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Carlos A. Fernández M.
Carlos A. Fernández M.
Estructura del DNA
Carlos A. Fernández M.
• Polinucleótido producido por la polimerización dedesoxirribonucleótidos
Grupo Fosfato + β – D - desoxirribofuranosa + Base nitrogenada
Desoxirribonucleósido
Desoxirribonucleótido
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• Bases Nitrogenadas: Bases Púricas
Adenina Guanina
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• Bases Nitrogenadas: Bases Pirimídicas
Timina Citosina
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• Azúcar (Pentosa)
β – D - desoxirribofuranosa
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• Grupo fosfato
O
O
O OP
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•Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)
dTMPDesoxitimidina monofosfatoDesoxitimidinaTimina
dCMPDesoxicitidina monofosfatoDesoxicitidinaCitosina
dAMPDesoxiadenina monofosfatoDesoxiadeninaAdenina
dGMPDesoxiguanosina monofosfatoDesoxiguanosinaGuanina
AbreviaturaNucleótido(Nucleósido+Fosfato)
Nucleósido(Base+Pentosa)
Base
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•Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)
Por consenso general el Nucleótido adquiere el nombrede la base nitrogenada que le dio origen
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•Modelo de la Doble Hélice de Watson y Crick
Watson y yo hemosencontrado el
secreto de la vida
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•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Los polímeros de
DNA estánconstituidos por doscadenas denucleótidos unidosen forma lineal porenlaces fosfodiesterlos cuales corren endireccionesopuestas(antiparalelas).
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•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Cada nucleótido se encuentra en un plano perpendicular al de la cadena
polinucleotídica.
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•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick La composición de bases de DNA sigue las reglas de Chargaff (Cantidad
de Purinas = Cantidad de Pirimidinas).
TCGA
0.110.260.280.12Mycobacterium sp
0.290.150.180.30Sacharomyces cerevisiae
0.270.230.240.26Bos taurus
0.310.180.180.29Homo sapiens
•Composición de las bases nucleotídicas en el DNA de algunas especies
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•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick
•Reglas de Chargaff
1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1
Es decir, A+G = C+T
2. En todos los DNA estudiados, la proporción molar de A es igual a lade T, y la de G igual a la de C.
Es decir, A = T y G = C
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•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick
Las fotografías del análisis dedifracción de rayos X de la salde DNA con alto contenido deagua indican que la moléculatiene una estructura helicoidaldoble (las cadenas giranalrededor de una línea centralimaginaria)
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•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick Las dos cadenas se encuentran apareadas por uniones de
hidrógeno establecidas entre los pares de bases
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•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick
Propiedades de los enlaces tipo puente de hidrógeno
Son económicos (energéticamente hablando). Son lo suficientemente fuertes para mantener la estructura de la doble
hélice pero lo suficientemente débiles para romperse determinadosmomentos (replicación).
Confieren un estado dinámico de la estructura (horquillas) Son altamente direccionales, discriminan entre las distintas pares de
bases.
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Los puentes de hidrógeno sonaltamente direccionales.
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Guanina Citosina
Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno
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Adenina Timina
Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno
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•Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica
Los polinucleótidos tienden a formar hélices, lo que lespermite conciliar las fuerzas de interacción moleculares,distribuyéndolas a intervalos regulares.
Las Interacciones hidrófobas entre los anillos de las basesy fuerzas de Van Der Walls (Resultado de la diferenciaentre interacciones dipolo y las fuerzas de dispersión deLondon) producen una conformación apilada (Staking).
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Las repulsiones entre los grupos fosfato cargadosnegativamente producen cierta rigidez en la estructura lascuales, en condiciones fisiológicas, se ven estabilizadaspor la cantidad de cationes (Mg2+) presentes en lasolución.
•Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica
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Puede formar enlaces que conectan dos moléculas. Dichos enlaces (llamados enlaces fosfodiéster) son sumamente estables
aunque pueden ser rotos facilmente mediante hidrólisis enzimática(Principio de conservación).
La carga negativa (debido a un Oxígeno ionizado) protege frente aataques nucleofílicos.
La ionización negativa total mantiene a los nucleótidos y al mismo DNAdentro de las membranas biológicas.
¿Por qué fosfatos?
•Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica
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•Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica
La formación de puentes de hidrógeno cooperativosaltamente direccionales asegura una estabilidad relativaademás de un estado dinámico.
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•Variaciones conformacionales del DNA
Se producen por cambios en los grupos pentosa-fosfatode la cadena polinucleotídica.
Variación entre la conformación anti y syn del ángulo deenlace entre las bases nitrogenadas y la pentosa.
Inclinación, giro o giro en hélice de los bares de bases delos nucleótidos.
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•Variaciones conformacionales del DNA
Variación en la inclinación y giro de las bases nitrogenadas
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•Variaciones conformacionales del DNA
Variación en la inclinación y giro de las bases nitrogenadas
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•Variaciones conformacionales del DNA
Variación en la inclinación y giro de las bases nitrogenadas
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DNA tipo A
•Variaciones conformacionales del DNA
•Doble hélice plectonémica ydextrógira
•Planos de bases oblicuosrespecto al eje de la doblehélica
•Propio de RNAs en doblehélice, o de híbridos DNA-RNA
•Más ancha y corta que DNA-B
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DNA tipo Z
•Variaciones conformacionales del DNA
•Doble hélice plectonémica ylevógira
•Zonas de secuencia alternante -GCGC-
•Conformación de G es syn- enlugar de anti-
•Más estrecha y larga que DNA-B
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•Variaciones conformacionales del DNA
A B Z
Grosor 2.6 2.4 1.8Giro Dextro Dextro LevoBases/vuelta 11 10.4 12P.de rosca 2.5 3.4 4.5Inclinación del plano 19º 1º 9ºde las bases
Cuadro Resumen de las Características de losdistintos tipos conformacionales
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•Desnaturalización del DNA
Se llama así al proceso de transición entre la forma dedoble hélice apilada y el ovillo estadístico.
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•Desnaturalización del DNA
Se puede lograr provocando cambios en la temperatura,pH o agregando sustancias desnaturalizantes.
TºRotura de los enlacespuente de hidrógeno
pHCambio en laionización de loscomponentes
Agentes DNBloqueo de losenlaces puente dehidrógeno
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•Desnaturalización del DNA
Efecto hipercrómico de laDesnaturalización del DNA
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•Renaturalización del DNA
Se produce mediante la llamada autoasociación porcomplementariedad.
Es dependiente de la concentración. Se favorece por la presencia de secuencias repetitivas
frecuentes. Inversamente proporcional a la complejidad del genoma.
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•Hibridación del DNA
Se basa en la capacidad de autoasociación porcomplementariedad.
Es necesaria una relación elevada decomplementariedad.
Es dependiente de la concentración.
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Útil para los siguientes propósitos:
1. Determinación de si una cierta secuencia de DNA sepresenta más de una vez en un determinado genoma.
2. Demostración de la existencia de relación genética oevolutiva entre organismos presentes.
3. Determinación del número de genes transcritos en unmRNA particular.
4. Determinación de la localización de una secuencia de DNA(Sonda).
•Hibridación del DNA
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Hibridación del DNA
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•Hibridación del DNA
1. Se desnaturaliza el DNA a hibridar2. Se inmovilizan las monohebras resultantes mediante fijación a un
polímero adecuado.3. Dichas monohebras se montan en una columna cromatográfica.4. Se hace pasar monohebras de DNA marcado radioactivamente (Timina
tritiada).
Procedimiento
*La velocidad de reasociación es proporcional a la que la radioactividad queda retenidaen la columna cromatográfica.
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Factores que afectan la estabilidad del híbrido
a) Número de pares GC v/s pares ATA mayor número de puentes de hidrógeno,
mayor estabilidad
• 3 puentes de H entre G y C
• 2 puentes de H entre A y T
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Factores que afectan la estabilidad del híbrido
b) Grado de complementariedadMenor complementariedad de bases
Menos enlaces de H formadosMenor estabilidad
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Factores que afectan la estabilidad del híbrido
c) Largo de las hebras
– Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb
más enlaces de H mayor estabilidad del híbrido.
– Menor largo de las hebras (oligos) <50pb Mayor especificidad Menor probalidad de hibridación cruzada
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Factores que afectan la estabilidad del híbrido
d) Concentración de sal en la solución
•Cationes monovalentes (Na+) o divalentes (Mg++)
•Las cargas negativas de los grupos fosfato se repelenunas a otras.
•Los iones positivos en solución reducen la repulsiónelectrostática entre las hebras.
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Factores que afectan la estabilidad del híbrido
e) Temperatura
•Mayor Tº aumenta la energía cinética de las hebras ydesestabiliza la estructura de los ácidos nucleicos.
las hebras se separan.
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•Uso de Sondas de DNA
Las sondas de ácido nucleico son poderosas herramientas aportadas por la biotecnología que se
emplean tanto en la investigación básica como en el campo
diagnóstico. La posibilidad de utilizarlas con el fin de detectar diversos agentes patógenos, sea en el ser humano, en plantas o
animales, ya ha tenido importantes repercusioneseconómicas.
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Sondas de DNA
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•Uso de Sondas de DNA
Se pueden clasificar las sondas en :
• "calientes" cuando se utiliza productos radiactivos• "frías” cuando no se utilizan productos radioactivos
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•Uso de Sondas de DNA
Autorradiografía
* Isotopos Radioactivos tanto de emisión alfa como beta:tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125
ADN
Isotopo radioactivo
Sondas “calientes”
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•Uso de Sondas de DNA
Sondas “frías”
1. Enzimas (peroxidasa o fosfatasa que llevan a cabouna reacción detectable )
2. Marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, quese van a unir posteriormente a otra molécula)
3. Moléculas Quimioluminiscentes Y Fluorescentes(que producen luz y puede excitar una películafotográfica).
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Sondas “frías”
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Souther Blot
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•Southren blot
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•Southren blot
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•Southren blot
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FISH
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•Citogenética moderna: FISH
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Tipos de Estructurasdel DNA
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•Tipos de estructuras del DNA
Los rasgos estructurales varían según el origen y funcióndel DNA.
Los DNA difieren en:
• Tamaño• Conformación• Topología
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•Diferencias en Tamaño
•El tamaño de un DNA puede ser expresado en:
Número de pares de basesPeso molecularLongitud de las hebrasMasa real del DNA
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•Diferencias en Tamaño
Virus
Miles de pares de bases
Bacterias
Millones de pares de bases
Animales
Miles de Millones de paresde bases
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•Diferencias en Tamaño
•El tamaño del DNA tiende a aumentar con la complejidadde la función celular.
•El tamaño del DNA no siempre refleja mayor complejidadcelular.
El aumento de secuencias repetitivas aumenta el tamañopero no la complejidad del genoma.
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•Formas de determinar el Tamaño de un DNA
•Centrifugación en equilibrio•Microscopía electrónica•Electroforesis en gel
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Gradiente
de densidad
•Centrifugación en equilibrio
•La anchura de las bandas en equilibrio es proporcional ala masa molecular
DNACentrifugación
Formación de bandasen el lugar de
equilibrio entre ladensidad del DNA y el
medio externo
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•Microscopía electrónica
•Se mide el largo de la hebra•El tamaño se obtiene usando patrones conocidos demasa por unidad.
+ + = DNA visible almicroscopio
Cubierta de proteína Película de metal
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Conformacionesdel DNA
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Continuará…