocer las
necesidades del cliente, satisfacerlas y de este mismo modo, generar
utilidades a la compañía.
8.1 NECESIDAD DEL MERCADO
El Helicobacter pylori es una bacteria microaerofílica, espiroidal, que coloniza
primariamente, la mucosa gástrica antral donde produce una inflamación
aguda y crónica activa. Esta infección se ha asociado también a úlcera
péptica, adenocarcinoma y linfoma gástrico.
La prueba de ureasa en biopsia antral constituye el método más rápido y
práctico para detectar el Helicobacter pylori en pacientes sometidos a
endoscopia. En el país, no existe un mercado comercial de éstas pruebas,
presentando dificultades para su adquisición por sus elevados precios y difícil
disponibilidad.
Ésta, es la principal razón por la que el mercado presenta la necesidad de
contar con un método rápido de diagnóstico clínico, de fácil acceso y con
altos niveles de especificidad y sensibilidad para enfermedades del tracto
gastrointestinal
SENSIBACTER pylori –TEST, es un producto de uso clínico básicamente
para Gastroenterólogos Endoscopistas; gracias a esta prueba, se puede
detectar la presencia de la bacteria Helicobacter pylori en el estómago y a su
vez, predecir el desarrollo de enfermedades ácido-pépticas que se han
asociado a la infección por dicho microorganismo.
Este diagnóstico se da a través de la endoscopia realizada al paciente, con
previa preparación; posterior a ésta, si el médico visualmente considera
pertinente, se puede tomar un espécimen de biopsia, de acuerdo con el
estado de la mucosa gástrica del estómago, donde se presentan unas
manchas rojas características de la colonización de esta bacteria.
El tejido extraído del paciente es introducido al liquido de prueba, donde se
encuentra un sustrato el cual reacciona de manera colorimétrica, virando de
amarillo a rojo, en un lapso de tiempo de 15 a 20 minutos, cuando se
evidencia un resultado positivo, de otra manera permanece en el color
inicial.
Este método es fácil de usar y la prueba no requiere condiciones exigentes
para su conservación, sólo mantenerse en lugares entre 18 y 22°C. La
manera de adquisición es supremamente económica y se le ofrece al cliente,
calidad y precisión. Ésta, no solamente beneficia el diagnostico del medico
sino a su vez a las instituciones prestadoras de salud y EPS, o en caso de
consulta privada al usuario, debido a que están adquiriendo un prueba
económica sin suprimir la endoscopia indispensable para detectar otras
lesiones gastrointestinales, pero, la prueba rápida de ureasa se convierte de
esta manera en un complemento necesario de la endoscopia.
La tendencia actual del mercado es adquirir este tipo de productos para
diagnóstico clínico por medio de importaciones, lo cual, no se ha dado con
gran éxito en el país.
Partiendo del análisis de la matriz DOFA se pueden establecer los
siguientes puntos con respecto a la introducción de SENSIBACTER pylori-
TEST en el mercado de pruebas de apoyo diagnóstico en Colombia.
q SENSIBACTER pylori - TEST, es un producto que genera gran
expectativa en el mercado de las pruebas diagnósticas puesto que suple
de manera eficiente y a bajo costo la necesidad de los gastroenterólogos
endoscopistas de acceder a una prueba de apoyo en el diagnóstico de las
enfermedades ácido-pépticas. El producto tiene la debilidad de no ser
reconocido en el área de productos para gastroenterología, sin embargo,
su gran fortaleza radica en las características ofrecidas que suplen las
necesidades del usuario, garantizándole que SENSIBACTER pylori –
TEST, cuenta con óptimos procedimientos de producción.
q Una amenaza evidente para la producción de SENSIBACTER pylori –
TEST, no consiste propiamente en la competencia de comercialización
frente a otras pruebas ya que en este momento no se cuenta con una
prueba de este tipo que esté posicionada en el mercado, simplemente la
amenaza radica en las referencias de baja calidad que han dejado otros
laboratorios al tratar de introducirla en el mercado colombiano.
q La oportunidad que tiene SENSIBACTER pylori TEST, es generar
credibilidad en el mercado objetivo, ofreciendo ventajas con la adquisición
de este producto para substituir la necesidad de apoyo indispensable en
el diagnóstico endoscópico.
8.2 ANTECEDENTES DE LAS PRUEBAS DE DETECCIÓN PARA
Helicobacter pylori
En años anteriores, en Colombia algunos laboratorios farmacéuticos
intentaron introducirse en el mercado de las pruebas diagnósticas para la
detección Rápida de Helicobacter pylori mediante la importación de éstas, sin
embargo, en este intento se presentaron dificultades que impidieron
continuar con el comercio de dicho producto en el país. Estos laboratorios
fueron:
ABBOTT LABORATORIES DE COLOMBIA
BioMérieux
HOSPIMEDICS
BALLARD MEDICAL PRODUCTS
En general las condiciones de refrigeración requeridas para conservar el
producto, no pueden ser suministradas en la mayoría de las unidades de
endoscopia en nuestro país lo cual no se convierte en desventaja para el
producto.
Otra causa del fracaso de las pruebas anteriores, son sus elevados costos
pues los trámites y aranceles de importación no permiten que estas pruebas
tengan un precio asequible para todos los usuarios.
Finalmente, una de las pruebas que contaba con características óptimas y
amplias posibilidades de éxito, no pudo comercializarse, ya que otro
laboratorio de Colombia utilizó el nombre que se le había asignado a la
prueba en su país de origen impidiendo que sus creadores pudieran
registrarla en nuestro país.
Actualmente en Bogotá, se conoce que dos laboratorios nacionales
SYNTESIS Y LUTECIA elaboran pruebas de este tipo y que están a
disposición del usuario solo en calidad de muestra gratis. A pesar de ello, no
ofrecen total confiabilidad de resultados ni cantidad suficiente para cubrir los
requerimientos de los usuarios
En síntesis, no se dispone en Colombia de una prueba que pueda adquirirse
a un precio determinado, y que, además, ofrezca buenos niveles de
sensibilidad y especificidad, por lo cual, la fabricación y comercialización de
una prueba rápida de ureasa constituye una oportunidad de gran proyección
económica.
8.3 DESCRIPCIÓN DEL MERCADO
Los consumidores de este servicio son las instituciones prestadoras de salud
que cuentan con Unidad de Endoscopia así, como los consultorios privados
de gastroenterología que ofrecen dicho servicio.
Los presupuestos manejados para ellos, son adjudicados en las IPS de
acuerdo con los requerimientos del médico para su diagnóstico acertado y
oportuno y la consulta privada de acuerdo al presupuesto de su paciente.
En los dos tipos de clientes se hace conveniente de igual forma, contar con
SENSIBACTER pylori- TEST como elemento de apoyo en el diagnóstico, y
es el endoscopista quien debe ser motivado directamente para adquirir el
producto.
8.4. COMPETENCIA
Pruebas rápidas de Ureasa para detectar Helicobacter pylori por primera vez
en pacientes sometidos a endoscopia, existen actualmente en Bogotá dos
marcas que son elaboradas por laboratorios SYNTHESIS y LUTESIA
respectivamente, los cuales, sólo pueden adquirirse como obsequio por parte
de los mismos en la cantidad dispuesta igualmente por ellos, que en
general no abastece a un porcentaje no mayor al 0.5% del que es
requerido.
En el resto del país no se tiene dato alguno sobre pruebas fabricadas con las
características de estas o que sean importados por alguna compañía.
Alrededor del mundo existen muchos tales como:
CLOtest ® - Trademark of Ballart Medical Products US
Pylorotek® - Horizons International Corp
Hut - Test - astra. etc.
Todos estos sin ninguna representación comercial en el país, por lo tanto, se
puede decir que hasta la fecha, no se cuenta en ningún lugar de la ciudad
con una prueba a la cual se pueda acceder por un precio determinado a
cantidades deseados de la prueba rápida de Ureasa.
8.5. OBJETIVOS DE MERCADEO
8.5.1 Generales.
§ Lanzar el producto en el segundo semestre de 2001, específicamente, en
la ciudad de Bogotá.
§ Penetrar durante el 2001 en el 17 % de las instituciones prestadoras de
salud y unidades privadas de endoscopia.
8.5.2 Específicos.
§ Alcanzar al finalizar el primer semestre de 2002, ventas de 50.000 cajas
de pruebas en la ciudad de Bogotá.
§ Lograr durante el 2002 tener el 25% de participación del mercado local.
§ Obtener en el 2002 por lo menos el 50 % de utilidad sobre la inversión
inicial.
§ Ser reconocido por la muestra entrevistada en 1999 como una marca
asociada con la gama de pruebas existentes y disponibles en diagnóstico
clínico.
§ Aumentar la conciencia del uso de la prueba en un 30% en el 2002.
8.6 ESTRATEGIAS DE MERCADEO
§ Promover el uso de Prueba Rápida de Ureasa SENSIBACTER pylori -
TEST como apropiada en el apoyo del diagnóstico endoscópico en
pacientes que requieran dicho estudio.
§ Hacer énfasis en la diferenciación SENSIBACTER pylori - TEST, como
una prueba que cuenta con una sensibilidad y especificidad
comparables con el resto de las pruebas existentes en el mundo.
§ Buscar para el producto SENSIBACTER pylori – TEST, la aceptación y
posicionamiento como una prueba de fácil acceso con resultados rápidos
y acertados.
§ Ofrecer un precio económico, que permita ser adquirido tanto por las IPS
como por los consultorios privados.
§ Tener dos tipos de presentación que se adecuen al tamaño del lote
demandado por cada tipo de cliente.
8.7 TÁCTICAS DE MERCADEO
§ Ofrecer al mercado de SENSIBACTER pylori - TEST presentación de
caja por 50 y 25 unidades de prueba.
§ Utilizar los eventos de actualización en gastroenterología como medio
para dar a conocer el producto.
§ Realizar estudios de casos y controles con diferentes endoscopistas que
estén interesados en probar SENSIBACTER pylori – TEST, con sus
pacientes.
§ Visitar las unidades de endoscopia y los consultorios privados para
mostrar y enseñar sobre el uso de SENSIBACTER pylori - TEST.
§ Ofrecer asesoría postventa permanente a los clientes del producto.
8.8 MARKETING MIX
8.8.1 Producto. La prueba de detección SENSIBACTER pylori- TEST, se
apoya en la poderosa actividad de la enzima ureasa que posee Helicobacter
pylori, en altas concentraciones, protegiéndola del medio ácido que
predomina en la mucosa gástrica.
Una vez dentro de la capa mucosa, gracias a la hidrólisis de la urea, la
bacteria continúa produciendo ureasa y por ende, amonio, que es fácilmente
detectado por un incremento de pH en el medio, gracias a un indicador de
color.
El diseño de la prueba asegura una rápida y confiable detección de la
bacteria en cada uno de los pacientes, ya que se dispone de un empaque
individual por prueba, el cual, cuenta con su propia aguja que conduce la
muestra desde el equipo de endoscopia hasta el contenido de la prueba, y
de la prueba, evitando que el tejido extraído pueda tener contacto con algún
tipo de material alterador del resultado y asegurando, además, el sellado
hermético antes y después de realizar el procedimiento, evitando que se
derrame el líquido.
El empaque comercial de la prueba cuenta con dos presentaciones x45 y x25
unidades de pruebas, contenidas en una caja de icopor, con una etiqueta
donde se resalta el logotipo que consiste en una lupa dentro de la cual se
puede detectar la presencia de Helicobacter pylori, con lo que se pretende
hacer referencia a los niveles de sensibilidad y especificidad que son
comparables con las pruebas existentes en el mercado mundial, el nombre
comercial y el nombre genérico, además, de una banda guía de colores para
la interpretación de resultados que ocurren en un intervalo de tiempo entre
10 y 20 minutos; las pruebas van acompañadas de un control negativo, un
inserto donde se indican las características de esta, los tiempos aproximados
de resultado y la instrucciones y precauciones de uso.
8.8.2 Canales de distribución y ventas. En primera instancia, el canal a
emplear serán dos promotoras del producto quienes participaran en su
elaboración, a las cuales se les asignará una cuota de clientes a concretar en
el sector de consulta endoscópica.
Estas promotoras recibirán una comisión de acuerdo con el cumplimiento de
la meta propuesta y superación de ésta. Uno de los canales que se puede
aprovechar y que reúne a gran cantidad de clientes potenciales, serán los
certámenes de actualización del área de gastroenterología y especialmente,
del área de endoscopia digestiva.
Para efectuar la venta, es importante en el caso de IPS hacer contacto con
los gerentes, Área Financiera y los médicos que participan de la Junta de
Presupuesto.
Procedimiento. Los pasos a efectuar por el vendedor son los siguientes:
§ Identificar el nombre y cargo de las personas, con quienes se establece
contacto telefónico para concreta una cita de presentación del producto y
definir una reunión.
§ Explicar en qué consiste el producto, mostrando los beneficios reales y el
porqué debe usarse y, lo acertado de la elección como prueba de apoyo
diagnóstico.
§ Dejar material promocional e insertos del producto.
§ Identificar las necesidades de cada cliente y concertar una nueva cita
para mostrar una propuesta que se adecúe a sus expectativas.
§ Cumplir las citas desde el primer contacto y cada una de las requeridas
por el cliente hasta asesoría postventa
§ Cerrar la venta, generando la factura y condiciones de pago
§ Realizar el cronograma de pedidos durante le año con cada cliente.
§ Efectuar un servicio de postventa por parte del vendedor.
8.8.3 Precios. El costo de cada una de las presentaciones (X45 - X25
unidades de pruebas), se determinó de acuerdo a los siguientes planes:
Plan1 IPS: Pedido previo mensual, mayor a 200 pruebas con pago al
finalizar el mes.
Plan 2 IPS: Pedido previo, menor a 200 pruebas en el mes, para pago en los
5 primeros días del mes.
Plan Particular: Caja x45 y x25 unidades de prueba, sin fecha para nuevo
pedido pago cinco primeros días.
Estos planes están sujetos a variación y es de conformidad para el cliente y
el fabricante.
8.8.4 Promoción. La estrategia del mercadeo directo, en primera
instancia, es construir una base de datos de las IPS que ofrecen el servicio
de diagnóstico endoscópico y la persona encargada de la adquisición de
pruebas diagnósticas, con el propósito de establecer contactos.
Mediante correo electrónico, motivar y sensibilizar a los médicos
endoscopistas para lograr un acercamiento al concepto, imagen y utilidad de
la prueba.
Una vez realizado ese tipo de contactos, realizar una cita con el cliente para
asesorarlo y responder sus interrogantes y propuestas.
8.9 COSTOS DIRECTOS PARA LA FABRICACIÓN DE UN LOTE DE
PRUEBAS
250 ml de reactivo para un lote de 1.000 pruebas
Materiales directos Cantidad Precio total
q Agua destilada
q Buffer fosfato
q Indicador de pH
q Preservante
q Sustrato
q Recipiente de envase
q Etiqueta autoadhesiva
- Presentación 1
- Presentación 2
q Empaque de polietileno de aluminio
q Silicona
q Caja de icopor
- Presentación 1
160ml
40ml
100mg
200mg
0.8g
1000 unidades
50 unidades
25 unidades
1000 unidades
100g
50 unidades
428
496
800
20
1000
74000
3990
7200
7100
1000
- Presentación 2
Caja de Agar sangre
Caldo TS
25 unidades
2 unidades
2 unidades
1200
1000
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
SENSIBACTER pylori- Test es un método rápido, sencillo y practico para
detectar la presencia de Helicobacter pylori en biopsia de mucosa gástrica.
A partir del estudio se logró estandarizar, un prototipo a escala de
laboratorio, verificando y ensayando los diferentes componentes de la prueba
y se definieron las condiciones para el escalamiento a nivel industrial.
El practico diseño de SENSIBACTER pylori-Test beneficia el diagnóstico
endoscópico por que permite un sencillo procedimiento para su uso.
De acuerdo al estudio de validación se concluyó que este producto es
competitivo por sus niveles de sensibilidad y especificidad respecto a lo
reportado internacionalmente.
A través del estudio de mercadeo se hizo evidente la amplia acogida que
puede tener este producto, dentro del mercado objetivo, al lograrse
establecer de forma precisa las expectativas y necesidades de los usuarios,
ofreciendo soluciones eficientes que reemplacen cada una de ellas.
Mediante la futura comercialización de este producto se benefician no
solamente las instituciones prestadoras de salud, sino que a su vez, los
pacientes que asisten a consulta privada encuentran ventajas, puesto que se
disminuye los costes de diagnóstico y se acelera la iniciación del tratamiento.
Se logró obtener un lote de 1000 unidades de pruebas de SENSIBACTER
pylori- TEST, estableciéndose los procedimientos de producción y control
adecuados además de un presupuesto necesario para su elaboración.
Con desarrollos de este tipo, se promueven iniciativas para la elaboración de
productos que fortalecen la industria nacional que garantizan calidad y
confiabilidad.
Se demostró que el apoyo a los investigadores posibilita obtener productos
adecuados que benefician a la sociedad.
Es importante continuar el trabajo profundizando en cuanto a formas de
mejoría en cuanto a la disminución de la cantidad mínima necesaria de UFC
que detecta la prueba, disminuyendo a un mínimo los falsos negativos y
dándole más competitividad al producto.
Se recomienda continuar con la prueba de estabilidad por un periodo más
largo de tiempo y determinar con exactitud la vida útil del producto.
Es importante prolongar el estudio de validación , ampliando el tamaño de
muestra aumentando el poder del estudio.
10 PERSPECTIVAS
Es evidente que la interacción entre Helicobacter pylori y su huésped, es muy
compleja y que los factores dependientes de la bacteria determinan la
enfermedad sólo en ciertos individuos susceptibles, sometidos a influencias
medio ambientales dadas en un país como Colombia, en el que las
enfermedades acido-pépticas constituyen un problema de salud pública; es
indispensable que se conozcan las características biológicas e
inmonogénicas de las bacterias nativas, para utilizar este conocimiento tanto
en la implementación de pruebas diagnósticas rápidas como lo es
Sensibacter pylori – TEST, donde adicionalmente a su estandarización, se
dio factibilidad de comercializar la prueba como resultado del estudio de
mercadeo propuesto para este objetivo.
En la determinación final de la estabilidad de los reactivos (hasta ahora 3
meses) debe prolongarse para darle una fecha de expiración más amplia y
confiable posible.
Mejorar el empaque y la presentación para que se haga más atractivo el
producto y al mismo tiempo permita conservar la estabilidad de los reactivos
y la facilidad para su utilización.
Puesta en marcha del plan de mercadeo y cumplimiento de las metas
propuestas en ventas.
Se han recibido numerosas propuestas para la admisión comercial por parte
de las instituciones prestadoras de salud y consultorios privados, lo cual,
conduce a registrar la prueba ante el INVIMA, para que esta prueba adquiera
un valor comercial.
.
BIBLIOGRAFIA
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ANEXOS
133
Anexo A. Estandarización y comercialización del test rápido de ureasa
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL La siguiente encuesta tiene como propósito estudiar la posibilidad de mejorar
el test rápido de ureasa para la detección de la bacteria Helicobacter pylori,
e introducirlo al mercado; para tal fin, se aplicará este cuestionario entre los
médicos gastroenterólogos, quienes permitirán conocer los principales
aspectos necesarios para implementar el nuevo kit y, de esta manera resulte
ventajoso Así mismo se conocerá lo relacionado con:
◊ La reducción de costos del test, ya que se presume esta variable como
una amenaza.
◊ Ventajas frente a las otras técnicas diagnósticas.
◊ Posibilidades de aceptación en el mercado como producto de fabricación
nacional.
La información suministrada no tendrá otro uso diferente al enunciado y se garantizará la confiabilidad.
134
IDENTIFICACIÓN
Nombre: _______________________
Teléfono: _______________________
Institución:_______________________
MARCAR CON UNA X
1. ¿Cómo ha adquirido usted la prueba de ureasa rápida para la detección
de Helicobacter pylori?
1. ¿La ha comprado?
2. ¿Se la han obsequiado?
3. ¿Se la suministra la entidad para la cual trabaja usted?
4. Otros.
2. Para usted como usuario del test de ureasa, ¿cuál cree que debe ser la
característica más importante para el mejoramiento del producto
existente?
1. Mayor estabilidad de la prueba.
2. Forma de conservación: Temperatura ambiente
3. Mayor agilidad en la obtención del resultado.
4. Disminución en cuanto a su costo.
5. Mejoramiento en asesoría post-venta.
135
3. ¿Qué Aspecto preferiría usted que el nuevo producto le proporcionara
garantizándole su optima calidad?
1. Sensibilidad y especificidad.
2. Facilidad de uso.
3. Bajos costos.
4. Otros.
5. Todos los anteriores
ESCRIBIR LA CANTIDAD
4. ¿Cuál es la vida útil del producto?
Horas: ___________
Días: ___________
Meses: ___________
Otros: ___________
5. ¿Cuál es el tiempo promedio de obtención del resultado?
Minutos:__________
Horas: __________
Días: __________
Otros: __________
136
6. ¿A través de qué laboratorios ha podido adquirir esta prueba?
7. En promedio, ¿cuántas endoscopias, realiza en un mes?
137
Anexo B. Formato de recolección de datos. Prueba de estabilidad PRUEBA DE ESTABILIDAD Prueba rápida De ureasa Fecha de control No.________ Preparación_______________ Preparada por__________________ Fecha _____________
Tubo prueba
Turbidez Precipitación
Color – pH
T-reacción
Volumen
Ctrl-24-72H
138
ANEXO C. Diagrama de Etapas de Fabricación del Lote
1. 10”
1-II.15”
15” 1-I.5”
1-IV.20”
Verificación de Equipos
Peso de Reactivos
Medición de pH
Envase Primario del Liquido
Control principio activo 3.10”
Adición y Homogenización de Preservante, Sustrato e Indicador
Preparación de
Preparación de Buffer
Control microbiológico 3.5"
139
2.1 Hora Anexo C. 30”
5” 4.15”
5” 4-III.15” 4,10”
1.15”
5.20”
Numeración por Fecha de vencimiento Inserto
Evaluación de las Especificaciones de Lote Terminado
Lote de Retención Lote de Venta
Diligenciar Formato de Control de Producción
Sellado del líquido
Control de calidad
Envase secundario del producto
Control de calidad
Etiquetado
Sellada del empaque secundario
Envase terciario Presentación 1 Presentación 2
140
Anexo D. Formato de control de la producción
Fecha de preparación del lote
No. De lote
Fecha de vencimiento
Peso de Reactivos
Buffer fosfato
Solución A
Solución B
Sustrato
Preservante
Indicador
141
Pruebas Envasadas
Pruebas Imperfectas
Pruebas Retención
Crecimiento en Agar Sangre
Crecimiento en Caldo TS
Responsable
Revisado__________________________
142
Anexo E. Tamizaje para la prueba rápida de ureasa
Número de registro:
DATOS GENERALES
1. FECHA DE RECOLECCIÒN DE DATOS: (D/M/A)
2. PACIENTE:
3. H.C:
4. EDAD: (años)
5. SEXO: F M
6. EMPRESA:
7. MÉDICO REMITENTE:
8. PROCEDIMIENTO:
9. ESÓFAGO:
10. ESTÓMAGO:
11. ZONA DE TOMA DE BIOPSIA:
143
12. DUODENO:
13. DIAGNÓSTICO ENDOSCÓPICO: a.
b
c.
d.
14. PRUEBA RAPIDA DE UREASA : Positiva Negativa
Tiempo min.
15. HISTOPATOLOGÍA : Positiva Negativa
DR.
RM.
144
Anexo F. Estudio estadístico del test rápido de Ureasa para la validación de sensibilidad y especificidad
EVALUACIÓN PROSPECTIVA DE UNA PRUEBA DE UREASA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori William Otero*+, Luis Pineda++, Victor Arbeláez++, Fabiola Quintero&,
Carlos Orozco&, Oscar Orozco# Adriana Briñez#, Andrea Bazzani#
Unidad de Gastroenterología Universidad Nacional de Colombia*, Clínica
Fundadores Gastroenterología+, Patología&, Centro de Enfermedades Digestivas++,
Laboratorio de Inmunología Instituto Nacional de Cancerología#. Bogotá
Colombia.
Introducción
El descubrimiento de Helicobacter
pylori (H. pylori) en 1983 y la
demostración de su papel en la
etiopatogénesis de gastritis (1),
úlceras gastroduodenales (2-4) y
tumores gástricos como
adenocarcinoma y linfomas MALT (4-
6), han producido un profundo cambio
en los conceptos sobre fisiopatología
y tratamiento de tales entidades.
Actualmente, está completamente
aceptado que la infección por H.
pylori debe ser erradicada en todos
los pacientes con úlceras pépticas y
en los que tienen linfomas MALT de
bajo grado de malignidad (4,7-9). El
alto contenido de ureasa de H. pylori,
ha estimulado el desarrollo de
múltiples pruebas para detectar la
infección (10-12). Estas pruebas
denominadas “pruebas rápidas de
ureasa” son consideradas primera
145
elección para el diagnóstico de H.
pylori en los pacientes a quienes se
les realiza endoscopia digestiva alta
(11) por su bajo costo, buena
sensibilidad (88-95%), excelente
especificidad (95-100%) (9-12) y
rapidez para el diagnóstico obviando
la necesidad de esperar los resultados
de la histología o del cultivo. Aunque
diversas pruebas invasivas y no
invasivas, han demostrado su
exactitud para detectar la infección
por H. pylori, el examen histológico
de biopsias de mucosa gástrica, es
considerado la prueba de oro (Gold
standard) para el diagnóstico. (12--
14). Entre las pruebas no Invasivas
(no requieren endoscopia digestiva
alta) se dispone de la serología y de
pruebas respiratorias con urea
marcada con Carbono 14 o 13 (no
radiactivo) (12-14). Entre todas las
pruebas diagnósticas disponibles, la
elección de cualquiera de ellas
dependerá de la pregunta que se
desee responder.
No obstante las ventajosas
características de las pruebas rápidas
de ureasa, éstas no son fácilmente
disponibles en nuestro medio y
cuando se consiguen, tienen alto
costo, por lo que se decidió realizar el
presente trabajo para evaluar la
eficacia de una prueba de ureasa
rápida producida por tres de los
autores (Orozco O, Briñez A, Bazzani
A) para detectar la infección por
H.pylori.
Materiales y Métodos
Selección de los pacientes. Se
incluyeron pacientes con edades
entre 16 a 85 años que fueron
sometidos a endoscopia digestiva alta
en los servicios de gastroenterología
de las instituciones participantes. Al
entrar al estudio, los pacientes dieron
su consentimiento por escrito.
Criterios de exclusión. Tratamientos
previos de erradicación de H. pylori.
Utilización de medicamentos capaces
de suprimir al microorganismo
(antibióticos, bismuto, inhibidores de
bomba de protones) dentro de las
cuatro semanas previas a la
evaluación. Pacientes con sangrado
activo al momento de la endoscopia.
Antecedente de cáncer gástrico,
cirugías gástricas o duodenales,
discrasias sanguíneas, embarazo
actual, melenas recientes o
enfermedades críticas.
146
Recolección de los datos. Al entrar al
estudio, en un formulario se
registraron los siguientes datos:
nombre, edad, sexo, diagnóstico
endoscópico.
Endoscopia y biopsias gástricas. A
todos los pacientes incluidos en el
estudio, se les realizó endoscopia
digestiva alta después de mínimo seis
horas de ayuno. Los pacientes no
fueron sedados, se utilizó anestesia
tópica orofaringea (benzocaina spray).
El examen se realizó con
videoendoscopios Olympus GIF 100.
Todos los hallazgos endoscópicos se
registraron en el informe usual y en el
formulario de cada paciente. Se
definió úlcera (gástrica o duodenal),
cualquier solución de continuidad
mayor de 5 mm con una profundidad
aparente. Gastritis crónica
endoscópica fue definida como la
presencia de eritema plano en
parches en el antro (gastritis antral) o
en cuerpo y en antro simultáneamente
(corporoantral). Gastritis erosiva
cuando se encontraron erosiones
(soluciones de continuidad menores
de 5 mm). Para la descripción de
Esofagitis, se utilizó la descripción de
Savary Miller modificada (14). Durante
la endoscopia se tomaron cuatro
biopsias del cuerpo medio (curva
mayor, pared anterior) y cuatro del
antro para análisis histológico, uno a
tres cms proximales al píloro
utilizando un fórceps de biopsia no
aserrado (biopsias mayores de 2mm)
(microvasive, Boston Scientific Corp ).
Del antro se tomó además una biopsia
para el test de ureasa rápida. Esta
biopsia, fue tomada de la pinza
fórceps con una aguja estéril que
hace parte del la tapa del recipiente
dentro del cual está la solución de
urea. Los especimenes enviados a
patología fueron leídos por patólogos
expertos (Quintero F, Orozco C), para
análisis histológico y detección de H.
pylori. Cuando el microorganismo no
fue detectado con hematoxilina-
eosina, se utilizó coloración de
Giemsa. Estas biopsias fueron fijadas
con formalina tamponada al 10% y se
hicieron cortes secuenciales de 4
micras. La presencia de H. pylori se
estableció por la apariencia de
bacterias típicas y la existencia de
gastritis crónica activa en cualquiera
de los especimenes La densidad de H
pylori se graduó en una escala de 0-
4: 0= ninguno, 1=focalmente mínimos
organismos, 2=pocos organismos
pero presentes de manera uniforme,
3= densidad moderada, 4=
147
distribución muy densa. El grupo de
patología desconocía los resultados
de la ureasa rápida.
La prueba rápida de ureasa,
SENSIBACTER pylori –TEST, fue
estandarizada con un Sustrato al
0.4% p/v; Buffer fosfato pH 5.5:
0.002M; Indicador de pH; 0.05% p/v;
Preservativo: 0.01% p/v. El tejido
extraído del paciente es conducido de
la pinza fórceps al liquido de prueba
mediante la aguja que sirva como
tapa del envase de la prueba, donde
se encuentra el sustrato el cual
reacciona de manera colorimétrica,
virando de amarillo, a rojo cuando se
evidencia un resultado positivo, en un
lapso de tiempo de 10 a 20 minutos,
de otra manera permanece en el
color inicial.
Este método es fácil de usar y no
requiere condiciones exigentes para
su conservación, solo mantenerse en
lugares entre 18 y 22°C, asegurando
de esta manera un tiempo de vida útil,
correspondiente a tres meses.
Análisis estadístico
En el programa Epi info 6.04 se
calcularon sensibilidad, especificidad,
valor predictivo positivo, valor
predictivo negativo de la prueba de
ureasa rápida tomando como
“estándar de oro” la histopatología.
Resultados
Se reclutaron 67 pacientes, Mujeres
(69.7%) y varones (30.3%), con una
media de edad de 49 años, desviación
estándar de 13.82, la información
endoscópica reveló que 92.4%
presentaban Gastritis Crónica y 7.6%
Esofagitis. Resultados positivos para
H. pylori en histología, fueron 46;
para Ureasa positivos fueron 45;
entre los positivos para prueba de
ureasa, 1 no fue positivo en la
histología (falsos positivos); entre los
negativos para ureasa, 2 fueron
positivos para la histología (falsos
negativos).
Con el SENSIBACTER pylori- TEST
se obtuvo una Sensibilidad del 95.6 %
y una Especificidad del 95.2%. El
Valor Predictivo Positivo fue del
97.7% y el Valor Predictivo Negativo
fue del 91%, con un IC del 95%.
Discusión
Este trabajo experimental es hasta el
momento pionero en la búsqueda de
validación de una prueba rápida de
148
ureasa fabricada en Colombia, por lo
cual, hay que destacar una de las
fortalezas de este estudio que fue
incluir el trabajo conjunto de dos
unidades de gastroenterología
dirigidas por el doctor Wílliam Otero,
lo que permitió darle más profundidad
a la información recolectada.
Estadísticamente, éste muestra que la
prueba realmente tiene condiciones
para ser comercializada ya que
después del extenso trabajo (5
meses), arrojó una sensibilidad,
especificidad, VPP, VPN y Nivel de
Confianza, muy fiables apoyándose
en la evidencia que reporta la
literatura mundial sobre estos valores
estadísticos.
Este estudio también presenta
limitaciones como cualquier otro, que
incluye factores humanos que alteran
de alguna manera en el éxito de los
resultados. Por este motivo, es
importante ampliarlo para certificar
que el producto es competitivo en
relación con otros productos similares
y otros tipos de pruebas.
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151
Anexo G. Proyecto de Régimen Sanitario, Vigilancia y Control en
relación con los productos y reactivos para el diagnóstico In Vitro en
el desarrollo de la Ley 09 de1979
152
Anexo H. Inserto
En la actualidad Helicobacter pylori es aceptado como agente causal de la gastritis crónica, enfermedad ulcero péptica y un factor etiológico importante en la cadena de eventos que conduce al carcinoma gástrico. Los estudios epidemiológicos sugieren que la infección por Helicobacter pylori está distribuida por todo el mundo, pero es mucho más común en los países en desarrollo, donde más de la mitad de la población está infectada a los 10 años y la incidencia de infección se eleva a más del 80% en los adultos jóvenes.
La prueba de detección Sensibacter pylori –TEST, se apoya en la poderosa actividad de la enzima ureasa que posee Helicobacter pylori, en altas
concentraciones, protegiéndola del medio ácido que predomina en la mucosa gástrica. Una vez dentro de la capa mucosa, gracias a la hidrólisis de la urea, la bacteria continúa produciendo ureasa y por ende amonio, que es fácilmente detectado por un incremento de pH en el medio, gracias a un indicador de color. El diseño de la prueba asegura una rápida y confiable detección de la bacteria en cada uno de sus pacientes, el envase primario cuenta con su propia aguja, la cual sella herméticamente el envase, y conduce la muestra desde el equipo de endoscopia hasta el contenido de la prueba, evitando que el tejido extraído
153
pueda tener contacto con algún tipo de material alterador del resultado. La prueba va acompañada de una tira de color que sirve como patrón de pH, ayudando a la interpretación de resultados. PROCEDIMIENTO 1. Confirmar el buen estado de la prueba, verificando que esta presente el color amarillo inicial que aparece en la banda patón.
2. Si la solución se encuentra refrigerada, aclimatar durante 30 minutos.
3. Suspender el espécimen de biopsia en la solución con ayuda de la aguja acompañante. 4. Observar el resultado, transcurridos 15 minutos después del contacto del tejido con el líquido.
RESULTADOS q Positiva: cuando se observa un
viraje de amarillo a rojo, en el tubo en el cual se suspendió la muestra.
q Negativo: no ocurre cambio de
color en el tubo prueba. . Prueba para uso In Vitro . Sensibilidad 95.6% . Especificidad 95.2% . VPP 97.7% . VPN 91%
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![III.-ACTIVIDAD Y RECESO INDUSTRIAL EN BILBAO. … · residencial se produce a gran escala tras la revolución industrial. [ ... ] Frente a la sórdida ciudad industrial se levanta](https://img.pdfslide.es/doc/110x75/5ba9ef5f09d3f2580f8d7290/iii-actividad-y-receso-industrial-en-bilbao-residencial-se-produce-a-gran.jpg)
