ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Transferencia de material genético II: Transformación

Pérez Reséndiz Enrique Leonardo

Ingeniería genética

Es una herramienta que permite la manipulación del material genético in vitro.

Se sustenta en técnicas que permiten aislar, caracterizar y manipular DNA.

Para la generación de un organismo genéticamente modificado se tienen que hacer algunas consideraciones.

Ingeniería genética

Enzimas fundamentales:Endonucleasas de restricciónLigasasFosfatasasCinasas PolimerasasTranscriptasa reversaHelicasas

Vectores de clonación

Es un sistema que permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar.

Los vectores permiten obtener múltiples copias de un trozo de DNA.

Vectores de clonación

1. Replicación independiente (ori*): Sirve para la replicación autónoma e independiente del genoma del hospedero.

2. Sitios de corte únicos: Permite la apertura del DNA (enzimas de restricción), denominado sitio múltiple de clonación

3. Marcador de selección: Permiten aislar a las células hospederas con el vector (genes de resistencia a antibióticos).

4. *Recuperación sencilla.

5. *Promotores fuertes.

Vector recombinante

Molécula del DNA del vector con DNA de interés.

Para la unión del DNA de interés se utilizan ligasas.

Transformación

Transformación

Para la introducción del DNA existen diferentes técnicas:Choque térmico.Microelectroporación.

Choque térmico

Las bacterias hospederas son pre-tratadas con agentes que aumentan su permeabilidad membranal, como la temperatura y los iones.

Los iones como el Ca2+, disminuyen la repulsión de cargas eléctricas entre los nucleótidos y la membrana, facilitando la entrada del plásmido al interior de la célula.

Células competentes o células transformantes

Las células que recibieron un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción del material genético se les denomina células competentes.

Las células transformantes son las células competentes que se les introdujo el material genético, a las cuales se les restauro su permeabilidad de la membrana y se encuentran en condiciones óptimas de crecimiento.

Objetivos Conocer el fundamento para transformar

células bacterianas. Realizar la técnica de transformación

bacteriana. Aprender a identificar células transformantes

mediante su fenotipo. Conocer la definición de organismo

transgénico. Conocer las aplicaciones de la transformación

bacteriana: beneficios y riesgos.

Material

Células competentes de E. coli. Plásmido PET-TEM-1:

Vector recombinante pET-TEM-1-ompAβ-lactamasa.

Cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 µg/mL).

Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20mM Glucosa.

Desarrollo experimental

Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque térmico.

1. Añadir 1 a 5 µL del plásmido en el tubo de las células de E. coli competentes.

2. Mezclar.

3. Dejar en hielo por 30 minutos.

4. Dar choque térmico a 42ºC durante 45 segundos (NO AGITAR).

Desarrollo experimental

5. Agregar 450 µL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37ºC con agitación 225 a 250rpm.

6. Concentrar las células por centrifugación. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 µL de medio SOC.

7. Esparcir los 100 µL de bacterias transformadas, en las cajas con medio de selección (Agar -LB-Kanamicina).

Desarrollo experimental

8. Incubar a 37ºC por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4ºC.

9. Como control negativo incubar 100 µL de células competentes en medio de selección a 37ºC por 24 h.

10. Calcular la eficiencia de la transformación.

Resultados

Se utilizara como indicador la resistencia a Kanamicina.

Las células que crecen en el medio Agar -LB-Kanamicina, son las células transformantes.

Resumen

Examen

1. Qué es un vector de clonación y da las tres características?

2. Da el nombre del método que se usará para la transformación

3. Y explica en que consiste

4. Que diferencia hay entre conjugación y transformación

Gracias por su atención

FIN