Estres a inicios del embarazo

The Journal of Neuroscience, Septiembre 3, 2008 • 28 (36) :9055-9065 • 9055

Comportamiento / Sistemas / Cognitiva

Sexo-específicas de programación de Offspring Emotividad después

El estrés a inicios del embarazo

Bridget R. Mueller y Tracy L. Bale Departamento de Biología Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania 19104

El estrés prenatal se asocia con una mayor vulnerabilidad a los trastornos del neurodesarrollo como el autismo y la esquizofrenia. A determinar la ventana de tiempo crítico cuando antecedentes fetales pueden inducir una predisposición a la enfermedad, se examinaron las respuestas de comportamiento en descendencia expuesta al estrés durante la primera, media y final de la gestación. Se encontró que los hijos varones expuestos a estrés temprano en la gestación mostrado desadaptativa responsividad conductual del estrés, anhedonia, y un aumento de la sensibilidad al inhibidor de la recaptación de serotonina tratamiento. Alteraciones a largo plazo en el centro de factor de liberación de corticotropina (CRF) y receptor de glucocorticoides (GR) de expresión, así como aumento hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) la capacidad de respuesta del eje, estuvieron presentes en estos ratones y probablemente contribuyó a una elevada sensibilidad al estrés. Cambios en el CRF y GR metilación de genes correlacionados con la expresión de genes alterados, proporcionando evidencia importante de programación epigenética durante el estrés prenatal temprano. Además, hemos encontrado el mecanismo básico que subyace a la vulnerabilidad masculina puede involucrar a la capacidad de respuesta placenta sexo-específicas, donde el estrés temprano en el embarazo aumenta significativamente la expresión de PPAR (peroxisome receptor activado por el proliferador), IGFBP-1 (factor de crecimiento similar a la insulina proteína 1 de unión), HIF3 (factor de 3a-inducible por hipoxia), y GLUT4 (transportador de glucosa 4) en placentas masculinos pero no las mujeres. El examen de maquinaria epigenética de la placenta reveló sexo basal diferencias, proporcionando una prueba más de que la programación específica del sexo comienza muy temprano en el embarazo, y pueden contribuir a la sincronización y la vulnerabilidad del feto en desarrollo a las perturbaciones maternas. En conjunto, estos resultados indican que la experiencia de estrés temprano en em- nancy puede contribuir a trastornos del desarrollo neurológico masculinos a través de los efectos sobre la función de la placenta y el desarrollo fetal.

Palabras clave: placenta; neurodesarrollo; metilación del ADN, el estrés prenatal, depresión, trastornos afectivos

Introducción Experiencia de estrés durante la gestación se asocia con un mayor incidencia de numerosos trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo de- depresión, la ansiedad, la esquizofrenia, y el autismo (Koenig et al, 2002.; Nestler et al, 2002;. Gillott y Standen, 2007;. Walker et al, 2008). El mecanismo a través del cual Antecedentes fetales contrib- Ute al desarrollo de la enfermedad no se conoce, pero probablemente implica un compleja interacción entre el medio ambiente y la genética. Porque muchas de las enfermedades asociadas con el estrés prenatal (PS) presentan una sesgo de sexo en la presentación, la determinación de cómo el sexo-específicas suscepti- dad surge puede dar una idea mecanicista crítica, generando así la identificación de nuevas dianas para el desarrollo terapéutico. Aunque el estrés prenatal ha sido ampliamente asociado con off- enfermedad de resorte, el sistema nervioso en desarrollo es poco probable para mostrar vulnerabilidad uniforme a las perturbaciones en el transcurso de gestación ción. Hemos establecido recientemente que la influencia de la atención prenatal el estrés en el aprendizaje dependiente del hipocampo y la memoria se espe- específica a las fechas de la exposición al estrés y el sexo de la descendencia (Mueller y Bale, 2006, 2007). Además, un estudio reciente re- Recibido 03 de abril 2008; Revisado el 30 de junio de 2008; aceptado el 23 de julio de 2008. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Universidad de Pennsylvania Investigación y March of Dimes 5FY03-133. B.R.M. fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud del Comportamiento / Cognitive Neuroscience Training subvención T32 MH-017168. Damos las gracias a K. Carlin y C. Welle para el apoyo técnico y D. Pankevich por su asistencia editorial. La correspondencia debe ser dirigida a la Dra. Tracy L. Bale, Escuela 201E de Medicina Veterinaria, 3800 Spruce Street, Universidad de Pennsylvania, Philadelphia, PA 19104. E-mail: [email protected]. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.1424-08.2008 Copyright © 2008 Sociedad para la Neurociencia 0270-6474/08/289055-11 $ 15.00 / 0

revelaron una asociación entre la experiencia de estrés materno durante el el primer trimestre y un aumento del riesgo de la esquizofrenia en los hombres (Khashan et al., 2008). Por lo tanto, la hipótesis de que el temporal especificidad puede contribuir al aumento de la incidencia de la enfermedad en los machos expuestos a estrés prenatal. Aunque el mecanismo específico por el cual el estrés materno contribuye al riesgo de la enfermedad sigue siendo poco clara, varios tecla contribu- dores han sugerido que implica cambios en la maternal hor- milieu monal. Glucocorticoides elevados en el útero puede alterar la vida temprana "Programación" (Seckl, 2000; Meaney, 2004). Sin embargo, los placenta inactiva un porcentaje significativo de la mortalidad materna glucocorticoides- coids vía 11 HSD2 (deshidrogenasa tipo 11-hidroxiesteroide 2), proteger al feto a través de las últimas etapas del embarazo (Seckl y Meaney, 2004). A pesar del papel fundamental de la placenta en regu- ción del intercambio de hormonas, nutrientes y productos de desecho entre los sistemas circulatorios de la madre y del feto, muy poco es conocido con respecto ya sea los efectos del estrés materno o la influencia del sexo fetal en la función placentaria. Un mecanismo potencial mediante el cual el estrés puede influir fetal desarrollo y la programación es a través de la epigenética, incluyendo La metilación del ADN (Seckl y Meaney, 2004;. Weaver et al, 2004b; Tsankova et al., 2007). Aunque se ha puesto énfasis reciente relativo a la participación de la maquinaria epigenética en la programación de los acontecimientos de la vida temprana, la influencia de los antecedentes del feto en el EPIG- enome sigue siendo desconocido (Meaney et al., 2007). Estrés central componentes, factor liberador de corticotropina (CRF) y la glu- receptor de cocorticoid (GR), han sido previamente demostrado ser

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Mueller y Bale Vulnerabilidad al Estrés Masculino Prenatal Temprana

regulado por metilación y programado temprano en la vida (Weaver et al, 2004b;. McGill et al, 2006).. La serotonina (5-HT) neurotransmisión misión y el desarrollo de enfermedades están asociadas con el estrés path- manera la desregulación (Valentino y Curtis, 1991;. Nestler et al, 2002). Por lo tanto, la hipótesis de que mediada antecedant fetal alteraciones en la programación de estos circuitos pueden ser un subyacente- ing factor en los trastornos del neurodesarrollo.

Materiales y Métodos Animales Los ratones utilizados en estos estudios estaban en una mixta C57BL / 6:129 fondo. Ratones hembras vírgenes (n 62) se aparearon en 6 - 8 semanas de edad. Presencia de un tapón de la cópula denota días de gestación 1. La mujer embarazada fue alojados individualmente, dado un nestlet de algodón, y asignado a un esfuerzo de tratamiento grupo de tratamiento (ver más abajo). Todos los animales fueron alojados en virtud de un 12 h luz / oscuridad ciclo (luces a las 07:00 AM) con temperatura ambiente de 22 ° C y una humedad relativa de 42%. Alimentos (Purina Rodent Chow; 28,1% de proteínas, 59,8% de hidratos de carbono, 12,1% grasa) y el agua se proporcionó durante todo el estudio ad libitum. Todos los estudios se hicieron según los protocolos experimentales aprobados por la Uni- sidad del Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Pennsylvania. El estrés prenatal Administración de crónica, estrés variable se realiza como anteriormente descrito (Mueller y Bale, 2006). En pocas palabras, las presas se asignaron al azar firmado a grupos de tratamiento para recibir el estrés durante una de las 3 semanas, o a un control (Ctrl) grupo no estresados. Ratones embarazadas asignadas a la grupos de estrés experimentado un factor de estrés diferente en cada uno de los 7 d durante la primera (días 1-7), medio (días 8 -14) o tardía (días 15-21) de gestación. Crónico estresores variables fueron las siguientes: 36 h de luz constante, 15 min (A partir de las 10:00) del zorro exposición olor (1:5000 2,4,5-trimetil- tiazol; Acros Organics) la exposición, novela objeto (ocho canicas de similares La exposición forma y color) durante la noche, a 5 min de la moderación de estrés (empezando a las 10:00 horas) en un tubo cónico de 50 ml, la novela de ruido (ruido blanco / Naturaleza Sonido-Sleep Machine; Brookstone) durante la noche, múltiples cambios de jaula durante todo el ciclo de luz y ropa de cama saturado (700 ml, 23 ° C el agua) durante la noche. Estos estresores leves fueron seleccionados para ser nonhabituating y para no inducir dolor o influir directamente en la ingesta de alimentos o materna aumento de peso (Mueller y Bale, 2006).

Tiempo de inmovilidad, que se define como la falta de todo movimiento con excepción de la barba el movimiento y la respiración, se registró a lo largo de una sesión de prueba de 6 min Prueba de natación forzada. Los ratones se pusieron a prueba en una versión modificada de la forzada nadar prueba (FST) como se describe previamente (Lucki, 1997;. Cryan y col, 2005). Todos los animales se colocaron en el cilindro para un preswim durante 5 min en el día 1 y monitoreados luego durante una prueba de 5 min 24 h después de la preswim (Cryan y Lucki, 2000). El tiempo dedicado a la natación, escalada, e inmóvil era determinado por un investigador ciego para el tratamiento y sexo. Inmovilidad se definió como el tiempo pasado todavía o sólo el uso de enderezamiento a los movimientos permanecer a flote. Natación se define como cualquier movimiento horizontal en naturaleza que participan al menos dos miembros. Escalada se define como cualquier movimiento vertical en la que la parte inferior de las patas delanteras tocó el lados del cilindro. Prueba de campo abierto. Los ratones fueron expuestos a la prueba de campo abierto durante la oscuridad ciclo de 1 semana después de la finalización de la FST para determinar el efecto de la PS en ansiedad-como el comportamiento y la actividad locomotora. El aparato de campo abierto consistía en un plexiglás blanco caja de 50 50 a 22 cm con 16 12 12 cm cuadrados dibujados en el suelo. Las pruebas se realizaron con 120 lux en el centro del area, 2-4 horas después de apagar las luces (9:00-23:00). Cada ratón se colocó en el centro de la caja para iniciar la prueba de 5 min. Los ratones fueron anotó para los cruces del total de líneas y centro cruza por un investigador ciego al grupo de tratamiento. Debido a que el tratamiento con fármacos ansiolíticos aumenta cruza en cuadrados de centro, el rendimiento en la prueba de campo abierto es una vali- fechada medida de ansiedad-como comportamiento (Bale et al., 2000).

Determinación mecanicista de la influencia de la atención prenatal temprana presión sobre los hijos varones Debido a que la descendencia masculina destacó temprano en la gestación mostró una significativa aumento de conductas inadaptadas en el TST y FST, examinamos sensibilidad anhedónico en una prueba de preferencia sacarosa. Para evaluar la posible mecanismos que contribuyen a estos resultados a largo plazo propias de cada sexo, las comparaciones se hicieron mediante la placenta array PCR y análisis epigenéticos. Prueba de preferencia de sacarosa Suspensión de la cola y las pruebas de natación forzada revelaron que el estrés prenatal temprano (E-PS) produce un fenotipo depresivo-como en la descendencia masculina adulta. A confirmar estos resultados, E-PS varones adultos fueron examinados en una sacarosa pref- prueba rencia, una medida de la anhedonia, un síntoma central de clínicas depre- Sion (Moreau, 1997). Ocho semanas de edad E-PS y el control de los hijos varones (n 16) se alojaron en una sola jaula, recibieron comida estándar ad libitum, y fueron inicialmente entrenado para consumir agua en el paradigma de dos botellas de opción durante 3 d a habituar a los ratones a la libre elección. Luego fue reemplazado Una botella de agua por una botella de solución de sacarosa al 1% durante 1 semana y 2 de acceso sacarosa. Durante la semana 3, la concentración de sacarosa se aumentó a 5%. Durante semana 4 y 5, la concentración se incrementó a 10% (Weatherly y Arthur, 2006). Las botellas se invierten dos veces por semana para controlar por lado la preferencia. La ingesta de líquidos se midió diariamente y reemplazado semanalmente. La resultados de consumo de sacarosa se expresaron como una relación de preferencia por sacarosa. Proporciones preferentes se calcularon como el porcentaje del volumen de sacarosa consumida (por 24 h) dividido por el consumo total de líquidos (por 24 h). La ingesta de alimentos, ingesta de agua, y el peso corporal se controlaron a lo largo de la prueba de preferencia sacarosa.

Establecimiento de las relaciones sexuales y la especificidad temporal de la atención prenatal tensión en el estrés conductual respuestas de afrontamiento Descendencia Para examinar el sexo y la vulnerabilidad de tiempo de gestación a la influencia de estrés prenatal, se comparó la respuesta al estrés conductual del macho y la descendencia de mujeres adultas que fueron expuestos al estrés materno durante el principios, mediados y finales de la gestación. Al nacer, las camadas fueron sacrificadas a ocho crías, y camadas que contienen menos de seis cachorros fueron excluidos del análisis. Durante semanas después del parto (4 días después del parto 25-27) crías se destetaron, grupo alojado con los mismos compañeros de camada de sexo, y etiquetada-ear para proporcionar una método de identificación permanente. Desde 10 -16 semanas de edad, de uno a dos machos y de uno a dos hembras por camada fueron probados en la conducta Los ensayos de la emotividad. El rendimiento de los hermanos del mismo sexo fue aver- años para evitar los efectos de camada (animales Control5 masculinos / femeninos 4 literas; animales Control4 / 4 camadas; masculinas animales stress8 temprano / 6 literas; estrés temprano hembra 7 animales / 6 litros, a mediados del estrés masculino 6 animales / 4 camadas; animales mediados de mujeres stress6 / 4 literas; varón tarde stress7 / 4 camadas; animales stress6 finales femeninas / 4 camadas). Estos descendientes eran probado en la suspensión de la cola, de natación forzada, y las pruebas de campo abierto, como se de- se describe a continuación, con un período de 10 d de recuperación entre las pruebas.

Prueba de esfuerzo sacarosa A la conclusión de preferencia sacarosa (día 36), se eliminó sacarosa durante 24 horas en e-PS y el control de la descendencia. La ingesta de sacarosa más de 2 y 24 h fue comparación entre los animales expuestos a un factor de estrés agudo olor de un depredador (1:5000 2,4,5-trimethylthiazole; Thermo Fisher Scientific) y animales que se deja en paz (n 4). Un paradigma restricción de estrés similares se ha demostrado previamente para inducir el comportamiento de borrachera como en ratas (Hagan et al., 2003). Los animales recibieron comida estándar y agua ad libitum dur- ción del período de restricción de sacarosa. La comida y el agua se controló la ingesta durante la restricción de sacarosa y las 24 h después del regreso de sacarosa. Para controlar para la restricción, se llevó a cabo un segundo experimento comparando 2 y 24 h la ingesta de sacarosa entre los animales expuestos a un estrés por inmovilización 15 min y animales que quedaron inalteradas (n 4). Estos animales fueron sacrificados después de la finalización del estudio. No se salvó de los tejidos.

El análisis del comportamiento Ensayo de suspensión de cola. Para examinar las conductas desadaptativas de los adultos fuera de la primavera, los ratones fueron examinados mediante la prueba de suspensión de cola (TST) como previamente descrito (Steru et al., 1985). Los ratones se fijan a un suspendido varilla de vidrio con cinta adhesiva coloca 1 cm de la punta de la cola y son suspendido 50 cm de la parte superior del banco dentro de un área visualmente aislado.


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Serotonina tratamiento inhibidor de la recaptación Para determinar si las conductas desadaptativas de estrés responden encontraron en varones E-PS fueron en respuesta a una recaptación de serotonina aguda inhibidor (ISRS), el citalopram se inyectó 30 minutos antes de la prueba en la cola prueba de suspensión (n 8), como se describió previamente (Crowley et al., 2005). Todo los ratones fueron conductualmente ingenua. El fármaco se disolvió en 0,9% de solución salina y inyectada en dos dosis: 2,5 y 10 mg / kg en un volumen de 100 l. Vehículo inyección fue de 100 l de 0,9% de solución salina. Estos animales fueron sacrificados después de com- pletion del estudio. No se salvó de los tejidos.

-Actina. Este valor se define como la CT. Cambio cuantitativo relativa se calculó utilizando la fórmula 2 (control CT E-PS CT) (n 4 -5).

CRF y GR in situ hibridación La expresión de genes importantes en neurocircuitos estrés se midió por in situ hibridación. E-PS y de control de los varones fueron asesinados 2 semanas después de la última prueba de comportamiento. Los cerebros se cortaron en un criostato a 20 m coronal secciones y se montaron en portaobjetos (SuperFrost Plus; Thermo Fisher Scientific). Sec- nes se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4% y se procesaron como ante- ously descrito (Teegarden y Bale, 2007). Tejido avenido Atlas era hibridada con GR antisentido 5S-UTP-etiquetados (generoso regalo del doctor Audrey Seasholtz, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI) o CRF sondas como se describió previamente (Bale et al., 2000). Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 55 ° C, se lavó a 65 ° C, se deshidrataron en etanol, y se secó al aire. Para los análisis de granos de plata, portaobjetos se sumergieron en nucleares líquidos NTB emulsión (Eastman Kodak) durante 17 d (GR) y 21 d (CRF). Diapositivas fueron desarrollado, counterstained con hematoxilina (Thermo Fisher Scientific), y coverslipped. El nivel de expresión se cuantificó mediante el análisis densidad óptica utilizando la versión 3.9 IPLab sistema de imágenes para Macintosh Computer (Scanalytics). Bajo iluminación de campo brillante, adecuada regiones de interés se extrajeron como se determina por referencia atlas (Paxinos y Franklin, 2001). Las secciones del cerebro se corresponden anatómicamente antes análisis. Expresión GR dentro CA1, CA2, CA3 y giro dentado (DG) se analizaron dentro de la misma sección del cerebro en cuatro secciones adyacentes y promediado para cada animal antes del análisis estadístico (n 4 -5). Central núcleo de la amígdala (CEA) expresión de CRF se analizó en dos secciones adyacentes y en promedio para cada animal (n4 -5). Lo mismo herramienta región de interés se utilizó para cada sección. Antecedentes fue sub- extrajo de cada medición de la densidad mediante el uso de una región a las afueras cada sección de tejido. Intensidad de luz microscópico se mantuvo constante en toda análisis. Las medidas se completan con un investigador ciego a grupo de tratamiento (n 4 -5).

Recogida de tejido cerebral de adultos Para examinar los cambios bioquímicos y moleculares en el cerebro de un adulto machos expuestos a estrés prenatal precoz, conducta ingenua e-PS y control adultos descendientes varones murieron a los 4 meses de edad (n 4 -5). Sesos se han eliminado y dividida sagitalmente en dos hemisferios. Para todos nuestros la expresión génica y análisis autoradiographical, se obtuvo tejido de o analizado en el mismo hemisferio a través de todos los animales. Para Autora- cardiografía y in situ estudios de hibridación, las mediciones para CRF y GR eran de las secciones de tejidos cerebrales del hemisferio izquierdo. En serio- estudios de PCR tiempo, micropunches se hicieron a partir de tejido de la derecha hemisferio. Para los estudios de metilación del ADN, micropunches bilaterales eran obtenido para el aislamiento de ADN. Por Western blot adulto, cortical tejido se toma del hemisferio derecho. Todo el tejido cerebral se almacenó a 80 ° C.

5-HT transportador autorradiografía Evaluación del transportador de serotonina (SERT) en E-PS y el control de los hombres se llevó a cabo con los métodos de autorradiografía 3H-citalopram. Fresh- , secciones de cerebro de concordancia atlas congelados fueron seleccionados de control y E-PS ratones (n 4 -5). Las secciones del cerebro (20 m) se incubaron en tampón Tris, pH 7,6, a 37 ° C durante 10 min. Las secciones fueron incubadas en tampón con- conteniendo 3H-citalopram (1,4 nM; PerkinElmer) durante 1 h a 37 ° C y se lavó en frío (0 - 4 º C) tampón de incubación (210 min). Por último, las diapositivas fueron se enjuagaron en agua destilada desionizada fría y se secó bajo una corriente de frío de aire. Las secciones del cerebro estaban adosados a Kodak Hyperfilm (Eastman Kodak) para el 21 d. Imágenes de películas que representan las secciones de tejido atlas emparejados eran seleccionado para el análisis. Región de los contornos de interés fueron diseñados para stan- análisis estandarizado del hipocampo dorsal, septum lateral y hypothal- amus como se determina por referencia atlas (Paxinos y Franklin, 2001). La densidad óptica se midió dentro de cada región de interés y promedió después de restar el fondo densidad de la película. Las imágenes fueron capturadas usando una 10 bit enfriado cámara digital QICam (QImaging). La densidad óptica mea- surements fueron hechas por IPlabs para el software de Macintosh (BD Biosciences / Scanalytics).

Hipotalámico-pituitario-adrenal respuesta al estrés del eje Para determinar si los machos E-PS mostraron hipotálamo-alterada pituitario-adrenal (HPA) del eje de respuesta al estrés, los niveles de corticosterona en 10 semanas de edad, los hijos varones adultos (n 6) después de un sistema de retención de 15 minutos fueron en comparación. Restricción se llevó a cabo en un tubo cónico de 50 ml. La sangre de la cola se recogió inmediatamente antes del inicio del estrés (0 min), inmediatamente después de la exposición al estrés (15 min), y 15 y 45 minutos después de la final de la tensión (30 y 60 min, respectivamente). El procedimiento de extracción de sangre duró 1 min. Las muestras se centrifugaron y se almacenaron a 80 ° C inmediatamente hasta que el Se llevó a cabo el ensayo. Los niveles de corticosterona se determinaron por radioim- ensayo inmunológico (ICN Biomedicals). (6 N). La intra-ensayo coeficiente de la variación fue del 5%.

Dorsal del rafe TPH2, SERT, y el análisis de la expresión de 5-HT1A Secciones a través del rafe dorsal 4,04-4,96 mm caudal a bregma fueron cortadas a un espesor de 300 m (Paxinos y Franklin, 2001). La ubicación de la región de microperforada corresponde a las figuras 64 -72 de la Paxinos y Franklin ratón atlas. El área de la dorsal del rafe era se determina usando el hipocampo dorsal y acueducto cerebral como puntos de referencia. Se tomaron entonces Micropunches con un diámetro de 1 mm usando una aguja hueca (Ted Pella). RNA fue aislado utilizando RNeasy (Qia- gen) y se volvió a suspender en RNasa libre de agua y la concentración me- Sured en un espectrofotómetro (Eppendorf). ADNc se transcribió utilizando el Sistema de Síntesis superíndice primer capítulo en tiempo real (RT)-PCR con cebadores aleatorios (Invitrogen). Los cambios en el receptor de la serotonina 1A (5Htr1a; NM_008308.4; Mm00434106_s1), triptófano hidroxilasa (Tph2; NM_173391.2; Mm00557717_m1), y transportador de serotonina (SLC6A4; NM_010484.1; Mm00439391_m1) se midieron utilizando cuantitativa en tiempo real PCR y TaqMan Gene Expresión Ensayo (AP- -Actina (Actb; NM_007393.3; IMPLÍCITAS Biosystems). Además, Mm00607939_s1) también se midió para cada muestra como un endógena control, y el umbral de ciclo se ha deducido del umbral de destino valor. Todas las muestras y los controles se prepararon en pocillos duplicados de una Placa de 96 pocillos y se analizaron utilizando el Applied Biosystems 7500 Fast Real- System Time PCR. Se utilizó el número de ciclo en el umbral (valor CT) para los cálculos de la cantidad relativa de las moléculas de ARNm. El valor de CT cada objetivo de genes se normalizó por la resta del valor de CT

El análisis de la metilación del ADN de la IRC, GR y BDNF El estado de metilación de los dinucleótidos CpG específicas dentro del promotor región de CRF ratón (McGill et al., 2006), GR Tipo II (Weaver et al., Se analizaron 2004b), y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (McGill y col., 2006) (N 4 -5). El ADN genómico de la hipotálamo y el núcleo central de la amígdala de E-PS y control de los varones eran extraída de los sedimentos celulares con el kit DNeasy Tissue (Qiagen), de acuerdo- ción a las instrucciones del fabricante. Se realizó la pirosecuenciación por EpigenDx, como se describe previamente (Kim et al, 2007;.. Liu et al, 2007). Las muestras de ADN Universalmente metilado y unmethylated (Millipore Bio- Investigación en Ciencias Reactivos) se utilizaron como controles en estos experimentos.

Recogida de tejido de la placenta Para determinar los perfiles de expresión de genes de la placenta después del estrés prenatal, presas expuestas a estrés durante los primeros 7 días de gestación y las presas a la izquierda imperturbable murieron 12 días después de la presencia de tapón de la cópula. Esta vez punto fue escogido porque en el día embrionario 12, la formación de la placenta es completo. Tejidos de embriones fue salvado para el aislamiento de ADN y placentas fueron se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para el aislamiento de ARN. Como anteriormente descrito, la RT-PCR usando cebadores específicos para Sry (5-GAGTACA- GGTGTGCAGCTCTA-3 y 5-CAGCCCTACAGCCACATGAT-3) se han utilizado para identificar el sexo de los embriones individuales (Zwingman et al., 1993). Ciclos térmicos condiciones fueron 98 ° C durante 30 s, 54 ° C durante 40 s, 72 ° C durante 50 s para 30 ciclos.



Placenta aislamiento de ARN De cada camada, una placenta de un embrión masculino y una placenta a partir de un embrión femenino se añadieron a reactivo TRIzol (Invitrogen) y se sonicada brevemente antes de aislamiento total con cloroformo y la precipitación con isopropanol. ARN fue resuspendido en agua libre de ARNasa y con- concentración medida en un espectrofotómetro (Eppendorf).

ARN (750 ng) fue transcrito a cDNA utilizando la RT 2 primera cadena syn- kit tesis (C-03; SuperArray Bioscience) y se analizaron mediante el ratón vía de señalización de la hipoxia array PCR (PAMM.032; SuperArray Bio- ciencia) y el SYBR verde Master Mix 2 RT PCR (SuperArray Bio- la ciencia). Cada serie consta de 84 genes que se sabe están involucrados en el respuesta hipóxica, la diferenciación celular, y el metabolismo, así como 12 SE- cuencias para el control de carga y calidad de cDNA [ADN plásmido pUC18 como control negativo; actina, peptidilprolil isomerasa A, y deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato para la carga]. El valor CT se utilizó para el cálculo de la cantidad relativa de las moléculas de ARNm. El CT valor de cada gen diana se normalizó por sustracción del valor CT del promedio de los cinco genes de limpieza. Este valor se define como la CT. Se calculó el cambio cuantitativo relativa utilizando la fórmula 2 (control CT E-PS CT) (n 4).

PCR análisis conjunto de los nutrientes de la placenta y el transporte de oxígeno la expresión génica

los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías para el sexo de la progenie y PS. Para los estudios de preferencia y de corticosterona de sacarosa, se analizaron los datos con día como un factor de medidas repetidas. Un ANOVA de dos vías para el PS y exposición al estrés agudo determinado significado de los datos de prueba de sacarosa-estrés. El efecto de citalopram en el comportamiento de la descendencia en el ensayo de suspensión de cola se analizó mediante un ANOVA de dos vías para el PS y el tratamiento de drogas. Bonfer- Se utilizó la prueba-roni comparaciones múltiples post hoc para el control de la basura efectos. Para los estudios bioquímicos, moleculares, y de metilación, un macho y la hembra por camada fueron elegidos al azar para el análisis, y Fisher PLSD post hoc prueba determinada influencia de PS. Para la PCR de la matriz de datos, genes mostrando 2 veces cambios fueron analizados por un ANOVA de dos vías para el sexo y PS para determinar los efectos principales. PLSD de Fisher post hoc prueba con una reducido pse utilizó el valor de 0,01 para controlar para comparaciones múltiples. Dobla los cambios se calculan con relación a los controles no acentuadas para hombres y placentas femenino. Se llevó a cabo todos los análisis estadísticos utilizando Statview SE (Abacus Concepts).

Resultados Análisis del comportamiento Para determinar los posibles efectos en el tiempo y el sexo-específicas de PS en hijos adultos depresión y comportamientos similares a la ansiedad, hombres y descendencia femenina destacó durante principios, mediados, finales de la gestación, o un- controles estresados se examinaron para las respuestas de estrés de comportamiento en la prueba de TST, FST, y campo abierto. Hubo un principal significativo efecto del PS (F (3,33) 3,9; p0,05) (fig. 1 Una) y una significativa la interacción entre el sexo y PS tratamiento (F (3,33) 2,95; p 0,05) (fig. 1 Una) el tiempo dedicado inmóvil en el TST. Los varones ex- planteada a E-PS pasaron significativamente más tiempo inmóviles en comparación con machos de control ( p0,01) (fig. 1 A). Ningún efecto significativo de PS fue evidente en las mujeres (F (3,17) 0,8; p0,49). En la FST, hubo un efecto principal significativo del PS a tiempo pasado inmóvil (F (3,26) 5,2; p0,05) y una significativa inter- acción entre PS y el sexo (F (3,26) 2,8; p0,05). E-PS masculina descendencia pasó mucho más tiempo inmóvil que el control varones ( p0,01) (fig. 1 B). En esta prueba, el aumento del tiempo dedicado inmóvil el resultado de una disminución significativa en el tiempo pasado escalada (F (3,26) 4,25; p0,01) (fig. 1C) y una tendencia para tiempo dedicado natación (F (3,26) 3,1 disminuido; p0,06) (fig. 1D), indicando un efecto específico del sexo de la primera PS en la catecol- amina y los sistemas de neurotransmisores serotonina. No significativo efecto del PS a tiempo inmóvil pasado estuvo presente en las mujeres fuera de la muelle (F (3,13) 0,7; p0,51) (fig. 1 B). Análisis de los pasos centrales de la prueba de campo abierto no reveló efecto del PS (F (3,31) 0,14; p0,92) o el sexo (F (1,31) 1,1; p 0,31) (fig. 1 E). Para determinar si TST y FST resultados fueron afectados por los cambios en la capacidad locomotora, línea completa cruza durante Se midió la prueba de campo abierto. No hubo EF-significativa defectos de PS tratamiento (F (3,31) 0,164; p0,03) (fig. 1 F) o el sexo (F (1,31) 1,3; p0,27) (fig. 1 F).

Determinación mecanicista de la influencia de la atención prenatal temprana presión sobre los hijos varones Prueba de preferencia de sacarosa Para determinar si los comportamientos de mala adaptación para afrontar el estrés dis- interpretado por los hombres E-PS en el TST y FST reflejan un depresivo-como fenotipo, el estado hedónico de estas crías se evaluó en un tarea preferencia sacarosa. Machos E-PS mostraron una disminución de la ingesta de 1% de sacarosa en comparación con el control de la descendencia masculina (F (1,179) 8,2; p0,05) (fig. 2 A). El aumento de la concentración de sacarosa al 5 o 10% mejoró la preferencia disminuida de machos E-PS (F (1179) 1,5; p0,85) (fig. 2 A). El peso corporal, la ingesta de alimentos y el consumo de agua se mon- monitoriza semanalmente durante las pruebas de preferencia de sacarosa (Tabla 1). Prena- estrés tal no afectó significativamente el peso corporal (F (1168) 3,5;

Inflamación de la placenta y la maquinaria epigenética análisis de expresión ARN (750 ng) fue transcrito a cDNA utilizando el superíndice III First- Reactivo del Sistema de síntesis (Invitrogen). Los cambios en la necrosis del tumor factor (TNF; NM_013693.2; Mm99999068_m1), interleucina-6 (IL-6; NM_031168.1; Mm01210733_m1), ADN metiltransferasa 1 (DNMT1; NM_0107883.3; Mm01151062_g1), Metil transferasa ADN 3a (DNMT3a; NM_007872.4; Mm00432870_m1), y metil-CpG La unión a proteínas-2 (MeCP2; NM_010788.3; Mm00465017_m1) eran como- evaluó utilizando TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) (n 4 -5). Además,-actina (Actb; NM_007393.3; Mm00607939_s1) era medido para cada muestra como control endógeno, y el ciclo umbral se resta del valor umbral objetivo. Todas las muestras y los controles se prepararon en pocillos duplicados de una placa de 96 pocillos y se analizaron utilizando el Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Los datos fueron normalizada a la actina y analizada por TC con base en veces de cambio cálculo ciones toman de los datos del ciclo umbral primas, como se describió anteriormente.

Análisis de transferencia Western Como evaluación bruto de los posibles cambios específicos de sexo en el cerebro de desarrollo Ment después del estrés prenatal temprano en la gestación, los niveles de neurofilamentos-1 (NF-1) se compararon entre E-PS y el control, las crías machos y hembras en la mañana (9:00-10 a.m.) del día postnatal 1 (el día en que una camada estaba presente). Un macho y una cría hembra fueron asesinados, y el todo el cerebro se retiró y se congeló rápidamente. En los hijos adultos (4 meses de edad), 500 mg de tejido que abarca la corteza prefrontal derecha se escindió con la ayuda de la referencia atlas de cerebro de ratón (Paxinos y Franklin, 2001) (aproximadamente 4,20 bregma -3,20 mm) y congelado en nitrógeno líquido. Los análisis bioquímicos se realizaron como se ha descrito previamente viamente (Bale et al., 2003). Brevemente, el tejido se homogeneizó y proteínas extraída. Todas las proteínas se ha ejecutado a 30 g por carril. Los anticuerpos utilizados fueron neurofilamentos-1 (150 kDa; 1:1000) (Millipore Bioscience Investigación Re- agentes) y el factor de crecimiento endotelial vascular (42 kDa; 1:1000) (Santa Cruz Biotechnology). Todos los blots fueron despojados y volvieron a incubar con -Actina (Sigma) para controlar los errores de transferencia o muestra de carga. Los análisis densitométricos se realizaron utilizando IPLab (BD Biosciences / Scanalytics). Una región de interés se ha elaborado en torno a una banda en la película, y una región idéntica se usa para medir densidades para cada poste- banda frecuente en esa mancha. Comparaciones de datos crudos fueron sólo dentro de cada mancha. El análisis estadístico Todos los estudios fueron realizados por un investigador ciego al sexo y PS trata- Ment grupos. Para determinar el sexo y el peso específico temporal del PS,



Figura 1. Machos E-PS mostraron desadaptativa responsividad conductual del estrés en la suspensión de la cola y obligó a las pruebas de natación. Las crías machos y hembras nacidos de madres no acentuadas [de control (C)] o presas expuesto a PS durante la primera (E), mid (M) o tardía (L) de gestación fueron comparados. A, B, Machos E-PS pasaron significativamente más tiempo inmóvil en un ensayo de suspensión de cola (A) y una prueba de natación forzada (B) en comparación con los varones de control (* p 0,05). C, Machos E-PS pasaron significativamente menos tiempo subiendo en comparación con los varones de control en la prueba de natación forzada (* p 0,05). D, No hay diferencias significativas en el tiempo se detectaron natación pasado entre el control y prenatalmente subrayó hombre o mujer descendencia. E, F, No se encontraron diferencias en la prueba de campo abierto a cruces a la arena central (E) o el número total de líneas cruzadas (F). Los datos son la media SEM. n4 - 6 de.

p0.05) (Cuadro 1, arriba), la comida (F (1168) 1,3; p0,05) (Tabla 1, medio), o de agua (F (1168) 1,2; p0.05) (Cuadro 1, abajo) ingesta. Durante el período de 5 semanas, el peso corporal en ambos grupos aumentado en comparación con los pesos iniciales (F (5,168) 13.5; p0,05) (Tabla 1, arriba), mientras que los alimentos (F (5,168) 18.5; p0,05) (Tabla 1, medio) y agua (F (5,168) 2,4; p0.05) (Cuadro 1, abajo) ingesta disminuyó. Prueba de esfuerzo sacarosa Para evaluar el efecto de E-PS y el estrés agudo en la búsqueda de recompensa comportamiento, sacarosa se eliminó durante 24 h. Los ratones fueron expuestos a un estresor o deja en paz antes del regreso sacarosa aguda. La sacarosa la ingesta se midió durante 2 y 24 h. Hubo una significativa principal efecto de la exposición al estrés agudo (F (1,27) 13,2; p0,05) (fig. 2B) y una interacción entre E-PS y la exposición de estrés agudo el 2 de ingesta h sacarosa (F (1,27) 5,3; p0,05) (fig. 2 B) y 24 h admisión (F (1,27) 4,1; p0,05) (Fig. 2C) después de la sacarosa durante la noche restricción. Durante la 2 h después de estrés agudo, los machos E-PS con- SUMED significativamente más sacarosa que los machos de control ( p0,05) (Fig. 2 B) y machos E-PS no perturbados ( p0,05) (fig. 2 B). Encima 24 h, el consumo de estrés expuestos machos E-PS sigue siendo significativamente elevada en comparación con los controles ( p0,05) (fig. 2C).

Figura 2. Machos E-PS mostraron disminución de la conducta hedónica basal y el aumento de la tensión- inducida por atracones sacarosa. La anhedonia de machos E-PS fue examinada en una prueba de preferencia sacarosa. Una, Machos E-PS muestran una disminución significativa en la preferencia de sacarosa a una concentración baja en comparación con la tecla Ctrl (n 16) descendencia masculina (* p 0,05; n16). B, C,

Dos horas (B) y veinticuatro horas (C) después de un estrés agudo, los machos E-PS consumen significativamente más del 10% su- Crose de control (* p 0,05) y sin molestias E-PS (#p0,05) de los hombres después de una noche restricción de sacarosa (n 8). D, E, Durante el acceso continuo de sacarosa, una exposición de estrés agudo hizo no influir en 2 h (D) o 24 h (E) 10% de sacarosa para el control de admisión o machos E-PS (n 4). Los datos son significa SEM.

Para el control de los efectos del estrés durante la sacarosa durante la noche restricción, se comparó la ingesta de 2 y 24 h después de estrés agudo la exposición en condiciones de acceso continuo. E-PS (F2 h (1,27) 1.2, p0,3; F24 h (1,27) 0,9, p0,5) y de estrés agudo (F2 h (1,27) 1.8, p0,3; F24 h (1,27) 0,9, p0.5) no influyó en 2 h (Fig. 2 D) y 24 h ingesta de sacarosa (Fig. 2 E).

Tratamiento con ISRS Debido a que los varones E-PS exhiben conductas similares a la depresión en el TST, FST, y las pruebas de sacarosa, se compararon las respuestas de comportamiento a un aguda ISRS. Un efecto principal de E-PS estuvo presente (F (1,29) 4,3; p 0,05), lo que indica que los machos E-PS tratados con vehículo pasaron significativamente más tiempo inmóvil que los controles tratados con vehículo ( p 0,01) (fig. 3A). También hubo un efecto principal de citalopram tratamiento Ment en tiempo pasado inmóvil (F (2,29) 3,9; p0,05) (fig. 3A). La administración aguda de 2,5 mg / kg de citalopram 30 min antes de la prueba- ción mejoró la diferencia significativa en el tiempo pasado inmóvil



Tabla 1. Pesos corporales medios y alimentos y la ingesta de agua diaria cada semana durante las pruebas de preferencia de sacarosa

Comienzo

Peso corporal (g) Ctrl E-PS La ingesta de alimentos diaria (g) Ctrl E-PS Ingesta de agua diaria (g) Ctrl E-PS

* P 0.05.

1

0.5 0.5

27.8 26.7

4.0 4.1

3.1 4.1

0.5 0.6

0.3 0.3

0.8 0.3

2

27.0 26.3

4.0 3.8

3.8 4.1

0.5 0.6

0.4 0.3

0.6 0.3

3

28.0 26.9

4.0 3.8

3.4 4.5

0.3 0.6

0.4 0.4

0.3 0.3

4

29.1 27.0

3.4 3.5

4.5 3.5

0.5 0.9

0.6 0.3

0.4 0.3

5

29.1 27.5

3.4 3.3

4.5 3.2

0.51 0.9

0.4 0.8

0.4 0.3

Tratamiento

F(1168) 3.5

Día

F(5168) 13.5 * 27.2 25.9

F(1168) 1.3 F(5168) 18.5 *

F(1168) 1.1 F(5168) 2.4 *

entre E-PS y de control tratado con vehículo machos ( p0,7) (fig. 3A), mientras que la administración de 10 mg / kg disminuyó significativamente tiempo dedicado inmóvil durante ratones control y E-PS ( p0,05) (fig. 3A). Un efecto principal de citalopram (F (2,29) 8,2; p0,05) (Fig. 3B) y una interacción significativa entre el citalopram y el E-PS (F (2,29) 4,4; pNúmero 0.05) (Fig. 3B) influenciado de la inmovilidad combates. E-PS machos tratados con vehículo mostraron significativamente más episodios de inmovilidad que los controles tratados con vehículo ( p0,01) (Fig. 3B). La administración aguda de SSRI a 2,5 mg / kg significativamente disminución de episodios de inmovilidad mostradas por los machos E-PS ( p 0,05) (Fig. 3B), pero no afectó a los hombres de control ( p0,8) (fig. 3B). La administración de 10 mg / kg disminuyó significativamente episodios de inmovilidad tanto para el control y los machos E-PS ( p0,05) (Fig. 3B). También se midió la latencia a la primera pelea de la inmovilidad. Hubo un efecto principal de E-PS (F (2,29) 15,5; p0,05) (fig. 3C) y un efecto principal significativo del tratamiento con citalopram (F (2,29) 4,4; p 0,05) (Fig. 3C) en la latencia de la primera pelea de la inmovilidad. Apoyar nuestro los resultados anteriores, los hombres E-PS tratados con vehículo mostraron una menor la latencia a la primera pelea de la inmovilidad ( p0,01) (Fig. 3C). Para E-PS varones, tanto 2,5 mg / kg de citalopram ( p0,05) (Fig. 3C) y 10 mg / kg aumentó significativamente la latencia para la primera pelea de la inmovilidad ( p0,05) (Fig. 3B). Para los hombres de control, no hubo un efecto de 2,5 mg / kg citalo- cochecito de niño ( p0,3) (Fig. 3C) o 10 mg / kg de citalopram ( p0,2) (fig. 3C) en la latencia de la primera pelea de la inmovilidad.

La serotonina transportador autorradiografía Para examinar los posibles efectos de la E-PS en los niveles de SERT que pueden ser contribuyendo al aumento de la sensibilidad de ISRS en los hombres, SERT Se midieron los niveles de autorradiografía. Machos E-PS mostraron una reducción significativa en los niveles de SERT en el CA1 (F (1,7) 25,6; p 0,05) y CA2 (F (1,7) 7,6; p0,04) (fig. 4 A, B) región de la hipocampo en comparación con los sujetos control. No hay diferencias fueron presentes en el hipotálamo (F (1,7) 0,8; p0,4), septum lateral (F (1,7) 2,7; p0,16), o regiones CA3 del hipocampo (F (1,7) 2,0; p0,2). Dorsal del rafe TPH2, SERT, y el análisis de la expresión de 5-HT1A Debido a que el rafe dorsal proporciona entrada serotoninérgico al hip- hipocampo, los niveles de expresión de TPH2, receptor de serotonina 1A (5 - HT1A), y SERT se midieron en golpes del rafe dorsal por PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de genes mostró una aparente aumento de TPH2 expresión (F (1,7) 5,7; p0,06) (Fig. 4 B). No hay diferencias en SERT (F (1,7) 0,9; p0,4) (Fig. 4C) o 5-HT1A (F (1,7) 0,3; p0,7) (fig. 4 D) de expresión se presente.

CRF in situ hibridación Debido a la capacidad de respuesta de estrés puede ser regulada por CRF, que examen- ined expresión CRF por in situ hibridación. En el nu-centro Cleus de la amígdala, los machos E-PS mostró una elevación significativa en la expresión en comparación con los controles ( p0,01) (fig. 5 A, B).

Eje HPA subrayan respuesta Debido a una mayor sensibilidad al estrés es un componente básico de afecto- trastornos TIVE, los niveles de corticosterona se compararon entre E-PS y control de los adultos descendencia masculina después de una exposición al estrés 15 min. Tratamiento de estrés prenatal temprano (F (1,18) 9,2; p0,05) y 15 exposición al estrés min (F (3,20) 14,2; p0,05) significativamente alterada los niveles de corticosterona. E-PS no influyó en la línea de base corticoste- niveles Rone. Machos E-PS han elevado significativamente corticosterona niveles después de 15 minutos de la moderación (tiempo de 15; p0,05), y 15 min después del fin de la tensión (tiempo de 30 min; p0,05) (fig. 5C). La recuperación de los Machos E-PS parecían ser retrasado, con los niveles de corticosterona 45 minutos después de finalizar el estrés permaneciendo elevada ( p0,07) (fig. 5C).

GR in situ hibridación E-PS disminuyó significativamente la expresión de GR en el CA3 ( p 0,05) y DG regiones del hipocampo ( p0,05) (fig. 5D, E). Una reducción no significativa también fue visto en CA1 después estrés prenatal temprano ( p0,06) (fig. 5 D, E). No hay diferencias fueron detectado en la región CA2 ( p0,4) (fig. 5 D, E).

El análisis de la metilación del ADN de CRF, GR y BDNF genes Dado que los estudios anteriores han demostrado que la experiencia de vida temprana puede altera el epigenoma, investigamos si los cambios en metil- ación conducían expresión alterada de CRF y GR (Weaver, 2004a). En el hipotálamo, el análisis de la metilación de citosina-dentro de el promotor CRF reveló efectos principales de la posición de base par (F (8,51) 44.25; p0,05) y la exposición al estrés prenatal temprano (F (1,51) 4,35; p0,05) con una reducción de la metilación en los hombres E-PS ( p0,05) (fig. 6A). No hay diferencias en la metilación entre el estrés prenatal trata- tos fueron evidentes dentro de la región analizada de la intrón CRF (F (1,51) 1,35; p0,4) (figura 6B). Análisis de los niveles de metilación dentro de la exón 17 región del promotor GR reveló efectos principales significativos de la posición de base par (F (8,51) 10,5; p0,05) y E-PS (F (1,51) 4,35; p0.05) con el aumento de la metilación en los hombres E-PS ( p0,05) (Fig. 6C). Sin efecto de E-PS fue evidente en la región promotora del BDNF (F (1,51) 0,75; p0,7) (Fig. 6D). De manera similar a los efectos de la hipo- tejido talámico, en el ADN aislado a partir del núcleo central de la amígdala, el análisis de la metilación de citosina-dentro del promotor de CRF reveló efectos principales de la posición de base par (F (8,50) 34,5; p0,05) y la exposición al estrés prenatal temprano (F (1,50) 3,65; p0.05) con reducida metilación en los hombres E-PS (336 pb: Ctrl 67,2 2,8, E-PS 62,1 2,5; 232 pb: Ctrl 58.2 3.3, E-PS 62,9 4,8; 226 pb: Ctrl 52.5 2.4, E-PS 52,4 3,8; 212 pb: Ctrl 73.6 3.1, E-PS 64,9 5,4; 147 pb: Ctrl 45.1 7.0, E-PS 36,2 5,49; 101 pb: Ctrl 42.2 8.0, E-PS 37,8 4,98; 95 pb: Ctrl 35.8 9.6, E-PS 19,7 3,25; 79 pb: Ctrl 42.8 9.0, E-PS 37,5 5,3; 55 pb: Ctrl 28.8 3.6, E-PS 24.5 1,3; 36 pb: Ctrl 24.9 2.6, E-PS 18.8 2.6).



Figura 4. Machos E-PS mostraron niveles de transportador de serotonina alterados. A, B, Machos E-PS mostraron una reducción significativa en los niveles de SERT en la región CA1 del hipocampo en comparación con machos de control (* p 0,05). C, PCR en tiempo real realizado en micropunches rafe dorsal reveladas ningún efecto significativo de E-PS en la expresión TPH2 ( p0,06). D, E, No se detectaron diferencias en SERT (D) o 5-HT1A (E) expresión en el rafe dorsal. Los datos son la media SEM. n4 -5. Hpc, Hippocampus; Hypo, el hipotálamo.

Figura 3. Machos E-PS mostraron una mayor sensibilidad a tratamiento agudo ISRS. A-C, En una cola prueba de suspensión, los machos E-PS pasaron más tiempo inmóvil (A), muestran un mayor número de episodios de inmovilidad (B), y mostró una latencia se redujo a la primera pelea de la inmovilidad (C) en comparación con machos de control (** p 0.01). Para los varones E-PS, una dosis subumbral de 2,5 mg / kg de citalopram redujo significativamente los episodios de inmovilidad (B) y la latencia a la primera pelea de la inmovilidad (C #;p 0,05) en comparación con el vehículo. El citalopram (10 mg / kg) redujo significativamente el tiempo pasó inmóvil y episodios de inmovilidad para el control y los machos E-PS (#p0,05; # #p0,01) en comparación con vehículo. C, Citalopram (10 mg / kg) también aumentó significativamente la latencia de la primera pelea de la inmovilidad para los varones E-PS (#p0,05). Los datos son la media SEM. n8.

PCR análisis conjunto de la placenta de la expresión génica Para determinar el mecanismo subyacente de conducir el sexo-específica efectos del estrés prenatal temprana, control y E-PS día 12 placentas embriones de hombres y mujeres fueron examinadas usando una PCR enfocado array. E-PS, sexos de las crías, y una interacción entre la descendencia el sexo y el E-PS influenciado significativamente la expresión placentaria de peroxisome receptor activado por el proliferador (PPAR), similar a la insulina factor de crecimiento de proteína 1 (IGFBP-1), transportador de glucosa 4 de unión (GLUT4), y el factor de 3a-inducible por hipoxia (HIF3A) (Tabla 2).

En comparación con las placentas de sexo masculino de control, E-PS placentas masculinos mostró significativa regulación de PPAR (4,7 veces; p0,01) (Fig. 7A), IGFBP-1 (8,1 veces; p0,01) (fig. 7A), de GLUT4 (3,6- doblar; p0,01) (fig. 7), y HIF3A (2,9 veces; p0,01) (fig. 7A). Por el contrario, E-PS placentas de mujeres mostraron downregu significativa lación de PPAR (3,2 veces; p0,01), y una downregu-trending lación de IGFBP-1 (4,7 veces; p0,06) en comparación con las mujeres placentas de control. Para obtener una lista completa de los genes y doblar los cambios, véanse los cuadros complementarios 1 y 2 (disponible en www.jneurosci.org como material suplementario). Placentario TNF y análisis de la expresión de IL-6 TNF expresión no se alteró por sexos de las crías ( p0.8) o E-PS ( p0,13) (fig. 7B). IL-6 expresión no se alteró por el sexo (p0.4) o E-PS ( p0,07) (Fig. 7C).

Placentario DNMT1, DNMT3a, y análisis de la expresión de MeCP2 Expresión DNMT1 fue alterada por la descendencia de sexo (F (1,11) 5,4; p0,05) y E-PS (F (1,11) 4,8; p0,05). Control masculino pla-



Figura 5. Machos E-PS muestran estrés desregulación vía incluyendo el aumento de Cea CRF, disminución del hipocampo GR, y un aumento de la respuesta de estrés del eje HPA. A, B, E-PS significativamente aumento de la expresión de CRF en el núcleo central de la amígdala en comparación con los controles (* p 0,05; n4). C, Los niveles de corticosterona después de un estrés por inmovilización 15 min fueron significativamente mayores en Machos E-PS comparados con los controles (* p 0,05; n6). D, E, De expresión de GR fue significativamente menor en los varones E-PS en comparación con los controles en la CA3 y DG del hipocampo dorsal (p * 0,05). La aparente disminución en la expresión de GR CA1 no fue significativa ( p0,07; n5). No efecto de E-PS se observó en CA2. Los datos son la media SEM. Hpc, Hippocampus.

Figura 6. Las alteraciones en la metilación del ADN de la IRC y GR en los hombres E-PS correlacionados con direccional cambios en los patrones de expresión de genes. Una, El análisis de metilación de los 10 dinucleótidos CpG dentro del promotor de CRF (336 a 36 pb) reveló una disminución significativa en la metilación en citosinas específicas en varones E-PS comparación con los varones de control (* p 0,05). B, No hay cambios en metilación fue evidente en la región intrónica CRF (79 -248 kb). C, Una disminución significativa en metilación en citosinas específicas en varones E-PS en comparación con los sujetos control se detectó en la región del promotor GR (578-490 pb) (* p 0,05). D, No hay cambios en la metilación fueron detectado en la región promotora (111 a 24 pb) del BDNF. Los datos son la media SEM. n4.

centas tuvieron significativamente menor expresión de DNMT1 que el control placentas femeninas ( p0,01) (Fig. 7D). Además, E-PS significati- aumento tivamente expresión DNMT1 en placentas de mujeres ( p 01) (fig. 7D), pero no las placentas masculinos ( p0,15) (Fig. 7D). DNMT3a expresión no se alteró por el sexo ( p0.1) o E-PS (p0,1) (Fig. 7E). Expresión MeCP2 no fue alterada por el sexo (p0.9) o E-PS ( p0,2) (Fig. 7F).

Análisis de transferencia Western Como evaluación bruto de posibles demoras propias de cada sexo en el cerebro de- desarrollo después del estrés prenatal temprano en la gestación, los niveles de NF-1 se compararon en día postnatal 1 cerebros de E-PS masculino y femenino cachorros. Además, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se examinó para determinar la influencia del estrés prenatal en la

el desarrollo de la vasculatura. Machos E-PS mostraron una disminución significativa en todo el cerebro NF-1 ( p0,05) (fig. 8 A). No hay efecto de la primera estrés prenatal se observó en las mujeres de NF-1 los niveles ( p0,7) (fig. 8 B). No se encontraron diferencias entre los grupos a los 4 meses de edad en NF-1 en la corteza prefrontal ( p0,8) (Fig. 8C). Prenatal temprano el estrés no influyó significativamente en el día postnatal 1 macho ( p 0,7) (fig. 8 D) o mujer ( p0,9) (fig. 8 E) Niveles de VEGF.



Tabla 2. Efecto de la E-PS y la descendencia de sexo en la expresión de genes en la placenta día 12 de gestación Gene

IGFBP-1 PPAR GLUT4 HIF3

* P 0,05; ** p 0.001.

E-PS

F(1,10) F(1,10) F(1,10) F(1,10)

0.8 0.1 49.6 * 63.6 *

Sexo

F(1,10) F(1,10) F(1,10) F(1,10)

37.9 * 41,2 ** 205.1 ** 3.8

Sexo

F(1,10) F(1,10) F(1,10) F(1,10)

E-PS

7.0 * 5.6 * 51.2 * 5.7 *

Figura 8. Disminuciones significativas en el cerebro NF-1 los niveles en los hombres E-PS soportan retraso CNS de- desarrollo. Como marcador bruto de desarrollo del cerebro, comparamos NF-1 los niveles de postnatal día 1 macho y la descendencia femenina. Una, Niveles de todo el cerebro de NF-1 se redujo significativamente en Machos E-PS compararon con los niveles masculinos de control en el día postnatal 1 (** p 0.01). B, NF-1 los niveles no fueron diferentes entre E-PS y Ctrl hembras al día postnatal 1. C, Niveles corteza prefrontal de NF-1 no fueron diferentes entre E-PS y control de los adultos de sexo masculino (16 semanas). D, E, No hubo efecto significativo de E-PS en VEGF en varones (D) o mujer (E) el día postnatal 1 cerebros. Los datos son significa SEM. n3 - 4.

Figura 7. E-PS placentas masculinos mostraron cambios robustos en la expresión de genes críticos para la crecimiento y señales de desarrollo. Una, E-PS placentas masculinos mostraron upregulation significativo de PPAR, IGFBP-1, GLUT4, y HIF3 comparó con las placentas de control masculinas (* p 0,01). En Por el contrario, E-PS placentas de mujeres mostraron regulación a la baja significativa de PPAR (* p 0,01) y una regulación a la baja tendencia de IGFBP-1 ( p0,06) en comparación con las placentas de control de sexo femenino. B, C, TNF (B) y la IL-6 (C) los niveles de expresión no se alteró significativamente por sexo o E-PS (n 5). D, En nuestro análisis de las diferencias de sexo en la maquinaria epigenética de la placenta, el control de placentas masculinos mostraron significativamente menor expresión de DNMT1 comparación con placentas de mujeres de control (#p0,01). E-PS aumento de la expresión de DNMT1 en placentas de mujeres (* p 0,05). No hay efecto de E-PS se detectó en niveles DNMT1 masculinos. E, F, DNMT3a (E) y (F) MeCP2 niveles de expresión no se alteró significativamente por el sexo o E-PS (n 4). Los datos son la media SEM.

Discusión La mortalidad y la morbilidad resultante de neurodesarrollo y los trastornos del estado de ánimo se ha mantenido prácticamente sin cambios durante la última 50 años (Insel y Scolnick, 2006). Dada la dificultad de tratamiento ción de estas enfermedades, un enfoque interdisciplinario que identifica el origen del desarrollo de las poblaciones de enfermedad y vulnerables es necesario para crear nuevas estrategias de prevención y tratamiento. La predisposición a los trastornos sexuales sesgada, incluyendo esquizo- esquizofrenia, el autismo y los trastornos afectivos, se ha asociado con antecedentes fetales relacionadas con el estrés (Ward, 1991; Watson et al, 1999.; Pardo y Eberhart, 2007). Sin embargo, el mecanismo subyacente esta influencia de PS sigue siendo poco clara. En nuestros estudios, de comportamiento

respuestas de supervivencia de la descendencia masculina y femenina expuesta al estrés a través de la gestación fueron examinados inicialmente para determinar si especificidad temporal puede ser la base de una vulnerabilidad del sexo dependiente al estrés prenatal. Las crías machos expuestos a E-PS exhibió desadaptativa comportamientos, tanto en la suspensión de la cola y las pruebas de natación forzada. Aunque controles de las mujeres en general, mostraron una mayor inmovilidad com- en comparación con los varones, el estrés prenatal no alteró aún más los esfuerzos de policías ing respuestas. Debido a las diferencias de sexo existentes en estos pruebas, un efecto techo pudo haber impedido el estrés prenatal de alterar aún más los resultados femeninos. Curiosamente, nuestros datos corres- finales con los hallazgos clínicos recientes que muestran el estrés temprano en embarazo aumentó la presencia de la esquizofrenia en los hombres, sup- portar un riesgo específico para el sexo temprano en el desarrollo (Khashan et al., 2008). Aunque nuestros estudios anteriores han informado de efectos de estrés durante los momentos de la gestación adicionales sobre los parámetros de aprendizaje y la memoria y la regulación del balance energético (Mueller y Bale, 2006, 2007), nuestros resultados actuales revelan una vulnerabilidad de vía de la tensión de programación específica para el embarazo temprano. Debido a que el macho E-PS aumenta la inmovilidad en la cola sus- pruebas de pensiones y de natación forzada era sugestivo de una depresión similar fenotipo, que también examinó la sensibilidad hedónica en estos ratones usando una prueba de preferencia sacarosa (Moreau, 1997). E-PS varones ex- prohibida su preferencia disminuido por una solución de sacarosa al 1%, sugiriendo gesting una sensibilidad disminuida a la basal recompensas hedónicos. ¿Cómo- Alguna vez, una exposición de estrés agudo inducido machos E-PS para consumir 100% más de sacarosa en las 2 horas después de una privación sacarosa com- en comparación con los ratones de acceso continuo. La mayoría de la diferencia entre el control y E-PS 24 h el consumo de sacarosa resultado de este 2 h de admisión, indicativo de atracones inducida por el estrés re- respuestas (Lynch y Taylor, 2005; Avena et al, 2006.). Dado el fenotipo similar a la depresión de los varones e-PS, de comportamiento Se midieron las respuestas a un ISRS aguda, citalopram,. Machos E-PS mostrado una mayor sensibilidad a una dosis subumbral de citalopram en



una prueba de suspensión de cola. Debido a que esta prueba mide afrontamiento activo compor- portamientos que son sensibles a los cambios agudos en los receptores 5-HT, la mayor sensibilidad detectada en los hombres E-PS puede indicar un dysregula- ción en las vías de 5-HT. Un examen más detallado del sistema 5-HT en estos ratones reveló reducción de los niveles del transportador de 5-HT en el hip- hipocampo y una tendencia de aumento de la triptófano hidroxilasa 2 ex- depresión en el rafe dorsal. Por lo tanto, el potencial de aumento de la producción de 5-HT y la disminución de la recaptación puede ser la base del aumento de la sensibilidad a tratamiento con ISRS aguda en estos ratones. La desregulación del sistema de la serotonina ha sido clásicamente vinculada a la etiología de los trastornos afectivos. CRF es un regulador conocido de Neurotransmisión 5-HT y un factor determinante de estrés responsiv- dad (Valentino et al, 1991;. Bale y Vale, 2004;. Tan et al, 2004). Por lo tanto, la desregulación de los componentes de la vía de CRF y de estrés podría ser un colaborador aguas arriba a anormalidades en 5-HT trans- misión y un fenotipo sensible al estrés. En las CEA, los machos E-PS mostró un aumento significativo en la expresión de CRF. Como un adicional indicación de aumento de la capacidad de respuesta de estrés, los machos E-PS también exhib- tada niveles de corticosterona más altos después de un estrés agudo moderación, y disminución de los recursos genéticos del hipocampo. Aunque estudios previos han re- cambios similares portados en los niveles de GR después de estrés experimentado a finales de gestación, nuestros resultados indican una ventana de desarrollo anterior durante ING que las vías de estrés muestran una vulnerabilidad específica del sexo (Cratty et al, 1995;. Darnaudery y Maccari, 2008) '. El impacto a largo plazo del estrés prenatal sobre la regulación de los cen- la expresión de genes tral puede ocurrir a través de efectos en el epigenoma. En nuestro examen de los patrones de metilación del CRF, informamos reducción en la metilación en citosinas específicos dentro de la identi- cado CRF isla CpG promotor, tanto en el hipotálamo y CEA que puede contribuir al aumento de CRF detectado en estos ratones. En nuestro examen del exón 17 regiones del GR pro- promotor, los machos E-PS mostraron un incremento de sitio específico en la metilación que se produjeron en la región que contiene la secuencia consenso de NGFI-A (factor de crecimiento nervioso inducible-A), donde la metilación estado ha sido previamente vinculado a la experiencia de la vida temprana y de- expresión aumentado (Weaver et al., 2004a, b). Debido a que el cerebro fetal no está presente durante este período de estrés temprano, la hipótesis de que los cambios específicos del sexo fetal en el desarrollo y la sensibilidad a largo plazo pueden ocurrir a través de ac- ciones en la placenta, ya que se deriva de la blasto-desarrollo quiste y se somete a crítica del desarrollo durante este período de E-PS (Hemberger, 2007). La placenta es el intermediario por que el medio hormonal materna influye en el desarrollo embrión, y por lo tanto está a punto de ser influenciado por las perturbaciones que ocurren temprano en el embarazo que pueden afectar el desarrollo fetal durante todo el embarazo mediante la alteración (1) de los nutrientes y el oxígeno trans- puerto, (2) las respuestas inflamatorias, y (3) epigenética programa- maquinaria ming. Para examinar esta hipótesis, examinamos ef- defectos de E-PS sobre la expresión genética de la placenta masculino y femenino patrones de uso de una matriz de PCR específico sobre los factores de crecimiento y nutrición genes de transporte ent. E-PS placentas machos exhiben significativa aumentos en PPAR, IGFBP-1, GLUT4, y HIF3. Sorprendentemente, E-PS placentas mujeres mostraron una reducción de PPAR y La expresión de IGFBP-1. Debido a que los glucocorticoides aumentan la expresión de PPAR (Lemberger et al., 1994), y PPAR a su vez aumenta expresión de IGFBP-1 (Degenhardt et al., 2006), nuestros resultados SUP-

Las alteraciones en el oxígeno y la disponibilidad de nutrientes han sido tan- ciados con la inflamación (Altay et al., 2004), y porque re- Estudios recientes han demostrado un vínculo importante entre la inflamación eventos tory y el inicio de la depresión mayor (Dantzer et al., 2008), las comparaciones adicionales de la placenta mark-inflamatoria res se realizaron. Aunque no se de-sin diferencias significativas protegida para los niveles de TNF e IL-6 en este punto de tiempo, es entre- sante que placentas masculinos mostraron un cambio direccional sugerente de una posible inflamación después de la E-PS que puede ser más robusta en diferentes puntos de tiempo embarazo. Para investigar más a fondo los posibles mecanismos que subyacen a la efecto específico del sexo del E-PS en la expresión de genes de la placenta, se exa- maquinaria INED metilación del ADN en las placentas masculinos y femeninos. Curiosamente, la expresión de DNMT1, la enzima responsable de mantenimiento metilación, fue significativamente menor en el control masculino placentas en comparación con las placentas de control hembra, proporcionando apoyo a nuestra hipótesis de que puede comenzar la influencia del E-PS a nivel de la placenta (Leonhardt et al., 1992). Además, aunque E-PS apareció para aumentar la expresión DNMT1 tanto sexos, este cambio sólo fue significativa en las mujeres. Porque ante- OUS estudios han demostrado que el mantenimiento de la metilación Pat- golondrinas de mar es fundamental en el desarrollo neurológico y las perturbaciones en pla- los patrones de metilación del ADN Cental son fuertes predictores de fetal cambios, una elevación inducida por el estrés de DNMT1 pueden indicar que las hembras son capaces de eludir los efectos del estrés por fortalecer- ing el mantenimiento de la metilación durante esta perturbación (Rivera et al, 2008;. Wang et al, 2008.). Estos cambios en la expresión génica de la placenta relacionados con el crecimiento factores, el transporte de nutrientes, y la epigenética puede influir en el de- veloping SNC. Como marcador bruto de desarrollo del cerebro, que com- comparado NF-1 los niveles, desde el día postnatal 1 macho y hembra off- primavera. Machos E-PS, pero no las hembras mostraron una significativa reducción de la NF-1, el apoyo a un posible retraso en el desarrollo del cerebro- Ment. Debido a las anomalías neuronales y retraso en el desarrollo se han asociado con el trastorno depresivo mayor y esquizo- esquizofrenia, tales cambios en el centro de NF-1 pueden ser predictivos de futuro enfermedad (Reines et al, 2004;..-Miguel Hidalgo et al, 2005). No ef-' se detectaron defectos de E-PS en la NF-1 los niveles en los hombres adultos, indicando ción que los hombres E-PS finalmente ponerse al día con los sujetos control. En resumen, debido a que es poco probable que cualquier gen específico produce la diferencia en los comportamientos detectados entre el control y Machos E-PS, una serie de factores genéticos, hormonales, y epigenéticos fueron examinados en estos estudios. Nuestros resultados apoyan la hipótesis que la desregulación E-PS de la IRC y la programación vía de la tensión puede ser un elemento clave para el fenotipo sensible al estrés detectado en estos ratones macho, incluyendo el aumento de la inmovilidad en la cola suspensión y de natación forzada pruebas, mayor capacidad de respuesta del eje HPA, y factores que influyen en el sistema 5-HT. Estos estudios proporcionan crítico visión mecanicista sobre la programación subyacente de sexo- trastornos del desarrollo neurológico sesgadas.

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Estres a inicios del embarazo