Estructura genética poblacional, historia demográfica y ... · de 5 localidades. El estudio de la variación fenotípica se realizó mediante ... para organismos de reproducción

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Tesis Doctoral

Estructura genética poblacional,Estructura genética poblacional,historia demográfica y variaciónhistoria demográfica y variaciónfenotípica del róbalo, Eleginopsfenotípica del róbalo, Eleginops

maclovinus (Perciformes)maclovinus (Perciformes)

Ceballos, Santiago Guillermo

2011

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Ceballos, Santiago Guillermo. (2011). Estructura genética poblacional, historia demográfica yvariación fenotípica del róbalo, Eleginops maclovinus (Perciformes). Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Ceballos, Santiago Guillermo. "Estructura genética poblacional, historia demográfica yvariación fenotípica del róbalo, Eleginops maclovinus (Perciformes)". Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2011.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Ecología, Genética y Evolución

Estructura genética poblacional, historia

demográfica y variación fenotípica del róbalo,

Eleginops maclovinus (Perciformes)

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de

Buenos Aires en el área: CIENCIAS BIOLÓGICAS

�BAutor: Lic. Santia go Guillermo Ceballos

�BDirector de tesis: Dr. Daniel Alfredo Fernández

Codirector de beca de postgrado: Dr. Enrique Pablo Lessa

Consejero de Estudios: Dr. Esteban Hasson

Lugar de trabajo: Centro Austral de Investigaciones Científicas (CADIC-

CONICET)

Ushuaia, Tierra del Fuego, Argentina.

Buenos Aires, 2011.

2

Estructura genética poblacional, hi storia demográfica y variación

fenotípica del róbalo, Eleginops maclovinus (Perciformes)

Resumen

Para comprender los fenómenos involucrados en la evolución de las

especies es importante estudiar los patrones de variación geográfica de los

atributos genéticos y fenotípicos de las poblaciones. El presente trabajo analiza

la estructura genética y la variación fenotípica en el pez marino, Eleginops

maclovinus (róbalo), una especie endémica del sur de Sudamérica que

constituye uno de los recursos marinos costeros de mayor importancia

socioeconómica de la región. El estudio genético se realizó con individuos

colectados a lo largo de casi todo el rango latitudinal de la especie en la costa

atlántica y pacífica. Se obtuvieron secuencias parciales del gen mitocondrial

citocromo b de un total de 261 individuos provenientes de 9 localidades y

también se analizaron 9 loci de microsatélites en 239 individuos provenientes

de 5 localidades. El estudio de la variación fenotípica se realizó mediante

morfometría geométrica en 140 individuos provenientes de 4 localidades

ubicadas a lo largo de la costa atlántica. El ADN mitocondrial reveló un patrón

general de baja estructuración poblacional y una clara señal de expansión

demográfica ocurrida, probablemente, durante el Pleistoceno Medio. El análisis

de microsatélites sugirió la existencia de dos grupos genéticos, uno

principalmente de origen pacífico y otro atlántico. Considerando ambos tipos de

marcadores fue posible modelar la historia de la especie a lo largo de

diferentes ciclos glaciares. El estudio fenotípico permitió discriminar todas las

poblaciones estudiadas. Futuros análisis serán necesarios para establecer la

importancia relativa de los factores ambientales y genéticos en la variación

fenotípica.

Palabras clave: Eleginops maclovinus, róbalo patagónico, filogeografía, ADN

mitocondrial, microsatélites, morfometría geométrica.

3

Geographic genetic structure, de mographic history and phenotypic

variation of the Patagonian blenny Eleginops maclovinus

Abstract

In order to understand the evolution of species it is important to study the

patterns of geographic variation in phenotypic and genetic attributes of

populations. This Thesis analyzes the genetic structure and phenotypic

variation in the marine fish, Eleginops maclovinus (sea bass), an endemic

species of southern South America and one of the most important coastal

marine economic resources in the region. The genetic study was conducted

with individuals collected throughout almost the entire latitudinal range of the

species in the Atlantic and Pacific coasts. We obtained partial sequences of the

mitochondrial gene cytochrome b from a total of 261 individuals from 9

localities, and we also analyzed 9 microsatellite loci in 239 individuals from 5

localities. The study of the phenotypic variation was performed using geometric

morphometrics in 140 individuals from 4 localities along the Atlantic coast. The

mitochondrial DNA revealed a general pattern of low population structure and a

clear signal of population expansion occurred probably during the Middle

Pleistocene. The microsatellite analysis suggested the existence of two genetic

groups, one mainly from a Pacific origin and the other Atlantic. Taking into

account both markers we were able to model the history of the species along

different glacial cycles. The phenotypic study was able to discriminate all the

populations studied. Future analysis will be required to establish the relative

importance of environmental and genetic factors on phenotypic variation.

Key words: Eleginops maclovinus, Patagonian blenny, phylogeography,

mitochondrial DNA, microsatellites, geometric morphometric.

4

Agradecimientos

En primer lugar quiero agradecer a mi director de tesis, el Dr. Daniel

Alfredo Fernández por su constante guía y por ayudarme a progresar durante

todos estos años. Me considero un afortunado por haber tenido un director

como él y por pertenecer a un grupo de trabajo como el del laboratorio de

Ecofisiología del CADIC. Quiero agradecer especialmente a Jorge Calvo y a

Elba Morriconi porque me permitieron, cuando yo era todavía un estudiante de

secundaria, ingresar como ayudante al laboratorio donde hoy, 16 años

después, estoy entregando mi tesis doctoral. Agradezco también a todos mis

compañeros de laboratorio por la ayuda que me brindaron durante todos estos

años: Fabián Vanella, Daniel Aureliano, Sonia Rimbau, Marcelo Gutierrez,

María Eugenia Lattuca, Claudia Boy, Claudia Duarte y especialmente a las

chicas que tuvieron que soportarme más de cerca Mariela Victorio y Eli

Gonzalez.

Durante todo el desarrollo de la tesis tuve el gusto de contar con la co-

dirección del Dr. Enrique Lessa quien fue generoso con sus conocimientos y

estuvo siempre inmediatamente disponible para cualquier pregunta o

corrección. Le agradezco a él y a todo su grupo de trabajo por haberme

recibido en el laboratorio de Evolución de la Universidad de la Republica y por

haberme ayudado a desempeñar mis tareas allá, en especial a Carolina Abud,

Alejadro D’Anatro y Matías Feijoo.

También agradezco enormemente a Roberto Licandeo por su valiosa

colaboración en la obtención de muestras que fueron muy importantes para

este trabajo.

Finalmente quiero agradecer a Natalia, a mis amigos y a toda mi familia

por el apoyo constante durante todos estos años.

5

A mis padres

6

ÍNDICE

Capítulo 1. Introducción general.

1.1 Filogeografía………………………………………………………….. 8

1.2 Características del róbalo………………………………………….. 12

1.3 Historia geológica y clima de la región marina patagónica ……. 20

1.4 Importancia y objetivos………………………………………………25

Capítulo 2. Marcadores moleculares mitocondriales

2.1 Introducción…………………………………………………………. 28

2.2 Materiales y métodos………………………………………………. 29

2.3 Resultados…………………………………………………………... 34

2.4 Discusión…………………………………………………………….. 42

Capítulo 3. Marcadores moleculares nucleares: Microsatélites

3.1 Introducción…………………………………………………………. 48

3.2 Materiales y métodos………………………………………………. 49

3.3 Resultados…………………………………………………………... 53

3.4 Discusión…………………………………………………………….. 69

Capítulo 4. Morfometría geométrica

4.1 Introducción………………………………………………………….. 72

4.2 Materiales y métodos……………………………………………….. 72

4.3 Resultados…………………………………………………………… 74

4.4 Discusión……………………………………………………………... 82

Capítulo 5. Discusión general…….……………………………………. 85

Referencias……………………………………………………………….. 91

Anexo……………………………………………………………………… 99

7

CAPÍTULO I

Introducción General

CAPÍTULO 1 / Introducción general

8

1.1FILOGEOGRAFÍA

15 mil millones de años de evolución cósmica que transformaron la materia en vida y conciencia.

Carl Sagan, Cosmos 1980.

La teoría de la evolución es una de las ideas de la biología más

fascinantes y estimulantes intelectualmente. Según esta teoría toda la

biodiversidad que actualmente existe sobre la tierra desciende de una misma

forma ancestral de vida, mediante procesos y mecanismos de especiación que

son el foco de grandes debates. El proceso por el cual una especie evoluciona

en dos (especiación) implica, para organismos de reproducción sexual, el

desarrollo de algún tipo de mecanismo de aislamiento reproductivo. La

especiación puede ocurrir teóricamente en tres contextos geográficos

diferentes. Si una nueva especie evoluciona dentro del rango geográfico de su

ancestro el proceso se denomina especiación simpátrica . Si la nueva especie

evoluciona en un rango geográfico contiguo a la especie ancestral se denomina

especiación parapátrica . Si la nueva especie evoluciona en aislamiento

geográfico de la especie ancestral se denomina especiación alopátrica . Los

modelos de especiación simpátrica implican, generalmente, algún tipo de

selección natural disruptiva, por ejemplo en el consumo de dos tipos de

alimentos, llevando a la población hacia dos trayectorias evolutivas diferentes.

El modelo de especiación parapátrica se plantea en especies que mantienen

una distribución continua a través de un abrupto cambio ambiental. La

adaptación a las condiciones ambientales en un lado o el otro del ambiente

propiciaría la divergencia de los linajes. En el modelo alopátrico la ausencia de

flujo génico permitiría gradualmente la aparición de mecanismos de aislamiento

reproductivo como una consecuencia de la mutación, la deriva génica y la

adaptación a las condiciones ambientales locales. Si posteriormente la barrera

geográfica desaparece las poblaciones diferenciadas podrían expandirse hasta

generar una zona de contacto secundario o incluso una amplia zona de

superposición. Si el aislamiento reproductivo fue completo la selección natural

podría incrementar la diferenciación en el uso del hábitat para evitar la

competencia. Si, alternativamente, el grado de especiación es solo incipiente y


9

por lo tanto el aislamiento reproductivo alcanzado es incompleto, y si además la

adecuación biológica de los híbridos es menor a la de los progenitores,

entonces la selección natural podría favorecer el desarrollo de mecanismos de

aislamiento reproductivo completando el proceso de especiación. Los modelos

de especiación simpátrica y parapátrica, aunque teóricamente posibles, son

más controvertidos que el modelo alopátrico y cuentan con menos ejemplos en

la naturaleza (Coyne & Orr 2004; Ridley 2004).

Un abordaje que puede ser utilizado para intentar comprender los

distintos procesos involucrados en la evolución de las especies es el análisis de

la variación intraespecífica, ya que es esta variación la que en última instancia

se convierte en variación entre especies. Una aproximación posible para el

análisis de la variación intraespecífica es la Filogeografía. Esta subdisciplina de

la biogeografía consiste en analizar los linajes genealógicos de una

determinada especie en el contexto de su distribución geográfica. Los patrones

geográficos de variación genética resultantes son en general interpretados a la

luz de información sobre comportamiento, caracteres morfométricos, caracteres

de historia de vida, relaciones filogenéticas con especies cercanas,

paleontología, geología, historia geográfica, etc. El objetivo final de las

aproximaciones filogeográficas es inferir las fuerzas históricas y

contemporáneas responsables de la actual estructura genética de las

poblaciones o de especies cercanamente emparentadas (Avise 2009)

La mayoría de las especies muestran al menos cierto grado de

diferenciación genética en relación a su distribución geográfica (Avise 2000).

Dichas diferencias pueden atribuirse tanto a procesos actuales como históricos

que hayan limitado el flujo génico o a diferentes regímenes de selección

natural. A nivel multiespecífico las aproximaciones filogeográficas son útiles

para detectar aquellos procesos que han tenido un efecto generalizado sobre

los ecosistemas o comunidades bióticas de la región. Muchas especies con

distribución y características ecológicas parecidas tienden a mostrar historias

demográficas y estructuras poblacionales semejantes sugiriendo que las

fuerza biogeográficas históricas han concordantemente moldeado la estructura

genética de biotas regionales particulares (Bermingham & Moritz 1998; Lessa

et al. 2003; Avise 2009).


10

Los cambios climáticos ocurridos durante el Cuaternario constituyen uno

de los principales procesos naturales a los cuales se les atribuye haber tenido

un efecto importante sobre la actual arquitectura genética de las poblaciones,

en particular en zonas de alta latitud. Estos eventos climáticos pueden ser

vinculados a cambios demográficos en el pasado ya que si las variaciones en

el tamaño poblacional son grandes, estas dejan improntas genéticas en las

poblaciones que, en algunos casos, pueden ser datadas si se dispone de una

estimación de la tasa de mutación. La visión clásica propone que durante los

periodos fríos se habría producido una retracción hacia menores latitudes de la

biota en general donde habrían permanecido diferentes refugios o poblaciones

aisladas (favoreciendo la divergencia genética en condiciones alopátricas) a

partir de las cuales se habría producido la recolonización hacia latitudes

mayores durante los periodos cálidos. El efecto de los ciclos glaciales sobre los

patrones filogeográficos han sido bien documentados para la flora y fauna

terrestre de agua dulce en el hemisferio norte. Estudios recientes muestran que

muchos de los patrones filogeográficos de diferentes especies terrestres y de

agua dulce reflejan las consecuencias de una recolonización posterior al último

máximo glacial hace aproximadamente 20.000 años (Hewitt 2004).

La Patagonia es una de las áreas del continente americano menos

estudiada a nivel filogeográfico, sin embargo en los últimos años se acumuló

cierta cantidad de información sobre varios organismos, principalmente

terrestres y de agua dulce (revisado en Sérsic et al. 2011). Aunque algunos de

estos organismos muestran patrones de expansión que se corresponderían con

el final de la última glaciación, muchos otros habrían experimentado

expansiones demográficos más antiguas atravesando con relativa estabilidad

demográfica la última glaciación (Ruzzante et al. 2008; Pardiñas et al. 2011).

Asimismo, diferentes procesos y direcciones de expansión de rango sugieren

patrones filogeográficos más complejos que el patrón norte-sur que se propone

tradicionalmente (Sérsic et al. 2011).

Estudios recientes muestran que las fluctuaciones climáticas durante el

cuaternario también tuvieron un impacto importante sobre las especies

marinas, principalmente las costeras, aunque este fenómeno fue registrado

principalmente en el hemisferio norte (Maggs et al. 2008; Liu et al. 2011; Wilson

& Eigenmann 2011). En la zona más austral de Sudamérica, correspondiente a


11

la región patagónica, los estudios filogeográficos sobre organismos marinos

costeros son muy escasos y están, generalmente, restringidos a uno de los

márgenes costeros de la Patagonia, el Atlántico o el Pacífico. Estos estudios

fueron realizados en mamíferos marinos (Túnez et al. 2007; Pimper et al. 2010;

Feijoo et al. 2011), lapas (de Aranzamendi et al. 2011; González Wevar et al.

2011), gasterópodos (Cárdenas et al. 2009; Sánchez et al. 2011), cefalópodos

(Ibáñez et al. 2011) y macroalgas (Fraser et al. 2010; Macaya & Zuccarello

2010). Sin embargo, hasta el momento,según el conocimiento del autor, no se

cuenta con estudios filogeográficos en peces marinos de las costas

patagónicas (además del presente trabajo).

Una característica común a muchas especies marinas es el bajo nivel de

diferenciación genética entre poblaciones. Este hecho, generalmente atribuido

a la ausencia de barreras físicas al flujo génico y a la gran capacidad dispersiva

de organismos marinos, ya sea en una fase larval o adulta, ha llevado a la

concepción de que las poblaciones de organismos marinos son

demográficamente abiertas y típicamente panmícticas a lo largo de grandes

áreas del océano (Ward et al. 1994; Waples 1998; Avise 2000). Sin embargo,

trabajos recientes, utilizando marcadores moleculares con mayor poder de

resolución (generalmente microsatélites), cuestionan esta concepción ya que

encuentran en peces marinos unidades genéticas a diferentes escalas

geográficas (Hauser & Carvalho 2008; Knutsen et al. 2011).


12

1.2 CARACTERÍSTICAS DEL RÓBALO

Distribución y hábitat

El róbalo, E. maclovinus (Cuvier & Valenciennes 1830), es uno de los

peces marinos más conocidos y característicos de las costas de la región

patagónica. Esta especie, endémica de las aguas templadas y subantárticas

del sur de Sudamérica, tiene una distribución latitudinal muy extensa en el

Océano Pacífico desde Valparaiso, Chile (33°S) (Pequeño 1989), hasta el

extremo sur del archipiélago fueguino (~56°S), y en el Océano Atlántico hasta

el Golfo San Matías, Río Negro, Argentina (40°S) (Cousseau & Perrotta 2000)

incluyendo también el archipiélago de las Islas Malvinas (Figura 2.1). Si bien

ésta constituye el área principal de distribución geográfica de la especie,

existen reportes ocasionales de capturas en Mar del Plata, Buenos Aires

(comunicación personal con pescadores de la zona) e incluso aun más al norte

en aguas Uruguayas (Lopez 1963 citado en Licandeo et al. 2006).

Se trata de una especie euritérmica que debido a su amplia distribución

soporta un gran espectro de temperaturas que rondan los 20ºC, al norte de su

distribución, hasta un mínimo de 4ºC en aguas del Canal Beagle.

Batimétricamente es considerado un pez estrictamente costero que pasaría la

mayor parte de su vida en aguas de profundidades menores a los 50 m,

aunque ocasionalmente se lo ha capturado en profundidades de hasta 250 m

(Gosztonyi 1980; Brickle et al. 2005b). La presencia de adultos y juveniles es

también muy común en estuarios y en la boca de los ríos por lo que es

considerado un pez eurihalino.

Taxonomía

E. maclovinus es el único representante de la familia Eleginopidae,

perteneciente al suborden Notothenioidei (comúnmente llamados Nototénidos)

del orden Perciformes (Teleostei: Acantomorpha). Los Nototénidos son

considerados un grupo monofilético (Near & Cheng 2008) compuesto por 131

especies, 44 géneros y 8 familias (J. T. Eastman 2010, lista de especies de

nototénidos: http://www.oucom.ohiou.edu/dbms-eastman/Articles/Noto-


13

valid_spp_list.pdf). Todos los nototénidos carecen de vejiga natatoria y son en

general de hábitos bentónicos, aunque presentan una gran diversidad

ecológica y morfológica (Eastman 1993). Del total de especies, 104 se

distribuyen exclusivamente en aguas antárticas mientras que las restantes 27

en aguas templadas y subantárticas. La familia del róbalo, Eleginopidae, junto

con las familias, Pseudaphritidae y Bovichtidae son los tres linajes de más

temprana divergencia dentro de los nototénidos y contienen 13 especies, todas

ellas con distribución extra antártica (excepto una especie de Bovichtidae). Las

restantes 5 familias, conocidas como “el clado antártico”, contienen 123

especies, la gran mayoría de ellas con distribución exclusivamente antártica

(Figura 1.1). El clado antártico constituye uno de los ejemplos más claros de

radiación adaptativa en vertebrados que resultó en la dominancia de los

nototénidos en la diversidad (76.6%), abundancia (91.6%) y biomasa (91.2%)

de peces de la plataforma continental Antártica (Eastman 2005). El gran éxito

de los nototénidos en la Antártida es generalmente atribuido a la presencia de

glicoproteínas anticongelantes (AFGPs: Antifreeze glycoproteins) en casi todos

lo nototénidos antárticos, presumiblemente presentes también en el ancestro

común al clado antártico, y que habría permitido la colonización de las aguas

con temperaturas bajo cero, y posterior radiación en ausencia de otros grupos

competidores (Chen et al. 1997; Matschiner et al. 2011). En la actualidad se

postula también que otros factores históricos podrían haber tenido igual

importancia en el éxito de los nototénidos en la Antártida (Near et al. en

prensa).

El róbalo es considerado de gran interés para comprender la

diversificación de los nototénidos en la Antártida ya que, como grupo hermano

del clado antártico, representa el “punto de partida” de la radiación de los

nototénidos antárticos, es decir, podría presentar muchas características del

estado ancestral a la radiación (Eastman & Lannoo 2008).


14

Figura 1.1. Relaciones filogenéticas entras la s distintas familias de nototénidos inferidas

a partir de la secuencia completa del gen mitocondrial 16S rRNA (Near 2004). Modificado

de Eastman y Lannoo 2008. AFGP: proteínas anticongelantes.

Descripción general

E. maclovinus es un nototénido relativamente grande (alcanza un

tamaño de 80 a 90 cm de talla máxima). Su cuerpo es fusiforme, robusto y

ligeramente comprimido, cubierto con grandes escamas levemente ctenoideas

(pseudocicloideas). La cabeza y los ojos son relativamente pequeños, con

hocico corto y romo. La boca es terminal, pequeña y protráctil bordeada por

labios finos. Posee dos aletas dorsales que se encuentran próximas entre sí y

la aleta caudal es truncada. Presenta una sola línea lateral, característica que

lo distingue del resto de los nototénidos de la región. El color es oliva oscuro

en el dorso aclarándose hacia los costados y blanco en el vientre (Gosztonyi

1980; Cousseau & Perrotta 2000; Bovcon & Cochia 2007).


15

Foto 1.1. Ejemplar adulto de E. maclovinus de unos 30 cm de largo total capturado en las

cercanías de la localidad de Río Gallegos, Santa Cruz.

Edad y crecimiento

El róbalo es una especie de crecimiento rápido, especialmente en los

primeros años de vida, durante los cuales puede aumentar su tamaño a razón

de 110 mm al año. Los ejemplares más longevos encontrados llegan a 11 años

de edad con una talla máxima de alrededor de 90 cm de longitud total. Sin

embargo, existen varios trabajos que analizan la relación entre edad y

crecimiento en distintos puntos de la distribución del róbalo y que ponen de

manifiesto claras diferencias en las curvas de crecimiento y en las tallas y

edades máximas (Tabla 1.1 y Figura 1.3).

Reproducción

E. maclovinus es un pez hermafrodita secuencial protándrico, es decir

que durante su ciclo de vida primero madura sexualmente como macho y en

determinado momento de su desarrollo experimenta una reversión sexual, en la

cual las gónadas se reestructuran de testículos a ovarios transformándose en

hembra. Este fenómeno, inicialmente descripto en la población del Canal

Beagle (Calvo et al. 1992), fue registrado en distintas zonas a lo largo de su

distribución, incluyendo Islas Malvinas (Brickle et al. 2005b), Río Valdivia

(Licandeo et al. 2006) y Golfo San Matías (Gastaldi et al. 2009). En estos

estudios la talla y edad a la que se estimó la reversión sexual, definidas como

el punto en el cual el 50% de la población son hembras, variaron según la zona

de estudio entre 35 y 53 cm de largo total, y entre los 2 y 6 años de edad.


16

El ciclo reproductivo anual también varió según el área de estudio,

siendo la época de desove estimada para otoño/invierno en el Golfo San

Matías (Gastaldi et al. 2009), invierno/primavera en Puerto Deseado (Gosztonyi

1980) y primavera en Islas Malvinas (Brickle et al. 2005b). En este último sitio

se sugiere la existencia de un pico menor de desove en mayo.

El róbalo estaría caracterizado por una alta fecundidad y pequeños

huevos pelágicos y, mientras que las aguas costeras serían utilizadas

principalmente para alimentación, el desove podría ocurrir en aguas más

profundas (30-100 metros de profundidad) (Gosztonyi 1980; Brickle et al.

2005b). Sin embargo, Panoso et al. 1996 (citado en Licandeo et al. 2006)

reportan que el róbalo desova en zonas estuariales en Chile central.

Lugar Latitud L∞ inf K T 0 n Lmax Amax L50 A50

Río Biobio (1) 38°S 49.93 0.4 -0.31 126 60 6 38 4 SAO(2) 40°S 38.2 1.252 -0.29 471 53 5 34.9 2 Río Valdivia (3) 40°S 105.4 0.08 -1.03 261 79 10 35.7 4.5 Pto. Deseado(4) 47°S 121 0.14 0.16 191 78 8 ---- ---- Is. Malvinas(5) 51°S 124.4 0.136 -0.01 1403 90 11 53 4.2 Canal Beagle(6) 54°S 61.36 0.217 -0.45 682 70 8 43 6

Tabla 1.1. Se muestran los principales parámetros de crecimiento de la ecuación de von

Bertalanffy y de reversión sexual: L ∞ = largo asintótico promedio, K = constante de

crecimiento, T 0 = edad a largo 0, n = número de individuos analizados, Lmax = largo

máximo registrado, Amax = edad máxima registrada, L 50 y A 50 = largo y edad en el que el

50% de los individuos son hembras. Los valores en rojo fueron estimados en el

presente trabajo a partir de datos de la bibliografía. 1: (Veas 1998), 2: (Gastaldi et al.

2009), 3: (Licandeo et al. 2006), 4: (Gosztonyi 1 980), 5: (Brickle et al. 2005a), 6: (Calvo et

al. 1992;Huergo et al.).


17

Edad (años)

0 2 4 6 8 10 12 14

Long

itud

espe

rada

(cm

)

-20

0

20

40

60

80

100

120Río Biobio (Veas et al. 1998)SAO (Gastaldi et al. 2011a)Río Valdivia (Licandeo et al. 2006)Puerto Deseado (Gosztonyi 1980)Islas Malvinas (Brickle et al. 2005)Canal Beagle (Huergo et al. 1996)

Figura 1.3. Curvas de crecimiento en distin to puntos de la distribución del róbalo

estimadas a partir de los anillos anuales de los otolitos. Abreviaciones: San Antonio

Oeste (SAO).

Variación geográfica de los caracteres de historia de vida

Algunos autores postulan que las diferencias en las tallas y edades

máximas así como las de reversión sexual serían consecuencia de un efecto

ambiental, sobre el cual podrían estar también actuando factores de origen

antrópico, como la actividad pesquera (Gastaldi et al. 2011; Licandeo et al.

2006). En este sentido argumentan que las especies hermafroditas

secuenciales serían más susceptibles que las dioicas a la sobre pesca o la

pesca selectiva por tallas, por lo que un cambio de sexo a una menor talla (o

edad) podría ser una estrategia reproductiva exitosa en las zonas donde la

actividad pesquera es más intensa.

La época del año en que se producen las mayores capturas de róbalo en

la costa también varía geográficamente. Mientras que en el Golfo San Matías la


18

temporada de mayor pesca comienza en mayo y continúa hasta fin del invierno

(Gastaldi et al. 2009), en el sur de la Patagonia, en las provincias de Santa

Cruz (Gonsztonyi 1980) y Tierra del Fuego (Figura 1.4) las máximas capturas

se registran entre los meses de noviembre y abril con un marcado descenso en

la época invernal. Aunque estos datos no están corregidos por el esfuerzo

pesquero, la experiencia acumulada en el equipo de trabajo del labratorio de

Ecofisiología del CADIC en muestreo de róbalo en distintos momentos del año

avala este resultado (datos no publicados).

Figura 1.4. Promedio de captura en cada mes entre los años 2005 y 2009. Datos

obtenidos del parte de pesca artesanal de la provincia de Tierra del Fuego.

Alimentación

La dieta del róbalo se estudió en varios puntos de su distribución. Estos

trabajos coinciden en caracterizar a esta especie como un predador de amplio

espectro que se alimenta de gran variedad de algas e invertebrados del bentos

(principalmente crustáceos y poliquetos) (Isla & San Román 1995; Pavés et al.

2005; Licandeo et al. 2006; Martin & Bastida 2008; Gastaldi & González 2009).

Asimismo, algunos de estos trabajos concuerdan en que existiría un cambio

ontogenético en la alimentación de esta especie, pasando de una dieta más

carnívora en los estadios juveniles a una dieta más omnívora en el estadio

adulto (Licandeo et al. 2006; Gastaldi & González 2009).


19

Valor como recurso

El róbalo es uno de los pocos peces costeros sometidos a explotación en

la región patagónica. Si bien no constituye un porcentaje importante de los

desembarques totales de peces a nivel nacional, a nivel regional es el principal

pez sustentador de la pesca artesanal (seguido por el pejerrey).

Año Róbalo(Kg) Total (Kg) % Total

2009 6179 8266 74,8

2008 5435 7373 73,7

2007 2404 2982 80,6

2006 3173 4186 75,8

2005 1424 2426 58,7

Promedio ----- ------ 72,72

Tabla 1.5. Captura anual de róbalo. Datos obtenidos del parte de pesca artesanal de la

provincia de Tierra del Fuego.

El róbalo es además una especie de importancia deportiva y social que

fomenta el turismo en la región. Las ciudades de Río Grande (Tierra del Fuego)

y Puerto Santa Cruz (Santa Cruz) celebran en diciembre y febrero

respectivamente la Fiesta Provincial del Róbalo, un evento deportivo, artístico,

turístico y cultural, que incluye muestras artesanales, recitales, la elección de la

reina de la festividad y el concurso de pesca “12 horas del róbalo” que convoca

cada año más aficionados de la pesca de la región y del país. La Fiesta del

Róbalo concita el interés de la comunidad, donde se promueve el amor por lo

autóctono y regional, difundiendo el arte y las costumbres tradicionales (datos

tomados de la página del gobierno de la Provincia de Santa Cruz:

http://santacruzpatagonia.gob.ar).


20

1.3 HISTORIA GEOLÓGICA Y CLIMA DE LA REGIÓN MARINA PATAGÓNICA

La paleogeografía y paleoclimatología de la Patagonia proveen el marco

necesario para comprender los actuales patrones de biodiversidad de la región.

La Patagonia, región más austral de Sudamérica, es la única masa de tierra

continental en el mundo (excepto la Antártida) que se extiende más al sur de

los 40°S. El clima en Pat agonia sufrió variaciones significativas durante el

Cenozoico, particularmente desde el Mioceno. Las glaciaciones fueron

frecuentes en esta región durante el Plioceno y el Pleistoceno. Los episodios

de glaciación fueron suficientemente grandes como para permitir la formación

de una placa de hielo continua entre 36° y 56°S, con una extensión de casi

2500 km, que cubrió completamente los andes patagónicos y se extendió más

allá de los pies de las montañas hacia el este (y hasta la actual plataforma

submarina al sur de Río Gallegos) y hasta el nivel del mar en el lado pacífico

(Figura 1.5). La “Gran Glaciación Patagónica” (GGP) que representa el máximo

de expansión del hielo en la Patagonia extra andina se desarrolló en algún

momento entre 1.1 y 1 millón de años (Rabassa 2008). Luego de la GGP

existe evidencia de al menos 4 episodios principales de glaciación: Post-GGP

1, 2, 3 y la última glaciación (UG) (siguiendo la nomenclatura de Coronato et al.

2004). Post-GGP 1 probablemente ocurrió antes del límite entre el Pleistoceno

Medio y el Pleistoceno Temprano ( > 710Ka antes del presente). Post-GPG 2

alcanzó su mayor avance glacial hace ~ 260 ka (Hein et al. 2009) y post-GGP 3

hace ~ 145 ka (Kaplan et al. 2005) durante el Pleistoceno Medio. La última

glaciación, desarrollada durante el Pleistoceno tardío, alcanzó su máximo

(UMG) hace aproximadamente 25 Ka y terminó hace 15 Ka (Rabassa 2008).


21

Figura 1.5. Mapa de la Patagonia con la posición y distribución de las placas de hielo

durante el Pleistoceno. Del lado chileno el hi elo alcanzó las aguas del Océano Pacífico al

sur de los 44°S (sur de la isla Chiloé). Del lado argentino al sur de Río Gallegos el hielo

se extendió sobre la actual plataforma submarina durante la Gran Glaciación Patagónica

y glaciaciones del Pleistoceno Medio. Tomado de Rabassa et al. (2008).


22

Figura 1.6. Registro climático mediante la señal isotópica δ18O de sedimentos marinos.

Los eventos glaciales (altos valores de δ18O) e interglaciales (bajos valores de δ18O)

(modificado de Lisiecki & Raymo 2005).

Los periodos de glaciación (Figura 1.6) fueron acompañados por importantes

descensos del nivel del mar, entre -120 y -140 m respecto del nivel actual,

dejando expuestas grandes extensiones de la plataforma continental argentina

(Rabassa 2008). Debido a que las variaciones en el nivel del mar

probablemente hayan sido muy similares en cada ciclo glacial-interglacial

durante el último millón de años, el modelo paleogeográfico que se presenta en

la figura 1.7 con la posición de la línea de costa para la última glaciación,

podría ser aplicado para cualquiera de las glaciaciones previas (Ponce et al.

2011) y por lo tanto utilizado para discutir distribuciones paleobiogeográficas en

Patagonia durante la mayor parte del Pleistoceno.

Las condiciones oceanográficas actuales se muestran en la figura 1.8.


23

Figure 1.7. Posición de la línea de costa en momentos de aparente estabilidad del nivel

del mar. Tomado de Ponce et al. (2011).


24

Figura 1.8. Condiciones Oceanográficas actuales. Temperatura del agua en verano y

principales corrientes marinas en Patagonia: Corriente Circumpolar Antártica (CCA),

Corriente de Humboldt (CH), Corriente del Ca bo de Hornos (CCH), Corriente de Malvinas

(CM), Corriente Costera Patagónica (CCP).


25

1.4 IMPORTANCIA DEL TRABAJO Y OBJETIVOS

El róbalo (Eleginops maclovinus) es un pez marino costero de gran

importancia ecológica y socioeconómica en la región patagónica. A pesar de

esto no existían, previos a este trabajo, esfuerzos por caracterizar

genéticamente las poblaciones de esta especie a lo largo de su distribución

geográfica. Este tipo de estudios aportan información sobre la estructura y

dinámica de las poblaciones que resulta fundamental para el desarrollo de

estrategias de conservación y manejo.

La distribución del róbalo a lo largo de un amplio gradiente latitudinal,

tanto en la costa Pacífica como Atlántica de la Patagonia, en una zona que fue

intensamente afectada por los ciclos glaciares durante el cuaternario, ofrece

además una oportunidad para estudiar los fenómenos de diferenciación

poblacional en respuesta a la variación ambiental. Los dos márgenes costeros

de la Patagonia, el Atlántico y el Pacífico, aunque con muchas características

diferentes, son prácticamente paralelos en dirección norte-sur y en este sentido

constituyen dos “réplicas” de un escenario simple para estudiar el efecto de las

glaciaciones sobre los organismos marinos costeros. Esta ventaja geográfica

de la Patagonia fue poco aprovechada ya que no existen trabajos que analicen

la variación genética en una misma especie a lo largo de ambas costas.

En este contexto se plantearon los siguientes objetivos:

Objetivos generales:

Evaluar cómo han respondido las poblaciones de peces a la variación

ambiental asociada a un extenso gradiente latitudinal, tanto en términos de su

estructura genético-poblacional como en cuanto a la variación fenotípica. A

largo plazo, contribuir al conocimiento de los fenómenos de diferenciación (y en

última instancia especiación) en respuesta a la variación ambiental. Finalmente

se pretende aportar información de base necesaria para el manejo y la

conservación de una de las especies de mayor importancia ecológica y socio-

económica de la región.


26

Principales objetivos específicos:

1) Determinar la variabilidad genética y su estructuración geográfica en E.

maclovinus a lo largo de todo el rango latitudinal de la especie en la costa

Atlántica y Pacífica mediante:

a) El análisis de secuencias de ADN mitocondrial.

b) El análisis de loci de microsatélites.

2) Evaluar la variación fenotípica en distintos puntos de la distribución

geográfica de E. maclovinus mediante el estudio de la forma general del cuerpo

utilizando técnicas de morfometría geométrica.

3) Integrar los resultados para realizar inferencias sobre la historia demográfica

de la especie y su relación con los ciclos climáticos del Cuaternario.

27

CAPÍTULO 2

Marcadores moleculares mitocondriales

CAPÍTULO 2 / ADN mitocondrial

28

2.1 Introducción

Los marcadores moleculares mitocondriales son generalmente utilizados

como una primera aproximación al estudio de la estructura poblacional y

filogeografía de las especies, ya que presentan algunas ventajas respecto de

los marcadores nucleares. En primer lugar, existen en copias múltiples dentro

de cada célula eucariota lo que facilita su extracción y posterior amplificación

por PCR. En segundo lugar poseen, típicamente, tasas de mutación varias

veces mayores que las de los genes nucleares por lo que son muy

informativos, en particular para el estudio de linajes genéticos que han

divergido recientemente. En tercer lugar se heredan de manera haploide, sin

recombinación (aunque hay excepciones), generalmente por vía materna, lo

que permite generar filogenias intraespecíficas (filogenia de genes) que pueden

ser interpretadas como el linaje materno del pedigree de un organismo.

Originalmente el estudio del ADN mitocondrial en el presente trabajo se

había planteado a partir de secuencias de la región de control. Se intentó

amplificar esta zona utilizando una batería de diferentes primers, ya sean

generales para peces como específicos diseñados a partir de secuencias

disponibles de róbalo. Se probaron muchas condiciones de PCR diferentes

variando la temperatura y las concentraciones de los reactivos pero sin éxito,

por lo que finalmente se decidió seguir adelante utilizando las secuencias de

Cyt b (como se detalla más abajo). Investigadores italianos encontraron la

misma dificultad con la región de control de róbalo, por lo que secuenciaron el

genoma mitocondrial completo excepto esa región (Papetti et al. 2007).

Finalmente, en un trabajo posterior (Zhuang & Cheng 2010) se logró

secuenciar la región de control. En la misma se encontró una región repetitiva

de 288 pb de longitud (tacatata x 36; N°acceso GB GU214211.1). Esta podría

ser la razón por la cual no se tuvo éxito al intentar amplificar la región de

control.


29

2.2 Materiales y métodos

Obtención de muestras

Se colectaron ejemplares de róbalo en 9 localidades distribuidas a lo

largo de la costa argentina y chilena, abarcando casi todo el gradiente

latitudinal en que se distribuye la especie (Figura 2.1). En los sitios de

muestreo San Antonio Oeste, Puerto Madryn, San Julián, Rada Tilly y Canal

Beagle la pesca se realizó con redes de arrastre costero (Foto 2.1)

obteniéndose mayormente ejemplares juveniles. En Punta María se utilizaron

redes de enmalle agalleras caladas en la zona intermareal, mientras que en las

3 localidades chilenas (Concepción, Puerto Montt y Puerto Aysén) la pesca se

realizó con redes de enmalle agalleras caladas desde pequeñas

embarcaciones.

Foto 2.1. Pesca en el Canal Beagle con redes de arrastre costero.

Tanto en Punta María como en las localidades chilenas se obtuvieron

individuos de mayores tallas que en general eran adultos. En el laboratorio se

obtuvieron las medidas de Largo total (LT), Largo estándar (LS) y Peso total

(PT) de los ejemplares. A cada individuo se le tomó una muestra de

aproximadamente 1 gr de músculo rápido (fast twich o blanco) tomado de uno

de sus flancos. Los tejidos se colocaron en tubos plásticos de 2 ml con alcohol

99% y se conservaron en freezer a -20°C para posteriorm ente realizar la

extracción de ADN. El instrumental de disección y los tubos plásticos utilizados

fueron esterilizados previamente a la obtención de cada muestra para evitar


30

contaminación cruzada entre las mismas o con otras fuentes ambientales de

contaminación.

Figura 2. 1. Mapa del sur de Sudamérica donde se indican los puntos de muestreo de

ejemplares de E. maclovinus a lo largo de todo el rango latitudinal de distribución de la

especie: San Antonio Oeste (Lat 40° 43’S, Long 64° 57’O), Puerto Madryn (Lat 42° 46’S,

Long 65° 00’O) Rada Tilly (Lat 45° 56’S, Long 67° 32’O), Puerto San Julián (Lat 49° 18’S,

Long 67° 43’O), Punta María (Lat 53° 57’S, Long 67° 27’O), Canal Beagle (Lat 54° 50’S,

Long 68° 11’O) , Puerto Aysén (Lat 45° 19’S, 72° 50’O), Puerto Montt (Lat 41° 28’S,Long

72° 54’O) y Concepción (Lat36° 50’S. Long73° 03’O).


31

Extracción de ADN

El ADN total de cada muestra se obtuvo realizando una digestión con

proteinasa K seguida de extracción con cloruro de sodio y precipitación con

isopropanol. El protocolo utilizado (modificado de Miller SA et al. 1988) se

detalla en el ANEXO. Las extracciones fueron chequeadas mediante

electroforesis en gel de agarosa 1 % (foto 2.2).

Foto 2.2. Electrofoeresis en gel de

agarosa 1%, revelada con Bromuro de

etidio. En cada calle se sembraron 5ul de

ADN extraído de róbalo más 1ul de buffer

de siembra. El marcador de peso

molecular indica un rango de entre 100 y

1000 pares de bases.

Amplificación por PCR y secuenciación

Se amplificó mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

un fragmento de 926 pb de la región 3’ del gen mitocondrial citocromo b (citb)

en un total de 261 individuos de E.maclovinus (entre 24 y 38 de cada una de

las 9 localidades muestreadas; tabla 2.1). Se utilizó como primer forward el

MVZ05 5’ – CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTT - 3’ tomado de Smith and

Patton (1991) y como primer reverse el R1negra 5’ -

CCAGTACTCCTCCAAGTTTGTCGGGG - 3’ diseñado a partir de secuencias

de citocromo b de nototénidos disponibles en Gen Bank. Las amplificaciones se

llevaron a cabo en un volumen total de 30 ul conteniendo los siguientes

componentes: 15 µl del ADN extraído en una dilución 2/25 (~ 4 µg/ml) como

molde, 1 unidad de ADN Taq polimerasa (Promega), buffer Taq polimerasa 1X,

dNTPs (0.2 mM cada uno), primers (0.3 mM cada uno) y MgCl2 (2.5 mM). Las

reacciones de PCR se realizaron en un termo ciclador modelo 2720 de Applied

Biosystems con un programa que consistió en una desnaturalización inicial de


32

3 min a 94°C, seguido de 30 ciclos de 30 seg de desnaturalización a 94°C, 30

seg de asociación a 50°C y 1 min de extensión a 72°C, y una extensión final de

5 min a 72°C. Los productos de PCR fueron chequeados mediante

electroforesis en gel de agarosa 1 % (foto 2.3) y enviados para su

secuenciación con ambos primers a Macrogen S.A. (Korea).

Foto 2.3. Electrofoeresis en gel de agarosa

1%, revelada con bromuro de etidio. En cada calle se

sembraron 5 ul de producto de PCR de la

amplificación del gen citocromo b róbalo más 1ul de

buffer de carga. El marcador de peso molecular

indica un rango de entre 100 y 1000 pares de bases .

Edición de secuencias

Los electroferogramas que resultaron de las secuenciaciones fueron

visualizados y analizados con el programa “BioEdit sequence alignment editor”

(Hall 1999). Las secuencias forward y reverse fueron alineadas para confirmar

los resultados y resolver ambigüedades. Luego de eliminar las secuencias de

los extremos con baja calidad de secuenciación (que incluían los primers) se

obtuvieron secuencias de 833 pb que fueron utilizadas para los análisis

subsiguientes.

Análisis de datos

Los índices de diversidad molecular de los haplotipos de CitB [número

de haplotipos, sitios polimórficos, diversidad haplotípica (DiHa), diversidad

nucleotídica (NuDi) y número promedio de diferencias pareadas (π)] y los

Análisis de Varianza Molecular (AMOVA), FST pareados considerando como

distancia entre haplotipos el número de diferencias pareadas (pairwise), Test

de Mantel y las pruebas de neutralidad D de Tajima y FS de Fu fueron

calculados usando el programa Arlequin 3.11 (Excoffier et al. 2006).


33

La red de haplotipos (minimum spanning network) se generó usando el

método Media Joining (Bandelt et al. 1999) implementado en el programa

Network 4.6 (www.fluxus-engineering.com). La distribución de diferencias

pareadas observada y la esperada bajo un modelo de crecimiento poblacional

exponencial se calcularon usando el programa DNAsp V5.1(Librado & Rozas

2009). Se obtuvieron tasas de fijación especie-específicas para 5 especies de

nototénidos usando un reloj molecular relajado con el programa Beast v1.6.0.

Los análisis se llevaron acabo bajo el modelo mutacional HKI + I + G

seleccionado, usando el programa JModeltest (Posada 2008), como el modelo

más apropiado de evolución molecular. Se utilizaron 8 secuencias de citb: 4

secuencias representativas de E. maclovinus, 1 secuencia de cada uno de 3

nototénidos antárticos con glico proteínas anticongelantes (GPAC) Dissostichus

eleginoides, Notothenia coriiceps y Chionodraco rastropinosus, y una

secuencia del nototénidos de divergencia temprana Cottoperca gobio como

grupo externo (dado que E. maclovinus es considerado el taxón hermano de

todos los nototénidos antárticos, Near et al. 2008). La calibración se realizó

colocando al ancestro común más reciente de los nototénidos antárticos

(portadores de GPAC) hace 24 ± 0.5 millones de años (Near 2004; Janko et al.

2007). La estimación de los parámetros se basó en la distribución de la

probabilidad posterior construida por muestreo de 10 millones de generaciones

cada 1000 pasos, luego de descartar 1 millón de generaciones iniciales.

Los tamaños poblacionales históricos de E. maclovinus se estimaron

usando el método coalescente “Bayesian Skyline Plot” (Drummond et al. 2005)

implementado en el programa Beast v1.6.0. La corrida consistió en 100

millones de generaciones muestreadas cada 1000 generaciones bajo el modelo

mutacional HKY + G. Las muestras antes de la zona de convergencia se

descartaron. También se utilizó el programa Arlequin v3.11 para estimar

parámetros bajo el modelo de expansión espacial (Schneider & Excoffier 1999;

Excoffier 2004).


34

2.3 Resultados

Variación entre haplotipos

Se analizaron 261 secuencias de 833 pb de longitud. En el alineamiento

se identificaron un total de 58 haplotipos definidos por 65 sitios variables,

incluyendo 28 singletons (mutaciones encontradas en una sola secuencia) y 37

sitios parsimoniosamente informativos (números de acceso a GenBank:

JN010371 - JN010428; tabla 2.1 y anexo). De los 65 sitios variables 8 fueron

cambios no sinónimos, de los cuales 6 fueron singletons y los otros dos fueron

observados en 2 y 3 individuos respectivamente. La diversidad haplotípica y

nucleotídica global fueron 0.90 y 0.0039, respectivamente, variando localmente

la primera entre 0.82 y 0.96 y entre 0.0026 y 0.0054 la segunda. Se observó un

alto número de haplotipos únicos (32), la mayoría de ellos definidos por

singletons (28).

Población n S N°Sin k π HaDi (DE) NuDi (DE)

San Antonio Oeste 25 16 3 10 3.94 0.91 (0.03) 0.0047 (0.0027)

Pto. Madryn 27 23 1 16 4.53 0.96 (0.02) 0.0054 (0.0031)

Rada Tilly 25 15 10 12 2.15 0.89 (0.04) 0.0026 (0.0017)

Pto. San Julián 24 20 15 9 2.90 0.86 (0.04) 0.0035 (0.0021)

Pta. María 38 20 7 11 2.99 0.87 (0.03) 0.0036 (0.0021)

Canal Beagle 36 23 14 16 3.15 0.88 (0.04) 0.0038 (0.0022)

Puerto Aysén 31 21 10 16 3.53 0.91 (0.03) 0.0042 (0.0025)

Puerto Montt 28 23 17 14 3.25 0.87 (0.06) 0.0039 (0.0023)

Concepción 27 15 9 13 2.64 0.90 (0.04) 0.0032 (0.0019)

Todas las poblaciones. 261 65 28 58 3.28 0.90 (0.01) 0.0039 (0.0022)

Tabla 2.1. Variación genética en cada sitio: tamaño de muestras (n), número de sitios

polimórficos (S), número de singletons (N°S in), número de haplotipos (K), número

promedio de diferencias pareadas ( π), diversidad haplotípica (HaDi), diversidad

nucleotídica (NuDi), D esvío Estandar (DE).


35

Variación genética geográfica

No se observaron diferencias fijas entre las poblaciones. Los haplotipos

más frecuentes se encontraron en varias poblaciones a lo largo del rango

geográfico muestreado (Anexo). La varianza entre poblaciones fue baja

(1.62%) pero significativa (p=0.019, AMOVA). Los valores de FST pareados

variaron entre –0.019 y 0.085 (ver tabla en el ANEXO), indicando que la

diferenciación entre poblaciones fue baja o moderada dependiendo de la

comparación particular (Hartl & Clark 2007). El test de Mantel (Figura 2.2) no

mostró una correlación significativa entre las distancias geográficas y los

valores de FST, por lo que no se encontró un patrón de aislamiento por distancia

(r = 0.23, p = 0.096). El AMOVA jerárquico agrupando por un lado las

localidades ubicadas en el Océano Pacífico y por el otro las ubicadas en el

Océano Atlántico (aunque ubicando al Canal Beagle dentro del grupo Pacífico)

resultó en una varianza entre grupos significativa (Ventre= 2,37%; p= 0.007). Sin

embargo el análisis de cluster, utilizando como medida de distancia entre

localidades los FST pareados, no fue capaz de distinguir estos grupos (Figura

2.3).


36

Figura 2.2 Representación gráfica de la correlación entre Distancia Geográfica y F ST

pareados (r = 0.23, p = 0.096). Los círcul os rojos indican las comparaciones de F ST

significativamente distintas de cero (p < 0.05).


37

Figura 2.3. Cladograma construido con la función hclust del paquete stats del programa

R utilizando como distancia entr e localidades los valores de F ST pareados. Concepción

(CC), Canal Beagle (CB), Puerto Montt (Mon), Puerto Aysén (AY), San Antonio Oeste

(SAO), Punta María (Pma), Puerto Madryn (Mad), Puerto San Julián (SJ), Rada Tilly (RT).

Relación filogenética entre haplotipos

La red filogéntica de haplotipos (minimum spanning network) se muestra

en la figura 2.4. Los haplotipos presentes en relativamente alta frecuencia se

encontraron en casi todas las poblaciones reflejando la ausencia de una

estructura filogeográfica marcada. Los 5 haplotipos más frecuentes se

encuentran centralmente ubicados en la red, mientras que el resto de los

haplotipos se encuentran en frecuencias muy bajas y están separados de los

más frecuentes en la mayoría de los casos por uno o pocos pasos

mutacionales. Por lo tanto puede considerarse que el patrón observado tiene

una forma aproximadamente estrellada lo que probablemente refleje la

impronta de una expansión poblacional (Slatkin & Hudson 1991). Esta

posibilidad se analiza formalmente más abajo.


38

.

Figura 2.4 Red filogenética de haplotipos de citocromo b de E. maclovinus. El área de los

círculos es proporcional a la frecuencia de los haplotipos y la longitud de las ramas es

proporcional al número de eventos mutacion ales. Los colores indican las localidades.

Pruebas de neutralidad y distribución de diferencias pareadas

Ambos test de neutralidad, D de Tajima y Fs de Fu, mostraron,

consistentemente, valores negativos en todas las poblaciones. La D de Tajima

fue significativa en Rada Tilly, San Julián, Canal Beagle y Puerto Montt,

mientras que la Fs de Fu fue significativa en Puerto Madryn, Rada Tilly, Canal

Beagle, Puerto Aysén, Puerto Montt y Concepción (Tabla 2.2). Los valores

globales para ambos estadísticos fueron negativos y significativos (D = -1.99, p


39

< 0.01; Fs = - 25.93, p < 0.001). Los valores negativos de los test de

neutralidad indican un exceso de mutaciones en baja frecuencia en relación a

lo esperado en el equilibrio mutación-deriva y sugerirían una expansión

poblacional reciente (Ramos-Onsins & Rozas 2002). Un análisis global mostró

una distribución unimodal de diferencias pareadas, lo que sugiere que los

eventos de coalescencia habrían ocurrido en una ventana de tiempo angosta,

hecho que sería consistente con un evento demográfico de expansión

poblacional (Slatkin & Hudson 1991). El test de bondad de ajuste realizado en

Arlequin v3.11 no encontró desviación significativa de lo esperado bajo el

modelo de “expansión espacial (Sum of Squared deviation = 0.0007 y p = 0.94;

Slatkin 1991; Figura 2.5).

Tabla 2.2. Valores de las pruebas

de neutralidad D de Tajima y Fs

de Fu en las 9 localidades

muestreadas.

Population Tajima’s D Fu’s Fs

D P Fs P

San Antonio Oeste -0.25 0.42 -0.96 0.35

Pto. Madryn -0.87 0.19 -5.79 0.01

Rada Tilly -1.61 0.04 -5.94 0.00

Pto. San Julián -1.67 0.02 -1.35 0.26

Pta. María -1.24 0.11 -1.64 0.25

Canal Beagle -1.46 0.06 -6.46 0.00

Pto. Aysén -1.15 0.12 -6.59 0.01

Pto. Montt -1.61 0.04 -5.29 0.01

Concepción -1.10 0.13 -5.56 0.01

All populations -1.99 0.001 -25.93 0.00


40

Número de diferencias

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Fre

cuen

cia

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

ObservadoEsperado

Figura 2.5. Distribución observada y esp erada (bajo un modelo de crecimiento

exponencial) de las diferencias pareadas entre las secuencias obtenidas de individuos

de E. maclovinus provenientes de las costas pacífica y atlántica.

Estimación de la tasa mutacional y tamaño poblacional

Si se dispone de una tasa mutacional es posible datar el evento de

expansión poblacional. La estimación de la tasa de fijación (que se asume

equivalente a la tasa mutacional) obtenida para E.maclovinus fue de 0.0054

fijaciones por sitio por millón de años (95% HPD 0024-0.0087 Ma) (Fig 2.6).

Utilizando esta tasa como información de entrada se realizó el “Bayesian

Skyline Plot” (Fig 2.7). De la figura se desprende que la expansión pudo haber

comenzado aproximadamente hace unos 125.000 años. Teniendo en cuenta

los límites de 95% HPD del gráfico se podría establecer un intervalo de

confianza gruesamente estimado de entre 100.000 y 175.000 años para el

comienzo de la expansión. El tiempo de coalescencia de todos los haplotipos

se calculó en 0.92 Ma, 95% HPD 0.25-1.92 Ma. La estimación del momento de

la expansión basada en el modelo de expansión espacial sugiere una

antigüedad mayor: 0.283 Mya (95%CI: 0.147-0.523Mya).


41

.

Figure 2.6 Calibración del reloj molecular ut ilizando 4 haplotipos representativos de E.

maclovinus, 3 secuencias de nototénidos antárticos ( N. coriceps, D. eleginoides y C.

rastrospinosus) y una secuencia del nototénidos de temprana divergencia C. gobio. La

calibración se realizó colocando al ancestro común más reciente de los nototénidos

antárticos hace 24 ± 0.5 millones de años (Near 2004; Janko et al. 2007 ). Sobre las barras

se indica el valor medio de la tasa de fijación estimada para cada segmento. El gradiente

de colores se corresponde con el valor estimado de la tasa mutacional.


42

Figura 2.7. Estimación del tamaño poblacional histórico usando el método “ Bayesian

Skyline Plot” con los haplotipos de citocromo b de E. maclovinus. El eje X está en

unidades de millones de años antes del presente y el eje Y representa el producto del

tamaño poblacional efectivo y el tiempo generacional en escala logarítmica. La línea

negra es la estimación de la mediana y el área entre las líneas grises representa la región

del 95% HPD.

2.4 Discusión

A pesar de que no existen estimaciones directas de la capacidad dispersiva del

róbalo es esperable que la misma sea alta. La dispersión podría ocurrir por

desplazamiento de los adultos, dado que el róbalo puede alcanzar tamaños de

aproximadamente ~ 80-90 cm como tamaño máximo (Gosztonyi 1974;

Licandeo et al. 2006) y es un nadador activo como puede observarse en

acuarios (observaciones personales) y como lo sugiere su alta taza metabólica

que es comparable con la de otro teleósteos subantárticos con alta movilidad

(Vanella & Calvo 2005). La dispersión a través de huevos o estadios larvales

tempranos también podría ser importante: como lo propone Brickle et al

(2005b) el róbalo estaría caracterizado por una alta fecundidad y pequeños


43

huevos pelágicos, y, mientras que las aguas costeras serían utilizadas

principalmente para alimentación, el desove podría ocurrir en aguas más

profundas (30-100 metros de profundidad). Si esto es así, los pequeños huevos

pelágicos y los estadios larvales tempranos podrían estar sujetos a las

corrientes marinas lo que facilitaría la dispersión a grandes distancias. De

hecho, en muchos nototénidos antárticos con estadios pelágicos extendidos la

dispersión de larvas a través de corrientes marinas fue sugerida como una de

las principales razones por la cual comúnmente no se encuentran diferencias

significativas en estudios de genética de poblaciones de estas especies con

distribuciones de miles de kilómetros de extensión (Matschiner et al. 2009 y

citas incluidas).

Otro carácter de historia de vida, que ha sido propuesto como un factor

que potencialmente podría tener algún efecto sobre la estructura genética de

las poblaciones es el cambio secuencial de sexos (hermafroditismo protándrico

en el caso del róbalo). Chopelet et al (2009) puso a prueba la hipótesis de que

las especies que cambian de sexo están más estructuradas genéticamente que

las gonocoristas, lo cual se esperaría como resultado de una natural proporción

asimétrica de sexos que implicaría una reducción en el tamaño efectivo de las

poblaciones y por lo tanto un aumento de la deriva génica. Sin embargo, en el

mencionado trabajo, no se encontraron diferencias significativas entre modos

de reproducción.

Los resultados en el presente trabajo son consistentes con los

encontrados en otros nototénidos o peces marinos para lo cuales se esperan

altos niveles de flujo génico. Esto fue revelado principalmente por la baja

varianza genética entre poblaciones (1.62%) detectada por el AMOVA así

como por el alto número de secuencias compartidas (como se observa en la

red de haplotipos), reflejando un patrón general de baja estructuración

geográfica. A pesar de esto fue posible observar para algunas comparaciones

pareadas de FST una heterogeneidad genética moderada y significativa. Los

sistemas espaciales de una dimensión (como puede ser considerada la

población de róbalos debido a sus hábitos costeros) tienen una varianza

reducida en sus atributos genéticos geográficos en comparación con sistemas

de 2 dimensiones, lo que aumenta las posibilidad de que se desarrolle un

patrón de aislamiento por distancia (Slatkin & Barton 1989). Sin embargo, como


44

se deduce de la falta de correlación entre Fst pareados y distancia geográfica,

la heterogeneidad genética observada no se encuentra distribuida formando un

patrón de aislamiento por distancia. Este resultado podría atribuirse a un

evento relativamente reciente de expansión poblacional acompañado por altos

niveles de flujo génico.

Aunque el índice FST es una excelente medida de la diferenciación

geográfica entre poblaciones, las inferencias sobre los niveles de migración

basados en FST conllevan una cantidad de supuestos (Whitlock & McCauley

1999) que muy probablemente no cumplen las poblaciones estudiadas en este

trabajo. Las estimaciones de flujo génico mediante FST se basan en

predicciones de equilibrio derivadas de la teoría neutral aplicada a modelos

ideales de estructura poblacional (Slatkin & Barton 1989; Avise 2004a). Los

resultados (principalmente los valores negativos de las pruebas de neutralidad,

la distribución unimodal de las diferencias pareadas, la ausencia de un patrón

de aislamiento por distancia y el crecimiento poblacional indicado por el

Bayesian Skyline Plot) sugieren que las poblaciones de E. maclovinus estarían

lejos del equilibrio deriva-mutación y deriva-migración y que podrían haber

invadido recientemente una parte importante del área que ocupan. Por lo tanto

la baja estructuración global observada podría ser consecuencia no solo de los

actuales niveles de flujo génico sino también de la conectividad histórica entre

poblaciones. De esta manera inferencias sobre los niveles de migración

basados en FST podrían estar sobreestimados (un ejemplo que ilustra esta

situación puede hallarse en Mora et al. 2007). Sin embargo, es importante

destacar que, con el análisis de un solo locus, no sería posible descartar

apartamiento de la neutralidad como explicación alternativa o adicional al

patrón observado de variación genética.

La calibración del reloj molecular que se realizó en este trabajo,

siguiendo Near (2004) y Janko (2007), es consistente con los resultados

obtenidos en un trabajo reciente de Matschiner et al. (2011) donde se utilizaron

6 puntos de referencia para estimar tiempos de divergencia de nototénidos. El

tiempo de divergencia entre E. maclovinus y el clado antártico fue estimado en

42.3 millones de años en el presente trabajo, mientras que en Matschiner et al.

(2011) este evento fue estimado en 42.9 millones de años. Este importante

acontecimiento en la historia filogenética de los nototénidos coincidiría con el


45

comienzo de la apertura del Pasaje de Drake estimado hace aproximadamente

41 Ma, lo cual habría permitido la formación de la Corriente Circunpolar

Antártica y la subsecuente aislación térmica de la Antártida (Scher & Martin

2006). De todos modos las estimaciones de tiempo basadas en relojes

moleculares deben ser consideras como aproximaciones muy amplias.

La estimación del momento de la expansión espacial resultó en un valor

más antiguo que el calculado mediante el Bayesian Skyline Plot. Sin embargo

los intervalos de confianza de ambas estimaciones se superponen y ambas

sugieren que la expansión podría haber ocurrido durante el pleistoceno medio,

claramente antes del último máximo glacial pero después del evento de

glaciación post-Gran Glaciación Patagónica 1 (según la notación de Coronato

et al. 2004) de una antigüedad no menor a 710 Ka. Estos resultados son

similiares a los encontrados en especies de moluscos costeros patagónicos

utilizando marcadores mitocondriales y estimaciones de la tasa de mutación:

Cárdenas et al. (2009) en un estudio sobre la costa del Pacífico en el gatrópodo

Concholepas concholepas encontró evidencias de expansión poblacional y

estimó el comienzo de la misma hace 427.000 años (IC del 95%: 207-606)

utilizando el modelo “Sudden population expansion”; Aranzamendi et al. (2011)

en un estudio sobre la costa atlántica en la lapa Nacella magellanica también

encontró evidencia de expansión poblacional y estimó el comienzo hace

110.000 años basándose en el Bayesian Skyline Plot.

Generalmente se propone que las especies afectadas durante las

glaciaciones se habrían desplazado hacia el norte en busca de hábitats más

propicios (Ruzzante et al. 2008; Lessa et al. 2010). Considerando este

escenario E.maclovinus podría haber mantenido al menos dos refugios durante

las glaciaciones, uno del lado del Océano Pacífico y otro del lado del Océano

Atlántico. Sin embargo, los principales patrones de variación genética

encontrados en el segmento de ADN mitocondrial estudiado sugerirían que la

expansión detectada se habría originado desde un único refugio debido,

principalmente a: 1) La red de haplotipos no está fuertemente estructurada en

dos o más clados: 2) La distribución de diferencias pareadas es claramente

unimodal, mientras que al menos dos o más modas se hubieran esperado en

caso de que hubiera existido más de un refugio; 3) los valores de las pruebas

de neutralidad, tanto la D de Tajima como la FS de Fu toman valores más


46

negativos y significativos al considerar todos los datos juntos mientras que una

genealogía estructura habría llevado estos estadísticos hacia valores más

positivos. Por otro lado, aunque el AMOVA jerárquico que divide a las

poblaciones del Atlántico de las del Pacífico resultó significativo para la

varianza entre grupos, es importante destacar que el análisis de cluster falló en

distinguir dichos grupos. Incluso, el FST entre la población más al norte en el

Pacífico (Concepción) y la población más al norte en el Atlántico (San Antonio

Oeste) es cero.

Las dos poblaciones ubicadas más al norte en el Atlántico (San Antonio

Oeste y Pto. Madryn) se diferencian del resto de las localidades en algunos

aspectos. Estas localidades exhiben mayor diversidad nucleotídica (Tabla 2.1)

y valores menos negativos para las pruebas de neutralidad (excepto por FS de

Fu en Puerto Madryn) (Tabla 2.2). Esto podría ser evidencia de que existió un

único refugio del lado Atlántico o que al menos estas poblaciones podrían

haber permanecido más estables históricamente. Este escenario de mayor

estabilidad relativa en el NE de la distribución es compatible con el hecho de

que la costa pacífica fue más afectada durante las fases glaciales debido a que

los glaciares alcanzaban el nivel del mar al menos hasta la latitud de la Isla de

Chiloé (Clapperton 1993). Asimismo, debido a que el aumento de la

profundidad es más abrupto en el Pacífico, y la plataforma continental es menor

que en el Atlántico, el descenso del nivel del mar durante los periodos fríos,

habría dejado un área menor (o más angosta) con aguas de baja profundidad

como las que habitualmente ocupa el róbalo.

47

CAPÍTULO 3

Marcadores moleculares nucleares: microsatélites

CAPÍTULO 3 / Microsatélites

48

3.1 Introducción

Los microsatélites son secuencias de ADN conformadas por motivos

cortos, de una longitud de entre 1 y 6 pares de bases (pb), que se repiten

consecutivamente una cantidad determinada de veces. Este tipo de secuencias

están presentes en los genomas de la mayoría de las especies animales y

vegetales. Pueden ser altamente polimórficos, variando en general en el

número de veces en que se repite el motivo. Debido a su gran variación

constituyen unos de los marcadores moleculares más utilizados para estudios

de estructura poblacional. Aunque su función en el genoma no está clara, en

general se asume que son marcadores neutrales desde el punto de vista de la

selección natural, sin embargo su variación a nivel poblacional puede estar

ligada (por proximidad física en el genoma) a un locus no neutral (Goldstein &

Schlötterer 1999; Avise 2004a). Existe evidencia, además, de que algunos

microsatélites podrían tener influencia sobre la organización de la cromatina, la

regulación del metabolismo del ADN (ejemplo, replicación, recombinación, etc)

o la regulación de la actividad génica, por lo que al menos en este tipo de

microsatélites la variación en el tamaño del alelo podría no ser neutral (Li et al.

2002; Li et al. 2004).

El genotipado de cada locus de microsatélite consiste en realizar una

amplificación por PCR, utilizando primers diseñados a partir de las secuencias

flanqueantes a las secuencias repetitivas, y una posterior determinación del

tamaño del producto de PCR por electroforesis.

Comúnmente los primers específicamente diseñados para amplificar un

locus de microsatélite en una determinada especie pueden también funcionar

en especies cercanamente emparentadas. Por este motivo se probaron en E.

maclovinus 27 pares de primers para microsatélites descriptos en otros

nototénidos, pero sin éxito, por lo que finalmente se decidió desarrollar primers

específicos para E. maclovinus. Esto fue posible gracias al curso “Microsatélites

para estudios genéticos de eucariotas: un curso teórico y práctico” dictado en la

una Universidad de Campinas (UNICAMP), Brasil, en el mes de febrero de

2009 por la Profesora Anete Pereyra De Souza, donde se generó una

biblioteca genómica enriquecida en microsatélites (Ceballos et al. 2011).


49

3.2 Materiales y métodos

Construcción de una biblioteca enriquecida en microsatélites

Se extrajo ADN genómico de tejido muscular de un individuo colectado

en el Canal Beagle mediante digestión con proteinasa K seguida de extracción

con cloruro de sodio y precipitación con isopropanol siguiendo el protocolo

(modificado de Miller SA et al. 1988) que se detalló en la sección 2.2. A partir

del ADN extraído se construyó una librería genómica enriquecida en

microsatélites de acuerdo al método descripto en Billotte et al. (1999). En

resumen el procedimiento consistió en los siguientes pasos:

Se digirió el ADN genómico con la enzima de restricción RsaI y

posteriormente los fragmentos resultantes fueron ligado a adaptadores Rsa21

5´ CTCTTGCTTACGCGTGGACTA 3´ y Rsa25 5´

TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA 3´. La librería fue enriquecida en

secuencias con repeticiones de dinucleotidos usando los oligos biotinilados

(CT)8 y (GT)8 como sondas que fueron adheridas a partículas paramagnéticas

(Streptavidin MagneShpere, Promega) de acuerdo a la instrucciones del

fabricante. Se amplificaron por PCR los fragmentos enriquecidos en

microsatélites usando los primers complementarios a los adaptadores y se

ligaron al vector pGEM-T (Promega). Los fragmento fueron clonados

transformando bacterias Escherichia coli, cepa XL-1 Blue con los vectores. Las

células transformadas se cultivaron en placas de agar conteniendo ampicilina

(100 µg/mL), galactosidasa (50 µg/mL) y 30 µl of isopropil b-D-1-

tiogalactopiranosida (IPTG) (20 mg/mL). Se seleccionaron 96 colonias blancas

(aquellas que contenían el vector con inserto) y se conservaron a -80ºC. Los

plásmidos de estas colonias se purificaron por miniprep y se secuenciaron los

insertos con los primers SP6 y T7. Los electroferogramas que resultaron de la

secuenciación fueron visualizados y analizados con el programa “BioEdit

sequence alignment editor” (Hall 1999). Las secuencias forward y reverse

fueron alineadas para chequear los resultados y resolver ambigüedades. Luego

de excluir las secuencias que no contenían microsatélites o con microsatélites

demasiado cerca del final de la secuencia como para permitir el diseño de

primers, quedaron 23 loci candidatos. Usando el programa CID (Freitas et al.


50

2008) se identificaron las secuencias repetitivas simples (SSRs) y se diseñaron

primers específicos para cada locus. Luego de optimizar las condiciones de

PCR se pudieron obtener productos satisfactorios en 10 de los 23 loci. Los

niveles de polimorfismo en estos 10 loci se evaluaron en 48 individuos

capturados en la localidad de San Antonio Oeste, Río Negro. Un primer de

cada par se marcó con los fluorocromos HEX o 6-FAM. Las PCR se llevaron a

cabo en un volumen total de 20 µL conteniendo los siguientes componentes: 10

µL de AND templado (4 µg/mL), 1 unidad de ADN Taq polimerasa (Promega),

1× buffer Taq polimerasa, 0.2 mM de cada dNTP, 0.3 mM de cada primer y

MgCl2 2.5 mM. Las PCRs se llevaron a cabo en un termociclador modelo 2720

(Applied Biosystems) usando el siguiente ciclo: 95ºC por 3 min, seguido de 37

ciclos de 94ºC por 30 s, la temperatura de asociación específica del primer (Ta)

por 30 s, y 72ºC por 30 s, y un paso de extensión final de 5 min a 72ºC. Los

genotipos se determinaron utilizando el servicio de Genescan de Macrogen

Korea y se visualizaron con el programa Peak Scanner v1.0 (Applied

Biosystems). El programa Arlequin v3.11 (Excoffier et al. 2006) se utilizó para

calcular la heterocigosis observada y esperada (Ho y He respectivamente) y

para realizar los tests de Equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) para cada locus

y de desequilibrio de ligamiento entre loci. El programa MICROCHECKER 2.2.3

(Van Oosterhout et al. 2004) se utilizó para detectar errores de genotipado

debidos a tartamudeo, no amplificación de alelos grandes y/o presencia de

alelos nulos.

Caracterización de los loci de microsatélites

Solo el locus EmA4 mostró desviación significativa del EHW (P < 0.005).

No se encontró evidencia de errores de genotipado causados por tartamudeo,

no amplificación de alelos grandes o presencia de alelos nulos en ningún locus

excepto en EmA4, donde se encontró evidencia de posibles alelos nulos. Las

frecuencias genotípicas y alélicas del locus EmA4 se corrigieron según el

método Brookfield2 implementado en MICROCHECKER para la estimación de

alelos nulos. Luego de esta corrección no se observó desviación significativa

del EHW (Tabla 3.1). Ningún par de loci mostró valores significativos de


51

desequilibrio de ligamiento luego de realizar la corrección de Bonferroni para

comparaciones múltiples.

Tabla 3.1 Caracterización de 10 loci polimórficos de microsatellites de E. maclovinus.

NoA = número de alelos; T a = temperature de asociación; He = heterocigosis esperada;

Ho = heterocigosis observada. La muestra corresponde a 48 ejemplares capturados en

San Antonio Oeste.

Luego de poner a punto la amplificación de los microsatélites y su

caracterización con los individuos de San Antonio Oeste, se procedió a realizar

la amplificación y posterior genotipado en 48 individuos de cada una de las

siguientes localidades: Rada Tilly (RT), Canal Beagle (CB), Pto. Aysén (AY) y

Concepción (CC) (Figura 2.1).

Análisis de datos

El programa Arlequin v3.11 (Excoffier et al. 2006) se utilizó para calcular

el número de alelos, la heterocigosis observada y esperada (Ho y He

respectivamente), los test de Equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) y de

desequilibrio de ligamiento, el AMOVA, los índices FST pareados y el Test de

Mantel. El programa MICROCHECKER 2.2.3 (Van Oosterhout et al. 2004) se

utilizó para detectar errores de genotipado debido a tartamudeo, no

amplificación de alelos grandes y/o presencia de alelos nulos. La frecuencia de


52

alelos nulos se calculó por máxima verosimilitud utilizando el programa ML-Null

(Kalinowski & Taper 2006). El intervalo de confianza del 95% de la

heterocigosis esperada para cada población se calculó utilizando el paquete

PopGenKit de R.

La estructuración poblacional se exploró mediante el método bayesiano

presentado en Pritchard et al. (2000) e implementado en el software Structure

2.3.3. Este método consiste en asumir la existencia de un número K de clusters

(o poblaciones) cada una caracterizada por un determinado conjunto de

frecuencias alélicas en cada locus. Los individuos son luego asignados

probabilísticamente a un cluster o a una mezcla de clusters si sus genotipos

indican una ancestralidad mixta. Los análisis se llevaron a cabo para valores

de k entre 1 y 5 utilizando un modelo con el siguiente conjunto de parámetros:

1) Ancestralidad mixta (Admixture model). Asume que cada individuo pudo

haber heredado una fracción de su genoma de ancestros pertenecientes

a cada uno de los k clusters.

2) Información de muestreo (LOCPRIOR model) (Hubisz et al. 2009). Utiliza

como información a priori los lugares de procedencia de las muestras

para asistir la detección de estructura cuando la señal de diferenciación

es muy débil.

3) Frecuencias alélicas correlacionadas (Correlated alelle frequencies

model). Asume que las frecuencias alélicas en los distintos clusters

derivan de una misma población ancestral. Los autores del programa

sugieren este modelo para poblaciones con baja diferenciación.

4) Modelo con alelos recesivos (Falush et al. 2007). Asume la existencia de

alelos recesivos (o nulos) en los loci indicados por el usuario.

Se realizaron 6 corridas independientes para cada K. Análisis preliminares

mostraron que un descarte inicial (burn-in) de 50.000 iteraciones son

suficientes para alcanzar la zona de convergencia, luego de las cuales se

realizaron 100.000 iteraciones adicionales para obtener las estimaciones

finales.

La distancia genética DA (Nei et al. 1983) entre poblaciones se calculó

utilizando el programa POPTREE2 (Takezaki et al. 2009).

El patrón de cambio en el tamaño poblacional histórico se evaluó

mediante el cálculo del parámetro de crecimiento exponencial “g” utilizando el


53

método bayesiano implementado en el programa Lamarc v2.1.6 (Kuhner 2006).

El análisis para cada localidad consistió en una cadena de la cual se

muestrearon 30.000 árboles en intervalos de 40 generaciones luego de

descartar 4.000 árboles iniciales. Se asumió un modelo mutacional mixto

Stepwise/K-allele permitiendo optimizar la importancia relativa de cada modelo.

3.3 Resultados

Variación genética en los loci

El locus EmE9 mostró una intensidad muy baja o nula en los

electroferogramas, probablemente debido a la degradación de alguno de los

primers, motivo por el cual se decidió descartar este locus. Los restantes 9 loci

se renombraron con números del 1 al 9. Se genotiparon exitosamente 47

individuos en Puerto Aysén y 48 en cada una de las 4 localidades restantes

totalizando 239 individuos. El número de alelos detectados fue en general

elevado variando según el locus entre 8 (locus 6) y 62 (locus 8) (Tabla 3.2). En

4 loci (5, 7, 8 y 9) se detectaron diferencias de tamaño de alelos que no son

múltiplo de 2 (Anexo) evidenciando falta de ajuste al modelo de “Stepwise”.

La heterocigosis observada (promediada entre localidades) varió según el locus

entre 0.571 y 0.933 mientras que la esperada bajo el EHW varió entre 0.746 y

0.963 (tabla 3.3). El apartamiento del EHW, evaluado en cada población para

cada locus, fue significativo sólo en 6 de los 45 casos (9 loci x 5 poblaciones)

(Tabla 3.4). Los desvíos más importantes se observaron para el locus 6 que

mostró consistentemente una deficiencia de heterocigotas en 4 de las 5

localidades estudiadas (tabla 3.3 y figura 3.1).

El análisis realizado con el programa Microchecker no encontró

evidencia de errores de genotipado por tartamudeo o no amplificación de alelos

grandes, pero detectó la posible presencia de alelos nulos en aquellos loci que

mostraron un apartamiento significativo del EHW. La frecuencia de alelos nulos

estimada fue relativamente alta (entre 0.11 y 0.21) para el locus 6 en 4

localidades (Tabla 3.5). Por este motivo todos los análisis subsiguientes se

realizaron por duplicado, incluyendo y excluyendo el locus 6. Sin embargo, no


54

se encontraron diferencias apreciables por lo que se muestra la salida de los

análisis que incluyen al locus 6.

Tabla 3.2. Número de alelos detectados en cada locus y población. Para cada población

se indica entre paréntesis el número de individuos genotipados. Los locus

caracterizados en la tabla 3.1 (con excepción del locus EmE9) fueron renombrados con

números del 1 al 9. Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO), Rada Tilly (RT), Canal Beagle

(CB), Pto. Aysén (AY), Concepción (CC).

Tabla 3.3 Heterocigosis observada (Obs.) y esperada (Esp.) en cada locus y población,

así como los correspondientes promedios (Prom.). Abreviaturas: San Antonio Oeste

(SAO), Rada Tilly (RT), Canal Beagle (CB), Pto. Aysén (AY), Concepción (CC).

Heterocigosis Heterocigosis


55

Figura 3.1 Diferencia entre la heterocigosis esperada y observada para cada locus y

población. Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO ), Rada Tilly (RT), Canal Beagle (CB),

Pto. Aysén (AY), Concepción (CC).


56

Tabla 3.4 Valores de p obtenidos mediante el test de permutaciones para evaluar desvios

significativos del EHW. Los valores menores a 0.05 se muestran en rojo . Abreviaturas:

San Antonio Oeste (SAO), Rada Tilly (RT) , Canal Beagle (CB), Puerto Aysén (AY),

Concepción (CC).

Tabla 3.5 Estimación de la frecuencia de alelos nulos en los loci donde se encontró

evidencia de la presencia de los mismos. Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO), Rada

Tilly (RT), Canal Beagle (CB), Pu erto Aysén (AY), Concepción (CC).

Desequilibrio de ligamiento

El desequilibrio de ligamiento se evaluó para cada combinación posible de loci

tomados de a dos en cada sitio de muestreo lo que significó un total de 180

pruebas estadísticas. Diez de estas resultaron en un p menor a 0,05. Sin

embargo ninguna fue significativa luego de realizar correcciones por

comparaciones múltiples (Tabla 3.6). De todas maneras el par constituido por

los loci 3 y 9 resultó significativo (previo a la corrección por comparaciones

múltiples) en tres localidades como se observa en la tabla. Este resultado es


57

poco probable por azar y podría sugerir que estos loci se encuentran ligados.

Debido a que algunos de los análisis subsiguientes son sensibles al

desequilibrio de ligamiento (por ejemplo el realizado con el software Structure)

se decidió correr los análisis en tres condiciones distintas: sin el locus 3, sin el

locus 9 y con ambos locus. Los resultados fueron similares en los tres casos

por lo que se asume que de existir algún grado de ligamiento entre los loci 3 y

9, esto no estaría afectando sensiblemente los resultados. Por este motivo los

análisis siguientes incluyen a ambos loci.

Tabla 3.6. Se indican los valores de p en los casos que resultaron significativos para la

prueba de desequilibrio de ligamiento realiz ada con el programa Ar lequin 3.11. Asimismo

se indican los valores de p corregidos por comparaciones múltiples según 5 métodos

diferentes implementados en el programa SGoF+(Carvajal-Rodriguez A & de Uña-Alvarez

2011): método SGoF (BMC Bioinformatics: Carv ajal-Rodriguez et al 2009); método B-H

(Benjamini and Hochberg Journal of the Royal Statistical Society. Series B:1995); método

SGoF+(Carvajal-Rodriguez & de Uña-Alvarez 2010); método SFisher (MCP: Perez-Diz et al

2010); método Bonferroni secuencial (BS) (Holm 1979). En la primera columna entre

paréntesis el par de loci involucrados. Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO), Rada Tilly

(RT), Puerto Aysén (AY).

Prueba Valor - p SGoF B-H SGoF+ SFisher BS RT (1,6) 0.00228 0.737027 0.4104 1 0.482142 0.4104 RT (3,9) 0.00931 1 0.8136 1 0.632421 1 AY (3,9) 0.01356 1 0.8136 1 0.73299 1 RT (6,7) 0.02673 1 0.81972 1 0.811038 1 AY (4,8) 0.03416 1 0.81972 1 0.862684 1 SAO(3,9) 0.03703 1 0.81972 1 0.90095 1 SAO(3,6) 0.03752 1 0.81972 1 0.930313 1 SAO(4,5) 0.03832 1 0.81972 1 0.952675 1 RT(7,8) 0.04198 1 0.81972 1 0.968986 1 SAO(1,7) 0.04554 1 0.81972 1 0.980129 1

Variación genética en las localidades

La heterocigosis observada en las localidades (promediando los loci)

varió entre 0.851 y 0.883 mientras que la esperada varió entre 0.872 y 0.908

siendo las diferencias entre localidades no significativas (figura 3.2). El número


58

de alelos totales alcanzó el mayor valor en CC (218), la localidad ubicada más

al norte del lado Pacífico (tabla 3.1). Por otro lado, el número de alelos

específicos mostró una correlación negativa y significativa con la latitud (prueba

no paramétrica rs de Spearman, p = 0.017), encontrándose los mayores

valores en las dos localidades ubicadas más al norte: 20 en CC y 17 en SAO,

mientras que en CB, la localidad ubicada más al sur, solo se detectaron 7

alelos específicos (Tabla 3.1).

Figura 3.2 Heterocigosis esperada en cada población y su respectivos intervalos de

confianza (IC) del 95%, estimados por bootstrap. Los intervalos de confianza se solapan

mostrando que las diferencias no son signifi cativas. Abreviaturas: San Antonio Oeste

(SAO), Rada Tilly (RT), Canal Beagle (C B), Puerto Aysén (AY), Concepción (CC).

Estructura geográfica

El FST global estimado entre poblaciones fue de 0.0135 con un intervalo

de confianza del 95% estimado por bootstrap entre 0.009 y 0.0179. Los valores

de FST evaluados en cada locus por separado variaron entre 0.0035 y 0.02812


59

siendo significativos en 8 de los 9 loci (tabla 3.6). Los valores de FST pareados

entre poblaciones variaron entre 0.001 y 0.021 siendo significativos en 9 de las

10 comparaciones posibles (Anexo). Para evaluar la existencia de un patrón de

aislamiento por distancia se realizó un test de Mantel, el cual resultó no

significativo, pero mostró una tendencia positiva, con un p = 0.11 y coeficiente

de correlación = 0.41 (figura 3.7).

Las relaciones filogenéticas entre poblaciones estimadas por el método

de Neighbor Joining o UPGMA a partir de distancias genéticas basadas en las

frecuencias alélicas agrupan a SAO y RT en un clado y a CC, AY y CB en otro

(Figura 3.8).

Tabla 3.6 Diferenciación gené tica global entre poblaciones ( Fst) para cada locus y su

significancia.


60

Figura 3.7 Representación gráfica de la correlación entre Distancia geográfica y FST

pareados (r = 0.4, p = 0.1). Los círc ulos rojos indican las comparaciones de FST

significativamente distintas de cero (p < 0. 05). Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO),

Rada Tilly (RT), Canal Beagle (CB), Puerto Aysén (AY), Concepción (CC).


61

Figura 3.8. Relaciones genéticas entre las pobl aciones inferidas mediante el método de

Neigbour Joining (A) o UPGMA (B) a pa rtir de la distancia genética D A (Nei et al. 1983).

Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO), Rada Tilly (RT), Canal Beagle (CB), Puerto

Aysén (AY), Concepción (CC).

El análisis bayesiano usando Structure permitió detectar estructura geográfica

sólo bajo el modelo que incorpora información a priori sobre los sitios de

muestreo (Hubisz et al. 2009). Para cada valor de K entre 1 y 5 se realizaron 6

corridas independientes verificándose que las salidas arrojaron resultados

consistentes entre sí (Fig 3.9 y 3.10). El Logn de la probabilidad a posteriori de

los datos sugeriría que las mejores soluciones podrían corresponderse con k =

2 o k = 3 (figura 3.11).

Asumiendo K = 2, la ancestralidad inferida para los individuos de CC, AY y CB

se corresponde casi totalmente con el cluster 1 (rojo); SAO muestra una mayor

proporción de ancestralidad correspondiente al cluster 2 (verde), mientras que

en RT se observa un patrón intermedio.

SAO

RT

AY

CB

CC99

90

0.02

SAO

RT

CB

CC

AY

59

80

80

0.02

A)

B)


62

Con k = 3 resulta posible discriminar entre las 5 localidades de muestreo ya

que cada una posee una proporción de asignación a cada uno de los 3 clusters

que la caracteriza y lo mismo ocurre para k = 4 y K = 5.

En la figura 3.10 se observa que los individuos de las localidades de CC, AY y

CB se ubican sobre la arista derecha del triangulo reflejando que la

ancestralidad inferida tendría componentes del cluster 1 y 2, pero no del cluster

3. Asimismo los individuos de las localidades de SAO y RT se ubican sobre la

arista izquierda reflejando que la ancestralidad inferida tendría componentes

del cluster 1 y 3, pero no del 2. Este patrón que separa SAO y RT por un lado

(arista izquierda) y CC, AY y CB por el otro podría estar reflejando la misma

diferenciación que se observa con k = 2.


63

Figura 3.9. Cada barra vertical representa un individuo. El color se corresponde con la

proporción de asignación de cada individuo en cada cluster para valores de K entre 2 y

5. Los individuos están ordenados por localidad de muestreo: 1 = San Antonio Oeste, 2

= Rada Tilly, 3 = Canal Beagle, 4 = Puerto Aysén, 5 = Concepción.


64

Figura 3.10. Otra forma de representar la salida de Structure para K = 3. Cada punto

representa un individuo cuya ubicación en el esquema está determinada por la

proporción de asignación a cada cluster. Los colores indican la localidad de origen del

individuo: rojo = San Antonio Oeste, verde = Rada Tilly, azul = Canal Beagle, amarillo =

Puerto Aysén, fucsia = Concepción.


65

Figura 3.11 Inferencia del valor de K que mejor representa la estructura de los datos. Se

muestra el promedio y desvio estandar del Ln de la probabilidad a posteriori de los datos

de 6 corridas independientes para cada k.

Tanto el análisis de la relaciones filogenéticas entre las poblaciones como el

análisis de clusters realizado con Structure sugerirían la existencia de dos

grupos: uno atlántico conformado por las localidades de SAO y RT y otro

principalmente pacífico conformado por CC, AY y CB. Considerando esto se

realizó un AMOVA jerárquico que reveló una diferenciación entre grupos baja

pero significativa (Tabla 3.7).

Table 3.7 Resultado de AMOVA jerárquico considerando un grupo conformado por San Antonio Oeste (SAO) y Rada Tilly (RT) y otro conformado por Concepción (CC), Puerto Aysén (AY) y Canal Beagle (CB).

Fuente de variación Componentes de

varianza Valor de P

Entre grupos

Grupo1: SAO-RT

Grupo2: CC-AY-CB

0.00707 0.00391

Dentro de grupos 0.00927 0.00000


66

Cambios demográficos históricos

Para evaluar la existencia de cambios demográficos en el pasado se estimó el

parámetro de crecimiento exponencial “g” utilizando el programa Lamarc. La

ecuación utilizada para modelar el crecimiento poblacional en Lamarc es:

Θt = Θ0 exp – (g*t*µ)

En esta ecuación Θt es igual a 4Nµ en un tiempo t en el pasado medido en

número de generaciones y Θ0 es 4Nµ en el momento en que los organismos

fueron muestreados. Valores positivos de “g” indican que las poblaciones

posiblemente experimentaron crecimiento poblacional mientras que valores

negativos son compatibles con un decrecimiento.

El valor estimado del parámetro “g” resultó positivo en todas las localidades y

los correspondientes intervalos de confianza del 95% no incluyeron al cero

excepto en SAO. Los valores de “g” no difieren significativamente entre

localidades dado que sus IC se superponen (Figura 3.12).


67

Localidad

CC AY CB RT SAO

Val

or m

ás p

roba

ble

de "

g" e

IC d

el 9

5%

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Figura 3.12 Parémetro “g” de crecimiento exponencial y su intervalo de confianza (IC) del

95% estimado en Lamarc v2.1.6 (Kuhner 2006) ut ilizando 9 loci de microsatélites en las 5

localidades estudiadas: Concepción (CC); Pu erto Aysén (AY); Canal Beagle (CB); Rada

Tilly (RT); San Antonio Oeste (SAO).

La interpretación final del valor de “g” depende de la tasa de mutación que se

asuma. Si µ es muy chica entonces es probable que el crecimiento poblacional

no sea visible. Por el contrario valores altos de µ podrían implicar un ritmo

superior de crecimiento poblacional para los mismos valores de “g” y Θ0.

No se dispone de estimaciones de la tasa de mutación para los loci de

microsatélites empleados en este trabajo, sin embargo, tasas de mutación

razonables para microsatélites de di-nucleótidos de entre 10-3 y 10-4

mutaciones por locus por generación (Lai & Sun 2003; Avise 2004b),

implicarían un ritmo apreciable de crecimiento poblacional para los valores de

“g” y Θ0 obtenidos en las localidades estudiadas (Figura 3.14)


68

Figura 3.14. Los gráficos representan el ri tmo de crecimiento poblacional en las últimas

100.000 generaciones según los valores de “g” y Θ0 estimados para cada localidad

asumiendo dos tasas de mutación. Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO), Rada Tilly

(RT), Canal Beagle (CB), Puerto Aysén (AY), Concepción (CC).


69

3.4 Discusión

Tres loci mostraron apartamiento significativo del equilibrio de Hardy-

Weinberg como consecuencia, en todos los casos, de una deficiencia de

heterocigotas que, según los análisis realizados, sugerirían la presencia de

alelos nulos. Si se hubiera aplicado el ajuste de Bonferroni para pruebas

múltiples algunos de estos apartamientos del equilibrio habrían resultado no

significativos. Sin embargo, a diferencia de los loci 1 y 8 para los que se verificó

deficiencia de heterocigotas en solo una localidad, el locus 6 mostró

consistentemente el mismo patrón en 4 de las 5 localidades estudiadas lo que

permitiría descartar que esta observación sea simplemente producto del azar. A

pesar de esto, el hecho de que los análisis realizados con la presencia o

ausencia del locus 6 no hayan arrojado diferencias sustanciales pone de

manifiesto que el apartamiento del EHW consistentemente detectado en este

locus en varias localidades no estaría afectando apreciablemente los

principales patrones observados en los datos. Asimismo, dado que la

deficiencia significativa de heterocigotas se detectó en solo 6 de las 45 pruebas

realizadas (9 loci x 5 localidades) sería posible considerar que en cada

población los apareamientos se producen al azar (panmixia).

La variabilidad genética evaluada mediante la heterocigosis esperada no

varió significativamente entre las localidades. Sin embargo se observó un claro

patrón latitudinal en el número de alelos específicos de cada localidad,

encontrándose los valores más altos en las localidades ubicadas a menor

latitud, tanto sobre la costa atlántica como sobre la costa pacífica. Este

resultado podría indicar que las localidades ubicadas más al norte serían más

antiguas y probablemente la fuente a partir de la cual se colonizaron las zonas

ubicadas más al sur (Bowcock et al. 1994 realizan una interpretación

equivalente sobre la distribución de alelos específicos para loci de

microsatélites en humanos). Esto sugiere que en algún momento en el pasado

podrían haber permanecido dos poblaciones de E. maclovinus separadas, una

sobre su actual distribución noreste y la otra sobre el noroeste. Este posible

escenario sería compatible con el patrón de estructura geográfica revelado por

los datos. El análisis de las distancias genéticas entre las poblaciones mediante

el algoritmo de NJ y el de UPGMA concuerdan en agrupar por una lado las


70

localidades ubicadas en la Patagonia atlántica media y norte (SAO y RT: grupo

atlántico) y por el otro a las localidades del Pacífico y la del Canal Beagle (CC,

AY y CB: grupo pacífico). Este patrón también es distinguible en el análisis

bayesiano realizado con Structure. Para K=2 se observa que el cluster verde es

un componente exclusivo de SAO y Rada Tilly. Esta última localidad muestra

un patrón intermedio entre SAO y el grupo formado por CC, AY y CB lo cual

tiene sentido geográfico y por lo tanto sugiere que la estructuración detectada

es genuina, además de ser compatible con la tendencia, aunque no

significativa, de un aumento de la diferenciación con la distancia geográfica

(figura 3.7). El análisis con K = 3 resulta compatible con lo observado para k =

2 ya que también distingue los grupos antes mencionados: por un lado el

cluster azul (el 3 en el esquema triangular) está presente exclusivamente en

SAO y RT y por el otro, el cluster verde (el 2 en el esquema triangular) esta

presente casi exclusivamente en CC, AY y CB. Sin embargo, a diferencia del

análisis realizado con k = 2, es posible también diferenciar las localidades

dentro del grupo “pacífico” debido a la asignación asimétrica de cada cluster,

reflejando, probablemente, la naturaleza jerárquica en la que la varianza

genética se encuentra estructurada. En línea con estos resultados el AMOVA

realizado mostró diferencias significativas tanto entre grupos como dentro de

grupos.

Llamativamente el FST entre Canal Beagle y Concepción resultó muy

bajo apartándose de la tendencia general observada en la figura 3.7. La

similitud entre estas dos localidades es también evidente en el análisis

realizado con Structure. Una posibilidad es que esta similitud esté relacionada

con eventos de dispersión de larga distancia.

Los valores del parámetro “g” de crecimiento poblacional resultaron

positivos y significativamente distintos de cero en 4 de 5 localidades. Este

análisis no pretende asumir que los tamaños históricos poblacionales se

ajusten a un modelo de crecimiento exponencial, como tampoco intenta

calcular un ritmo preciso de expansión demográfica. Sin embargo los valores

positivos y significativos de “g” son compatibles con un posible escenario de

crecimiento poblacional histórico y en este sentido los resultados coinciden con

los obtenidos mediante ADN mitocondrial.

71

CAPÍTULO 4

MORFOMETRÍA GEOMÉTRICA

CAPÍTULO 4 / Morfometría geométrica

4.1 Introducción

El estudio de la variación fenotípica a nivel geográfico contribuye a

comprender los procesos ecológicos y evolutivos que influyen sobre la

biodiversidad y por lo tanto aporta al conocimiento de base necesario para el

manejo y conservación de las especies. La diferencias morfológicas entre

individuos pueden deberse a una variedad de procesos biológicos como, por

ejemplo, cambios ontogenéticos inducidos por el ambiente (plasticidad

fenotípica), adaptación a condiciones ambientales locales o divergencia

evolutiva (West-Eberhard 2003; Pigliucci & Preston 2004).

La morfometría geométrica (Bookstein 1997) es una de las herramientas

más poderosas para estudiar la variación de estructuras anatómicas complejas.

En esta aproximación la forma de una determinada estructura se representa

mediante la posición relativa de distintos puntos anatómicos llamados

landmarks los cuales se consideran homólogos entre todos los individuos del

estudio. Las relaciones espaciales propias de cada configuración de landmarks

permiten, en general, una descripción de la forma más precisa que la

morfometría tradicional de medidas lineales (Rohlf 2000). Otra ventaja de la

morfometría geométrica es que permite, además, una visualización e

interpretación sencilla de las diferencias en la forma (Zelditch et al. 2004).

El objetivo del presente capítulo es analizar, mediante técnicas de morfometría

geométrica, la forma general del cuerpo en individuos de E. maclovinus

provenientes de distintos punto de su distribución geográfica.

4.2 Materiales y Métodos

Se utilizaron un total de 140 individuos provenientes de 4 localidades: 52 de

San Antonio Oeste (SAO), 15 de Pto. Madryn (Madryn), 35 de Pto. San Julián

(SJ) y 38 de Canal Beagle (CB) (ver Figura 2.1). Para el estudio se

seleccionaron individuos juveniles de alrededor de 10 cm de largo total para

independizarse de efectos del tamaño en la forma. Los ejemplares fueron

fotografiados con una cámara digital marca Nikon modelo coolpix 4600,

utilizando un estativo para mantener la cámara a 30 cm de los individuos.

Utilizando un nivelador de burbuja se constató que la cámara de fotos y el


73

ejemplar estuvieran en planos paralelos. La puesta a punto de las fotografías

fue realizada siguiendo las recomendaciones propuestas por Zelditch et al.

(2004).

Se marcaron 19 landmarks (que se asumen homólogos) sobre el flanco

izquierdo de cada pez (Figura 4.1).

1- Extremo anterior del labio superior.

2- Poro anterior del sistema lateral sensitivo cefálico

3- Narina.

4- Extremo anterior del ojo.

5- Extremo posterior del ojo.

6- Centro del ojo.

7- Comisura occipital del sistema lateral sensitivo cefálico.

8- Inserción anterior de la primera aleta dorsal.

9- Inserción posterior de la primera aleta dorsal.

10- Inserción anterior de la segunda aleta dorsal.

11- Inserción posterior de la segunda aleta dorsal.

12- Inserción superior de la aleta caudal.

13- Inserción inferior de la aleta caudal.

14- Punto medio de la inserción de la aleta caudal.

15- Inserción posterior de la aleta anal.

16- Inserción posterior de la aleta ventral.

17- Inserción anterior de la aleta ventral.

18- Inserción superior de la aleta pectoral

19- Inserción inferior de la aleta pectoral.

El programa TpsDig (Rohlf 2005) se utilizó para colocar los landmarks en cada

foto y determinar sus coordenadas en los ejes “x” e “y”. Las configuraciones de

landmarks obtenidas se superpusieron con el método de Procustes

Generalizado (Rohlf 1999), implementado en el programa MorphoJ

(Klingenberg 2011) con el propósito de trasladar, rotar y escalar las imágenes

de manera de minimizar las distancias. Se realizó un CVA (Canonical variate

analysis) para encontrar las características morfológicas que mejor discriminan

entre los grupos estudiados. Se obtuvieron las grillas de deformación para


74

destacar las zonas principales de variación en forma. Se realizaron un total de

1000 permutaciones de individuos entre grupos como test no paramétrico de la

significancia de la distancia Procrustes y de Mahalanobis entre pares de

grupos. Finalmente se realizaron pruebas de clasificación correcta/incorrecta

mediante validación cruzada entre pares de localidades utilizando el programa

MorphoJ (Klingenberg 2011) y pruebas globales utilizando el programa PAST

v2.13 (Hammer et al. 2001).

Figura 4.1. Ejemplo de las foto s tomadas a los ejemplares de E. maclovinus para el

estudio de morfometría geométrica. Los puntos rojos corresponden a los landmarks.

4.3 Resultados

Inicialmente se realizó un Análisis de Componentes Principales (PCA)

mediante el cual no fue posible distinguir entre localidades. Por ese motivo se

procedió a realizar un análisis canónico el cual mostró una buena

discriminación entre localidades. En conjunto los 3 ejes discriminantes

distinguen a todos las localidades entre si. La variación entre grupos explicada

por el eje canónico 1 fue más del doble que la explicada por el eje canónico 2 o

el eje canónico 3. Específicamente el EC1 explicó el 54,7 % de la varianza

entre grupos, el EC2 el 24,7% y el EC3 el 22,6%. En el eje EC1 se distingue


75

principalmente la localidad de Canal Beagle de las otras 3 (Figura 4.3). Como

puede inferirse de la grilla de deformación correspondiente al EC1 estas

diferencias morfológicas podrían atribuirse principalmente a un cuerpo más

comprimido dorso-ventralmente en la zona de la aleta pectoral (indicado por el

desplazamiento relativo de los landmarks 16, 17 y 19) y a una posición más

posterior del extremo posterior de la aleta anal (indicada por el desplazamiento

del landmark 15) (Figura 4.6). Los otros dos ejes canónicos, aunque explican

un menor porcentaje de varianza entre grupos, contribuyen en combinación con

el eje 1 a diferenciar todas las localidades entre si.

Las distancias pareadas de Mahalanobis y de Procrustes entre

poblaciones fueron en todos los casos significativas (Tabla4.1, p < 0.0001). La

validación cruzada realizada para evaluar la fiabilidad de la discriminación entre

grupos mediante comparaciones pareadas, correctamente asignó a los

individuos a sus grupos en general en más del 80 % de los casos (Tabla 4.2).

Las excepciones involucran a Pto. Madryn, la localidad con menor número de

ejemplares (Tabla 4.2 y 4.3).

Figura 4.2. Superposición de procrustes de los landamarks. Los puntos azules de mayor

tamaño ubicados en el centro de cada nube corresponden a la configuración de

consenso.


76

Figura 4.3 Eje canónico 1 vs. eje canónico 2. Los colores se corresponden con las 4

localidades estudiadas. Las elipses representan el área del 95% de confianza para cada

localidad. Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO), Puerto Madryn (Madryn), Puerto San

Julián (SJ), Canal Beagle (CB).

Eje canónico 1

Eje

can

ónic

o 2

Eje canónico 1

Eje

can

ónic

o 2


77





Eje canónico 1

Eje

can

ónic

o 3

Eje canónico 1

Eje

can

ónic

o 3


78





Eje canónico 2

Eje

can

ónic

o 3

Eje canónico 2

Eje

can

ónic

o 3


79

Figura 4.6 Grilla de deformación. Cambio de forma asociado con valores positivos del eje

canónico 1.

Figura 4.7 Grilla de deformación. Cambio de forma asociado con valores positivos de eje

canónico 2.

Figura 4.8 Grilla de deformación. Cambio de forma asociado con valores positivos de eje

canónico 3.


80

Tabla 4.1. Distancias de Mahalanobis en la matriz triangular inferior y distancias de

Procustes en la matriz triangular superior. Las distancias son en todos los casos

significativas (p < 0.0001). Abreviaturas: Sa n Antonio Oeste (SAO), Puerto Madryn

(Madryn), Puerto San Julián (SJ), Canal Beagle (CB).

SAO Madryn SJ CB

SAO - 0.0174 0.0107 0.0138

Madryn 4.85 - 0.0172 0.0159

SJ 3.47 4.97 - 0.0128

CB 4.88 5.38 5.13 -

Tabla 4.2. Pruebas de validación cruzadas d onde se indica la cantidad de individuos que

fueron correctamente asignados a su grupo de origen para todas las comparaciones

pareadas posibles (a-f). Abreviaturas: San Antonio Oeste (SAO), Puerto Madryn

(Madryn), Puerto San Julián (SJ), Canal Beagle (CB).

a) SAO- Madryn

Grupo de

origen

Grupo asignado

SAO Madryn Total % de

validación

SAO 46 6 52 88

Madryn 5 10 15 67

b) SAO-SJ

Grupo de

origen

Grupo asignado

SAO SJ Total % de

validación

SAO 44 8 52 85

SJ 6 29 35 83


81

c) SAO-CB

Grupo de

origen

Grupo asignado

SAO CB Total % de

validación

SAO 50 2 52 96

CB 2 36 38 95

d)Madryn-SJ

Grupo de

origen

Grupo asignado

Madryn SJ Total % de

validación

Madryn 9 6 15 60

SJ 6 29 35 83

e) Madryn - CB

Grupo de

origen

Grupo asignado

Madryn CB Total % de

validación

Madryn 13 2 15 86

CB 2 36 38 95

f) SJ-CB

Grupo

verdadero

Grupo asignado

SJ CB Total % de

validación

SJ 32 3 35 91

CB 3 35 38 92


82

Tabla 4.3 Tabla de asignación global realizada con el método Jackknifing de validación

cruzada implementado en PAST v 2.13 (Hammer et al. 2001). Abreviaturas: San Antonio

Oeste (SAO), Puerto Madryn (Madryn), Puerto San Julián (SJ), Canal Beagle (CB).

SAO Madryn SJ CB Total %Val.

SAO 40 2 6 4 52 77

Madryn 2 9 3 2 16 56

SJ 7 4 21 3 35 60

CB 5 1 1 32 39 82

4.4 Discusión

Los caracteres morfométricos, al igual que los fenotípicos en general,

tienen la complicación de estar influenciados tanto por factores ambientales

como genéticos, y la importancia relativa de ambas fuentes de variación es

difícil de determinar. Una manera directa de abordar esta problemática sería

mediante experimentos de crianza común (common garden), donde las

variables ambientales se controlan de modo de poder distinguir los

componentes ambientales y genéticos de la variación fenotípica (Conover et al.

2006). Este tipo de experiencias son, en general, muy difíciles de llevar a cabo

en organismos no modelos debido a la imposibilidad de cría en cautiverio de

algunas especies o a ciclos de vida largos. Otro tipo de aproximación directa

involucraría una búsqueda a nivel genómico de loci asociados con algún rasgo

fenotípico determinado. Sin embargo, es posible hacer algunas aproximaciones

indirectas para obtener indicios de que tipo de factores estarían influyendo más

sobre la diferenciación fenotípica, como evaluar correlaciones entre distancias

genéticas, distancias ambientales y distancias morfológicas (Jorgensen et al.

2008; Ruzzante et al. 2011).

Existen dos tipos principales de variación genética que se utilizan

frecuentemente en estudios evolutivos, especialmente en aquellos relacionados

con la biología de la conservación. Una es la variación molecular que se

asume neutral desde el punto de vista de la selección natural porque no afecta

el fenotipo, y por lo tanto se supone que no influiría sobre el fitness. La otra


83

sería la variación genética entre individuos que afecta el fenotipo, y que por lo

tanto potencialmente podría afectar el fitness. En este caso la selección natural

podría favorecer la divergencia adaptativa o bien limitarla en el caso de que la

selección sea estabilizadora. La geografía de la variación genética de genes

neutrales y no neutrales proveen información muy diferente sobre la ecología y

la evolución de las especies (Shaw & Mullen 2011).

En la presente tesis se utilizaron marcadores moleculares que se

asumen neutrales para los que además no habría ninguna razón para creer

que tuvieran algún efecto sobre la forma del cuerpo. Sin embargo, caracteres

independientes pueden estar correlaciones debido a una historia evolutiva en

común (D’Anatro & Lessa 2006; Leinonen et al. 2006). Al igual que los análisis

multilocus realizados en esta tesis, el análisis de morfometría geométrica

mostró ser suficientemente preciso como para distinguir entre todas las

localidades estudiadas, pudiendo, además, asignar correctamente a los

individuos a sus respectivas poblaciones en más de un 80 % en promedio. El

eje canónico 1, que explica más del 50% de la varianza entre grupos es el que

permite distinguir más claramente al Canal Beagle de las otras 3 localidades

estudiadas. Por otro lado el análisis con microsatélites realizado en el capítulo

3 sugiere una mayor afinidad genética del Canal Beagle con las localidades

ubicadas sobre la costa Pacífica que sobre la Atlántica. Por este motivo sería

interesante realizar un estudio de morfometría en localidades sobre la costa

Pacífica. De esta manera sería posible evaluar si la localidad del Canal Beagle

posee mayor afinidad morfológica (por ejemplo en los caracteres asociados a la

variación en el eje canónico 1 de este estudio) con localidades en el Pacífico o

en el Atlántico. En este sentido, una mayor afinidad morfológica del Canal

Beagle con el Pacifico que con el Atlántico, en conjunto con la mayor afinidad

genética detectada en el análisis de microsatélites, podría estar indicando una

historia evolutiva común. Lamentablemente, por cuestiones de logística, no fue

posible incluir en este trabajo localidades del lado pacífico.

El estudio de morfometría geométrica se realizó en individuos

juveniles de aproximadamente 10 cm debido a que es el tamaño de pez más

fácil de capturar. Si en los individuos adultos las diferencias morfológicas entre

localidades se mantienen, estas deberían ser mayores en términos absolutos

de distancia, por lo que el análisis podría ser más robusto.


84

Futuros estudios deberían extenderse a individuos de mayor tamaño,

incorporar un mayor número de localidades, tanto para el análisis morfométrico

como para el análisis multilocus y tratar de establecer posibles patrones de

correlación entre caracteres morfológicos, genéticos, ambientales y

geográficos.

CAPÍTULO 5 / Discusión general

85

CAPÍTULO 5. Discusión general

En el presente trabajo se logró caracterizar los principales patrones de

variación genética en la especie E. maclovinus a lo largo de casi toda su

distribución utilizando como marcadores genéticos secuencias mitocondriales

del gen del citocromo b y loci nucleares de microsatélites.

Los análisis con ambos tipos de marcadores moleculares mostraron

similitudes en algunos aspectos y diferencias en otros. Ambos tipos de

marcadores detectaron importantes niveles de polimorfismo, pero con débil

estructuración geográfica reflejada en los bajos porcentajes de variación entre

localidades. Este resultado es común en especies marinas y es generalmente

interpretado como la consecuencia de la influencia (en combinación o no) de 3

factores principales: expansiones recientes del rango de distribución, altos

niveles de flujo génico y tamaños poblacionales grandes (Hauser & Carvalho

2008). Las expansiones recientes de rango contribuirían a un bajo nivel de

diferenciación porque implicarían conectividad histórica entre poblaciones; el

flujo génico sería una fuerza homogeneizadora importante en el ambiente

marino debido a la ausencia de barreras físicas para la migración, y los

tamaños poblacionales grandes implicarían una menor contribución de la deriva

génica en la diferenciación poblacional. En E. maclovinus ambos tipos de

marcadores muestran patrones de variación compatibles con una posible

expansión poblacional. Además, a pesar de que no existen estimaciones

directas de la capacidad dispersiva del róbalo es esperable que la misma sea

alta, dadas las características de la especie: la migración sería posible

mediante el desplazamiento de los adultos, ya que son activos nadadores, o

mediante la dispersión de los huevos y larvas pelágicas. Finalmente la

abundancia de E. maclovinus a lo largo de toda su distribución permite suponer

tamaños poblacionales grandes. Por lo tanto E. maclovinus no sería la

excepción a la regla en organismos marinos y los bajos niveles de variación

entre localidades estimados con ambos tipos de marcadores moleculares

podrían ser la consecuencia de la combinación de los 3 factores anteriormente

mencionados.

Por otro lado, la principal diferencia entre ambos tipos de marcadores

sería que el análisis con ADN mitocondrial parece reflejar una expansión desde


86

un único refugio ubicado probablemente al NE de su actual distribución

(Océano Atlántico a la latitud de la Provincia de Río Negro), mientras que el

análisis de microsatélites indicaría dos refugios (o al menos dos zonas de

mayor estabilidad demográfica) ubicados en el NE y NO de la actual

distribución de la especie (Océano Atlántico a la latitud de la Provincia de Río

Negro, y Pacífico Sur a la latitud de Concepción). Los principales resultados

obtenidos a partir de las secuencias mitocondriales, que indicarían un único

refugio son: la distribución unimodal de las diferencias pareadas y los valores

negativos de las pruebas de neutralidad globales. En el caso de los

microsatélites la principal evidencia que sugiere dos refugios es el

ordenamiento latitudinal en el número de alelos específicos, tanto en el

Atlántico como en el Pacífico. Además, aunque en ambos casos los FST entre

grupos (Atlántico y Pacífico) resultaron significativos y de valores comparables

(lo que atenúa la diferencia entre ambos tipos de marcadores), en el caso de

los microsatélites la distinción entre ambos grupos fue consistentemente

detectada por el análisis realizado con el programa Structure y por el

fenograma construido a partir de las distancias genéticas DA de Nei entre

localidades. En cambio, en el caso del ADNmt el análisis de cluster no logró

distinguir dichos grupos, incluso el FST pareado entre la población más al norte

en el Pacífico, (Concepción) y la población más al norte en el Atlántico, (SAO)

es cero.

Es posible imaginar al menos dos escenarios históricos que expliquen la

aparente discordancia entre los resultados mitocondriales y los de

microsatélites:

- Escenario 1) La población de E. maclovinus experimentó cambios

demográficos en el pasado, siendo la distribución actual el resultado de la

colonización desde 2 refugios, uno en el NE y otro en el NO de su actual

distribución, como sugieren los análisis realizados con microsatélites. La

expansión aparente desde un único refugio que refleja el patrón mitocondrial,

podría ser consecuencia de la expansión de una variante ancestral en toda la

distribución, luego de un contacto secundario entre las poblaciones

originalmente separadas. Dicha expansión debiera estar mediada por la

selección natural.


87

- Escenario 2) La población de E. maclovinus experimentó una

expansión poblacional desde un único refugio, probablemente durante el

Pleistoceno Medio, como sugiere el ADN mitocondrial. Subsecuentes

fluctuaciones demográficas (una situación esperable dado los cambios

climáticos; ver figura 1.6), probablemente menos severas, serían las

responsables del patrón observado con loci de microsatélites. Específicamente,

la historia posterior habría facilitado la persistencia de variación microsatelital

en las regiones más estables de la distribución, es decir en las áreas a menor

latitud, tanto en el Pacífico como en el Atlántico.

Al considerar el escenario 2 surge la pregunta de por qué las

fluctuaciones demográficas más recientes podrían no haber dejado una

impronta clara en el segmento de ADN mitocondrial estudiado. Los sistemas

diploides tienen un tamaño efectivo aproximadamente 4 veces mayor que los

haploides de herencia uniparental (como el caso del ADN mitocondrial), razón

por la cual los tiempos esperados de coalescencia también son 4 veces

mayores (Wakeley 2009). Por este motivo podría esperarse que una

genealogía mitocondrial sea capaz de captar eventos demográficos, por

ejemplo de vicarianza, mas recientes que una genealogía nuclear. Otra manera

de apreciar este fenómeno es la deriva genética, la cual se espera tenga una

influencia mayor sobre marcadores mitocondriales debido a su menor tamaño

efectivo. Esta podría ser la razón por la cual el FST dividiendo en grupos

Atlántico y Pacífico fue un poco mayor en el análisis mitocondrial. También hay

que considerar que dicho valor de FST se calculó en base a 9 localidades para

el ADN mitocondrial, mientras que para el análisis de microsatélites solo se

utilizaron 5 localidades. Si el FST entre regiones se calcula utilizando las

mismas 5 localidades que para los microsatélites, entonces, el valor cae dentro

del rango en que varían los valores de FST calculados para cada locus por

separado (Figura 5.1). Por otro lado, la ventaja de los análisis nucleares es que

pueden involucrar muchos loci independientes, y por lo tanto potencialmente

pueden tener mayor poder de resolución para determinar la estructura

geográfica débil, ya que se sumarían muchas pequeñas señales. Un ejemplo

extremo de esto se ilustra en el artículo de Novembre et al. (2008) donde, en

base al análisis de centenares de miles de SNP nucleares, se resuelve en

humanos una estructura geográfica imposible de detectar con ADN


88

mitocondrial. Esta podría ser la razón por la cual la agrupación de las

localidades en dos grupos (uno Atlántico y otro Pacífico) fue más consistente

en el análisis de microsatélites que en el análisis mitocondrial. Además de la

estructura, la variación geográfica en la diversidad genética luego de una

expansión de rango es mejor evaluada por varios loci que por uno solo debido

a la estocasticidad del proceso genético poblacional (Austerlitz et al. 1997). Por

lo tanto las últimas fluctuaciones demográficas de E. maclovinus planteadas en

el escenario 2 pueden no verse reflejadas en el ADN mitocondrial simplemente

porque se trata de un único locus.

De todas maneras diferentes autores mantienen distintos puntos de vista

sobre cómo interpretar las diferencias entre análisis multilocus nucleares y

análisis de ADN de organelas (ejemplo Zink & Barrowclough 2008;

Barrowclough & Zink 2009; Edwards & Bensch 2009).

Locus

1 2 3 4 5 6 7 8 9 todos mt9P mt5P

% d

e va

rianz

a en

tre

grup

os

-2

-1

0

1

2

3

Figura 5.1. Se muestran los FST entre regiones (Atlántico y Pacífico) para cada locus de

microsatélites (1 a 9), para todos los loci de microsatélites (todos), para el ADNmt

considerando las 9 poblaciones analizadas (mt9P) y para el ADNmt considerando solo

las mismas 5 poblaciones que se utilizaron para el estudio de microsatélites (mt5P). Los

puntos rojos indican valores significativos (p< 0,05).

Pocos estudios genéticos en organismos marinos bentónicos

comprenden grandes extensiones en las costas del extremo sur de

Sudamérica. Los mismos están generalmente restringidos a solo una de las


89

costas (Pacífica o Atlántica) y utilizan, en la mayoría de los casos, solo

marcadores mitocondriales. Dos de estos estudios presentan resultados muy

similares a los obtenidos en este trabajo: fueron realizados en el gastrópodo

Concholepas concholepas sobre la costa pacífica (Cárdenas et al. 2009) y en la

lapa Nacella magellánica en la costa atlántica (de Aranzamendi et al. 2011).

Ambas especies mostraron bajos valores de FST entre localidades y ausencia

de un patrón de aislamiento por distancia. En ambos casos el resultado fue

interpretado por los autores como la consecuencia de altos valores de flujo

génico acoplados con un escenario de expansión poblacional reciente. En

ambas especies el momento estimado de la expansión fue previo al último

máximo glacial siendo 400.000 años para C. concholepas y 110.000 para N.

magellanica. Aunque en este último caso los autores consideraron que las

tasas mutacionales a nivel poblacional pueden ser 10 veces mayores que las

tasas de sustitución estimadas a nivel de especie (siguiendo a Ho et al. 2005;

Ho et al. 2007), y que por lo tanto la expansión poblacional podría haber

ocurrido luego del último máximo glacial. Otras especies muestran en cambio

evidencias más claras de colonización posterior al último máximo glacial en el

extremo sur de Patagonia. El gastrópodo Acanthia monodon, que posee

limitada capacidad dispersiva, tiene, sobre el margen Pacífico, una estructura

regional cuyas distancias genéticas están correlacionadas con la distancia

geográfica (Sánchez et al. 2011). En el extremo sur solo se detectó un

haplotipo mitocondrial, lo que fue interpretado por los autores como una

colonización posterior al último máximo glacial luego de que el hielo se retirara

de la zona intermareal. Un patrón similar se encontró en la misma zona en el

alga Durvillaea antarctica, la cual estaría caracterizada por la capacidad de

colonizar rápidamente hábitats vacantes, pero de limitado flujo génico entre

poblaciones ya establecidas (Fraser et al. 2009; Fraser et al. 2010).

Este es el primer trabajo que evalúa la estructura y los patrones de

variación genética en una misma especie marina a lo largo de la costa Atlántica

y Pacífica del extremo sur de Sudamérica. La geografía y la historia climática

de la región sugieren que durante los periodos fríos del cuaternario, al menos

algunas especies marinas costeras del extremo sur de Sudamérica podrían

haber experimentado una retracción demográfica hacia el norte quedando

eventualmente al menos dos poblaciones aisladas, una sobre el margen


90

Atlántico y la otra sobre el Pacífico. En estas circunstancias, el extremo sur de

Patagonia cubierta por glaciares que desembocaban en el mar podría haber

constituido una barrera geográfica al flujo génico para muchos organismos

marinos costeros permitiendo la diferenciación en condiciones alopátricas. Este

es el primer trabajo que aporta evidencia a favor de este escenario como lo

sugieren, por lo menos, los resultados del análisis realizado con microsatélites

en E. maclovinus. De todas maneras en esta especie no se habría alcanzado

una fuerte diferenciación, posiblemente debido a un tamaño efectivo grande.

Otras especies, tal vez con poblaciones de menor tamaño efectivo, podrían

haber alcanzado una diferenciación más marcada o incluso especiación

incipiente. Futuros estudios de este tipo en otras especies con distribución

similar a la de E. maclovinus serán importantes para evaluar la importancia de

los ciclos glaciares durante el cuaternario como motores generadores de

biodiversidad en las costas marinas de la Patagonia.

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ANEXO

Protocolo de extracción de ADN:

Soluciones necesarias

- Buffer de lisis (50 mM de Tris HCl, 50 mM EDTA ph 8, 1 % de SDS y 50

mM de NaCl),

- Proteinasa K (10 mg/ml),

- NaCl (5 M), TE 1X pH 8 (autoclavado),

- Isopropanol absoluto a -20 ºC

- RNasa A (10 mg/ml).

Procedimiento

1. Colocar una pequeña muestra de tejido (unos 20 mg) en un Eppendorf de

1.5 ml.

2. Enjuagar brevemente con agua destilada.

3. Agregar 500 ul de buffer de lisis y 10 ul de proteinasa K.

4. Incubar a 55ºC, preferentemente con agitación, por un mínimo de 2 horas

o hasta toda la noche.

5. Una hora antes de finalizar, agregar 5 ul de RNasa A.

6. Centrifugar al máximo (por ej., 15.000 rpm) por 15 min.

7. Pipetear 500 ul del sobrenadante a un tubo limpio. Evitar acarrear la

fracción sólida del fondo, así como la capa superficial oleosa (si existiese).

8. Agregar 300 ul de NaCl, agitar brevemente y centrifugar al máximo por 15

min.

9. Pipetear 500-600 ul del sobrenadante a un tubo limpio. Agregar igual

volumen de isopropanol absoluto a -20ºC o el doble de volumen de etanol

absoluto a -20ºC. Agitar lentamente primero, luego mezclar completamente.

10. Colocar a -20ºC por dos horas o toda la noche.

11. Centrifugar al máximo por 15 min. Descartar todo el líquido sobrenadante

con cuidado de no tirar el pellet.

12. Lavar breve y cuidadosamente con unos 750 ul de etanol 70º, evitando

perder o disgregar el pellet.

13. Descartar el alcohol. Secar en estufa a 37ºC (aproximadamente dos

horas) o en campana de vacío media hora.

14. Resuspender en 100 ul 1xTE. Agitar, y opcionalmente incubar a 55ºC (o

menos) por 2 horas.

15. Guardar a -20ºC.

ANEXO Matriz de FST pareados (considerando como distancia entre haplotipos el número de diferencias) en base a las secuencias parciales de 833pb del gen mitocondrial citoctomo b. Los valores en rojo son significativamente distintos de cero. Valores de FST pareados obtenidos a partir de 9 loci de microsatellites. Los valores en rojo son significa tivamente distintos de cero.

Beagle Madryn SAO SJ Tilly PMaría Aysen MonttMadryn 0.024 0SAO 0.017 0.005 0SJ 0.041 0.021 0.01 0Tilly 0.051 0.03 0.036 -0.012 0Pmaría 0.016 0.012 -0.009 -0.012 0.01 0Aysen 0.015 0.021 -0.004 0.049 0.066 0.007 0Montt -0.016 0.028 0.015 0.061 0.085 0.02 -0.001 0Concepción -0.011 0.017 0 0.022 0.043 -0.01 -0.008 -0.019

POB Micro FstSAO RT 0.01SAO CB 0.016SAO AY 0.02SAO CC 0.019RT CB 0.009RT AY 0.021RT CC 0.012CB AY 0.009CB CC 0.001AY CC 0.015

ANEXO Sitios polimórficos en las secuencias parciales de citocromo b del ADN mitochondrial de Eleginops maclovinus (N=261; largo de

las secuencias = 833 pb). Se indican el número de haplotipos, la distribución de cada haplotipo por localidad y el número total de

individuos por haplotipo (T). Entre paréntesis se informa el tamaño de la muestra. Las abreviaciones de las localidades son: SAO:

San Antonio Oeste; Mad: Puerto Madryn; RT: Rada Tilly; SJ: San Julián; PM: Punta María; CB: Canal Beagle; Ay: Puerto Aysén;

Mon: Puerto Montt; Con: Concepción.

SAO ( 25)

Mad ( 27)

RT ( 25)

SJ ( 24)

PM ( 38)

CB ( 36)

Ay ( 31)

Mon ( 28)

Con ( 27)

T ( 261)

N°Hap Polymorphic sites H1 CGCTACACTCGGCAAACCGACGATTGCAAAATTCCGTACCAAATTAGACCGCCAATCCAGGATGA 3 7 5 6 5 3 2 4 35

H2 .....................................G........................... 3 1 5 7 7 3 1 2 3 32

H3 ....................................C.......C.................C.. 1 1 2

H4 ..T.............................C................................ 5 4 2 4 10 11 8 10 7 61

H5 ....................................C..................C......C.. 2 1 3

H6 ....................................C............................ 2 1 2 5 1 4 2 3 20

H7 ....................................C..........G....T.........C.. 1 1

H8 .......................C....GG................................... 2 1 3

H9 ....................................C.........................C.. 3 2 4 2 3 1 3 2 20

H10 ....C...............................C.................G.......... 1 1

H11 ..T....T............T...........C................................ 1 1 2

H12 .AT.............................C................................ 1 1

H13 ...........A..G.....................C.........................C.. 1 1

H14 ...................................A............................. 1 1

H15 .................................T..C....................T....C.G 1 1 2

H16 ..T.............................................................. 1 1

H17 ...................G................C.........................C.. 4 1 1 6

H18 ..T.............................C...........................A.... 1 1

H19 ..T................G............C................................ 1 1

H20 .......T...............C...............T....................A.... 2 2

H21 .......T.............................G........................... 2 1 1 2 6

H22 ........................................................T........ 2 2

H23 ...C.....T.......T....................T.......................... 2 2

H24 ............................................................A.... 2 1 3

H25 ....G..........G..A...........G..................TA.............. 3 1 1 2 7

H26 .......................C.....G................................... 2 2

H27 ....G..........G..A...........G..................TA.........A.... 1 1

H28 ..T..................A..........C................................ 1 1

H29 ..T.............................C............................G... 2 2

H30 ........C...T.....C.............................................. 1 1

H31 ..................................T..G........................... 1 1

H32 ...........................G.........G.....C..................... 1 1

H33 .........T...................................................G.A. 1 1 2

H34 .........T..............................G........................ 1 1 2

H35 ....................................C........G.........C......C.. 1 1

H36 T.........................................................G...... 1 1

H37 ...................................................T............. 1 1 2

H38 ..............G.....................C.........................C.. 1 1 2

H39 ..T.............................C.........................G...... 1 1

H40 .................................T...G........................... 1 1

H41 ..T.............................C.................A.............. 1 1

H42 ..T.....................C.......C................................ 1 1

H43 ..................A...........G..................TA.............. 3 1 4

H44 ....................................C.........A.................. 1 1

H45 .......................................T......................... 1 1

H46 ....................................C........................G... 1 1 1 3

H47 .....TG...........A...........G..................TA.......G...... 1 1

H48 ..T.............................C....................G....G...... 1 1

H49 ..T......................A.....CC................................ 1 1

H50 ..T...........G.................C................................ 1 1

H51 ................T...................C............................ 1 1

H52 ..................A...........G..................TA..........G... 1 1

H53 ..........................T.........C...........T................ 1 1

H54 ........C...........................C.........................C.. 1 1

H55 ........C.........C.......................G...................... 1 1

H56 ..T.............................C....................G........... 2 2

H57 .............G......................C............................ 1 1

H58 ..........C...........G.......G.....CT...G.................A..... 1 1

ANEXO

MICROSATÉLITES: Frecuencias alélicas por población y por locus Locus Poblaciones Locus Poblaciones

A4 SAO Cam Tilly CC AY A5 SAO Cam Tilly CC AY 224 1.06 1.04 104 1.06 2.08 230 1.06 3.19 4.17 4.26 106 1.06 1.06232 1.06 1.06 108 2.13 9.38 6.25 3.19234 1.06 2.08 1.04 3.19 116 1.06 3.13 1.06236 19.15 7.29 4.26 5.21 4.26 118 17.02 27.66 9.38 25.00 5.32238 3.19 5.21 3.19 2.08 1.06 120 1.06 3.19 1.04 1.06240 4.26 2.08 2.13 4.17 13.83 124 1.06 242 3.13 2.13 1.04 2.13 126 5.32 12.77 7.29 13.54 17.02244 2.08 1.06 4.17 1.06 128 10.64 8.51 13.54 2.08 14.89246 1.04 2.13 3.13 1.06 130 5.32 5.32 7.29 4.17 5.32248 3.13 1.06 2.08 2.13 132 1.06 11.70 1.04 7.29 21.28250 1.04 1.06 134 6.38 7.45 7.29 5.21 8.51252 1.04 4.26 1.06 136 3.19 3.13 3.13 254 7.45 6.25 4.26 4.17 5.32 138 11.70 2.13 4.17 2.08 2.13256 2.13 1.04 1.06 2.08 1.06 140 2.13 1.06258 3.19 4.17 1.04 142 1.04 260 12.77 4.17 21.28 6.25 2.13 144 1.06262 3.19 3.13 4.26 1.04 1.06 146 1.04 1.06264 5.21 2.13 4.17 8.51 148 1.04 1.04 1.06266 3.19 2.08 1.06 3.13 150 1.06 1.04 1.06268 2.08 1.06 2.08 2.13 152 2.13 2.08 5.21 270 1.06 2.08 4.17 1.06 154 1.04 2.08 272 1.06 1.04 1.06 156 5.21 1.04 2.13274 1.06 158 1.06 2.13 1.04 6.25 1.06276 3.13 1.06 160 1.06 2.08 2.08 1.06278 1.06 1.04 1.04 1.06 162 2.08 280 1.04 1.06 3.19 164 1.04 282 2.13 2.08 2.13 1.04 1.06 166 1.06284 2.08 2.13 1.04 2.13 168 2.13 2.08 7.45286 1.06 1.04 170 1.04 1.06288 2.13 3.19 1.04 2.13 172 1.04 1.04 290 2.08 4.26 2.08 1.06 174 17.02 1.06 10.42 1.04 292 1.06 1.04 3.19 1.04 1.06 176 2.13 2.13 3.13 2.08 294 7.45 1.06 2.08 3.19 178 1.06 2.13 2.08 296 1.06 6.25 1.04 1.06 182 1.06 4.26 298 2.13 2.13 3.13 2.13 188 7.45 300 4.17 2.13 5.21 190 1.06 302 3.19 1.04 1.06 1.04 2.13 194 1.06 1.04 304 1.04 1.04 1.06 196 1.04 306 1.06 2.08 1.06 1.04 2.13 202 1.06 308 2.13 3.13 3.19 7.29 3.19 310 3.13 1.06 2.08 2.13 312 1.06 1.04 1.06 1.04 314 1.06 2.08 1.06 1.04 3.19

316 1.06 2.08 3.19 318 1.06 2.08 2.13 1.04 320 2.13 1.04 1.06 1.04 322 3.19 1.04 324 1.06 1.04 4.26 326 1.04 1.06 1.04 330 1.06 332 1.06 334 1.06 336 1.06 340 1.06 348 2.13 350 1.04 366 1.04

Locus Poblaciones Locus Poblaciones C4 SAO Cam Tilly CC AY C11 SAO Cam Tilly CC AY

114 2.22 4.17 3.13 3.26 124 6.38 9.38 7.29 9.38 9.57116 1.11 1.04 3.13 4.35 126 2.13 7.29 3.13 3.13 8.51118 6.67 2.08 9.38 2.17 128 4.26 2.08 120 1.06 130 1.06 1.04 1.06122 2.13 8.89 4.17 4.17 3.26 132 1.04 3.13 1.06124 5.32 8.89 1.04 5.21 9.78 134 1.04 126 4.26 5.56 8.33 1.04 1.09 136 3.13 3.13 3.13 2.13128 30.85 10.00 18.75 10.42 10.87 138 2.13 1.04 130 5.32 3.33 7.29 1.04 5.43 140 6.38 9.38 4.17 6.25 11.70132 3.33 4.17 3.13 3.26 142 6.38 8.33 1.04 5.21 9.57134 8.51 4.44 9.38 5.21 2.17 144 9.57 16.67 29.17 11.46 5.32136 7.45 5.56 4.17 5.43 146 8.51 4.17 10.42 2.08 3.19138 4.26 5.56 7.29 8.33 8.70 148 7.45 6.25 7.29 8.33 4.26140 6.38 7.78 4.17 5.21 9.78 150 13.83 14.58 9.38 26.04 28.72142 6.38 4.44 9.38 8.33 2.17 152 10.64 6.25 5.21 4.17 3.19144 4.26 10.00 3.13 11.46 8.70 154 15.96 4.17 8.33 4.17 5.32146 2.13 2.22 7.29 4.17 9.78 156 2.13 4.17 7.29 5.21 2.13148 1.06 2.22 2.17 158 1.06 1.04 1.04 2.08 2.13150 3.19 4.44 2.08 1.04 2.17 160 2.08 1.04 2.08 1.06152 1.06 2.22 2.08 162 1.06 154 3.19 1.09 164 1.04 1.06156 1.06 1.04 166 1.06 1.04 158 1.04 172 1.04 160 1.04 1.04 162 2.08 176 1.04 1.09 184 1.06 186 3.13 188 1.04 2.08 1.09 190 1.06 192 1.09 194 1.11 1.09 196 1.04

202 1.04 Locus Poblaciones Locus Poblaciones E7 SAO Cam Tilly CC AY F6 SAO Cam Tilly CC AY

188 7.45 8.33 1.04 6.38 3.19 94 9.38 9.78 4.26 8.33 15.00192 1.04 1.04 96 6.25 4.35 13.83 10.42 10.00194 1.06 1.06 98 4.17 2.17 1.06 1.04 196 1.06 1.06 100 17.71 26.09 24.47 31.25 11.25198 2.13 1.04 2.08 4.26 102 51.04 33.70 37.23 26.04 53.75200 21.28 21.88 25.00 21.28 17.02 104 6.25 10.87 10.64 15.63 5.00202 2.13 8.33 5.21 4.26 7.45 106 1.04 8.70 6.38 5.21 5.00204 20.21 4.17 2.08 8.51 8.51 108 4.17 4.35 2.13 2.08 206 6.38 3.13 8.33 2.13 8.51 208 18.09 4.17 20.83 7.45 5.32 210 2.13 7.29 6.25 8.51 11.70 212 2.13 1.04 6.25 3.19 213 1.04 1.06 214 4.26 2.08 4.17 2.13 216 2.13 4.17 7.29 3.19 6.38 217 1.06 1.06 218 2.08 3.19 1.06 219 1.06 220 4.26 10.42 2.08 7.45 7.45 221 2.13 7.29 3.13 2.13 8.51 222 1.04 1.04 1.06 5.32 223 1.04 1.06 224 2.08 225 2.13 4.26 1.06 226 2.08 227 1.04 1.06 229 1.04 1.06 231 1.04 232 4.17 1.04 1.06 5.32 234 1.06 236 1.06 2.08 2.13

Locus Poblaciones Locus Poblaciones G6 SAO Cam Tilly CC AY H9 SAO Cam Tilly CC AY

135 1.06 166 2.08 1.04 2.13 158 1.09 168 1.04 1.04 2.08 1.06 159 3.19 7.29 6.25 4.26 171 6.25 6.25 7.29 2.13 6.38163 1.06 2.17 173 1.06 2.13165 32.98 21.88 29.17 27.17 21.28 176 1.04 2.08 1.04 1.06 1.06166 1.09 182 3.13 3.13 4.26 17.02167 22.34 23.96 22.92 16.30 23.40 188 1.04 2.08 2.13 1.06168 1.09 192 3.13 2.08 3.13 3.19169 19.15 18.75 20.83 9.78 21.28 202 1.04 2.08 1.04 5.32 2.13170 2.08 1.09 204 4.17 2.08 3.19 1.06171 12.77 6.25 5.21 5.43 4.26 206 1.04 172 1.09 208 1.04 2.08

173 4.26 13.54 4.17 14.13 12.77 210 1.04 1.04 175 1.06 212 2.08 1.06177 1.09 1.06 216 1.04 1.04 178 1.09 220 1.04 179 1.04 222 1.06180 2.17 224 2.08 181 1.04 1.09 3.19 226 6.25 2.08 183 1.06 228 2.08 185 3.13 1.04 2.17 230 1.04 2.08 1.06 187 3.13 2.17 2.13 232 7.29 3.13 3.19 1.06189 1.06 1.04 1.04 3.26 3.19 234 1.04 191 2.13 1.04 3.26 236 2.08 1.06193 1.04 2.08 2.17 238 1.04 1.04 1.06 195 1.04 1.04 1.06 240 1.04 1.04 1.04 1.06 1.06220 1.09 242 1.04 2.13

243 2.13 244 2.08 1.04 1.06 245 1.04 1.04 246 1.04 1.04 1.06 5.32 248 2.08 1.04 1.04 1.06 1.06 250 4.17 10.42 5.21 10.64 5.32 252 3.13 6.25 3.13 4.26 5.32 254 1.04 4.17 3.13 2.13 8.51 255 1.04 1.04 3.13 256 7.29 5.21 4.17 5.32 2.13 257 1.04 1.06 1.06 258 2.08 4.17 8.33 3.19 260 7.29 2.08 3.13 2.13 10.64 261 1.06 262 3.13 3.13 4.17 2.13 1.06 263 1.06 264 1.04 3.13 1.04 4.26 2.13 266 2.08 4.17 3.19 4.26 267 2.08 268 4.17 4.17 3.13 3.19 1.06 270 1.04 3.13 3.13 9.57 272 2.08 4.17 3.13 2.13 1.06 274 3.13 4.17 2.08 2.13 1.06 275 1.04 276 2.08 2.08 2.13 1.06 278 3.13 2.13 280 7.29 2.08 4.26 2.13 282 1.04 1.04 1.04 284 1.04 1.04 3.19 288 1.04 292 1.04 294 1.04 298 2.08 1.06 300 1.04 1.04 310 1.06

Locus Poblaciones H10 SAO Cam Tilly CC AY

141 7.29 23.96 18.75 8.33 14.81 143 3.13 4.17 11.46 1.85 145 11.46 12.50 16.67 15.63 9.26 147 18.75 11.46 8.33 8.33 18.52 148 1.04 4.17 4.17 3.13 149 4.17 3.13 2.08 4.17 5.56 151 21.88 19.79 22.92 16.67 14.81 153 10.42 14.58 12.50 14.58 14.81 155 6.25 4.17 7.29 10.42 12.96 157 8.33 2.08 2.08 2.08 5.56 159 1.04 1.04 3.13 1.85 161 1.04 171 4.17 173 5.21 1.04 183 1.04

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Estructura genética poblacional, historia demográfica y ... · de 5 localidades. El estudio de la variación fenotípica se realizó mediante ... para organismos de reproducción