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Estructuración de una metodología para la expresión de péptidos y proteínas por
medio de la levadura Kluyveromyces lactis.
María Fernanda Castillo Barrera, Yeimy Alejandra Montenegro Bacca
Luis Humberto Reyes Barrios
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia
RESUMEN
Los péptidos y proteínas son biomoléculas ampliamente usadas en distintas actividades y
aplicaciones de gran beneficio en la industria y en la salud humana, sin embargo, la
producción eficiente y rentable a gran escala de dichas biomoléculas representa un reto.
Estas biomoléculas se producen comúnmente usando distintos microorganismos como la
bacteria Escherichia coli, sin embargo, esta producción no posee un alto rendimiento
debido a que no secretan las proteínas y péptidos al medio de cultivo. El objetivo de este
proyecto es producir péptidos y proteínas haciendo uso del vector pKLAC2 de la levadura
Kluyveromyces lactis. Para esto, se diseñó una metodología que permite expresar péptidos
y proteínas, mediante la inserción de ADN foráneo en dicha levadura. Este proyecto
demostró que K. lactis es un hospedero efectivo para la expresión de proteínas
recombinantes, sin embargo, es necesario establecer protocolos posteriores que permitan
verificar la efectividad del procedimiento realizado.
PALABRAS CLAVE: Proteínas recombinantes, péptidos, levaduras, Kluyveromyces
lactis, expresión, biotecnología.
1. INTRODUCCIÓN
Los péptidos son moléculas formadas por menos de 50 aminoácidos unidos por enlaces
peptídicos [1]. En la actualidad los péptidos son usados en gran variedad de aplicaciones que
van desde su uso como componente bioactivo en la alimentación, pasando por su utilización
como péptidos antimicrobianos, hasta llegar a emplearse como biosurfactantes [2] [3] [4].
Los péptidos como surfactantes son una alternativa interesante a los surfactantes sintéticos
debido a su renovación, biocompatibilidad y mayor funcionabilidad. Estos pueden poseer
cadenas laterales hidrofílicas e hidrofóbicas mientras los otros biosurfactantes tienen una
estructura convencional con una cabeza hidrofílica y un tallo hidrofóbico [4].
Por otra parte, las proteínas son biomoléculas formadas por más de 50 aminoácidos que
pueden contener azufre, fósforo, hierro, magnesio y cobre. Estas biomoléculas son de vital
importancia en los organismos vivos ya que están involucradas en las funciones estructurales,
enzimáticas, trasportadoras, entre otras [1]. En la actualidad, las proteínas más ampliamente
estudiadas y usadas son las proteínas recombinantes por su aporte en la salud humana y el
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alto impacto económico que tienen [5]. Estas son proteínas que han sido clonadas y
producidas tras la introducción del gen codificante en la célula de otra especie [6].
Una de las proteínas recombinantes más innovadoras es la proteína verde fluorescente (GFP),
la cual contiene dentro de su cadena peptídica un cromóforo capaz de emitir luz verde
fluorescente, lo que le ha brindado un gran potencial como marcador biológico. Esta proteína
fue descubierta y purificada por Osamu Shimomura y su equipo en la década de los 70 y fue
clonada y secuenciada en 1992 por el biólogo Douglas C. Prasher lo que permitió usarlas
como marcador [7] [8]. Dos años más tarde se publicó en la revista Science el uso de GFP
como marcador en bacterias y eucariotas, aumentando rápidamente el número de estudios
sobre el uso de estas proteínas [7]. Desde entonces esta proteína ha sido altamente aplicada
como marcadores de transgenes o virus, además de ser empleada para aplicaciones
neurológicas, progresión de enfermedades, entre otros [9] [10]. Adicionalmente y tras el
avance en la biotecnología se han desarrollado diferentes variantes de la GFP como lo son
las proteínas DsRed y su variante mRFP que emiten una coloración roja [7]. Sumado a esto
se encuentra la proteína Superfolder GFP (sfGFP) adecuada para detectar interacciones
proteína – proteína mejorando el desarrollo de biosensores y marcadores [11].
Ahora bien, una alternativa para la obtención de estos péptidos y proteínas se basa en la
extracción directa de los recursos naturales como plantas, medusas, entre otros. El proceso
consiste en básicamente producir el extracto que se obtiene de las regiones contenedoras,
para luego purificar las proteínas [8]. No obstante, este procedimiento suele ser tedioso, las
cantidades obtenidas son bajas, la extracción suele ser costosa y en algunos casos imposible.
Además, el proceso es poco amigable con el medio ambiente puesto que requiere
sobreexplotar los recursos naturales y en algunos casos genera contaminantes dependiendo
de la naturaleza de las proteínas [12].
Tras los diferentes avances en biotecnología la producción de estas proteínas se ha enfocado
hacia el uso y mejoramiento del metabolismo de organismos como algas, células y animales
transgénicos que son capaces de producirlas. Sumado a esto y tras el desarrollo y avance de
la biotecnología vegetal, se ha logrado emplear plantas modificadas genéticamente para
producir proteínas terapéuticas como vacunas, citosinas, anticuerpos, entre otros.
Adicionalmente, el empleo de plantas como biorreactores resulta ser adecuado dado que
requiere un bajo costo, genera proteínas estables y es de fácil escalamiento [13].
Otra importante técnica, que se ha venido estudiando desde hace varios años atrás, es la
producción de proteínas recombinantes que son producidas por microorganismos sencillos
como bacterias. Así pues, las primeras proteínas recombinantes fueron producidas con fines
farmacéuticos, empezando en 1978 con la producción de insulina en Escherichia coli por la
empresa Genentech [14]. Desde entonces la producción de proteínas de uso terapéutico ha
incrementado rápidamente generando un gran impacto en la economía de muchos países [12].
Por consiguiente, la bacteria E. coli ha sido ampliamente usada en biotecnología dado que su
genoma, fisiología y metabolismo son bien conocidos facilitando así su manipulación. En
adición, esta bacteria presenta un rápido crecimiento en medios simples con altos niveles de
producción por lo cual es ampliamente usada para la producción de péptidos y proteínas
recombinantes [5]. Sin embargo, estos organismos presentan ciertas desventajas que las
vuelven poco eficientes para la expresión de determinadas proteínas. Dentro de estas
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desventajas se encuentra la baja eficiencia para secretar proteínas al medio de cultivo, la
incapacidad de generar modificaciones postraduccionales los cuales son requeridas para
ciertas proteínas, la destrucción de la proteína obtenida por las proteasas producidas por la
misma bacteria, entre otras [15].
De este modo, las proteínas biofarmacéuticas han sido unas de las primeras y mayormente
producidas a nivel mundial. Estas se obtienen principalmente en células hospederas de
levaduras en 20%, E. coli en 30 % y células eucariotas superiores en 50%. No obstante, las
levaduras tienen ciertas ventajas frente a otras formas de producción como lo es la expresión
en mamíferos e insectos. Esto, debido a que se realiza una menor inversión en medios,
equipos e infraestructura requerida en el proceso. Además, al ser organismos unicelulares es
fácil manipularlos genéticamente, no generan endotoxinas. Igualmente, las levaduras tienen
la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales como el empalme de intrones,
proteólisis de proteínas, plegamiento, formación de enlaces disulfuro y glicosilación, lo que
les permite secretar las proteínas heterólogas al medio facilitando el proceso de purificación
y mejorando significativamente el rendimiento [12] [16] [17].
La producción de proteínas heterólogas en levaduras se ha venido dando principalmente en
Saccharomyces cerevisiae, además, es reconocida por la American Food and Drug
Administration (FDA) como un organismo seguro. Sin embargo, esta presenta un alto
metabolismo fermentativo y la producción de proteínas recombinantes ha sido limitada.
Adicionalmente, se ha encontrado que las proteínas producidas son hiperglicosiladas por lo
que hay retención de estas con una consiguiente degradación parcial, además los productos
de esta degradación son muy difíciles de eliminar. Por lo que desde mediados de 1980 se han
venido buscando y estandarizando protocolos para la producción de proteínas recombinantes
en levaduras no convencionales. Estas levaduras han presentado algunas ventajas sobre las
levaduras convencionales, permitiendo generar altos niveles de proteínas recombinantes
tanto intra como extracelularmente. El primer producto generado en levaduras no
convencionales se dio en el 2009 y fue producida en Pichia pastoris, esta cepa de levaduras
junto con, Pichia methanolica, Candida boidinii, entre otras son conocidas como levaduras
metilotróficas las cuales son capaces de emplear metanol como única fuente de energía, son
capaces de crecer a altas densidades, presentan fuertes promotores, entre otros [12] [16]. En
contraste, las levaduras no metilotróficas son altamente usadas por su alta capacidad
fermentativa y que han sido ampliamente estudiadas en el área de biotecnología, dentro de
los principales géneros se encuentra Saccharomyces cerevisiae y Kluyveromyces lactis de las
cuales ya se encuentran secuenciado completamente su genoma [12].
K. lactis es una levadura empleada desde hace varios años atrás para producir diferentes
productos tanto intra como extracelularmente. Esta levadura es reconocida por su capacidad
de producir β-galactosidasa (lactasa), una enzima que hidroliza la lactosa convirtiéndola en
azucares que pueden ser fácilmente fermentables por otras levaduras. Además, la producción
masiva de lactasa ha sido útil para la obtención de productos lácteos para personas con
intolerancia a la lactosa. De hecho, esta levadura es considerada como un organismo GRAS
(Generally Recognised As Safe), ya que los productos generados por esta levadura son
seguros para la industria alimentaria y farmacéutica [17]. Por otra parte, esta levadura ha sido
empleada para la producción de péptidos y proteínas de alto peso molecular con un alto
rendimiento. No obstante, tienen como desventaja el hecho de que las proteínas producidas
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presentan una glucosilación que no se ajusta apropiadamente al patrón humano lo que puede
afectar diversas propiedades biológicas como la inmunogenicidad de proteínas para uso
terapéutico [17].
Alrededor de 1950 esta levadura se empezó a emplear como fuente para la producción de
lactasa. Una década después se empieza a emplear levadura inactivada y seca como
suplemento proteico. En 1980 se logra establecer el sistema para una efectiva transformación
dando inicio a los estudios de producción de proteínas heterólogas en esta levadura, esto
permitió expresar la enzima quimosina bovina siendo una de las primeras en ser producida
en organismos eucariotas. Desde entonces se ha presentado una gran atención a la expresión
de proteínas recombinantes en este organismo llegándose a producir más de 40 proteínas
diferentes con K. lactis [18].
Actualmente, New England Biolabs tiene en el mercado un kit de expresión de proteínas el
cual facilita la expresión en esta levadura. En este kit se emplea la cepa GG799 la cual ha
presentado excelentes resultados en la síntesis y secreción de proteínas [18]. Además, la
expresión es impulsada por una variante fuerte del promotor LAC4 que permite emplear el
vector pKLAC2 en E. coli antes de ser usado para la expresión en levaduras, adicionalmente
cuenta con diferentes alternativas para la expresión tanto intra como extracelularmente [19].
Lo anterior permite que esta levadura sea una importante herramienta biotecnológica para la
expresión de péptidos y proteínas recombinantes.
Considerando lo mencionado, en este trabajo se realizará la expresión de péptidos y proteínas.
Para lo cual el principal objetivo del presente estudio es lograr establecer una metodología
que permita producir de forma eficiente péptidos y proteínas haciendo uso del vector
pKLAC2 en la levadura K. lactis.
2. METODOLOGÍA
2.1 Diseño del péptido
Se mandó elaborar una secuencia de ADN que codifica para un péptido anfifílico con mayor
región hidrofílica, un tamaño corto entre 18 y 30 aminoácidos, una baja hidrofobicidad de
0,032 (ver Figura 1) y una carga neta de -6. Para su fácil recuperación se le añadió una cola
de poli-histidina (6XHIS) en el extremo C terminal.
Figura 1. Hidrofobicidad péptido hidrofílico, región azul hidrofílica y naranja hidrofóbica. (Obtenida en Chimera
Sofware).
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Adicionalmente, usando el Codon Optimizaction Tool de IDT se logró generar la siguiente
secuencia de ADN que fuese óptima para Kluyveromyces lactis: ATG TTC TTC GCA GCT
GCA GCA GCA GAA GAA GAG GAG GAG GAA AAT AAC AAC CAA CAG CAA
CAT CAT CAC CAC CAC CAT TAA.
Similarmente, se mandó elaborar una secuencia de ADN que codifica para un péptido
anfifílico con mayor región hidrofóbica, un tamaño corto entre 18 y 30 aminoácidos una
hidrofobicidad de 0,640 (ver Figura 2) y una carga neta de -2. También cuenta con la cola de
poli-histidina (6XHIS). Con la siguiente secuencia de DNA óptima para K. lactis: ATG CTA
GCC GCA ATG GTA GCT TTG CTA GCA GCT CTT GTT GCA CTA ATT GCA CAA
GAA GAG CAT CAT CAT CAC CAT CAT.
Figura 2. Hidrofobicidad péptido hidrofóbico, región azul hidrofílica y naranja hidrofóbica. (Obtenida en Chimera
Sofware).
Adicionalmente, las secuencias de ADN que codifican para los péptidos diseñados fueron
almacenadas dentro del vector PUC57. Estos fueron entregados liofilizados para mantener
su conservación. Por otra parte, se tiene un plásmido PUC57 que contiene la secuencia de
ADN que codifica la proteína GFP.
2.2 Preparación células competentes E. coli
Para comenzar, fue necesario preparar un cultivo de la bacteria E. coli DH5α en cajas de Petri
con medio LB (Luria-Bertani) que se dejó incubando toda la noche. En este caso se
prepararon 250 ml de medio LB el cual contiene 2,5 g de triptona, 1,25 g de extracto de
levadura, 1,25 g de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g de agar. Las cepas empleadas fueron
obtenidas del cepario presente en el laboratorio de biología molecular de la universidad de
los Andes.
Luego de obtener las colonias en medio sólido, se pasó una colonia a medio LB sin agar y se
incubo nuevamente toda la noche. Para la preparación de células competentes fue
necesario preparar diluciones del cultivo e incubar hasta alcanzar una densidad óptica
de aproximadamente 0,4. El crecimiento celular se detuvo empleando hielo. La densidad
óptica medida en este paso fue realizada empleando un espectrofotómetro de UV-visible. El
siguiente paso fue retirar el medio por centrifugación y resuspender el pellet en una
solución de cloruro de calcio (CaCl2) que contiene CaCl2 al 60 mM, glicerol al 15% (v/v) y
Tris – HCl 10 mM (pH 7). Las muestras fueron almacenadas en tubos Eppendorf a -80°C.
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2.3 Transformación de plásmidos en E. coli DH5α
Para esto se hace uso de las células competentes de E. coli DH5α y se transforma por medio
de choque térmico para insertar el plásmido de interés dentro de estas células. Para realizar
el choque térmico se sometieron las células competentes junto con 50 ng del ADN de interés
a una temperatura de 42ºC por 45 segundos. Seguidamente, se dejaron las muestras en hielo
por 5 minutos y luego se incubaron a 37ºC y 250 rpm por una hora en 400 µl de medio SOC.
El paso siguiente fue centrifugar las muestras a 1300 rpm por 3 min con el fin de precipitar
un poco las células sin dañarlas para poder retirar 200 µl de medio y resuspenderlas.
Finalmente, se plaqueó en medio LB sólido con ampicilina a una concentración de 100 g/ml
y se incubó toda la noche. El antibiótico es empleado para comprobar que se haya logrado
una apropiada inserción del plásmido a la bacteria y evitar posible contaminación con otros
microorganismos.
2.4 Purificación de ADN por medio de Miniprep
Para esto, se tomó una de las colonias del paso anterior, se suspendió en tubos de ensayo con
5 ml de medio LB liquido con ampicilina y se incubó a 37 °C toda la noche. Posteriormente,
las muestras fueron sometidas a Miniprep con lisis alcalina siguiendo el protocolo indicado
en el kit de Miniprep Monarch ® de la compañía New England Biolabs (NEB) [20].
2.5 Digestión de ADN con enzima de restricción
En este paso se pretende separar las secuencias del plásmido PUC57 y generar los
extremos cohesivos en el vector pKLAC2. En este caso, se emplearon las enzimas de
restricción XhoI y NotI para los péptidos y enzimas BamHI-HF y EcoRI-HF para la proteína
GFP, las secuencias de reconocimiento se presentan en la Figura 3. Cabe recalcar que para
el desarrollo de este proyecto todas las enzimas empleadas junto con sus respectivos buffers
fueron obtenidas de la compañía NEB.
Figura 3. Secuencia de reconocimiento de enzimas Xho I, Not I, BamHI-HF y EcoRI-HF, respectivamente [21] [22] [23]
[24].
Las digestiones se realizaron en tubos Eppendorf agregando 2 µg de ADN, 1 µl de las
enzimas de restricción, agua desionizada y estéril y 5 µl de buffer 3.1 para los péptidos y
buffer CutSmart para la proteína GFP, para un total de 50 µl de solución. Esta solución se
dejó incubando toda la noche y las enzimas fueron desactivadas al siguiente día en baño seco
a 65°C.
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2.6 Linealización y desfosforilación del vector pKLAC2
Por otra parte, también se emplean enzimas de restricción con el fin de linealizar el vector de
expresión en K. lactis. Para esto el vector pKLAC2 se dirigió haciendo uso de la enzima de
restricción SacII llegando a un tamaño de 6280 pb. Posteriormente, se realiza la
desfosforilación haciendo uso de la enzima CIP para eliminar los grupos fosfatos y de esta
forma impedir que los extremos del vector se unan.
2.7 Validación por electroforesis de la digestión
Para comprobar que las digestiones se hayan efectuado de forma apropiada se usó la técnica
de electroforesis. Para esto se prepararon dos geles de agarosa en TAE 1X uno a 0,9 % para
lograr visualizar los plásmidos y otro al 2,5 % para identificar las secuencias. Las muestras
se prepararon mezclando el ADN con el buffer de carga 6x. Adicionalmente, se emplearon 2
marcadores de peso, el primero de 1 Kb para identificar los plásmidos PUC57 y pKLAC2
con tamaños de 2710 pb y 9107 pb respectivamente y la proteína GFP con un tamaño de 783
pb; y el segundo marcador de 50 pb para identificar las secuencias peptídicas con un tamaño
estimado de 94 pb. Los resultados fueron observados con el documentador de geles.
2.8 Extracción y purificación de ADN
Se realizó la extracción y la purificación del ADN digerido cortando la banda que representa
el péptido para posteriormente hacer uso del Monarch® DNA Gel Extraction Kit de NEB
[25]. Adicionalmente, se hace uso del kit Invitrogen PureLink PCR purification para realizar
purificaciones adicionales [26].
2.9 Ligación del péptido al plásmido pKLAC2
En este paso el objetivo es unir el ADN de interés al plásmido pKLAC2. Para esto se
incubaron las muestras con la enzima T4 DNA ligasa, a una temperatura de 4 ºC por 4 horas
y 16 ºC durante toda la noche, el protocolo llevado a cabo se presenta en Ligation Protocol
with T4 DNA Ligase (M0202) [27].
2.10 Preparación células competentes K. lactis
Se cultivó e incubo previamente la levadura K. lactis por 2 días en medio YPAD sólido el
cual contiene 2% de extracto de levadura, 4% de bactopeptona y 4% de glucosa. Las cepas
de levadura fueron obtenidas del K. lactis Protein Expression Kit, adquirido de NEB. Luego
de obtener las colonias en medio sólido, se pasó una colonia a medio YPAD sin agar y se
incubo nuevamente por 20 horas. Para la preparación de células competentes se siguió el
protocolo establecido por Gietz y Schiestl [28]. Sin embargo, fue necesario realizar algunas
modificaciones al protocolo para hacerlo óptimo a la levadura K. lactis, estas modificaciones
son principalmente en los diferentes tiempos de incubación, ya que la incubación inicial es
de 20 horas, y en el caso de la incubación para lograr 2 * 107 cel/ml es necesario incubar 8
horas adicionales. Lo anterior se debe a que la velocidad de crecimiento de la levadura K.
lactis es de aproximadamente 0,17 h-1 [29].
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2.11 Transformación de levadura K. lactis con el plásmido pKLAC2
Se realiza transformación de la levadura K. lactis con el plásmido pKLAC2 por medio de
choque térmico con el fin de insertar el plásmido en las células competentes. Para esto se
agregaron 620 µl de reactivo de transformación a las células competentes y se mezclaron
hasta homogenizar. Luego se dejó incubar por 30 min a 30 °C y se aplicó choque térmico en
baño seco, manteniendo una temperatura de 37 °C por una hora. Posteriormente, se
centrifugó y resuspendió para finalmente cultivar e incuba en medio YCB solido con una
concentración de 5 mM de acetamida para comprobar la adecuada inserción del plásmido en
la levadura. Todos los pasos llevados a cabo en esta etapa se realizaron siguiendo el protocolo
establecido por Gietz y Schiestl [28].
2.12 Clonación en K. lactis
Para esto, se usa el K. lactis Protein Expression Kit usando la Estrategia de Clonación I, dado
que se quiere secretar la proteína (o péptido) con su extremo N terminal nativo. El kit fue
adquirido de NEB. Este kit incluye todos los reactivos necesarios para la expresión de una
proteína recombinante en K. lactis. Dentro de este se encuentran los vectores pKLAC2, el
cual se observa en la Figura 4, pKLAC1-mallE control plasmid, enzima de restricción SacII,
con su respectivo buffer CutSmart® Buffer (10X), primers de integración 1, 2 y 3, células
competentes, agentes para transformación y el medio para levadura (YCB) [30].
Figura 4. Vector de expresión pKLAC2 [19].
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2.13 PCR de colonia
Para este paso se emplean las condiciones descritas en el manual del kit de expresión de
proteínas en K. lactis. Para esto se preparó una solución de 50 µl que contenía 3,2 µl de 10X
primers de integración 1 y 2 provistos en el kit, 13,6 µl de agua estéril, 5 µl de cultivo y 25
µl de Safe-GreenTM 2X PCR BestaqTM MasterMix de la compañía Applied Biological
Materials - abm. La PCR se realizó en un termociclador con 1 ciclo de 13 minutos a 94 °C
para abrir la pared celular y separar el ADN, adicionalmente se agregaron 35 ciclos con una
temperatura de denaturación de 94 °C por 10 s, una temperatura de anillamiento de 60 °C por
un periodo de 30 s y para la elongación se empleó una temperatura de 72 °C por 50 s.
Finalmente se agregó un ciclo de 72 °C por 5 min y se almacenó a 4 °C.
2.14 Extracción de ADN genómico
Como una posible forma de mejorar los resultados de PCR se decide realizar una extracción
de ADN del genoma de la levadura luego de inserción de la clonación. Para esto se usó el kit
para purificación de ADN/ARN de la compañía INVITEK, siguiendo el protocolo de dicho
kit [31].
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Verificación de sitios de restricción
En primer lugar, se realizó la transformación de las bacterias de E. coli DH5α competentes
con los plásmidos por medio de choque térmico para posteriormente cultivarlas en cajas de
medio LB con ampicilina para la selección de las células transformadas. Luego, se extrajo el
ADN haciendo uso del Monarch® Plasmid Miniprep. Como resultado se obtuvieron
soluciones de ADN de 258,7 ng/µl, 125,9 ng/µl y 646,7 ng/µl para los vectores con péptidos
hidrofílico e hidrofóbico y para el vector pKLAC2, respectivamente. Este ADN se digirió
con las enzimas de restricción respectivas y los resultados fueron validados en geles de
electroforesis al 2,5% y 0,9% de agarosa, los resultados se muestran en la Figura 5 y Figura
6, respectivamente. Con los resultados de la electroforesis se puede ver que las digestiones
no fueron correctas ya que no se tiene la presencia de bandas en el gel de 2,5% de agarosa
con un tamaño esperado de 94 pb, que corresponderían a las secuencias de ADN que
codifican para los péptidos de interés. Además, en el gel de 0,9% se observa la presencia de
bandas, con el tamaño de los plásmidos sin digerir que es de 2817 pb. Por lo anterior, se
puede afirmar que las enzimas de restricción no están haciendo los cortes respectivos por lo
que no se logró separar las secuencias de ADN codificantes para los péptidos de los vectores
PUC57.
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Figura 5. Electroforesis realizada digestiones XhoI y NotI. a) Marcador de ADN 50 bp NEB [32]. b) primer carril
marcador de ADN 50 bp, segundo carril secuencia codificante péptido hidrofílico, tercer carril secuencia codificante
péptido hidrofóbico
- Figura 6. Electroforesis realizada digestiones XhoI y NotI. a) Marcador de ADN 1 kb NEB [33]. b) primer carril marcador
de ADN 1 kb, segundo carril vector PUC57 con péptido hidrofílico, tercer carril vector PUC57 con péptido hidrofóbico,
cuarto carril vector pKLAC2.
Con base a los anteriores resultados, se procede a realizar comprobaciones de digestión de
cada una de las enzimas por separado, los resultados de la electroforesis al 0,9% de agarosa
se presenta en la Figura 7 y la Figura 8 para las enzimas NotI y XhoI, respectivamente. Con
base a esto, se evidencia que las bandas obtenidas de cada digestión presentan el mismo
tamaño que el vector PUC57 sin digerir. Por lo anterior, se puede concluir que las enzimas
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de restricción no están realizando los cortes respectivos, esto puede deberse a la formación
de estructuras secundarias que impiden que la acción de las enzimas sea la adecuada o a
problemas en los sitios diana de corte de las enzimas de restricción que no permiten que las
enzimas reconozcan sus sitios de corte y realicen la digestión [34]. Por lo tanto, se
recomienda mandar a secuenciar las muestras con el fin de asegurar la presencia de los sitios
de restricción. Adicionalmente se aconseja realizar un análisis sobre la estructura
tridimensional de los vectores con el fin de detectar una posible formación de estructuras
secundarias que impidan el correcto funcionamiento de las enzimas de restricción.
Figura 7. Electroforesis realizada digestión NotI. a) Marcador de ADN 1 kb NEB [33]. b) primer carril marcador de ADN
1 kb, segundo carril vector PUC57 con péptido hidrofílico, tercer carril vector PUC57 con péptido hidrofóbico
Figura 8. Electroforesis realizada digestión XhoI. a) Marcador de ADN 1 kb NEB [33]. b) primer carril marcador de ADN
1 kb, segundo carril vacío, tercer carril vector PUC57 con péptido hidrofílico, cuarto carril vector PUC57 con péptido
hidrofóbico
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Dados los anteriores resultados, se procede a hacer uso de la proteína verde fluorescente
(GFP) la cual puede ser usada como una plataforma de producción para péptidos. Esto se
realiza, ya que esta proteína permite realizar inserciones en sus loops sin generar alteraciones
significativas en la funcionalidad de la proteína [35].
Por lo tanto, se realizó la transformación por medio de choque térmico de las bacterias E. coli
DH5α competentes con el plásmido pKLAC2 y el vector PUC57 que contenía la secuencia
codificante de la proteína GFP. A continuación, se realizó la selección de células
transformadas por medio de un cultivo en medio LB con ampicilina y se extrajo el ADN
haciendo uso del Monarch® Plasmid Miniprep. Teniendo como resultado soluciones de
ADN de 262,8 ng/µl para el vector con la secuencia codificante de la proteína GFP y 437,3
ng/µl para el plásmido pKLAC2. Posteriormente, el ADN del vector PUC57 se digirió con
las enzimas de restricción respectivas, mientras que el ADN del plásmido pKLAC2 se digirió
con la enzima SacII y se realizó la purificación por gel mediante el Monarch ® DNA Gel
Extraction Kit. Con el fin de evitar que los extremos del vector se vuelvan a unir, se llevó a
cabo la desfosforilación, asegurándose así que el vector se mantenga linealizado. Con lo
anterior se dio paso a la purificación del vector mediante el uso del kit Invitrogen PureLink
PCR purification para posteriormente verificar por electroforesis que el procedimiento haya
sido el adecuado como se ilustra en la Figura 9.
Figura 9. Electroforesis al 0,9 % de agarosa realizada. a) Marcador de ADN 1 kb NEB [33]. b) primer carril marcador de
ADN 1 kb, segundo carril vector pKLAC2 digerido con SacII, tercer carril GFP
La anterior figura muestra una banda con un tamaño alrededor de las 6000 pb que
corresponde al vector de expresión pKLAC2 cuyo tamaño luego de la digestión con SacII es
de 6280 pb. Adicionalmente, las digestiones para GFP también fueron apropiadas ya que en
el último carril se evidencia la presencia de una banda entre los 500 y 1000 pb que
corresponden a la proteína verde fluorescente la cual tiene un tamaño de 783 pb luego de las
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respectivas digestiones. Gracias a estos resultados se puede ver que los sitios diana de corte
para la secuencia que codifica la proteína GFP son adecuados, además se observa que la
linealización del vector pKLAC2 se da con éxito, por lo cual la enzima SacII es apropiada en
el proceso de linealización del plásmido pKLAC2.
Luego de la digestión de GFP y linealización del vector se realizó la digestión del vector
pKLAC2 con las enzimas BamHI-HF y EcoRI-HF con el fin de generar los extremos
cohesivos a los cuales se unirá posteriormente la secuencia codificante para GFP. Antes de
realizar la ligación se procede a purificar el vector pKLAC2, haciendo uso del kit Invitrogen
PureLink PCR purification, para posteriormente realizar la ligación.
3.2 Trasformación en levadura K. lactis
El resultado de la ligación se transformó en células competente de K. lactis por medio de
choque térmico y se cultivaron de 3 a 4 días en medio YCB con acetamida para la selección
de células transformadas, los resultados de esta transformación se ilustran en la Figura 10.
En la Figura 10 b se logra observar la formación de pequeñas colonias lo que indica que el
vector de expresión ha logrado introducirse en las células de levadura proporcionándoles la
resistencia a acetamida, mientras que en el control negativo (Figura 10 a) no se observa
presencia de colonias por lo que el procedimiento fue adecuado ya que las cepas de levadura
sin vector no lograron crecer en un medio con acetamida. Los anteriores resultados,
demuestran la efectividad de la transformación, sin embargo, para obtener un procedimiento
más eficiente se recomienda realizar el calentamiento previo de cada uno de los medios y
soluciones usados. Por otra parte, en necesario considerar la posibilidad que algunas de las
colonias transformadas solo cuenten con la inserción del del vector pKLAC2 sin el gen de
interés debido a una baja eficiencia de la ligación, por lo cual es necesario verificar la
presencia del gen de interés haciendo uso de diversas colonias.
Figura 10. Resultados transformación células de Kluveromyces lactis competentes, a) control negativo, b) células
transformadas
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3.3 Verificación por PCR de colonia
Dado que la transformación fue exitosa, se procedió a hacer pases de 8 colonias a medio
líquido y se incubo durante 2 días. Posteriormente, se realizó PCR de colonia y luego una
electroforesis para verificar que el gen de interés se encontrara dentro del genoma de la
levadura. Los resultados de la electroforesis se ilustran en la Figura 11.
Figura 11. Electroforesis al 0,9 % de agarosa realizada. a) Marcador de ADN 1 kb NEB [33]. b) primer carril marcador de
ADN 1 kb, carril dos al nueve colonias escogidas, carril 10 a 12 controles k. lactis.
Con base a la Figura 11, se observa la presencia de bandas diferentes a los controles con un
tamaño aproximado de 1,3 kb, en los carriles 2, 3, 4, 5, lo cual no es lo esperado ya que
basados en el protocolo de expresión en K. lactis se esperaba una banda de 2,4 kb que
indicaría una adecuada inserción del gen de interés al genoma de la levadura. Sin embargo,
la presencia de una banda por fuera de los carriles de control es interpretada como una posible
inserción que no puede verse claramente en un procedimiento de PCR de colonia, por lo que
se procede a realizar extracción del ADN de la levadura para volver a evaluar por PCR.
Adicionalmente, estos resultados demuestran que no todas las colonias de la transformación
tienen la inserción de la secuencia codificante de la proteína GFP, lo cual puede deberse a
baja eficiencia en el proceso de ligación, que se pudo dar por las concentraciones del inserto
y/o el vector, ya que se tenía el inserto a una concentración de 8,3 ng/µl y el vector a una
concentración de 16,2 ng/µl, por lo cual fue necesario realizar la ligación en una relación 7:1,
lo cual es una de las mayores relaciones usadas en este procedimiento.
Por otra parte, se considera que una de las razones por la que no se ha logrado obtener un
tamaño de banda de 2,4 kb se debe a que la secuencia codificante para la proteína GFP
presenta sitios de corte para la enzima SacII lo cual no es recomendable por el manual de
expresión ya que impide que se forme un adecuado casete de expresión.
15
3.4 Verificación por PCR con ADN genómico
Por lo anterior, se realizó un cultivo en medio YNB solido con acetamida de las colonias
seleccionadas. Para posteriormente realizar un cultivo liquido en medio YNB con acetamida,
luego se realizó la extracción de ADN genómico de dichas colonias, teniendo como
resultados concentraciones para las colonias 1, 2, 7, 8 de 210 ng/µl, 130,9 ng/µl, 128 ng/µl,
125,2 ng/µl respectivamente. Luego, se llevó a cabo una PCR con el ADN genómico
resultante, cuyos resultados de la electroforesis se ilustra en la Figura 12.
Figura 12. Electroforesis al 0,9 % de agarosa realizada. a) Marcador de ADN 1 kb NEB [33]. b) primer carril marcador de
ADN 1 kb, segundo carril colonia 1, tercer carril colonia 2, cuarto carril colonia 7, quinto carril colonia 8, sexto carril
control PCR.
Con base en la anterior figura, se observa que solamente las colonias 1, 2, y 7 que se encuentra
en los carriles 2, 3, 4 tienen presencia de bandas, mientras en la colonia 8 no se observan
bandas y el control de PCR no tiene bandas tal como esperaba. Por otra parte, se puede ver
que las bandas inferiores a 1kb que se evidencian en el gel corresponderían a la huella de la
levadura. Además, en esta prueba se vuelve a observar una banda adicional ubicada en
aproximadamente 1,3 kb lo cual puede interpretarse como la inserción de un gen externo en
la región promotora LAC4 del genoma de K. lactis. Con estos resultados, se puede ver que
no se llega al tamaño de banda esperado, lo cual se puede atribuir a la presencia del sitio de
corte de la enzima SacII en el gen de interés, por lo cual se recomienda revisar la secuencia
con anterioridad para verificar que no tenga el sitio de restricción de esta enzima y en caso
de tenerlo poder retirarlo antes de insertarlo al genoma. Adicionalmente y con el fin de
determinar qué es lo que se está amplificando con los primers de integración se recomienda
secuenciar los fragmentos obtenidos. Del mismo modo, para verificar la inserción del gen de
GFP en el genoma de la levadura se propone diseñar primers antes de la región de
recombinación del vector pKLAC2 para amplificar el casete de expresión e intentar evaluar
la integración del gen por electroforesis o secuenciación.
16
3.5 Verificación por fluorescencia
Por otra parte, se verificó la expresión de la proteína GFP haciendo uso de exposición en UV,
sin embargo, no se logró observar un cambio significativo en la fluorescencia de las muestras
por lo que se considera que los niveles de expresión de GFP en K. lactis no fueron lo
suficientemente altos para visualizar su expresión en UV. Lo anterior, se observa en la Figura
13, en la que se observa un cambio en la fluorescencia entre las muestras de la expresión de
la proteína GFP con las muestras blanco. Con base a estos resultados, se tiene que la proteína
GFP puede ser usada cómo plataforma de producción de péptidos haciendo uso de la levadura
K. lactis. Sin embargo, es necesario realizar curvas de fluorescencia que permitan analizar a
profundidad la fluorescencia y a su vez permitan estudiar la eficiencia de crecimiento, para
posteriormente estudiar la eficiencia de producción del gen de interés.
Figura 13. Resultados exposición UV. En la parte superior se observa las muestras resultantes de la expresión de la
proteína GFP, en la parte inferior se observa el blanco.
4. CONCLUSIONES
La digestión de los péptidos hidrofílico e hidrofóbico no fue exitosa debido a la ineficiencia
al intentar separar el gen de interés del vector inicial, por lo cual se requiere realizar un
análisis sobre los sitios diana y verificar la posible formación de estructuras secundarias. Esto
con el fin de identificar la causa de la inefectividad del proceso de digestión y con ello realizar
las correcciones pertinentes para posteriormente pasar a evaluar su producción en K. lactis.
Adicionalmente, la proteína GFP es una plataforma adecuada para la producción de péptidos
en la levadura K. lactis, sin embargo, es necesario hacer uso de una secuencia de ADN que
codifique la proteína, pero no posea sitio diana de corte de la enzima SacII, con el fin de
lograr una adecuada formación del casete de expresión que permita una apropiada inserción
del gen de interés en el genoma de la levadura.
17
La levadura K. lactis es un sistema efectivo para la expresión de péptidos y proteínas; sin
embargo, es necesario realizar una curva de crecimiento que facilite y/o mejore la creación
de células competentes. Además, se recomienda realizar estudios de comportamiento a
diferentes condiciones de cultivo, que permitan conocer a profundidad el funcionamiento de
la levadura. Todo esto, con el fin de lograr un óptimo desempeño de la levadura.
Por otra parte, se recomienda realizar comprobaciones del procedimiento en la bacteria E.
coli antes de realizar la inserción en la levadura K. lactis, esto con el fin de verificar la
adecuada realización de los procedimientos como lo son la ligación y la digestión. Esto se
realiza con el fin de verificar la efectividad de la metodología y así evitar pérdidas de tiempo
y recursos y a su vez mejorar la eficiencia en la producción.
Finalmente, se sugiere emplear diferentes péptidos que permitan evaluar el método de
secreción de péptidos y proteínas al medio, con el fin de usar la importante estrategia de
producción propia de levaduras como lo es K. lactis.
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