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Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro

y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

Viviana López Ramírez

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Minas, Departamento de Geociencias y Medio Ambiente

Medellín, Colombia

2015

II Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro

y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

Viviana López Ramírez

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Medio Ambiente y Desarrollo.

Director:

Ph.D. Marco Antonio Márquez Godoy

Codirectora:

Ph.D. Claudia Ximena Moreno Herrera

Línea de Investigación:

Biotecnología ambiental

Grupo de Investigación:

Grupo de Mineralogía Aplicada y Bioprocesos (GMAB)

Grupo de Microdiversidad y Bioprospección (MICROBIOP)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Minas, Departamento de Geociencias y Medio Ambiente

Medellín, Colombia

2015

IV Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

Believe those who are seeking the truth.

Doubt those who find it.

André Gide

VI Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

Agradecimientos

Agradezco principalmente a Dios. A mi familia por todo su amor y comprensión durante todo este camino. Mis padres que han sido maravillosos y me han apoyado en todo mi proceso personal y académico, a mi hermana que siempre me escucha y con sus consejos no sería lo que soy hoy, y a quien admiro demasiado. A mi hermoso sobrino Pablo, quien diariamente me alegra la vida con sus sonrisas y abrazos. A Sergio que con sus palabras de amor, consejos permanentes y apoyo incondicional hicieron esto más sencillo.

A la Universidad Nacional de Colombia- Sede Medellín, por la financiación de esta investigación por medio del proyecto con código QUIPU 200000012984, a través de la “Convocatoria del programa nacional de proyectos para el fortalecimiento de la investigación, la creación y la innovación en posgrados de la Universidad Nacional de Colombia 2013-2015” y a COLCIENCIAS por financiar el proyecto con código QUIPU 202010013057 de la “Convocatoria Nacional Jóvenes Investigadores e Innovadores 2014-2015”.

A la empresa Mineros S.A. por proveer las muestras de la planta industrial para este estudio.

A mis compañeros de los grupos de Microdiversidad y Bioprospección (MICROBIOP) y el Grupo de Mineralogía Aplicada y Bioprocesos (GMAB), con quienes tuve momentos bastante agradables y me ayudaron tanto con sus comentarios, enseñanzas y sugerencias.

Agradezco a los Laboratorios de Biomineralogía y Biohidrometalurgia (LBB) y Laboratorio de Investigación de Biología Molecular y Celular, en donde se llevó a cabo esta investigación.

Igualmente, me gustaría expresar mi gratitud a mis directores Dra. Claudia Ximena Moreno Herrera y Dr. Marco Antonio Márquez Godoy por su constante apoyo y paciencia durante el desarrollo de la esta tesis y compartir sus conocimientos por medio de su asesoría técnica y profesional.

VIII Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

Resumen y Abstract IX

Resumen Las tecnologías usadas para el tratamiento de aguas residuales contaminadas con cianuro dependen de una combinación de factores físicos y químicos. Debido a que el cianuro es altamente tóxico, debe ser tratado antes de ser descargado en los efluentes. Se desconoce la diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a lugares contaminados con cianuro que puedan tener potencial para un proceso de remediación in situ. El tratamiento, con la ayuda de microorganismos, puede utilizarse eficazmente para reducir la carga de productos químicos nocivos al medio ambiente. En este estudio fueron usadas aproximaciones dependientes de cultivo y análisis moleculares para estimar la diversidad bacteriana asociada a procesos de cianuración en una planta artesanal y una planta industrial en Marmato (Caldas, Colombia). En este trabajo los patrones de diversidad bacteriana fueron determinados a través de PCR-TTGE (Electroforesis en gel de gradiente de temperatura temporal). Los patrones de diversidad fueron estimados por el número y la intensidad de las bandas del TTGE, donde se encontraron diferencias de diversidad entre las muestras de las dos plantas artesanal e industrial. Estos hallazgos se complementaron con análisis de cultivos de bacterias con capacidad de crecer en medio suplementado con cianuro y medios sin suplementar. Los aislados se caracterizaron e identificaron por el análisis de la Región del Espaciador Intergénico 16S-23S DNAr (RISA) y la secuencia del gen RNAr 16S. Los fila predominantes fueron Firmicutes, Proteobacteria y Actinobacteria. Adicionalmente, se evaluó la capacidad de degradación de cuatro aislados en medio LB con 200 ppm de cianuro como ensayo preliminar de degradación y posteriormente se evaluaron todos los aislados nativos obtenidos de forma individual en tres concentraciones de cianuro (200, 500 y 1000 ppm) en medio M9 y un ensayo de degradación usando un cultivo mixto de tres microorganismos nativos, usando las tres concentraciones de cianuro. Los tres ensayos revelaron degradación con respecto al tiempo en todos los aislados. El aislado que presentó mayores porcentajes de degradación usando el medio LB con 200 ppm de cianuro, fue el aislado A7R2A9 identificado molecularmente como Rhodococcus corynebacterioides y el que mostró mejor desempeño en el medio M9 con las tres concentraciones evaluadas, fue el A8R2A16 identificado molecularmente como Microbacterium oxydans, degradando hasta 40% de cianuro presente en el medio. Por otro lado, los ensayos usando cultivos mixtos mostraron que no hubo degradación, probablemente debida a competencia entre los aislados usados o generación de metabolitos secundarios que inhibían la degradación. Este trabajo es el primer reporte en Colombia que proporciona información sobre los patrones de diversidad bacteriana por métodos dependientes e independientes de cultivo, de lugares contaminados con cianuro y evalúa la capacidad de degradación de cepas nativas, donde algunas de ellas no habían sido reportadas como degradadoras ni habitantes de lugares contaminados con cianuro. Estos datos sugieren que la presencia de estos microorganismos en dichos ambientes tiene un papel en la degradación biológicas de estos compuestos de cianuro o procesos acoplados a ésta.

Palabras clave: Cianuro, diversidad bacteriana, degradación biológica de cianuro, bacterias nativas, TTGE.

X Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

Abstract

The technologies used into cyanide contaminated water treatment depend of a combination of physic and chemistry factors. Due to cyanide is highly toxic, it must be treated before it to be discharged into effluents. It is unknown the bacterial communities diversity which are associated with places contaminated with cyanide who could have an in situ remediation process potential. The treatment, with help of microorganism, can be used efficiently in order to reduce the load of chemistry products which are harmful to environment. In this study were used some approximations which are dependent of molecular culture and analysis to estimate the bacterial diversity associated to cyanidation processes in an artisanal plant and in an industrial plant located in Marmato (Caldas, Colombia). In this paper, the bacterial diversity patrons were determined by PCR-TTGE.The diversity patrons were estimated by the number and intensity of the Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis bands, where were found diversity differences among samples of the two plants, the artisanal and the industrial one. These finds were complemented with analysis of bacterial cultures with capability to grow up into environment supplemented with cyanide and into environments without any supplement. The isolates were characterized and identified by analysis of ribosomal intergenic spacer regions 16S-23S DNAr (RISA) and 16S rRNA gene sequence. The predominant fila were Firmicutes, Proteobacteria and Actinobacteria. Additionally, was evaluated the degradation capability of four isolated in LB media with 200 ppm of cyanide as preliminary test of degradation and later were evaluated all of the native isolated which were obtained individually, with three cyanide concentrations (200, 500 and 1000 ppm) in M9 media and a degradation test in which it was used a mixed culture with three native microorganisms and the three different cyanide concentrations. The three tests revealed degradation in function of time in all of the isolated. The isolated which showed higher degradation percentages using LB media with 200 ppm of cyanide was the A7R2A9 isolated, was identified molecularly as Rhodococcus corynebacterioides, which degraded until 53% and the isolated which showed better performance in M9 media, with the three concentrations evaluated, was the A8R2A16 isolated, identified molecularly as Microbacterium oxydans, which degraded until 40% of the cyanide in the media. On the other hand, tests which used mixed cultures showed there was not degradation, probably due to competence among isolated which were used or due to secondary metabolites which inhibited degradation. This paper is the first report in Colombia which provides information about the bacterial diversity patrons by dependent and independent culture methods, from places contaminated with cyanide and evaluates native bacteria degradation capabilities, where some of them had not been reported as degraders and neither as habitants of places contaminated with cyanide. These data suggest who the presence of these microorganisms in said environments has a role in the biological degradation of these cyanide compounds or in the processes coupled to this degradation.

Keywords: cyanide, bacterial diversity, cyanide biological degradation, native bacteria, TTGE.

Contenido XI

Contenido Pág.

Resumen………………………………………………………………………………….IX Lista de figuras…………………………………………………………………………XIII Lista de tablas………………………………………………………………..…………XIV Lista de abreviaturas………………………………………………………………….....XV Introducción………………………………………………………………………………..1

Objetivos…………………………………………………………………………………...3

1. Capítulo: Caracterización de la diversidad bacteriana asociada a lugares contaminados con cianuro. ............................................................................................. 5

1.1 Introducción ..................................................................................................................... 5 1.2 Materiales y métodos ....................................................................................................... 8

1.2.1 Toma y procesamiento de las muestras ....................................................................................... 8 1.2.2 Caracterización inicial de las muestras ......................................................................................... 9 1.2.3 Aislamiento de bacterias tolerantes a medios con cianuro ........................................................ 9 1.2.4 Secuencias DNAr 16S y análisis filogenético de los aislados .................................................. 10 1.2.5 Análisis de la comunidad bacteriana mediante Electroforesis en Gel de Gradiente de Temperatura Temporal (TTGE) .............................................................................................................. 10 1.2.6 RISA de la fracción cultivable y la fracción total ...................................................................... 11 1.2.7 Activación de los inóculos ........................................................................................................... 11 1.2.8 Ensayos a nivel de Erlenmeyer .................................................................................................... 12 1.2.9 Métodos analíticos ......................................................................................................................... 12

1.3 Resultados ...................................................................................................................... 13 1.3.1 Caracterización físico-química de las muestras ......................................................................... 13 1.3.2 Diversidad de aislados bacterianos en medio con solución cianurada .................................. 14 1.3.3 Secuencias DNAr 16S y análisis filogenético de aislados obtenidos ..................................... 16 1.3.4 Análisis de la comunidad bacteriana mediante Electroforesis en Gel de Gradiente de Temperatura Temporal (TTGE) .............................................................................................................. 18 1.3.5 RISA de la fracción cultivable y la fracción total ...................................................................... 20 1.3.6 Bioensayo preliminar de degradación ......................................................................................... 21

XII Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

1.3.7 Comportamiento de pH y crecimiento celular ......................................................................... 22 1.3.8 Análisis estadísticos ....................................................................................................................... 23

1.4 Discusión ........................................................................................................................ 24

2. Capítulo: Tratamiento biológico de cianuro por bacterias aisladas de plantas de lixiviación de oro colombianas. ..................................................................................... 33

2.1 Introducción ................................................................................................................... 33 2.2 Materiales y métodos ..................................................................................................... 37

2.2.1 Aislados bacterianos ..................................................................................................................... 37 2.2.2 Activación de los inóculos ........................................................................................................... 37 2.2.3 Ensayos a nivel de Erlenmeyer ................................................................................................... 37 2.2.4 Diseño experimental ..................................................................................................................... 38 2.2.5 Métodos analíticos ........................................................................................................................ 38 2.2.6 Extracción de DNA cultivos mixtos .......................................................................................... 39 2.2.7 Análisis estadísticos ....................................................................................................................... 39

2.3 Resultados ...................................................................................................................... 39 2.3.1 Bioensayos de degradación con aislados bacterianos .............................................................. 39 2.3.2 Bioensayos de degradación con cultivos mixtos ...................................................................... 42 2.3.3 Comportamiento de pH y crecimiento celular ......................................................................... 43 2.3.4 Concentración de DNA de los cultivos mixtos ....................................................................... 44 2.3.5 Análisis estadísticos ....................................................................................................................... 45

2.4 Discusión ........................................................................................................................ 45

3. Capítulo: Conclusiones y recomendaciones. ......................................................... 53 3.1 Conclusiones .................................................................................................................. 53 3.2 Recomendaciones .......................................................................................................... 54

A. Anexo: Sitios de muestreo…………………………………………………..........…..57

B. Anexo: Aislados obtenidos con su identificación macro y microscópica..........…..59

C. Anexo: Resultados análisis estadísticos FC y FT……………………………………61

D. Anexo: Resultados análisis estadísticos ensayos de degradación………………….63

E. Anexo: Abstracts presentados en congresos…………………………………………90

Bibliografía………………………………………………………………………………..93

XIII

Lista de figuras Pág.

Figura 1-1: Localización del municipio de Marmato (Caldas, Colombia)………………………...9

Figura 1-2: Recuento de UFC/mL en los medios LB y LBs……………………………………14

Figura 1-3: Análisis RISA de los aislados……………………………………………………….16

Figura 1-4: Árbol filogenético de los aislados…………………………………………………..18

Figura 1-5: Dendograma TTGE de los productos amplificados del gen DNAr 16S……………19

Figura 1-6: Árbol filogenético de las bandas del TTGE………………………………………...21

Figura 1-7: Análisis RISA de la FC y FT………………………………………………………..22

Figura 1-8: Análisis NMDS del TTGE…………………………………………………………23

Figura 1-9: Degradación de cianuro vs tiempo en el medio LB a 200 ppm de NaCN…………..24

Figura 1-10: pH vs tiempo de los bioensayos preliminares en medio LB………………………...25

Figura 1-11: Concentración de cianuro y pH inicial vs UFC/mL………………………………...26

Figura 2-1: Degradación de cianuro vs tiempo a 200 ppm de NaCN en medio M9…………….42

Figura 2-2: Degradación de cianuro vs tiempo a 500 ppm de NaCN en medio M9…………….43

Figura 2-3: Degradación de cianuro vs tiempo a 1000 ppm de NaCN en medio M9…………....43

Figura 2-4: Cianuro removido vs concentración de cianuro en medio M9……………………...44

Figura 2-5: Degradación de cianuro vs tiempo usando los cultivos mixtos en medio M9......…...45

Figura 2-6: Análisis RISA de los cultivos mixtos……………………………………………….47

Contenido XIV

Lista de tablas Pág.

Tabla 1-1: Parámetros físico-químicos de las muestras………………..……………………….13

Tabla 1-2: Caracterización del efluente tomado de la planta industrial…………………………13

Tabla 1-3: Identidades taxonómicas de las secuencias de las bacterias aisladas…...…………….17

Tabla 1-4: Identidades taxonómicas de las bandas del TTGE…………………………...……..20

Tabla 2-1: Concentración celular de inóculos y al final de los ensayos de degradación………....46

Contenido XV

Abreviaturas Abreviatura Término L Litro mL Mililitro mg Miligramo 𝜇L Microlitro °C Grados centígrados WAD Ácido Débil Disociable (Weak-Acid Dissociable) SAD Ácido Fuerte Disociable (Strong-Acid Dissociable)

CL9650

Concentración de una sustancia, elemento o compuesto, solos o en combinación, que produce la muerte al cincuenta por ciento (50%) de los organismos sometidos a bioensayos en un período de noventa y seis (96) horas.

ppm Partes por millón M Molar rpm Revoluciones por minuto h Hora(s) pH Potencial de hidrógeno V Voltios % Porcentaje UFC Unidades Formadoras de Colonia LB Medio de cultivo Luria-Bertani R2A Medio de cultitvo Reasoner´s 2A TAE Buffer Tris-Ácido Acético-EDTA RISA O IGS Análisis de espaciadores intergénicos ITS Internal Transcribed Spacer PCR Reacción de la Cadena Polimerasa

TTGE Electroforesis en Gel de Gradiente de Temperatura Temporal

KCl Cloruro de potasio DNA Ácido Desoxirribonucleico RNA Ácido Ribonucleico bp Pares de bases HCN Cianúro de hidrógeno NaCN Cianuro de sodio KCN Cianuro de potasio N Nitrógeno C Carbono

Introducción Para la explotación de oro y plata es necesario el uso de sustancias químicas como el mercurio, el cianuro o el ácido nítrico (Akcil, 2003), cada uno de ellos con un impacto importante sobre el medio ambiente. El cianuro es el insumo básico de muchos procesos industriales aparte del beneficio de oro, sin embargo, es muy tóxico y puede llegar a ser letal. Estos residuos cuando son vertidos sin ningún tipo de tratamiento pueden ocasionar que los cuerpos receptores no se auto-recuperen, alterando sus características y generando un gran impacto ambiental (Deloya, 2012).

De ahí la gran importancia de tratar los residuos de cianuro, para lo cual existen varios métodos que han sido utilizados ampliamente, entre los que se destacan tratamientos químicos y físicos como cloración alcalina, peróxido de hidrógeno, ozonación, ósmosis reversa, destilación, fotólisis, entre otros (Dash et al., 2009). Por otro lado, la degradación biológica aparece como una alternativa capaz de degradar diversos complejos de cianuro como cianuro libre, tiocianato, complejos metálicos WAD y SAD (Dash et al., 2009), sin generar efectos adversos y con un menor costo de operación (Akcil, 2003).

La gran variedad de especies de microorganismos que se encuentran en un lugar específico, nos da información acerca de cómo trabajan y nos permite encontrar soluciones a problemas ambientales complejos, tales como: degradación y pérdida de suelos, regeneración de plantaciones forestales, contaminación ambiental, etc. El uso de tales agentes debe tener implícita una estrategia de conservación y preservación.

En un primer acercamiento, la ecología microbiana nos permite de forma inicial conocer qué microorganismos están presentes en cierto nicho y de esta forma caracterizar y conocer su papel en estos ambientes (Torres-Cázares et al., 2012). De nuestro interés, es el ambiente minero contaminado con cianuro, con el objetivo de obtener microorganismos con la capacidad de resistir o degradar este contaminante. Por lo tanto, la ecología microbiana se convierte en una herramienta muy útil para aislar e identificar microorganismos con capacidad degradadora de cianuro.

El empleo de microorganismos que proliferan en ambientes de lixiviación con cianuro y su capacidad para utilizar este químico como fuente de nutrientes, específicamente de nitrógeno, convierte a esta tecnología en una valiosa herramienta natural para propósitos ambientales. Para el estudio de la biodiversidad, específicamente presente en sitios contaminados con cianuro, es necesario usar métodos convencionales y moleculares para la identificación de los microorganismos. El principal objetivo de este trabajo fue estudiar la diversidad bacteriana presente en efluentes residuales de procesos de cianuración en plantas de beneficio de oro y evaluar su potencial frente a la degradación de cianuro.

2 Introducción

Este trabajo se dividió en tres capítulos. El Capítulo 1 contiene el estudio de diversidad bacteriana asociada a sitios contaminados con cianuro por medio de técnicas dependientes de cultivo y moleculares, además se muestra un ensayo preliminar de degradación usando cuatro microorganismos aislados nativos. En el Capítulo 2, se evalúan todas las cepas nativas que fueron aisladas en tres concentraciones de cianuro, además de evaluar la capacidad de degradación de un cultivo mixto de tres microorganismos nativos. Por último, en el Capítulo 3, se dan algunas recomendaciones para estudios posteriores y conclusiones más importantes de la investigación.

Objetivos 3

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Estudiar la diversidad bacteriana presente en efluentes residuales de procesos de cianuración en plantas de beneficio de oro y evaluar su potencial frente a la degradación de cianuro.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Evaluar y caracterizar la diversidad microbiana, presente en los efluentes residuales de procesos de cianuración en minas de oro en Antioquia, usando técnicas independientes de cultivo.

• Caracterizar las poblaciones bacterianas presentes en los efluentes residuales de procesos de cianuración, usando técnicas de cultivo-dependiente y correlacionar la diversidad bacteriana encontrada usando técnicas de cultivo independiente.

• Identificar la cepa o consorcio que presente degradación de cianuro y evaluar su desempeño in vitro.

4 Introducción

1. Capítulo: Caracterización de la diversidad bacteriana asociada a lugares contaminados con cianuro.

Resumen: En el presente trabajo se estudió la diversidad bacteriana más representativa asociada a lugares contaminados con cianuro por minería de veta, en dos plantas de beneficio de oro, en el municipio de Marmato ubicado en el departamento de Caldas, Colombia. Estos lugares presentaban diferentes concentraciones de cianuro y metales pesados debido al proceso extractivo específico, los lugares consistían en una planta de beneficio de oro industrial y artesanal, donde las condiciones de cada proceso eran diferentes, siendo más rigurosa al controlar concentraciones de cianuro y pH la planta industrial. En la determinación de la estructura de la diversidad bacteriana se utilizaron técnicas dependientes e independientes de cultivo como la Electroforesis en Gel de Gradiente de Temperatura Temporal (TTGE) , basada en el análisis de gen RNAr 16S por medio de geles de poliacrilamida según su comportamiento denaturate y movilidad electroforética. Los amplicones obtenidos del gen fueron secuenciados y comparados con bases de datos de DNA públicas. Estas afiliaciones permitieron identificar filogenéticamente las poblaciones bacterianas asociadas a estas dos plantas de beneficio de oro. Se encontró que la diversidad es variable dependiendo del lugar de proveniencia de la muestra si era planta industrial o artesanal, además de visualizar diferencias entre la diversidad encontrada por métodos dependientes e independientes de cultivo, por lo que la aproximación con ambos métodos fue complementaria. El análisis de la diversidad muestra que las comunidades bacterianas pertenecen a miembros del fila Firmicutes, Actinobacteria y Proteobacteri. Adicionalmente, se evaluó la capacidad de degradación de cianuro de cuatro de los aislados a una concentración de 200 ppm en medio LB, donde el aislado A7R2A9 presento la mayor degradación (53%). Este trabajo permitió caracterizar patrones de diversidad bacteriana en lugares contaminados con cianuro y sugiere que su presencia en dichos ambientes tiene un papel en la degradación biológica de estos compuestos de cianuro o procesos acoplados a ésta.

Palabras Clave: Cianuro, ecología microbiana, diversidad bacteriana, TTGE, gen RNAr 16S.

1.1 Introducción

El cianuro es considerado como una molécula involucrada en la síntesis de aminoácidos, proteínas, nucleótidos, lípidos y membranas en la tierra primitiva (Gupta et al., 2010), por lo que tiene gran importancia evolutiva en la aparición de los primeros organismos vivos (Lazcano, 1986). El cianuro es producido de forma natural por bacterias, hongos, insectos, algas y plantas, donde es usado como mecanismo de defensa o con propósitos invasivos. Sin embargo, para la mayoría de sistemas vivos el cianuro es altamente tóxico, ya que forma complejos estables con metales de transición esenciales para el funcionamiento de proteínas (Luque-Almagro et al., 2005). Además de esto, el cianuro es capaz de complejarse con la enzima citocromo oxidasa C de la Cadena Transportadora de Electrones (Raybuck, 1992), inhibiendo la formación de ATP esencial para la energía celular. Los organismos capaces de

6 Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y

evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

crecer en presencia de cianuro deben tener un metabolismo insensibles a él, como el caso del citocromo bd (insensible al cianuro) en algunas bacterias (Jünemann, 1997; Matsushita et al., 1983).

En la Primera Guerra Mundial, el cianuro fue usado como arma química para exterminación en edificios y barcos (Gupta et al., 2010). Actualmente, gran variedad de industrias lo usan para sus procesos productivos como la galvanoplastia, el plástico, pesticidas, medicamentos, producción de papel, minería, entre otras. Sólo el 18% de la producción total de cianuro es usado en la minería, especialmente en la recuperación de oro (Logsdon et al., 2001). La molécula de cianuro es fácilmente destruída por fotodegradación, temperatura, precipitación, complejación, adsorción y biodegradación mediada por microorganismos nativos (Christen, 2008; Laitos, 2012). Sin embargo, a bajas concentraciones causa grandes daños ambientales, además de formar complejos metálicos de cianuro altamente estables y persistentes en el ambiente (Luque-Almagro et al., 2005).

Dentro de las numerosas tecnologías existentes para la remediación del cianuro, la degradación biológica se presenta como una alternativa muy prometedora. El empleo de microorganismos que proliferan en ambientes de lixiviación con cianuro y su capacidad para utilizar este químico como fuente de nutrientes, específicamente de nitrógeno, convierte a esta tecnología en una valiosa herramienta natural para propósitos ambientales. Por lo tanto, estas tecnologías más limpias, en especial la bioremediación o los biotratamientos, requieren el conocimiento sobre microorganismos ambientales, ya que nos dan información que permite el desarrollo de actividades biotecnológicas de remediación, alimentos, medicamentos, entre otros. En un primer acercamiento, la ecología microbiana nos permite de forma inicial conocer qué microorganismos están presentes en cierto nicho y de esta forma caracterizar y conocer su papel en estos ambientes (Johnson, 2001; Torres-Cázares et al., 2012). De nuestro interés, es el ambiente minero contaminado con cianuro, con el objetivo de obtener microorganismos con la capacidad de resistir o degradar este contaminante.

La ecología microbiana en minas ha sido de gran interés en los últimos años, ya que ha dilucidado información del papel fundamental de los microorganismos en estos ambientes, que generalmente son hostiles como biolixiviación de minerales (Muñoz et al., 2015), formación de depósitos calcáreos (García et al., 2015), tolerancia a metales pesados (Abbas et al., 2015) y degradación de sustancias tóxicas asociadas a procesos extractivos (Blumer & Haas, 2000; Dhal et al., 2011; Ledin & Pedersen, 1996). La diversidad y distribución de microorganismos está influenciada por la composición de la matriz geoquímica de los microhabitats y la introducción de sustancias tóxicas o contaminantes que causa cambios en la estructura, diversidad y función de la comunidad microbiana asociada al lugar (Dhal et al., 2011). La minería aurífera trae consigo una importancia a nivel económico y social, pero también, en la mayoría de los casos, el cianuro usado en esta industria para lixiviar el oro de la roca, tiene gran impacto a nivel ambiental por la falta de tratamiento (Cordy et al., 2011) o por ser muy costosa la destrucción de éste para poder liberar las aguas residuales de este contaminante (Akcil et al., 2003; Akcil, 2003; Kuyucak & Akcil, 2013).

Las condiciones extremas de los ambientes mineros pueden referirse a condiciones físicas extremas como temperatura, presión o radiación y a condiciones geoquímicas extremas como la salinidad y el pH (Restrepo et al., 2006). Además algunos microorganismos pueden sobrevivir en ambientes expuestos a sustancias químicas tóxicas, debido a las actividades realizadas por el hombre (Aksornchu

Capítulo 1 7

et al., 2008; Z. Chen et al., 2012; Nakatsu et al., 2005). De ahí, la importancia biotecnológica que estos microorganismos tienen como potenciales agentes en remediación y por lo tanto en tecnologías más limpias, amigables y responsables con el medio ambiente.

El estudio de la ecología microbiana presente en las plantas de beneficio de oro en Colombia, implica un aporte al conocimiento sobre la microdiversidad y sobre todo de los potenciales biotecnológicos que poseen ciertos terrenos mineros de nuestro país. Es necesario conocer la diversidad microbiana como un componente conectado a su hábitat, el cual incluye otras formas de vida y ambientes interrelacionados e interdependientes y al darles un uso sostenible por medio de herramientas biotecnológicas (Torres-Cázares et al., 2012).

A pesar de que los terrenos mineros son ambientes creados por el ser humano, son gobernados por reglas ecológicas, tales como las relaciones simbióticas entre quimiolitótrofos y su ambiente (Torres-Cázares et al., 2012). Por esta razón, aislar e identificar las cepas nativas presentes, requiere de un amplio estudio de métodos independientes y dependientes de cultivo. Por un lado, una ventaja del uso de métodos dependientes de cultivo es estudiar características fisiológicas y estructurales de los aislados, por otro lado, representa una herramienta invaluable para estudiar la biología y ecología asociada a bacterias (Vaz-Moreira et al., 2013).

La Reacción de la Cadena Polimerasa- Electroforesis en Gel de Gradiente de Temperatura Temporal (PCR-TTGE), es una técnica basada en la técnica de PCR convencional, en la cual el DNA es extraído de la muestra y amplificado usando primers universales bacterianos de la región conservada DNAr 16S (Fischer & Lerman, 1983). Todos los fragmentos de PCR son aproximadamente del mismo tamaño y cuando es corrido en electroforesis en el gel de poliacrilamida, éste contiene un gradiente de temperatura denaturante de DNA (Monira et al., 2012; Nieguitsila et al., 2007), que incrementa gradualmente durante el tiempo de corrida. Al correr el ADN en el gel, la molécula se mantiene como doble cadena hasta que alcanza la concentración o temperatura desnaturalizante, reduciendo su movilidad (Hill et al., 2000). Los amplicones dejan de migrar como doble cadena y se desnaturalizan en función de su contenido G+C (Fischer & Lerman, 1983; McCracken et al., 2001). Esta técnica permite la separación de secuencias individuales de acuerdo a su contenido G+C, las cuales estas corresponden a diferentes comunidades microbianas presentes en la muestra (McCracken et al., 2001). El patrón de bandeo entre cada muestra permite evaluar la similaridad entre comunidades microbianas de diferentes lugares o tratamientos (McCracken et al., 2001).

La mayor parte de estudios de lugares contaminados con cianuro se enfocan en la biorremediación y pocas se centran en el estudio de las comunidades microbianas asociadas a este ambiente. Para el estudio de la biodiversidad y las variaciones entre poblaciones bacterianas, específicamente presente en sitios contaminados con cianuro, es necesario usar métodos convencionales y moleculares para la identificación de los microorganismos (Torres-Cázares et al., 2012; Vaz-Moreira et al., 2013). Se ha observado que aunque los linajes pueden no coincidir, el mismo fila predominante se detecta usando métodos ya sea cultivo independiente o dependiente (Hoefel et al., 2005; Vaz-Moreira et al., 2013).



Estudios usando técnicas cultivo dependientes o convencionales han encontrado bacterias gram negativas como Pseudomonas (Grigor’eva et al., 2008), Achromobacter, Flavobacterium, Nocardia, Bdellovibrio, Mycobacterium, y bacterias nitrificantes como, Nitrosomonas y Nitrobacter (Akcil, 2003). Además, se ha observado una actividad degradadora de cianuro en Trichoderma sp. (Zhou et al., 2007), Polyporus sp. (Özel et al., 2010), entre otros. Por otro lado, usando técnicas independientes de cultivo como DGGE (Electroforesis en Gel con Gradiente de Desnaturalización), se han encontrado microorganismos tales como Zoogloea ramigera, Acidovorax sp., Achromobacter sp., Janthinobacterium sp., Klebsiella sp., Microbacterium sp., Acidobacteria, Algibacter sp., Chryseobacterium sp., Pedobacter, Haliscomenobacter y Cytophaga (Zhe-Xue et al., 2006).

En Colombia existen antecedentes en degradación biológica de cianuro por consorcios o microorganismos nativos aislados (Coley-Benjumea & Zapata-Zuluaga, 2006; Molina et al., 2006) y con Pseudomonas fluorecens (Gil & Giraldo, 2005; Restrepo et al., 2006; Sánchez, 2010). Sin embargo estos estudios han sido sólo cultivo dependientes y es necesario correlacionarlos con técnicas moleculares y usando metodologías de cultivo independientes.

El principal objetivo de este capítulo fue evaluar y caracterizar la diversidad bacteriana presente en los efluentes residuales de procesos de cianuración en dos plantas de beneficio de oro, usando técnicas dependientes de cultivo y correlacionar la diversidad bacteriana encontrada usando técnicas independientes de cultivo. Adicionalmente, se eligieron cuatro aislados dependiendo de la concentración de cianuro del lugar donde fue aislado, para evalular su potencial de degradación en medio LB suplementado con 200 ppm de cianuro.

1.2 Materiales y métodos

1.2.1 Toma y procesamiento de las muestras

El muestreo se realizó en dos lugares: una planta de oro artesanal y una planta industrializada, ubicadas en el municipio de Marmato (Caldas, Colombia) (Figura 1-1). En total fueron tomadas 10 muestras en lugares donde el cianuro estaba presente. Se pudo constatar que la planta artesanal no tenía condiciones controladas para su proceso (pH, temperatura, concentración de cianuro). Por otro lado, la planta industrializada realizaba el proceso de cianuración controlando condiciones de pH, temperatura y concentración de cianuro en cada tanque de espesado, al igual que a la salida del proceso (Kuyucak & Akcil, 2013). Las muestras obtenidas de los dos sitios de muestreo estaban separadas geográficamente 200 m aproximadamente. Las muestras pertenecientes a la planta industrial fueron 4 (M1, M2, M3, M4) (Anexo A) y se tomaron de tanques espesadores, donde estaba presente la pulpa y la solución cianurada. Sólidos de la pared, película superficial y agua con pulpa de los tanques fueron tomadas como muestras. Por otro lado, la planta artesanal, estaba ubicada en un espacio abierto y no había mayores controles dentro y ni al finalizar el proceso. Se tomaron 6 muestras (A5, A6, A7, A8, A9, A10) (Anexo A). Las muestras se tomaron del borde del tanque de espesado, cachaza semisólida,

Capítulo 1 9

sedimento de decantación y efluente a la salida del proceso aguas arriba y aguas abajo. Entre estos dos últimos puntos había una distancia de 1.5 m aproximadamente.

Figura 1-1. Localización del municipio de Marmato (Caldas, Colombia).

De cada muestra se tomaron aproximadamente 500 mL en frascos de vidrio estériles, oscuros, tapa rosca, los cuales fueron conservados a 4°C, hasta su procesamiento en el laboratorio donde se les midió el pH. Las muestras se procesaron inmediatamente para su análisis cultivo dependiente.

1.2.2 Caracterización inicial de las muestras

Alícuotas de las 10 muestras se enviaron a laboratorios externos para realizar análisis de concentración de cianuro en todas las muestras, por medio de titulación o valoración volumétrica con nitrato de plata (American Public Health Association et al., 1913) y presencia de algunos metales en la muestras por medio de Espectrofotometría de Absorción Atómica por aspiración directa (plomo y aluminio acoplado a horno de grafito) (Robledo-Vélez & Castaño-Puerta, 2012).

1.2.3 Aislamiento de bacterias tolerantes a medios con cianuro

Bacterias con capacidad de tolerar o utilizar cianuro como fuente de nitrógeno bajo condiciones aerobias fueron aisladas en 4 medios diferentes: agar LB (LB) (Bertani & Weigle, 1953), agar LB suplementado con efluente que contenía cianuro (LBs). Se realizó diluciones seriadas de 1/10 mL de muestra en agua destilada estéril hasta 10-3. Los medios de cultivo se incubaron por 36 horas a 28°C hasta obtener crecimiento en las placas de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC). Las colonias



puras fueron re-aisladas en medio LB por lo menos tres veces y las cepas puras se caracterizaron microscópicamente mediante tinción de Gram (Anexo B) y molecularmente mediante el Análisis de Regiones Espaciadoras Intergénicas Ribosomal (RISA o IGS) entre la región DNAr 16S-23S (Gomez et al., 2011).

Para el Análisis RISA o IGS, se usaron los primers G1 (50-GAAGTC GTAACAAGG-30) y L1 (50-CAAGGCATCCACCGT-30) (Jensen et al., 1993). Los productos de la amplificación se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) utilizando el software GelCompar II (Applied Maths Biosystems, Bélgica); el método de correlación de DICE (Nei & Li, 1979) y, el coeficiente de similitud UPGMA (Mohammadi & Prasanna, 2003). Para la conservación a largo plazo, los aislados se almacenaron en medio LB líquido al 20% de glicerol -20°C y en -80°C.

1.2.4 Secuencias DNAr 16S y análisis filogenético de los aislados

Los aislamientos seleccionados según el patrón de bandeo dado por el análisis de IGS, se identificaron a través de la secuenciación del gen RNAr 16S (Weisburg et al., 1991), utilizando cebadores universales Eubac27F (50-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-30) y 1492R 50-GGTTACCTTGTTACGACTT-30). Aproximadamente 950 bp se obtuvieron a partir de la secuencia en ambas direcciones por Macrogen (Seúl, Corea), en un ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU). Las secuencias fueron editadas usando el programa BioEdit® (Hall, 1999) y se compararon con las secuencias de referencia a partir de la base de datos GenBank y el Ribosomal Database Project (RDP) con la herramienta de búsqueda de alineamiento (BLAST) (Altschul et al., 1997). Las secuencias fueron alineadas con el software MEGA, versión 6 (http://megasoftware.net/) (Tamura et al., 2007). Las quimeras fueron analizadas por DECIPHER (Wright et al., 2012) y el árbol filogenético generado por el método neighbor-joining (Saitou & Nei, 1987); las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de Jukes-Cantor y bootstrap de 1000 réplicas.

1.2.5 Análisis de la comunidad bacteriana mediante Electroforesis en Gel de Gradiente de Temperatura Temporal (TTGE)

La extracción de DNA total se hizo por medio del FastDNA™ SPIN kit for Soil (Wang et al., 2015). Para cada muestra se hicieron dos extracciones por separado, uniendo los eluidos correspondientes de la misma muestra y concentrándolos, usando Concentrator 2000 (Eppendorf, Estados Unidos). Se cuantificó el DNA mediante espectrofotometría usando NanoDrop 2000 (v1.0, Termo Scientific, Estados Unidos) y se visualizó en un gel de agarosa al 1% para verificar presencia y calidad del DNA.

La región V3-V6 del gen DNAr 16S se amplificó con los cebadores 341F (5`-GCCTACGGGAGGCAGCAG-3`) con una cola de GC en el extremo 5` y 907R (5`-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3` ) (Gomez et al., 2011; McCracken et al., 2001), con el fin de

Capítulo 1 11

obtener huellas moleculares de las comunidades bacterianas presentes en las muestras totales. Los fragmentos del ADNr 16S obtenidos de la amplificación fueron separados usando el DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, U.S.A), con un gel del poliacrilamida al 7% y urea 7M, en buffer TAE 1.5X. La electroforesis se llevó a cabo a un voltaje constante de 55 V por 15 h, con una temperatura inicial y final de 66 y 69°C respectivamente y una rampa de temperatura de 0.1°C/h. Los geles fueron teñidos con SafeView™ (Applied Biological Materials Inc). Las bandas de ADN, con patrones únicos de migración con respecto al marcador establecido y las bandas de mayor intensidad en cada gel de TTGE, fueron escindidas. El ADN de cada una de las bandas fue recuperado por el método de elución, dejando toda la noche las muestras en 60 𝜇L de agua de PCR. El ADN eluído fue usado para llevar a cabo la reamplificación, usando los cebadores 341F y 907R (sin la cola GC). Los productos re-amplificados fueron secuenciados en ambas direcciones por Macrogen (Seúl, Corea) en un ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU).

1.2.6 RISA de la fracción cultivable y la fracción total

La extracción de DNA total se hizo por medio del FastDNA™ SPIN kit for Soil (Wang et al., 2015) como se describió anteriormente. Para la fracción cultivable se tomó 1 mL de cada muestra de los medios agar LB suplementado (LBs) con efluente que contenía cianuro (1000 ppm) y agar LB (LB) y se realizó la extracción de DNA por medio de Soil DNA Isolation Kit (NORGEN, Biotek Corp.). Para ambas fracciones (total y cultivable) se hizo un análisis de Regiones Espaciadoras Intergénicas Ribosomal (RISA o IGS) (Jensen et al., 1993). Los productos amplificados de la región intergénica, se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). El análisis de los perfiles obtenidos en el gel, se analizó utilizando el software GelCompar II (Applied Maths Biosystems, Bélgica) (Rademaker & Bruijn, 2008). El análisis de agrupamiento se realizó por el método de correlación de DICE (Nei & Li, 1979) y con el coeficiente de similitud UPGMA (Mohammadi & Prasanna, 2003).

Para el análisis estadístico de los patrones de bandeo del TTGE de los productos amplificados de la Fracción Cultivable (FC) y de la Fracción Total (FT), se utilizaron las matrices cuantitativas y de presencia-ausencia, para evaluar la 𝛼-diversidad con los índices de Riqueza (S), Shannon (H`), Margalef (Mg) para la fracción total, además se realizó análisis de NMDS (Non-metric Multidimensional Scaling), basado en el índice de Bray-Curtis para observar diferencias significativas entre la Fracción Cultivable (FC) y la Fracción Total (FT), al igual que con lugares de muestreo; esto se realizó por medio del Software PAST versión 3.0 (Hammer et al., 2012). (http://folk.uio.no/ohammer/past/).

1.2.7 Activación de los inóculos

Se seleccionaron cuatro aislados de acuerdo a las concentraciones iniciales de los lugares donde fueron recolectados (alta, intermedia y baja). Los aislados M1LQA1, A7R2A9, A7LQA15 y A9LSA19, se reactivaron en medio LB, por 6 días, hasta alcanzar una concentración celular mayor a 109 células/mL, a 30°C y 180 rpm, en un agitador orbital. En las mismas condiciones se activó la cepa comercial



Pseudomona fluorenscens DSM7155 (Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) la cual se utilizó como control positivo en los bioensayos.

1.2.8 Ensayos a nivel de Erlenmeyer

En erlenmeyers de 500 mL, se inocularon 250 mL de medio LB, suplementado con 200 ppm de cianuro de sodio (NaCN), ajustado a un pH 10. Para el control positivo y 4 aislados seleccionados, se agregaron 240 mL de medio LB, suplementado con 200 ppm de NaCN, además de 10 mL de inóculo vivo, para un volumen final de 250 mL; para los controles negativos se agregaron 250 mL de medio LB suplementado con NaCN, sin inóculo. Todos los ensayos se hicieron por duplicado y se crecieron en un agitador orbital a 180 rpm, 30°C, por 72 h, en condiciones aerobias. Las mediciones de pH y concentración de cianuro se hicieron cada 24 h. Al final del ensayo se midió la biomasa.

1.2.9 Métodos analíticos

Cada 24 horas se tomó una alícuota de 10 mL de cada ensayo el cual es llamado analito, se midió el pH usando medidor HQ 40d-multi (HACH Company®) con un electrodo de KCl (PHC301). La concentración de cianuro libre en solución se determinó por medio de titulación con una bureta automática, usando como valorante nitrato de plata (AgNO3) grado analítico al 0.005M (0.84935 g de AgNO3 en 1 litro de agua estéril). Como indicador se usó p-dimetil-amino-benzal rodanina (Rh-), el cual se preparó en una solución de 20mg por 100mL de acetona, según el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (American Public Health Association et al., 1913). El analito es mezclado con 10 gotas del indicador rodanina (Rh-), la solución toma un color amarillo, una vez se comienza a adicionar gota a gota el valorante (AgNO3), éste se disocia liberando iones plata que reaccionan con el cianuro libre y forman un complejo de cianuro de plata, una vez que todo el cianuro libre es ocupado con los iones plata (Ag+2), éste comienza a unirse al indicador rodadina (Rh-). La plata es un ión metálico que actúa como donador de electrones para formar complejos y tiene mayor afinidad con el ión CN- que por el ión Rh-. Una vez se forma el complejo RhAg, la solución cianurada vira a un color rosa o naranja (American Public Health Association et al., 1913; Breuer et al., 2011). Una vez la solución cambia de color se toman los valores iniciales y finales gastados del valorante (AgNO3). Los datos se compararon con respecto al control sin microorganismo. La concentración de cianuro fue determinada por la siguiente fórmula (American Public Health Association et al., 1913):

CN :mg L=ppm = VolTitulante mL *ConcentraciónAgNO3*2*49.01*1000

Volvalorante mL (1.1)

Capítulo 1 13

1.3 Resultados

1.3.1 Caracterización físico-química de las muestras

En la Tabla 1-1 se muestran los resultados de los parámetros fisicoquímicos medidos a las muestras tomadas. Como se puede ver, las concentraciones de cianuro en la planta industrial variaron entre 39.21 y 147.02 ppm de cianuro y en la planta artesanal entre 39.21 y 303.85 ppm (Tabla 1-1). El pH fue alcalino en casi todas las muestras a excepción de la muestra A8 que corresponde a un lixiviado de un tanque de sedimentación que se liberaba al ambiente y sus condiciones no eran controladas. Controlar el pH a valores superiores de 7.0, se hace con el fin de evitar la volatilización del cianuro en cianuro de sodio (HCN) (Huertas et al., 2010). En la Tabla 1-2 se muestran los resultados de la caracterización del efluente que se usó para suplementar los medios de cultivo para el aislamiento de los microorganismos.

Tabla 1-1. Medida de los parámetros físico-químicos de las muestras, las cuales son nombradas con “A” si proviene de la planta artesanal y “M” si proviene de la planta industrial.

Tabla 1-2: Caracterización del efluente tomado de la planta industrializada (M) que se usó para suplementar los medios de cultivos (LBs) para el aislamiento.

Parámetro Medición (unidades)

pH 10.33

Cianuro total 1186.04 (mg/L)

Hierro

4.03 (mg/L)

Cobre

38.06 (mg/L)

Plomo

243.33 (µg/L)

Aluminio

553.78 (µg/L)

Calcio

706.79 (mg/L)

Zinc 110.68 (mg/L)

Origen Muestras pH [CN- ] (ppm)

Planta Industrial

M1 10.55 147.02 M2 10.50 147.02 M3 9.49 39.21 M4 9.87 58.81

Planta Artesanal

A5 10.50 49.01 A6 11.69 49.01 A7 11.0 58.81 A8 7.83 49.01 A9 10.54 303.85 A10 8.03 39.21



Las características físico-químicas de las muestras revelaron presencia de zinc, plomo, hierro, cobre, aluminio y calcio (Tabla 1-2). El calcio es el metal de mayor concentración en el efluente, probablemente debido a la cal (Ca OH !) usada comúnmente para mantener elevado el pH en el tanque de cianuración (Luque-Almagro et al., 2005; Muñoz Echeverri et al., 2015). El zinc proviene de la esfalerita, que se encuentra en concentraciones bajas en el mineral y al zinc observado seguramente pudo provenir de lixiviación parcial de la esfalerita la cual es común en concentraciones menores en el mineral del Distrito de Marmato (Rendon, 1993) y el zinc metálico se emplea en el tanque de cianuración para precipitar el oro después de la lixiviación (Rendon, 1993). El hierro detectado, posiblemente pudo deberse a la lixiviación parcial de la esfalerita (en Marmato presente como marmatita, variedad rica en hierro) y calcopirita, además de otros minerales presentes en el depósito como la pirita, la pirrotita, la arsenopirita, entre otros, siendo que su baja concentración se pudo deber a: (i) la baja solubilidad de la pirita (en alto porcentaje en el mineral) en la solución acuosa, (ii) a las bajas concentraciones del hierro en la esfalerita, a la disolución parcial de la calcopirita y a las mínimas proporciones de pirrotita y arsenopirita en el mineral (Rendon, 1993). El plomo y el cobre pudieron provenir de la lixiviación parcial de la galena y la calcopirita, respectivamente, minerales presentes en el depósito de Marmato (Rendon, 1993). Por último el aluminio pudo provenir de la lixiviación parcial de algunos aluminosicatos presentes como la plagioclasa, entre otros (Rendon, 1993).

1.3.2 Diversidad de aislados bacterianos en medio con solución cianurada

El recuento de las UFC/mL en los diferentes medios se observa en la Figura 1-2. Hay crecimiento en el LB (sin suplementar con solución cianurada) en todas las muestras y se obtiene un rango entre 1.2 X 106-1 X 104.

Figura 1-2. Recuento de Unidades Formadoras de Colonia en los medios LB y LBs (Agar suplementado con solución cianurada)

Los mayores valores de UFC/mL observados se dieron en la muestra M3 crecida en LB (1.2 X 106). En cuanto a los ensayos donde se usó el medio LBs, se puede resaltar: (i) los segundos valores más

0

20

40

60

80

100

120

140

M1 M2 M3 M4 A5 A6 A7 A8 A9 A10

UF

C/m

L X

10^

4

Muestra

LBs LB

Capítulo 1 15

importantes se dieron usando este medio en las muestras M3 (8.5 X 105 UFC/mL) y A10 (8.3 X 105 UFC/mL), además se observaron valores significativos en las muestras A9 (3.5 X 105 UFC/mL) y A8 (2.5 X 105 UFC/mL) y valores menores en la muestra A7 (6 X 104 UFC/mL); (ii) las muestras M1, M4, A5 y A6 no presentaron crecimiento, o este fue mínimo, en este medio.

25 aislados se seleccionaron como representantes de las sitios de muestreo y de los diferentes medios. Después de que los aislados se caracterizaron morfológicamente (tinción de Gram) y molecularmente por el Análisis de Espaciadores Intergénicos 16S-23S (RISA) (Figura 1-3), un aislado representante de cada clúster con un porcentaje de similaridad superior 67%, fue seleccionado para identificación por el análisis de la secuencia del DNAr 16S.

Los aislados están nombrados como A o M dependiendo de su lugar de aislamiento planta artesanal o industrial respectivamente, seguida del número de 1 a 10 que indica a qué lugar específico de muestreo pertenecen. Finalmente, la nomenclatura termina con el número del aislado desde (A1-A21).

Figura 1-3. Dendograma obtenido con el programa GelCompar II de los patrones de bandeo en geles de poliacrilamida del producto amplificado de los RISA a partir de los aislados obtenidos. El valor observado en cada rama representa el porcentaje de similitud.

Los cambios en la diversidad bacteriana de la fracción cultivable se observan en el RISA de los aislados obtenidos (Figura 1-3). El dendograma muestra diferencias entre los aislados por el patrón de bandas analizados y aunque no hay un patrón diferencial claro, parece que el agrupamiento se debe en gran medida al medio de cultivo usado (suplementado y no suplementado).

33.3

33.3

36.7

70.0

22.3

66.7

66.725.6

3.8

50.0

50.016.7

66.7

5.6

72.2

6.0

50.0

50.018.9

68.9

9.4

7.0

50.0

50.09.6

59.6

16.1

75.7

9.6

6.6

33.3

33.346.7

80.0

11.8

4.2

1.6

97.6

ITS

100

908070605040302010

ITS

A10LBA25A7LBA14M2LBA3A7LBA13A10LBA24M1LBA2A9LSA18M1LQA1A8R2A16A7LBA11A10LSA23M2LBA4A7R2A9A9LSA19M3LBA6A7LBA12A7R2A8A7LSA10A7LBA15M3LQA5A10LQA22A10LBA21



1.3.3 Secuencias DNAr 16S y análisis filogenético de aislados obtenidos

13 aislados fueron diferentes y todas las secuencias tuvieron alta similaridad (96–99%) con las secuencias encontradas en las bases de datos públicas (Tabla 1-3). Basados en la filogenia, las bacterias fueron identificadas a nivel de filum como Firmicutes y en menor proporción a Actinobacteria y Proteobacteria. La mayor proporción de microorganismos encontrados fueron de la familia Bacillaceae, ya que tiene el 23.08% del total de aislados, los segundos en abundancia fueron los representantes de la familia Carnobacteriaceae con un 15.38% y el resto de representantes pertenecen a las familias Nocardiaceae, Dermabacteraceae, Propionibacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillaceae, Aerococcaceae, Enterococcaceae y Alcaligenaceae.

Tabla 1-3. Identidades taxonómicas de las secuencias de bacterias aisladas de la planta artesanal e industrial.

Origen Aislado NCBI Acceso

Secuencia relacionada Similitud (%)

Afiliación filogenética

M1 M1LQA1 KU175866

Bacillus pumilus (KP895574.1) 99

Firmicutes

M3 M3LQA5 KU175867

Pisciglobus halotolerans

NR_117521.1 97

M3LBA6 KU175868

Lysinibacillus fusiformis KT369966.1 99

A6 A6LBA7 KU175869

Paenibacillus illinoisensis JQ579623.1 97

A7

A7R2A8 KU175870

Aerococcus viridans AB680271.1 99

A7LSA10 KU175872

Trichococcus flocculiformis JF505984.1 98

A7LBA14 KU175873 Bacillus cereus KT238996.1 98

A7LQA15 KU175874

Enterococcus hirae LC027237.1 98

A7R2A9 KU175871

Rhodococcus corynebacterioides KC294231.1 98

Actinobacteria A8 A8R2A16 KU175875

Microbacterium oxydans

HM629350.1 99

A9

A9LSA18 KU175876

Brachybacterium sp. KP119749.1 97

A9LSA19 KU175877

Tessaracoccus oleiagri GU111567.2 99

A9LBA21 KU175878 Alcaligenes sp. KR051028.1 96 β-Proteobacteria

Figura 1-4. Árbol filogenético basado en las secuencias obtenidas del DNAr 16S de los aislados obtenidos de las muestras provenientes de la planta artesanal e industrial de beneficio de oro. El árbol fue generado con secuencias de referencia de bases de datos Ribosomales usando el método de Neighbor-Joining con 1000 réplicas. Se usó una secuencia de referencia de Archaea como outgroup.

Capítulo 1 17

Pisciglobus halotolerans strain C01

Pisciglobus halotolerans SIF5

Pisciglobus halotolerans strain aab20d02

M3LQA5

Enterococcus hirae

Enterococcus hirae(2)

Enterococcus hirae isolate IPN14 71N

A7LQA15

Aerococcus viridans strain NBRC 12317

Aerococcus viridans strain RCB841

Aerococcus viridans strain Mnlv2

A7R2A8

Trichococcus flocculiformis strain DSM 2094

Trichococcus flocculiformis strain KNUC9050

Trichococcus flocculiformis strain KNUC9047

A7LSA10

Paenibacillus illinoisensis strain IHB B 16671

A6LBA7

Paenibacillus illinoisensis strain: NBRC 15379

Paenibacillus illinoisensis strain F24

M3LBA6

Lysinibacillus fusiformis strain YF28-1(1)

Lysinibacillus fusiformis strain 11-4(3)

Lysinibacillus fusiformis strain 15-4(1)

Bacillus pumilus strain M3

Bacillus pumilus strain 31DMVR

Bacillus pumilus strain MD-A19

M1LQA1

Bacillus cereus strain HMR12

A7LBA14

Bacillus cereus strain BPRIST013

Bacillus cereus strain BPRIST012

Alcaligenes sp. BN14

Alcaligenes sp. BN3

Alcaligenes sp. BN2

A9LBA21

Rhodococcus corynebacterioides strain YUAB-SO-35

Rhodococcus corynebacterioides strain XB109

Rhodococcus corynebacterioides strain M-BI-2 clone FS2

A7R2A9

Tessaracoccus oleiagri strain SL014B-76A1

Tessaracoccus oleiagri strain SL014B-20A1

Tessaracoccus oleiagri strain SL014B-79A

A9LSA19

Microbacterium oxydans strain B-G-R2A8

Microbacterium oxydans strain B-G-PYD6

Microbacterium oxydans strain B-G-NA9

A8R2A16

Brachybacterium sp. KKDK-10

Brachybacterium sp. XJ133-127-6NF2

Brachybacterium sp. YB268

A9LSA18

S002869340| Crenarchaeote enrichment culture clone OREC-R101

9 9

2 9

3 0

9 1

6

4

9 1

7 7

9 0

3 3

1 0

2 4

7 2

6 2

9 9

7 8

8 2

8 0

9 7

9 8

5 9

9 3

3 5

5 3

6 4

2 8

3 6

6 4

9 2

0.2

Firmicutes

𝛃-Proteobacteria

Actinobacteria



1.3.4 Análisis de la comunidad bacteriana mediante Electroforesis en Gel

de Gradiente de Temperatura Temporal (TTGE)

La evaluación de la diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a las plantas industrial y artesanal, se determinó asumiendo que cada banda con patrón de migración diferente representa un grupo de bacterias Figura 1-5.

El resultado de la evaluación del perfil evaluado, usando el programa GelCompar II, reveló la presencia de varios patrones de migración. Para el análisis de la Figura 1-5, basados en la intensidad de las bandas de DNA, hubo 2 bandas únicas y 5 bandas comunes. La riqueza se evaluó por determinación del número de bandas del TTGE, siendo que el total de bandas analizadas de la planta industrial fueron 4 bandas, mientras que en la planta artesanal se analizaron 3 bandas. No hubo diferencia significativa (p=0.42081, p>0.05) indicando niveles similares de riqueza bacteriana en ambas plantas. Los perfiles se evaluaron usando índice de similaridad de DICE con el programa GelCompareII, el cual reveló que ambas plantas tienen diferencias, ya que hay separación en 2 clúster o grupos, uno por cada sitio. El Análisis de Similaridad (ANOSIM) reveló que hay diferencias (R=0.2313) entre las dos plantas (valores positivos de R (hasta 1) significa disimilaridad entre grupos) (Clarke, 1993).

Figura 1-5. Dendograma y patrón de bandeo del gel de TTGE de los productos amplificados del DNAr 16S de la fracción total de las muestras tomadas de las plantas industrial “M” y artesanal “A”. Las líneas en los carriles representan las bandas (a, b, c, d, e, f, g) que fueron escindidas para ser identificadas. La identidad de cada banda se muestra en la Tabla 1-4.

Las bandas comunes, así como las bandas únicas, fueron exitosamente re-amplificadas y secuenciadas. De esta forma, fueron agrupadas en grupos taxonómicos específicos de bacterias de acuerdo con el porcentaje de similaridad en la secuencia del DNAr 16S con la ayuda de bases de datos públicas. Trece bandas representativas fueron seleccionadas. Se obtuvieron secuencias entre 450-520 bp, en ninguna se encontraron quimeras. Las afiliaciones mostraron los fila Proteobacteria y Firmicutes como predominantes, los cuales incluían géneros como Commamonadaceae sp., Erysipelotrichaceae sp., Hydrogenophaga sp., Halomonas sp., Bacillus sp. y Pseudoalteromonas sp (Tabla 1-4).

Capítulo 1 19

Tabla 1-4. Identidades de las secuencias de las bandas escindidas del TGGE de las muestras de la planta industrial y artesanal y su identificación taxonómica.

Origen Banda TTGE

RDP/Genbank acceso

Secuencia relacionada Similaridad (%)

Afiliación filogenética

A2, A3, A4 a KU175879 Uncultured Comamonadaceae

sp. EU639867.1 99 β-Proteobacteria

A3, A4 b KU175880 Uncultured Erysipelotrichaceae sp. HQ332395.1. 95 Firmicutes

A3, A4 c KU175881 Uncultured Firmicutes sp. KJ650766.1. 95 Firmicutes

A3 d KU175882 Hydrogenophaga sp. KF441666.1 99 β-Proteobacteria

M5 e KU175883 Halomonas sp. HM598300.1 96 γ-Proteobacteria

M6, M7 f KU175884 Bacillus sp. JF496919.1 99 Firmicutes

M9, M10 g KU175885 Pseudoalteromonas sp. KP126928.1 98 γ-Proteobacteria

Figura 1-6. Árbol filogenético basado en las secuencias obtenidas del DNAr 16S de las bandas escindidas del TTGE de muestras totales que provenían de la planta artesanal e industrial de beneficio de oro. El árbol fue generado con secuencias de referencia de bases de datos Ribosomales usando el método de Neighbor-Joining con 1000 réplicas. Se usó una secuencia de referencia de Archaea como outgroup.

KF441666.1| Hydrogenophaga sp.

3c Banda d

EU639867.1| Uncultured Comamonadaceae bacterium clone

2a Banda a

4c Banda a

3d Banda a

KP126928.1| Pseudoalteromonas sp.

7a Banda g

8a Banda g

HM598300.1| Halomonas sp.

5a Banda e

6a Banda f

11a Banda f

JF496919.1| Bacillus sp.

3a Banda b

4a Banda b

HQ332395.1| Uncultured Erysipelotrichaceae bacterium

HE858184.1| Uncultured Firmicutes bacterium

3b Banda c

4b Banda c

gi|238527404|gb|FI901789.1|Uncultured Euryarchaeote

8 2

5 9

9 9

9 9

9 9

9 8

8 6

7 7

7 5

8 3

7 4

9 0

0.1

Firmicutes

Proteobacteria

𝛃-Proteobacteria

𝛄-Proteobacteria



Los índices de Shannon y Margalef para las muestras M2, A5, A6, A7, A9 y A10 fueron cero, ya que el número de individuos fue 1. Por otro lado la muestra M3 y M4 tuvieron 4 y 3 individuos respectivamente, por lo que se pudo calcular los índices H` y Mg. Para M3, H`= 1.089 y Mg= 0.763, para M4, H`= 0.7728 y Mg= 0.4969.

1.3.5 RISA de la fracción cultivable y la fracción total

Se realizaron los análisis de RISA para ambas fracciones y se obtuvo la matriz presencia ausencia para este análisis Figura 1-7.

Figura 1-7. Dendograma obtenido con el programa GelCompar II a partir de los patrones de bandeo en geles de poliacrilamida del producto amplificado de los RISA de la fracción total y la fracción cultivable. El análisis de agrupamiento por el método de correlación de DICE, con el coeficiente de similitud UPGMA. Las muestras totales están nombradas con “M” o “A” dependiendo del lugar de procedencia, industrial o artesanal, respectivamente. Y las muestras de la fracción cultivable se nombraron con el consecutivo del aislado (A1-A21) seguido con “S” si provenían de medio LB sólido suplementado con efluente o “NS” si provenían de medio LB sólido no suplementado con efluente.

A partir de la matriz cuantitativa generada por el programa GelCompare II de los RISA, se obtuvieron los análisis de NMDS para la fracción total (TTGE) (Figura 1-8) y la fracción cultivable (S y NS) (Anexo C) y la comparación entre ellas (Anexo C).

97

62

82

79

91

88

79

79

76

96

87

81

78

64

100

92

66

ITS

100

90807060504030

ITS

.

.

.

.

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.

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A9NS A7NSM3SA10M4SM2A7M3NSM10S M2NSM4NSM1NSA6NSA5NSM1SA6SM1M3A8A10NSA6M4A9A5A9SA8SA7SA5SA8NS

Principalmente totales

Principalmente artesanal suplementados

No Suplementado

Varios

Capítulo 1 21

Figura 1-8. Análisis NMDS de la matriz cuantitativa del TTGE. Las muestras son nombradas de acuerdo a su lugar de procedencia “A” para la planta artesanal y “M” para la planta industrial. La concentración de cianuro y el pH, al momento de tomar las muestras son mostrados (valores mostrados en la Tabla 1-1).

Se observa para el análisis NMDS del TTGE que hay diferencias de diversidad entre los dos lugares de muestreo, ya que se agrupan las muestras provenientes de la planta artesanal “A” y las muestras provenientes de la planta industrial “M”. La diversidad entre la planta artesanal es muy cercana, exceptuando por el lugar de muestreo A9. Por su parte la planta industrial, muestra mayor dispersión.

La Fracción Cultivable (FC) se analizó usando el método NMDS por medio de la matriz cuantitativa y se observó que hay diferencias entre los dos medios usados, LBs y LB, ya que el primero se agrupó y el LB se visualiza más disperso pero entre sí, pero no se agrupa con los puntos correspondientes al LBs (Anexo C).

El análisis de ambas fracciones cultivable y total (FC y FT) (Anexo C) evidencia la similitud entre la Fracción Cultivable del medio LB Suplementado (FCS) y la FT ya que se agrupan de forma que los datos están más cercanos entre sí, mientras que la Fracción Cultivable del medio LB No Suplementado (FCNS) se observa con datos más dispersos y alejados de FCS y FT. Estos resultados confirman los obtenidos del análisis de RISA de la FC y FT (Figura 1-7).

1.3.6 Bioensayo preliminar de degradación

Se eligieron los aislados M1LQA1, A7R2A9, A7LQA15 y A9LSA19, correspondientes a Bacillus pumilus, Rhodococcus corynebacterioides, Enterococcus hirae y Tessaracoccus oleagri, respectivamente. teniendo en cuenta la concentración de cianuro de donde provenían. De esta forma, los aislados Rhodococcus corynebacterioides y Enterococcus hirae, que se obtuvieron de las concentraciones más bajas de cianuro (58.81 ppm), el aislado Bacillus pumilus de una concentración intermedia de cianuro (147.02 ppm) y el aislado Tessaracoccus oleagri de la concentración más alta (303.85 ppm).



La Figura 1-9 muestra los resultados de los bioensayos, donde se observó disminución de la concentración de cianuro en el tiempo y no hay degradación por efecto del medio de cultivo, ya que los controles abióticos se observaron muy constantes y no mostraron disminución considerable en el tiempo. Se eligió la cepa de P. fluorescens (DSM7155) como control positivo, debido a que esta especie ha sido reportada como degradadora de cianuro (Harris & Knowles, 1983). Se observó que los aislados que tuvieron mejor degradación fueron Rhodococcus corynebacterioides y Enterococcus hirae, cada uno con porcentajes de 53% y 42% de degradación, respectivamente. Los demás, Bacillus pumilus, Tessaracoccus oleagri y P. fluorescens, mostraron 36%, 40% y 31% de degradación, respectivamente.

La cepa R. corynebacterioides, tuvo un comportamiento muy característico, ya que logró alrededor de la mitad de la degradación en las primeras 24, detuvo la degradación durante 24h y se disparó, alcanzando la mayor degradación en las últimas 24 h del proceso. La otras cepas lograron su mayor degradación durante las primeras 24h, después de lo cual prácticamente no hubo mayor efecto. Vale la pena agregar que la cepa T. oleagri, aunque no fue la cepa que mostró mayor porcentaje de degradación, fue la que en menor tiempo (24 h) alcanzó la mayor degradación (115.174 ppm). Fue posible observar que el control negativo no presentó prácticamente ninguna degradación.

Figura 1-9. Gráfica de degradación de la concentración de cianuro vs tiempo en horas en el medio LB, usando los aislados Bacillus pumilus (B.p), Rhodococcus corynebacterioides (R.c), Enterococcus hirae (E.h) y Tessaracoccus oleagri (T.o), un control positivo de la cepa P. fluorescens (DSM7155) (P.f C+) y un control negativo sin inóculo (Control -).

1.3.7 Comportamiento de pH y crecimiento celular

En los bioensayos preliminares de degradación, el pH disminuyó a través del tiempo, con un pH inicial de 10, el control negativo tuvo un pH final de 9.58 y los ensayos tuvieron pH finales de 9.45 para los aislados B. pumilus y R. corynebacterioides. 9.43 para E. hirae y 9.49 para T. oleagri, por otro lado, el control positivo, fue el que tuvo un pH final más bajo de 9.27; sin embargo no se consideró volatilización del

70

90

110

130

150

170

190

210

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Con

cent

raci

ón d

e C

N (

ppm

)

Tiempo (horas)

B.p

R.c

E.h

T.o

P.f C+

Control -

Capítulo 1 23

cianuro como cianuro de hidrógeno (HCN) (Donato et al., 2007; Luque-Almagro et al., 2005), ya que no alcanzó valores por debajo de pKa=9.2. El crecimiento celular fue evidenciado por la actividad degradadora de cianuro hasta el último día de cada ensayo y por medición de biomasa al final de cada tratamiento. Todos los inóculos iniciales estuvieron entre 10! células/mL, antes de agregarlos al medio de cultivo. Al final de los bioensayos preliminares de degradación se obtuvieron valores de biomasa de 1.7 X 10!, 1.6 X 10!, 1.4 X 10!, 2.9 X 10!, 2.3 X 10! células/mL para Bacillus pumilus, Rhodococcus corynebacterioides, Enterococcus hirae, Tessaracoccus oleagri y P. fluorescens, respectivamente.

Figura 1-10. Cambio de pH en el tiempo de los bioensayos preliminares de degradación en el medio LB, usando los aislados Bacillus pumilus (B.p), Rhodococcus corynebacterioides (R.c), Enterococcus hirae (E.h) y Tessaracoccus oleagri (T.o), un control positivo de la cepa P. fluorescens (DSM7155) (P.f C+) y un control negativo sin inóculo (Control -).

1.3.8 Análisis estadísticos

Se obtuvo resultados de ANAVA y test T para los ensayos con los 4 aislados. Todos los resultados de ANAVA arrojaron valores F>Pr, aceptando la hipótesis alternativa, es decir, hay diferencias entre las medias de los tratamientos, de esta forma, por lo menos dos tratamientos fueron diferentes entre sí a la hora de degradar cianuro. El test T evidencia que los aislados que presentaron diferencias significativamente importantes con respecto a los demás fueron el R. corynebacterioides y E. hireae; los resultados de los ANAVA y los test T se muestran en el Anexo D.

9,2

9,3

9,4

9,5

9,6

9,7

9,8

9,9

10

10,1

0 10 20 30 40 50 60 70 80

pH

Tiempo (horas)

B.p R.c

E.h T.o

P.f C+ Control -



1.4 Discusión

Los medios de cultivo que no fueron suplementados con cianuro, tuvieron los mayores recuentos de UFC (Figura 1-2), el recuento de bacterias aerobias asociadas a la muestra puede deberse a algún mecanismo de resistencia o tolerancia del cianuro bajo condiciones empleadas (Mohanraj Perum et al. 2013; Naghavi et al., 2012). El medio LBs tuvo recuentos menores que el medio LB, lo que claramente es debido a la inhibición que tiene el cianuro en muchos sistemas vivos. El medio LBs además de contener mayor concentración de cianuro tenían metales pesados, obligando entonces a que los microorganismos que crecieron en estos medios por lo menos fueran tolerantes al cianuro, o en el mejor de los casos, pudieran metabolizarlo.

Figura 1-11. Concentración de cianuro [CN-] y pH inicial vs UFC/mL en el medio LBs en cada muestra.

De la Figura 1-11, se observa que no hay una relación clara entre el pH inicial de las muestras y las UFC/mL en el medio LBs. Se ha reportado valores óptimos de crecimiento en soluciones cianuradas entre 7 y 9.3 (Kim et al., 2011; Kumar, et al., 2013; Nallapan et al., 2013). A valores de pH, inferiores o superiores el crecimiento tienden a disminuir (Kumar et al., 2013). Sin embargo, se observa que en las muestras tomadas de la planta industrial, presenta el mayor recuento de UFC/mL justo donde la concentración de cianuro es más baja (39.21 en la muestra M3). Los metales pesados presentes en el efluente (s) con el que se suplementó el medio LBs estaban en relativamente alta concentración, por lo que pudo ser un factor determinante para el crecimiento bacteriano en los medios LBs, sin embargo esta concentración no pareció afectar a los crecimientos de las muestras M3 y A9 donde el recuento de UFC/mL fue significativamente mayor que los demás. La planta industrial tiene un proceso controlado y eficiente, por lo que probablemente la cantidad de metales lixiviados en el agua que suplementó los medios de cultivos LBs era mayor con respecto a las demás muestras, de forma que la

0

2

4

6

8

10

12

14

0

50

100

150

200

250

300

350

M1 M2 M3 M4 A5 A6 A7 A8 A9 A10

pH

UF

C/m

L X

10^

4 C

once

ntra

ción

de

cian

uro

(ppm

)

Muestras

UFC/mL

[CN-]

pH

Capítulo 1 25

presencia de microorganismos se viera afectada. Se ha reportado que metales como cobre, plomo, aluminio y zinc son efectivos agentes antimicrobianos. Estudios recientes muestran que la bacteria A. thiooxidans, es sensible al aluminio (Caicedo Pineda, 2014) y hay evidencias que concentraciones de 1200 mg/L comienzan a afectar la actividad de oxidación de iones 𝐹𝑒!! (Malik et al., 2004), debido a la acumulación de aluminio en el citoplasma y la membrana celular (Blight & Ralph, 2008). Por otro lado, el cobre se ha estudiado en aplicaciones antimicrobianas, especialmente patógenos hospitalarios por su gran efecto en el crecimiento celular debido al daño que puede ocasionar en la membrana celular (Neciosup et al., 2015). Además de lo anterior, el cobre tiene mayor efecto en bacterias gram negativas, inhibiendo su crecimiento (Narancic et al., 2012), es probable que por esta razón, la mayoría de cepas aisladas de los medios de cultivo usados sean gram positivas. El plomo y el zinc, también reportados como inhibidores bacterianos de bacterias resistentes a antibióticos, alterando sus rutas metabólicas por acumulación en la célula (Ribeiro et al., 2015; Singh et al., 2013).

Una posible razón por la cual las muestras M3 y A9 tuvieron mayores recuentos podría ser que: i) de las muestras de la planta artesanal, la A9 fue la que presentó la mayor concentración de cianuro inicial y consistía en un efluente de salida después del proceso de recuperación del metal, por tanto pudo haber tenido una concentración similar de metales pesados al efluente (s) usado en los medios de cultivo y ser favorecido de esta forma al agregar el efluente industrial y ii) que la muestra M3 estaba en un punto intermedio del proceso de cianuración y la concentración de metales pesados probablemente fue levemente inferior al igual que la concentración de cianuro, favoreciendo proliferación de microorganismos en este punto del proceso, en comparación con los demás lugares muestreados que tuvieron concentraciones superiores.

La caracterización microscópica de los aislados mostró que todos ellos, (excepto el A9LBA21) fueron gram-positivos (Anexo B). Es bien conocido que las bacterias gram-positivas varían en su morfología, fisiología y propiedades metabólicas permitiéndoles prosperar en un amplio rango de ambientes y responder a situaciones de estrés por condiciones químicas o físicas (Narancic et al., 2012). Las bacterias resistentes a condiciones ambientales extremas atribuyen su capacidad a los mecanismos que desarrollan para resistir, como la formación de plásmidos y genes que son transferidos de una célula a otra para facilitar su supervivencia (Yamina et al., 2012). Por otro lado, se conoce que gran variedad de bacterias gram-negativas son buenas degradadoras de compuestos aromáticos y otros contaminantes (Narancic et al., 2012).

Las secuencias del DNAr 16S mostraron 13 aislados que tuvieron afiliaciones diferentes, con similaridad de 96-99% con respecto a las bases de datos públicas. Se encontraron miembros de los fila Firmicutes en su gran mayoría, Actinobacteria y β-Proteobacteria (Tabla 1-3). Los aislados pertenecen a las familias Bacillaceae, Carnobacteriaceae, Paenibacillaceae, Aerococcaceae, Enterococcaceae, Norcandiaceae, Microbacteriaceae, Dermabacteraceae, Propionibacteriaceae y Alcaligenaceae (Tabla 1-3).

Dentro de la familia Bacillaceae se encuentran los aislados M1LQA1, M3LBA6 y A7LBA14, que fueron identificados como Bacillus pumilus, Lysinibacillus fusiformis y Bacillus cereus, respectivamente. Estos microorganismos han sido reportados en ambientes mineros (García G. et al., 2015; Torres-Cázares et al., 2012) y reportados como buenos degradadores de cianuro están B. cereus y B. pumilus (Bhalla et al., 2012), mientras que el género Lysinibacillus ha sido reportado como degradador de compuestos tóxicos



como el cromato y solventes orgánicos (He et al., 2011; S. Wang et al., 2014), pero no se ha reportado como degradador de cianuro.

Los aislados M3LQA5 y M7LSA10, que pertenecen a la familia Carnobacteriaceae, fueron identificados como Pisciglobus halotolerans y Trichococcus flocculiformis. La familia Carnobacteriaceae es del orden Lactobacillales, siendo que sus miembros han sido encontrados en productos alimenticios, humanos y en ambientes fríos (Lawson & Caldwell, 2014). P. halotolerans es una bacteria anaeróbica facultativa que se ha aislado de salsas fermentadas de pescado y puede resistir hasta 10% NaCl (Tanasupawat et al., 2011). Por su parte T. flocculiformis es una bacteria gram-positiva a gram variable, es anaeróbica facultativa y ha sido aislada de reactores de lodos metanogénicos (Lawson & Caldwell, 2014; Scheff et al., 1984; van Gelder et al., 2012). Ambos aislados han sido encontrados en hábitats difíciles y por las condiciones de anaerobiosis que pueden presentar, estos podrían cumplir un rol importante en la degradación de cianuro a bajas concentraciones de oxígeno, característica que seguramente se da en el fondo de los tanques de cianuración.

El aislado A6LBA7 fue identificado como Paenibacillus illinoisensis miembro de la familia Paenibacillaceae. Miembros de esta familia han sido aislados de suelo, compost y material vegetal (Rosenberg et al., 2014). Los aislados A7R2A8 y A7LQA15 fuieron identificados como pertenecientes a las familias Aerococcaceae y Enterococcaceae, respectivamente. Éstos fueron identificados como Aerococcus viridans y Enterococcus hirae, respectivamente. El género Aerococcus sp. ha sido asociado a entornos hospitalarios, tejido humano y sitios marinos (Rosenberg et al., 2014). El género Enterococcus sp. se ha reportado como colonizador de humanos y se ha encontrado varias muestras ambientales (Rosenberg et al., 2014). Sin embargo no han sido asociados al metabolismo o a la degradación del cianuro.

Los aislados A7R2A9, A8R2A16, A9LSA18 y A9LSA19 pertenecen al filum Actinobacteria, donde cada uno de ellos pertenece a las familias Norcandiaceae, Microbacteriaceae, Dermabacteraceae y Propionibacteriaceae, respectivamente. Éstas fueron identificadas molecularmente como Rhodococcus corynebacterioides, Microbacterium oxydans, Brachybacterium sp. y Tessaracoccus oleiagri, respectivamente. El género Rhodococcus sp. está distribuido en amplia variedad de hábitats. Para el caso de lugares contaminados con cianuro se han aislado cepas nativas de Rhodococcus sp. con capacidad de degradarlo (Nallapan Maniyam et al., 2013) y se han obtenido de efluentes de beneficio de oro (Souza-Fagundes et al., 2004). Algunas cepas de Rhodococcus exhiben diversidad metabólica notable que puede ser explotada para una amplia gama de fines biotecnológicos (Rosenberg et al., 2014). El género Microbacterium se ha encontrado en lodos activados contaminados con complejos de cianuro (Zhe-Xue et al., 2006), siendo además que varias cepas de M. oxydans han sido aisladas de diversos ambientes, entre ellos de lugares contaminados con arsénico (Aksornchu et al., 2008; Paul et al., 2015), suelos contaminados con aceite (Yan et al., 2013) sedimentos marinos (Yuan et al., 2014) y suelos con presencia de pesticidas (Mostafa & Helling, 2003). Éste parece ser un microorganismo versátil para resistir a ambientes agrestes, con la capacidad de producción de metabolitos extracelulares (Thys et al., 2004), capacidad de biodezulfurización (Li et al., 2005) o resistir moléculas complejas (Aksornchu et al., 2008; Mostafa & Helling, 2003).

Cepas de Brachybacterium sp., han sido aisladas de lugares con temperaturas bajas (5-25 ºC) con producción de amoniaco (NH3) (Yadav et al., 2015); por otro lado el género Brachybacterium sp., se ha

Capítulo 1 27

reportado con capacidad de producir exopolisacáridos como forma de resistencia a amenazas externas (Orsod et al., 2012). Tessaracoccus oleiagri no ha sido reportada como degradadora de cianuro, sin embargo, se han aislado miembros del género Tessaracoccus sp. en lugares contaminados con uranio (Chen et al., 2012), alta concentración de sales (Claverías et al., 2015) y suelos contaminados con aceite (Cai et al., 2011), lo que sugiere que sus representantes pueden tener características biotecnológicas importantes, como es el caso de T. flavescens que ha sido reportada con actividad antimicrobiana, también aislada de ambientes salinos (Claverías et al., 2015).

Por otra parte, el aislado A9LBA21 fue identificado como Alcaligenes sp. perteneciente a la familia Alcaligenaceae y clasificado como 𝛽-Proteobacteria. Este género ha sido reportado como degradador y habitante nativo de lugares contaminados con cianuro (Baxter & Cummings, 2006; Bhalla et al., 2012; Ingvorsen et al., 1991) y metales pesados (Abbas et al., 2015).

El análisis cultivo independiente reveló que en general hay baja diversidad, lo que se observó en las pocas bandas encontradas en el TTGE (Figura 1-5). Una posible razón de esto, es la degradación de DNA por almacenamiento de muestras. La baja diversidad se corroboró con los índices de diversidad a partir de la matriz cuantitativa del TTGE, donde se observó que las muestras M3 tenía un índice de Shannon es ligeramente superiror (H`=1.089) que la muestra M4 (H`=0.7728); otra consideración a tener en cuenta para el análisis de diversidad son las condiciones geoquímicas de los terrenos mineros, ya que presentan gran cantidad de metales pesados y condiciones fisico-químicas agrestes para la supervivencia de una comunidad bacteriana, por lo tanto los miembros de ella deben de ser toleantes a dichas condiciones. El análisis de riqueza es similar en las dos plantas, lo que se evaluó de acuerdo al número de bandas con identificación taxonómica diferente. Sin embargo, el análisis del patrón de bandeo del TTGE (Figura 1-5), reveló diferencias entre los dos lugares de muestreo, agrupando en clusteres diferentes las muestras provenientes de la planta industrial y la planta artesanal. Una explicación de esta diferencia podría deberse al hecho de que las plantas de beneficio de oro llevan a cabo los procesos de manera diferente, ya que en las plantas artesanales no se controlan algunas variables como pH, temperatura y concentración de cianuro, en contraste con la planta industrial, donde tienen en cuenta estas variables. Diferencias en los procesos de cianuración parecen influir en las poblaciones predominantes presentes en cada muestra, dependiendo del lugar de procedencia. Esto es confirmado por el análisis NMDS (Anexo C) donde se determinó que las características del patrón de bandeo en ambos lugares de muestreo varían. Además de esto, se observa que las características de las muestras como pH y la concentración de cianuro, tienen mayor influencia en las muestras procedentes de la planta industrial, ya que los datos de “M”se muestran más cercanos a las líneas de pH y la concentración de cianuro (Anexo C), debido al control de estas variables. Como se había mencinado anteriormente, el control de variables en la planta industiral puede afectar la presencia de microorganismos, mientras que en la planta artesanal pueden favorecer la proliferación de ellos, ya que la mayoría de aislados precisamente se aislaron de este lugar.

Las bandas escindidas revelaron que del total de las bandas observadas en el TTGE, sólo 7 eran taxonómicamente diferentes. Teóricamente cada banda corresponde a una población o filotipo presente en la comunidad (Monira et al., 2012), sin embargo, la técnica TTGE flanquea aproximadamente un tercio de la longitud total del gen RNAr 16S y su calidad no siempre es óptima, por lo que dificulta la resolución filogenética (del Rosario Llames & Izaguirre, 2011), además de presentar interferencias entre varios filotipos de una misma banda, por lo que lo ideal es hacer estimaciones de diversidad relativa entre comunidades y considerar filotipos en lugar de especies



(Escalante, 2008). Posiblemente por esta razón, la identificación molecular pudo evaluarse hasta género.

Las bandas con clasificación molecular diferentes fueron las bandas a, b, c, d, e, f y g, correspondientes a Commamonadaceae sp., Erysipelotrichaceae sp., Firmicutes No cultivable, Hydrogenophaga sp., Halomonas sp., Bacillus sp. y Pseudoalteromonas sp., respectivamente (Figura 1-6, Tabla 1-4). Estos miembros pertenecen los fila Firmicutes y Proteobacteria, que también fueron encontrados en la afiliación filogenética de los aislados obtenidos a partir de la fracción cultivable. El filum Firmicutes fue dominante en la Fraccicón Cultivable (FC), mientras que en la Fracción Total (FT) predominó el filum Proteobacteria. Se sabe que en muestras ambientales, la FC puede ser inferior al 5% de la FT (Gomez et al., 2011), de esta forma el filum que predominante podría revelarlo la FT.

Una de las bandas fue correspondiente a Halomonas sp., la cual ha sido reportada como degradadora de algunos compuestos tóxicos como fenol y catecol (Alva & Peyton, 2003); adicionalmente, algunos de los representantes de este género han sido reportados tolerantes a altas concentraciones de sal, además de ser buena desnitricadora (Mormile et al., 1999; Vreeland et al., 1980). Recientemente, se ha descubierto que la cepa BN1 perteneciente al género Halomonas, es capaz de degradar cianuro hasta en un 66% de concentración inicial (Khamar et al., 2015). El género Hydrogenophaga sp. identificado en la banda d, se ha reportado como reductor de ciertos compuestos tóxicos como selenio (Adams & Pickett, 1998) y degradador de 4-aminobenzenesulfonato (Gan et al., 2012). Se encuentran en microorganismos de este género proteínas que codifican la enzima Nitrilasa cianuro hidratasa (Gan et al., 2012), lo que sugiere que ésta está implicada en el proceso de oxidación del hidrógeno (Yoon et al., 2008) y al estar en ambientes contaminados con cianuro, puede estar envuelto en el aprovechamiento del vapor de cianuro de hidrógeno (HCN) generado al volatilizarse este compuesto. El género Pseudoalteromonas sp. tiene representantes como Pseudoalteromonas atlantica, que codifica para la enzima thiosulfato sulfotransferasa que cataliza, aunque con baja eficiencia, la reacción de transferencia de sulfuro de thiosulfato a cianuro (Copeland et al., 2006).

El RISA de la fracción cultivable de los dos medios analizados, LBs y LB, sugiere que hay diferencias entre el patrón de bandeo de ambos medios (Anexo C). Los datos del medio LB se observan más dispersos, es decir, diferentes entre sí y diferentes a los datos del LBs. Por otro lado, los datos del medio LB parecen tener patrones comunes y parecidos entre sí, ya que se agrupan. Esto sugiere que al parecer hay mayor diversidad usando el medio LB, por lo tanto, se obtiene mayor información de poblaciones bacterianas presentes en las muestras. Al parecer el método de suplementar y no suplementar los medios de cultivo para aislamientos de microorganismos de interés, son complementarios para llegar a tener información de una comunidad microbiana de cierto nicho. Por otro lado, la correlación de la Fracción Cultivable (FC) y la Fracción Total (FT), se llevó a cabo por medio de los RISA de cada fracción (Anexo C). Este análisis sugirió que la FC con medio suplementado (FCS) y la FT comparten características comunes entre los patrones de bandeo, a partir del anexo C se puede observar el agrupamiento de los datos de la FCS y la FT, mientras que la FCNS muestra datos más dispersos. Esto sugiere que los microorganismos encontrados en los medios suplementados fueron una buena aproximación para el estudio de las poblaciones, ya que la suplementación simuló bien su hábitat natural. Sin embargo las dos técnicas utilizadas para el estudio de la comunidad, fueron complementarias. El TTGE reveló microorganismos que no fueron identificados por la aproximación dependiente de cultivo.

Capítulo 1 29

Los ensayos se realizaron con el fin de evaluar la capacidad de degradación de 4 aislados que fueron tomados de concentraciones bajas (Rhodococcus corynebcterioides y Enterococcus hirae), medias (Bacillus pumilus) y altas (Tessaracoccus oleagri), según su lugar de procedencia, de forma que se tomara una muestra de la población total de aislados obtenidos para estudiar su desempeño in vitro, en medio LB y en una concentración de cianuro de 200 ppm (Akcil, 2002). Los 4 aislados bacterianos evaluados presentaron disminución de la concentración de cianuro en el medio con respecto al tiempo, mientras que el control negativo permaneció muy constante con respecto a los ensayos con inóculo vivo, esto da a entender que la degradación se dio gracias a la acción de las diferentes aislados y no por interacción con el medio de cultivo, este fenómeno tampoco se debe a la volatilización porque ningún ensayo alcanzó valores por debajo de pKa=9.2 (Luque-Almagro et al., 2005) esto se observa en la Figura 1-10.

El análisis estadístico para los ensayos preliminares de degradación usando 4 aislados en medio de cultivo LB, indica que por lo menos dos ensayos son diferentes entre sí, según arroja el análisis ANAVA, ya que el valor F=5.37 y el valor Pr= 0.047, por lo tanto F>Pr, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa de que por lo menos dos ensayos son diferentes entre sí.

En estos ensayos, el aislado que tuvo mejor degradación con respecto a los demás fue el Rhodococcus corynebcterioides, degradando 53% del cianuro del medio, y según el test T es significativamente mayor con respecto a los demás aislados evaluados en el ensayo preliminar. R. corynebcterioides, fue aislado de una zona con baja concentración de cianuro (58.81 ppm) y un pH 11, según los resultados previamente descritos. Se ha encontrado aislados del género Rhodococcus spp. con capacidad de degradar cianuro hasta en un 50%, en medios de cultivo con glucosa y nitrógeno(Nallapan Maniyam, 2013b, 2013c). La biomasa al final del ensayo fue de 1.6 X 10!, uno de los mayores recuentos, esto indica que hubo buen crecimiento y adaptación al medio. Sin embargo, valores similares de biomasa se midieron en el control positivo P. fluorescens, pero no fue el que tuvo mejor desempeño. Esto se puede atribuir a que P. fluorescens, pudo preferir una fuente secundaria de nitrógeno además del cianuro en el medio, ya que el LB contiene N que pudo ser más biodisponible para esta cepa. Además, al ser una cepa comercial, está adaptada a las condiciones de almacenamiento de los distribuidores, mientras que las cepas nativas, estuvieron en contacto con el cianuro desde su aislamiento y probablemente están metabólicamente más adaptadas.

La cepa Enterococcus hirae, segunda de acuerdo con el porcentaje de degradación, fue aislada de una zona con baja concentración de cianuro (58.81 ppm) y un pH 11. E. hirae pertence a la familia Enterococcaceae, la cual es capaz de crecer bajo condiciones anaerobias y en presencia de compuestos complejos de cianuro como protonoforo carbonil cianuro m-clorofenilhidrazona (Poladian et al., 2006), lo que se le atribuye a la fuerza protón motriz para realizar procesos reductivos, sin embargo, se sabe que el cianuro sí tiene efectos directos sobre la matriz bacteriana, suprimiendo el crecimiento bacteriano (Poladian et al., 2006). Este aislado parece mostrar buen crecimiento en el medio y buena degradación, ya que disminuyó la concentración de cianuro presente en el medio hasta 42%.



Los aislados Bacillus pumilus y Tessaracoccus oleagri, obtenidos de zonas donde las concentraciones de cianuro eran intermedias y altas 1(47.02 y 303.85 ppm, respectivamente) y el pH en los sitios de muestreo muy alcalino (10.5 y 10.54, respectivamente), presentaron degradaciones de 36% para Bacillus pumilus y 40% para Tessaracoccus oleagri.

Miembros del género Bacillus sp. y especialmente la especie B. pumilus, se han reportado como buenos degradadores de cianuro (Meyers et al., 1991; Meyers et al., 1993; Skowronski & Strobel, 1969) y han sido ampliamente utilizados para este tipo de ensayos. Por otro lado el género Tessaracoccus sp. perteneciente a la familia Propionibacteriacea (Stackebrandt et al., 2006), no ha sido reportado como resistente o degradador de cianuro, al igual que ningún miembro de la familia Propionibacteriacea; sin embargo, algunos miembros de esta familia han sido capaces de degradar compuestos tóxicos, como el caso del género Propioniferax sp. ha sido reportado como degradador de fenol (Khan et al., 2004).

La cinética de crecimiento de los aislados revelan que dentro de las primeras 24 h, ocurre una degradación importante, sin una evidente fase lag o de adaptación. Esto probablemente se dio, porque el medio de reactivación fue el mismo usado en los ensayos, el medio LB. Por otro lado, en la literatura se reporta que la bioestimulación con fuentes de carbono y nitrógeno adicionales, en medios con cianuro permite el crecimiento microbiano, facilitando la degradación y en muchos casos mejorando su desempeño comparado con medios sin adición de otras fuentes de carbono y nitrógeno (Kumar et al., 2013; Naghavi et al., 2012; Ohta & Adjei, 1999). E. hirae, fue el primero en llegar a su fase estacionaria de degradación, ya que a las 24 h alcanzó prácticamente su mayor disminución de cianuro. Un comportamiento similar se observó en T. oleagri, donde la mayor tasa de degradación ocurre en las primeras 24 h y la degradación es mínima las siguientes horas. Una posible explicación de este comportamiento, es que la fuente de carbono se esté agotando rápidamente y esté actuando como sustrato limitante. Otra alternativa, por el contrario, sería que la concentración de carbono en el medio afecte la degradación de cianuro, Adjei y colaboradores, reportan que un óptimo crecimiento celular en B. cepacia, ocurre a 1% de concentración de fructosa, sin embargo, hay un efecto inhibidor de ésta, en la utilización del cianuro, siendo que la tasa máxima de degradación ocurre al 0.25% (w/v) de fructosa. Un efecto parecido podría estar ocurriendo con los ensayos. El aislado R. corynebacterioides, por el contrario, experimenta dos fases de degradación, una a las primeras 24 h y otra a las 48 h, después de una fase donde no hubo degradación; para el género Rhodococcus sp., se ha reportado que la ruta probable de degradación de cianuro es por medio de la ruta hidrolíca por medio de la enzima nitrilo hidratasa y la amidasa (Gupta et al., 2010), donde ambas son responsables del metabolismo del cianuro. Primero la nitrilo hidratasa convierte el cianuro a un intermediario que es una amida, después, ésta es convertida en acido y amonio por la acción de la amidasa (Gupta et al., 2010). En este cambio enzimático, puede estar ocurriendo entre las horas 24 y 48, dándose una fase estacionaria de degradación y posteriormente, continuar con la degradación.

Aunque aún no se conozcan las ruta de degradación de cianuro para E. hirae ni para T. oleagri, estas podrían atribuirle su capacidad de degradación a la capacidad de adaptarse y sobrevivir a lugares con presencia de cianuro y metales pesados, ésta característica de adaptación es común en bacterias gram positivas (Narancic et al., 2012). Uno de estos mecanismos de adaptación, podría ser la presencia de citocromos alternativos, que brindan resistencia al cianuro, esto se ha reportado en P. aeruginosa, la cual es resistente a KCN (Matsushita et al., 1983) y de esta forma la cadena transportadora de electrones no es bloqueada.

Capítulo 1 31

A pesar de que los terreros mineros son ambientes creados por el ser humano, son gobernados por reglas ecológicas, tales como las relaciones simbióticas entre microorganismos nativos y su ambiente (Torres-Cázares et al., 2012). Por esta razón, aislar e identificar las cepas nativas presentes, requiere de un amplio estudio. El uso de aproximaciones dependientes e independientes de cultivo, reveló que es una herramienta útil para el estudio de comunidades microbianas asociadas a lugares contaminados con cianuro. Aunque nuestro estudio indicó una diversidad bacteriana moderada, también se evidenció poblaciones que no habían sido reportadas en este tipo de ambientes. Adicionalmente, mostró que los medios suplementados parecen simular mejor las poblaciones dominantes reales de los lugares donde fueron tomadas las muestras simulando las condiciones de su entorno y los medios no suplementados dieron información de los microorganismos persistentes en estos ambientes. Por otro lado, el ensayo preliminar de degradación indicó que los mejores aislados nativos fueron Rhodococcus corynebacterioides y Enterococcus hirae, cada uno con porcentajes de 53% y 42% de remoción de cianuro. Sin embargo, es necesario evaluar otras alternativas de fuentes de carbono y nitrógeno para observar si incrementa la degradación.



2. Capítulo: Tratamiento biológico de cianuro por bacterias aisladas de plantas de lixiviación de oro colombianas.

Resumen: Las tecnologías usadas para el tratamiento de aguas contaminadas con cianuro dependen de una combinación de factores físicos y químicos. Como el cianuro es altamente tóxico, debe ser tratado antes de ser descargado en los efluentes. El tratamiento con la ayuda de microorganismos puede utilizarse eficazmente para reducir la carga de productos químicos nocivos al medio ambiente. En el presente trabajo se estudió la capacidad de degradación de cianuro, por parte de trece aislados asociados a dos plantas de lixiviación de oro vetiforme, una artesanal y otra industrial, situadas en el municipio de Marmato, ubicado en el departamento de Caldas, Colombia. Estos lugares presentaban diferentes concentraciones de cianuro debido al proceso extractivo. La evaluación de degradación de trece aislados miembros de los fila Actinobacteria, Proteobacteria y Firmicutes, demostró actividad positiva, disminuyendo la concentración de cianuro en el tiempo, con respecto al control abiótico negativo, indicando capacidad de asimilación del cianuro en su metabolismo. El aislado que mayor degradación tuvo fue Microbacterium oxydans, el cual disminuyó 39.96%, 32.36% y 19.13% para 200, 500 y 1000 ppm respectivamente, por otra parte, el test T reveló que los mayores porcentajes de degradación se dieron en el medio que contenía 200 ppm de cianuro.Además se realizó un ensayo usando un cultivo mixto con tres aislados, dos de ellos Microbacterium oxydans y Tessaracoccus oleiagri, debido a que presentaron buena degradación en ensayos donde actuaron independientemente y el último, Bacillus cereus, ha sido ampliamente reportado en la literatura como degradador de cianuro, sin embargo no se presentó una sinergia en la degradación entre aislados, ya que no hubo estadísticamente, una disminución del porcentaje de cianuro en el medio con respecto al control abiótico negativo. Este trabajo permitió evaluar la capacidad de degradación de cepas nativas y sugiere que su presencia en dichos ambientes tiene un papel en la degradación biológica de estos compuestos de cianuro e indica que hay microorganismos implicados en los procesos acoplados de nitrificación y aprovechamiento de desechos del metabolismo celular. Mayor investigación es necesaria para dilucidar los mecanismos de degradación en los cultivos mixtos.

Palabras Clave: Cianuro, plantas de lixiviación de oro, aislados nativos, cultivo mixto.

2.1 Introducción

El cianuro es una sustancia química compuesta por carbono e hidrógeno unidos por un enlace triple (C≡N), el cual está presente ampliamente en el ambiente en forma de sales inorgánicas como el KCN y el NaCN, en forma HCN el cual es altamente tóxico al ser muy volátil en solución acuosa. Otras formas de encontrarlo es en complejos metálicos de cianuro, nitrilos, cianatos, entre otros (Kjeldsen, 1999). Este compuesto es considerado como una de las macromoléculas involucradas en el origen de



Título de la tesis o trabajo de investigación

la vida primitiva y como posible precursor ancestral de bases nitrogenadas como adenina y guanina (Lazcano, 1986).

Es usado en varios procesos industriales tales como producción de nylon, plásticos acrílicos, galvanoplastia, producción de goma sintética, endurecimiento de metales, aplicaciones fotográficas, productos farmacéuticos, pesticidas, extracción minero metalúrgica de oro y otros metales, entre otros. Sólo el 18% de la producción total es usado en la minería, especialmente en la recuperación de oro (Logsdon et al., 2001). Aunque el cianuro es considerado como una sustancia altamente tóxica para los seres vivos, se puede transformar en otras sustancias menos tóxicas mediante procesos físicos, químicos y biológicos, descomponiéndolo y haciéndolo no persistente en el ambiente (Logsdon et al., 2001).

Los residuos contaminados con cianuro pueden llegar a ser letales a ciertas concentraciones. El cianuro libre es uno de los venenos de rápida actuación más conocidos en el mundo, ya que es fácil de ser absorbido a través de inhalación, ingestión o contacto con la piel (Kjeldsen, 1999). En sistemas vivos, actúa inhibiendo la enzima citrocromo oxidasa C de la cadena respiratoria (Raybuck, 1992). Estos residuos cuando son vertidos sin ningún tipo de tratamiento pueden ocasionar que los cuerpos receptores no se auto-recuperen, alterando sus características y generando un gran impacto ambiental (Deloya, 2012). De ahí la gran importancia de tratar estos residuos contaminados, para lo cual existen varios métodos que han sido utilizados, entre los que se destacan tratamientos químicos y físicos, como cloración alcalina, peróxido de hidrógeno, ozonación, oxidación anódica, electrodiálisis, ósmosis reversa, destilación, flotación, AVR, precipitación de cianuro de hierro, carbón activado, ácido de Caro, oxidación catalítica, fotólisis, entre otros (Dash et al., 2009). Sin embargo estos tratamientos presentan altos costos iniciales y de operación, ya que se debe hacer un tratamiento posterior (Ata Akcil & Mudder, 2003; Young & Jordan, 1995).

A nivel mundial, se ha aceptado un límite de cianuro total cerca del 0.2 mg/L para agua potable y se ha determinado que para tanques abiertos debería haber una concentración de 50 mg/L, con el fin de proteger aves migratorias (Logsdon et al., 2001). En Colombia, la minería de oro es una de las industrias con mayor importancia para la economía, siendo que, gran parte de ella se realiza a pequeña escala y de forma artesanal (UPME, 2007).

La legislación colombiana, en el decreto 1594 de 1984, describe que los criterios de calidad de agua admisibles para la destinación del recurso para consumo humano y doméstico limitan la concentración de cianuro a 0.2 mg/L; para el vertimiento en un cuerpo aceptor, las concentraciones de carga de cianuro son de 1 mg/L y, finalmente, los criterios de calidad admisibles para la destinación del recurso para preservación de flora y fauna, en aguas dulces, frías o cálidas y en aguas marinas o estuarios, son de de 0.05 CL9650 (Ministerio de Agricultura, República de Colombia, 1984).

Capítulo 2 35

De esta forma, la opción biológica aparece como una alternativa capaz de degradar diversos complejos de cianuro como cianuro libre, tiocianato, complejos metálicos WAD y SAD (Dash et al., 2009), no generar efectos adversos y ser menos costosa en su operación (Desai & Ramakrishna, 1998). Además es conocida por ser una aproximación a la degradación natural, donde se pueden tratar grandes cantidades de agua residual contaminada con cianuro, posibilitando llegar a zonas de bajo flujo de las pilas a tratar, siendo que la biomasa, además de poder, ser activada por aireación, presenta buena resistencia a los cambios drásticos de temperatura y sobre todo no genera subproductos tóxicos, entre otros beneficios (Dash et al., 2009).

Algunas plantas de beneficio de oro a nivel mundial, han incursionado en el tratamiento biológico, haciendo que su costo operativo sea menor y empleando esta tecnología ambientalmente más limpia. Entre las que podemos destacar está The Homestake Mine, ubicada en Estados Unidos, donde hubo una disminución del 60% de costo inicial y una disminución del 29% del costo de operación comparado con el tratamiento de peroxidación; Green Bank Gas Works, ubicada al este de Blackburn, Reino Unido, la cual logró un ahorro de US$70.000 con respecto a métodos convencionales usando degradación biológica, además de evitarse el transporte de grandes cantidades de material contaminado. Por último USMX Green Springs Gold Operations, ubicada en Nevada, Estados Unidos, la cual al realizar ensayos de biodegradación logró reducir una concentración inicial de cianuro WAD de 20 ppm a 8,5 ppm (Dubey & Holmes, 1995).

Por lo tanto, estas tecnologías más limpias, en especial la bioremediación o los biotratamientos, requieren el conocimiento sobre microorganismos ambientales, ya que éstos nos dan información de la interacción de ellos con su medio y el rol desempeñan en este nicho, además de vislumbrar posibles actividades biotecnológicas que nos puedan ofrecer para remediación, alimentos, medicamentos, entre otros.

Dentro de los microorganismos que pueden estar presentes en las muestras de efluentes residuales de plantas de beneficio, están bacterias gram negativas como Pseudomonas (Grigor’eva et al., 2008), Achromobacter, Flavobacterium, Nocardia, Bdellovibrio, Mycobacterium, y bacterias nitrificantes como, Nitrosomonas y Nitrobacter (Akcil, 2003). Además, se ha observado una actividad degradadora de cianuro en Trichoderma sp (Zhou et al., 2007), Polyporus sp (Özel et al., 2010), entre muchos otros.

Los microorganismos no se rigen bajo un solo mecanismo de biodegradación. Diversas investigaciones han determinado que los microorganismos pueden actuar de acuerdo a 5 vías generales de reacción (Blumer & Haas, 2000; Dubey & Holmes, 1995; Gupta et al., 2010; Knowles, 1976):

• Reacciones hidrolíticas: Este tipo de reacciones son predominantes cuando se presentan altas concentraciones de cianuro (Pereira et al., 1996). Es muy común en hongos (Gupta et al., 2010). Son catalizadas por enzimas como cianuro hidratasa, nitrilo hidratasa, cianidasa y nitrilasa, encargadas de degradar el cianuro a través de las siguientes reacciones (Molina et al., 2006):

Cianuro hidratasa: HCN + H2O → HCONH2 (2.1)




Nitrilo hidratasa: R–CN + H2O → R–CONH2 (2.2)

Cianidasa: HCN + 2H2O → HCOOH (2.3)

Nitrilasa: R–CN + 2H2O → R–COOH (2.4)

• Reacciones oxidativas: Bajo este tipo de mecanismo se generan amoníaco y dióxido de carbono. Estas enzimas requieren una fuente extra de carbono además del cianuro (Gupta et al., 2010). Es predominante a bajas concentraciones de cianuro (Pereira et al., 1996). Esta ruta, forma amonio y CO2, por medio de la enzima cianuro monoxigenasa, la cual convierte el cianuro en cianato. El cianato es catalizado por la cianasa donde se convierte en amonio y CO2; una segunda ruta utiliza cianuro dioxigenasa (Gupta et al., 2010).

Cianuro Monoxigenasa: HCN + O2 +H+ +NAD(P)H → HOCN + NAD(P)+ +H2O (2.5)

Cianuro Dioxigenasa: HCN + O2 +2H+ +NAD(P)H → CO2 +NH3 +NAD(P)+ (2.6)

• Reacciones reductivas: Se considera que ocurren en condiciones anaerobias (Gupta et al., 2010). Algunos microorganismos, en condiciones facultativas, pueden degradar el cianuro en ausencia de oxígeno, hasta convertirse en metano, amoníaco y formaldehido (Ebbs, 2004).

HCN + 2H+ +2e−→ CH2=NH + H2O → CH2=O (2.7)

CH2= NH + 2H+ +2e−→ CH3-NH + 2H+ +2e−→ CH4 +NH3 (2.8)

• Reacciones de sustitución/transferencia: Implican la asimilación del cianuro para el crecimiento celular, proporcionando una fuente de nitrógeno adicional y evitando la toxicidad del cianuro (Gupta et al., 2010). Se ha reportado la producción in vivo de tiocianatos a partir de cianuro por acción de la enzima cianuro sulfotransferasa, presente en algunos microorganismos. El cianuro puede ser convertido a 𝛽-cianoalanina o 𝛼-aminonitrilo, catalizado por 𝛽-cianoalanina sintetasa, seguida por hidrólisis, donde se libera NH3 y un ácido. Otras rutas producen tiocianato, que es menos tóxico. Este compuesto, producido por la enzima sulfurtransferasa, podría entonces ser biodegradado por rutas como carbonilo o la del cianato (Ebbs, 2004; Gupta et al., 2010).

Cianoalanina sintetasa: Cisteína + CN−→𝛽-cianoalanina + H2S (2.9)

OAS+CN−→𝛽-cianoalanina + CH3COO− (2.10)

Tiosulfato: cianuro sulfurtransferasa: CN− +S2O3→ SCN− +SO32− (2.11)

Capítulo 2 37

• Reacciones de sintetasas: Esta vía es también una vía de asimilación de cianuro. Se trata de la síntesis de aminoácidos, 𝛽-Cianoalanina y ácido 𝛾-Ciano-𝛼-Aminobutírico, mediante el uso de residuos de aminoácidos como precursores, que reaccionan con compuestos de cianuro (Gupta et al., 2010).

Existen microorganismos que pueden utilizar más de un mecanismo, incluso otros que utilizan diferentes a los ya mencionados (Ebbs, 2004). En algunos casos, los consorcios bacterianos utilizados en los procesos de biodegradación de cianuro suelen venir acompañados de bacterias nitrificantes, que se encargan de degradar el amoníaco producido, excedente que no toman las demás bacterias como fuente de nitrógeno (Grigor’eva et al., 2008).

En Colombia, se han llevado a cabo estudios de degradación con microorganimos nativos todos del género Pseudomonas sp. (Gil & Giraldo, 2005; Restrepo et al., 2006; Sánchez, 2010) y se han usado consorcios con microorganismos no identificados para evaluar su desempeño frente a la degradación del cianuro (Molina et al., 2006), todos ellos con resultados prometedores frente a la degradación de cianuro.

El principal objetivo de este capítulo fue evaluar la capacidad de degradación de cianuro en cepas nativas aisladas de efluentes residuales de procesos de cianuración en dos plantas de beneficio de oro, donde la mayoría de cepas identificadas no han sido reportadas como degradadores de cianuro e identificar la cepa o consorcio que presente mayor degradación, evaluando su desempeño in vitro.

2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Aislados bacterianos

Los trece aislados bacterianos usados en este estudio pertenecían a los fila Actinobacteria, Firmicutes y Proteobacteria. Los aislados bacterianos fueron obtenidos de 2 plantas de beneficio de oro: una planta de oro artesanal y una planta industrializada, ubicadas en el municipio de Marmato (Caldas, Colombia), como se describe en la tabla 1-3 del Capítulo 1.

2.2.2 Activación de los inóculos

Los aislados se hicieron crecer en medio LB, por 48 h, hasta alcanzar una concentración celular mayor a 106 células/mL, a 30°C y 180 rpm, en un agitador orbital. En las mismas condiciones se activó la cepa comercial Pseudomona fluorenscens DSM7155 (Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) la cual se utilizó como control positivo en los bioensayos. Se realizó activación para cada uno de los ensayos realizados (200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm de cianuro y cultivos mixtos).

2.2.3 Ensayos a nivel de Erlenmeyer

Se usaron los trece aislados que correspondían a una identidad filogenética diferente (Tabla 1-3). Los ensayos se realizaron en erlenmeyers de 500 mL, donde se agregaron 10 mL de inóculo vivo y 240 mL




de medio mínimo M9 (Miller, 1992), que contenía para 1 L: 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 19 mM de NH4Cl, 1 mM de MgSO4, 0.09 de CaCl2 y 9 mM de NaCl. Como fuente de carbono se usó glicerol al 20%, con un pH inicial de 11.7. Con cada una de las cepas se usaron tres concentraciones de cianuro de sodio (NaCN), las cuales fueron 200, 500 y 1000 ppm. Todos los ensayos se hicieron por duplicado y se crecieron en un agitador orbital a 180 rpm, 30°C, por 168 h, en condiciones aerobias. Las mediciones de pH y concentración de cianuro se hicieron cada 24 h. Al final del ensayo se midió la biomasa.

Un segundo bioensayo se realizó eligiendo los aislados Microbacterium oxydans, Bacillus cereus y Tessaracoccus oleagri, debido a su previo desempeño in vitro y de acuerdo a su reporte en la literatura como degradador de cianuro, con el fin de llevar a cabo un cultivo mixto. Los bioensayos se realizaron en erlenmeyers de 500 mL, donde se inocularon 10 mL de inóculo vivo y 240 mL de medio mínimo M9 (Miller, 1992), conteniendo para 1 L: 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 19 mM de NH4Cl, 1 mM de MgSO4, 0.09 de CaCl2 y 9 mM de NaCl. Como fuente de carbono se usó glicerina al 20% con un pH inicial de 11.7. Con cada uno de los cultivos mixtos se usaron tres concentraciones de cianuro de sodio, las cuales fueron 200, 500 y 1000 ppm. Todos los ensayos se hicieron por duplicado y se crecieron en un agitador orbital a 180 rpm, 30°C, por 168 h, en condiciones aerobias. Las mediciones de pH y concentración de cianuro se hicieron cada 24 h. Al final del ensayo se midió la biomasa. Los tres aislados, se eligieron en base que, (i) M. oxydans tuvo porcentajes altos de degradación en las 3 concentraciones evaluadas; (ii) el aislado T. oleagri tuvo buenas degradaciones a 500 y 1000 ppm, semejante a las concentraciones usadas a nivel industrial; y finalmente, (iii) el aislado B. cereus se eligió, debido a que ha sido ampliamente reportado como degradador y tolerante a altas concentraciones de cianuro (Bhalla et al., 2012; Knowles, 1976), así las proporciones de degradación de cianuro en los ensayos individuales de aislados, no superaran 14.48% de degradación.

2.2.4 Diseño experimental

El diseño experimental usado para todos los bioensayos fue un Diseño Completamente al Azar (DCA) donde hay 15 tratamientos (13 aislados bacterianos, el control positivo con P. fluorescens y un control negativo) cada uno con una réplica, evaluados en 3 unidades experimentales (200, 500 y 1000 ppm de NaCN), con el fin de disminuir la magnitud del error experimental.

2.2.5 Métodos analíticos

Cada 24 h, se tomó una alícuota de 10 mL de cada ensayo el cual es llamado analito. Se midió el pH usando medidor HQ 40d-multi (HACH Company®) con un electrodo de KCl (PHC301). La concentración de cianuro libre en solución se determinó por medio de titulación con una bureta automática, usando como valorante nitrato de plata (AgNO3) grado analítico al 0.005M (0.84935 g de AgNO3 en 1 litro de agua estéril). Como indicador se usó p-dimetil-amino-benzal rodanina (Rh-), el cual se preparó en una solución de 20mg por 100mL de acetona, según el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (American Public Health Association et al., 1913). Los datos se compararon con respecto al control sin microorganismo. La concentración de cianuro fue determinada por la siguiente fórmula (American Public Health Association et al., 1913):

CN :mg L=ppm = VolTitulante mL *ConcentraciónAgNO3*2*49.01*1000

Volvalorante mL (2.12)

Capítulo 2 39

2.2.6 Extracción de DNA cultivos mixtos

Se tomó una alícuota de 2 mL de cada cultivo en sus diferentes concentraciones y se realizó extracción de DNA por medio de Soil DNA Isolation Kit (NORGEN, Biotek Corp.), se hizo un análisis de Regiones Espaciadoras Intergénicas Ribosomal (RISA o IGS) (Jensen et al., 1993). Los patrones de IGS se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). El gel se analizó utilizando el software GelCompar II (Applied Maths Biosystems, Bélgica). El análisis de agrupamiento por el método de correlación de DICE (Nei & Li, 1979), con el coeficiente de similitud UPGMA (Mohammadi & Prasanna, 2003).


Todos los experimentos fueron realizados por duplicado. El error experimental fue estimado y representado con barras de error (desviación estándar) del promedio de los ensayos. Los datos fueron analizados usando el software SAS® STUDIO versión 3.4 (Edición Basic). Se llevó a cabo un Test ANAVA (95% de intervalo de confianza) verificando F>Pr. La comparación entre ensayos se llevó a cabo por análisis de diferencias de medias por medio de un test T.

2.3 Resultados

2.3.1 Bioensayos de degradación con aislados bacterianos

El bioensayo de degradación mostró que hubo una disminución de la concentración de cianuro, la cual no fue debida al efecto del medio de cultivo, ya que los controles negativos no mostraron degradación considerable durante el tiempo. Se observó que el aislado nativo que tuvo mejor degradación fue Microbacterium oxydans, para todos los ensayos individuales en todas las concentraciones de cianuro, con degradaciones de 39,96%, 32,36% y 19,13% para 200, 500 y 1000 ppm respectivamente. Aunque nominalmente en los experimentos con 1000 ppm NaCN el ensayo con la cepa nativa Microbacterium oxydans, fue el de mayor degradación, los ensayos con las cepas Tessaracoccus oleagri (17.66%) y Rhodococcus corynebacterioides (18.15%), mostraron degradaciones finales estadísticamente idénticas, siendo que la última presentó las mejores características ya que alcanzó ese valor prácticamente desde el día dos.

Fue evidente la disminución en el porcentaje de cianuro degradado, conforme aumentó la concentración de cianuro. Sin embargo es interesante ver que, si bien el porcentaje relativo de cianuro degradado disminuyó, la cantidad final de cianuro degradado aumentó en todos los aislados, al aumentar la cantidad de cianuro en los ensayos, como se puede ver en la Figura 2-4, donde se puede destacar especialmente el comportamiento de la cepa control (P. fluorescens) y los aislados M. oxydans, T. oleagri y R. corynebacterioides, aunque vale la pena resaltar que el ensayo con el aislado M. oxydans, no aumentó de la misma forma entre los ensayos con 500 y 1000 ppm de 𝐶𝑁!, si se compara con los otros ensayos mencionados. Todos los ensayos (con excepción de los ensayos con los aislados T. oleagri y R. corynebacterioides) mostraron una disminución relativa entre los ensayos con 500 y 1000 ppm 𝐶𝑁!.




Figura 2-1. Gráfica de degradación de la concentración de cianuro vs tiempo en horas, usando una concentración inicial de 200 ppm de cianuro en el medio M9. todos los aislados: Bacillus pumilus (B.p), Pisciglobus halotolerans (P.h), Lysinibacillus fusiformis (L.f), Paenibacillus illinoisensis (P.i), Aerococcus viridans (A.v), Rhodococcus corynebacterioides (R.c), Trichococcus flocculiformis (T.f), Bacillus cereus (B.c), Enterococcus hirae (E.h), Microbacterium oxydans (M.o), Bracybacterium sp. (B. sp.), Tessaracoccus oleagri (T.o) y Alcaligenes sp. (A. sp.), un control positivo de la cepa P. fluorescens (DSM7155)(P.f C+) y un control negativo sin inóculo (Control-).


100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Con

cent

raci

ón d

e C

N (

ppm

)

Tiempo (horas)

Control - P.f C+ B.p P.h L.f P.i A.v R.c T.f B.c E.h M.o B. sp. T.o A. sp.

Capítulo 2 41


310 330 350 370 390 410 430 450 470 490 510 530 550 570

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Con

cent

raci

ón d

e C

N (

ppm

)

Tiempo (horas)

Control - P.f C+ B.p P.h L.f P.i A.v R.c T.f B.c E.h M.o

710 740 770 800 830 860 890 920 950 980

1010 1040 1070 1100

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Con

cent

raci

ón d

e C

N (

ppm

)

Tiempo (horas)

Control - P.f C+ B.p P.h L.f P.i A.v R.c T.f B.c E.h M.o B. sp. T.o A. sp.




Figura 2-4. Gráfica de cianuro removido vs concentración de cianuro usada en los ensayos (200, 500 y 1000 ppm) en el medio M9. todos los aislados: Bacillus pumilus (B.p), Pisciglobus halotolerans (P.h), Lysinibacillus fusiformis (L.f), Paenibacillus illinoisensis (P.i), Aerococcus viridans (A.v), Rhodococcus corynebacterioides (R.c), Trichococcus flocculiformis (T.f), Bacillus cereus (B.c), Enterococcus hirae (E.h), Microbacterium oxydans (M.o), Bracybacterium sp. (B. sp.), Tessaracoccus oleagri (T.o), Alcaligenes sp. (A. sp.) y un control positivo de la cepa P. fluorescens (DSM7155)(P.f C+).

2.3.2 Bioensayos de degradación con cultivos mixtos

Los ensayos con cultivos mixtos no mostraron una eficiencia mayor en la degradación, con respecto a los cultivos de aislados individuales. Por lo tanto, se sugiere que no hay una sinergia de degradación entre los aislados elegidos para llevar a cabo el proceso. Las degradaciones obtenidas en cada uno de los tratamientos fue de 15,45%, 11,29% y 10,31% para 200, 500 y 1000 ppm. De manera similar, se pudo observar una disminución, aunque menos marcada, en la eficiencia del proceso de degradación de cianuro, conforme se aumentó la concentración de éste en el ensayo. De acuerdo con los resultados de los controles, se considera que prácticamente no hubo degradación biológica en estos ensayos, ya que las diferencias se encuentran dentro del error o muy cerca de éste. Este efecto se hizo más evidente conforme se aumentó la concentración de cianuro en los ensayos.

Figura 2-5. Gráfica de degradación de la concentración de cianuro vs tiempo en horas, usando una concentración inicial de 200, 500 y 1000 ppm de cianuro en el medio M9, cultivos mixtos de los

0

50

100

150

200

250

200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Cia

nuro

rem

ovid

o (p

pm)

Concentración de cianuro (ppm)

M.o B.p P.f C+

E.h P.i T.o

T.f R.c B. sp.

A. sp. A.v L.f

P.h B.c

Capítulo 2 43

aislados Bacillus cereus, Microbacterium oxydans y Tessaracoccus oleagri, además un control negativo sin inóculo para cada concentración.

2.3.3 Comportamiento de pH y crecimiento celular

En los bioensayos de degradación con aislados bacterianos y cultivos mixtos el pH permanecieron casi constantes, todos los tratamientos iniciaron con un pH de 11,7 y ninguno bajó de pH 10. El crecimiento celular fue evidenciado por la actividad degradadora de cianuro hasta el último día de cada ensayo y por medición de biomasa al final de cada tratamiento. Todos los inóculos iniciales tuvieron un orden de 10! células/mL, antes de ser agregados al medio de cultivo. Al final de los ensayos de degradación con aislados bacterianos la biomasa incrementó hasta valores entre 10! y 10! células/mL. Para los cultivos mixtos el inóculo inicial para todos los ensayos fue de 15 mL (5 mL de cada uno de los 3 aislados agregados) y tenía un inóculo inicial de 10! células/mL antes de ser agregados al medio, al final de los ensayos la biomasa tenía una concentraciones de 10!, estos datos se observan en la tabla 2-1.

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Con

cent

raci

ón d

e C

N (

ppm

)

Tiempo (horas)

Control - 200 ppm Control - 500 ppm Control - 1000 ppm Cultivo Mixto 200 ppm Cultivo Mixto 500 ppm Cultivo Mixto 1000 ppm




Tabla 2-1. Concentración celular de los inóculos, al final de los bioensayos de degradación y en los cultivos mixtos en las concentraciones de 200, 500 y 1000 ppm de cianuro.

Microorganismo Inóculo Inicial (𝟏𝟎𝟔)

Conteo celular después de los ensayos (𝟏𝟎𝟕)

200 ppm 500 ppm 1000 ppm P. f luore s c ens (C+) (P. f C+) 5 1.3 2.1 1.5 B. pumi lus (B.p) 1.3 1.5 4.5 2 P. ha lo to l e rans (P .h) 1.4 1.4 2.8 1.3 L. fus i fo rmis (L. f ) 1.6 1.4 1.8 1.8 P. i l l ino i s ens i s (P . i ) 1.1 1.6 1 1.1 A. v i r idans (A.v) 3.2 1.4 1.7 1.2 R. corynobac t e r io ides (R.c ) 3.4 1.2 2.1 1.5 T. f lo c cu l i fo rmis (T. f ) 1.2 1.2 1.2 1.2 B. c e r eus (B. c ) 1 1.6 1.5 1 E. h irae (E.h) 2.6 2.2 1.3 3 M. oxydans (M.o) 6.7 3.6 2.7 1.1 Brachybac t e r ium sp. (B. sp.) 2.4 1.8 1.5 1.6 T. o l eagr i (T.o ) 4.1 1.2 1.3 1.1 Alca l i g enes sp. (A. sp.) 1.2 1.8 1.7 1.3 Cultivos Mixtos 2.8 0.03 0.01 0.01

2.3.4 Concentración de DNA de los cultivos mixtos

Para los cultivos mixtos se realizó extracción de DNA en dos momentos del ensayo, en el día 4 (mitad del ensayo) y el día 8 (final del ensayo), con el fin de definir si hubo algún cambio que explicara esta baja proporción de degradación. Para esto se realizó un análisis RISA, donde se observó menor concentración de DNA al final de los ensayos, indicando aparentemente que el DNA se degradó con el paso del tiempo. Además de lo anterior se observó que en los diferentes tratamientos (200, 500 y 1000 ppm), se acentuaron o atenuaron algunas bandas, mientras que otras permanecieron constantes (Figura 2-6).

Capítulo 2 45

Día 4 Día 8

200 500 1000 200 500 1000

Figura 2-6. Perfiles de bandeo del análisis de Regiones Espaciadoras Intergénicas Ribosomal (RISA) en electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de cultivos mixtos, en los diferentes tratamientos 200, 500 y 1000 ppm, tomados a mitad del ensayo (día 4) y al final del ensayo (día 8).


Se obtuvo resultados de ANAVA y test T para los ensayos con los aislados y cultivos mixtos. Todos los resultados de ANAVA arrojaron valores F>Pr, aceptando la hipótesis alternativa, es decir, hay diferencias entre las medias de los tratamientos. De esta forma, por lo menos dos tratamientos (aislados o cultivo mixto) fueron diferentes entre sí a la hora de degradar cianuro; los resultados de los ANAVA y los test T se muestran en el Anexo D.

2.4 Discusión

En los ensayos de degradación con los aislados bacterianos obtenidos de las plantas de beneficio de oro artesanal e industrial, se evaluaron las 13 cepas aisladas, según la identificación molecular descrita en el capítulo 1, que fueron diferentes. Para este caso, el medio de cultivo usado fue el medio mínimo M9 (Miller, 1992) usando como fuente de carbono glicerol y sin ningún tipo de fuente de nitrógeno aparte del NaCN, esta modificación se llevó a cabo para inducir a los microorganismos a tomar su fuente de nitrógeno directamente de la molécula de cianuro. Se usó como fuente de carbono glicerol, debido a que se ha reportado para Serretia marcescens cepa RL2b degradaciones superiores de cianuro con glicerol como fuente de carbono, con respecto a otras fuentes carbonadas como glucosa, fructosa, sacarosa y succinato (Kumar et al., 2013). El crecimiento de los microorganismos se observa en la tabla 2-1, donde se visualiza que las concentraciones celulares fueron similares en las tres concentraciones de cianuro, por lo que se puede deducir que el crecimiento celular no se vio




evidentemente afectado al aumentar el cianuro en el medio, así que los resultados obtenidos probablemente no se atribuyan a muerte celular.

El aislado que mejor desempeño obtuvo en los diferentes medios fue M. oxydans. Hubo otros aislados que presentaron buen desempeño, sin embargo en comparación con el ensayo en medio LB con cianuro donde se usaron los aislados B. pumilus , R. corynebacterioides, E. hirae y T. oleagri (Capítulo 1), estos mismos aislados no tuvieron tan buen desempeño en el medio M9 con NaCN, ya que los porcentajes de degradación fueron mayores para el LB con NaCN.

De la Figura 2-1, se observa que para 200 ppm de cianuro inicial en el medio, los aislados L. fusiformis, R. corynebacterioides, B. cereus, Alcaligenes sp., P. halotolerans, Brachybacterium sp. y el control positivo P. fluorescens, tuvieron baja degradación las primeras 24 h y para el control positivo, fue hasta las 48 h. Esto se puede atribuir a una fase lag (Meyers et al., 1991), de adaptación al nuevo medio con cianuro, sin embargo, después de esta baja degradación, entre las horas 24 y 72, ocurre casi todo el proceso de degradación. Después de las 72 h, prácticamente se alcanza el porcentaje de degradación final. Esta fase inicial de adaptación puede ser corta (horas) o larga (hasta varios días), dependiendo del grado de adaptación de las cepas al cianuro y a la puesta en marcha de enzimas que faciliten la asimilación del cianuro (Luque-Almagro et al., 2005; Meyers et al., 1991). Para Rhodococcus sp. y Alcaligenes sp., se ha determinado que la ruta más probable para la degradación de cianuro es la ruta hidrolítica y la cual, puede variar entre las enzimas cianidasa y nitrilo hidratasa, dependiendo de la especie (Gupta et al., 2010). La enzima nitrilo hidratasa puede ser inducida por cofactores como cobalto (Gupta et al., 2010), una posible alternativa para inducir el metabolismo por parte de esta enzima sería bioestimular los cultivos por medio de cofactores para disminuir la fase lag e inducir a la degradación de cianuro, esto se ha estudiado para Rhodococcus sp., donde se usa como inductor para la enzima, Acetonitrilo (Nallapan Maniyam et al., 2013). Para A. viridans, T. flocculiformis, T. oleagri, P. illinoisensis, E. hirae, B. pumilus y M. oxydans, la fase lag es corta y a las 24 h, se alcanza prácticamente la degradación final. Sin embargo, los dos últimos aislados, presentaron la mayor pendiente de degradación en las primeras 24 h. Para B. pumilus, la enzima encargada de este proceso es la cianidasa (Gupta et al., 2010).

Para el ensayo de degradación a 500 ppm, Figura 2-2, ocurre un fenómeno similar que el descrito para 200 ppm. Hay una fase lag corta para los ensayos, sin embargo, se observa que para los aislados P. illinoisensis, E. hirae y B. cereus, la mayor degradación ocurre dentro de las primeras 24 h, casi alcanzando la degradación final y para el resto de aislados, la pendiente de degradación es mayor en las primeras 24 h y la degradación continúa hasta el último día de medición. En esta concentración los microorganismos que mayores pendientes de degradación muestran en las primeras 24 h, son M. oxydans y P. fluorescens, alcanzando los mejores valores finales de degradación 32.4% y 31.4%, respectivamente.

Para la degradación de 1000 ppm de cianuro en el medio, se observa en la Figura 2-3, hay una fase lag que es mayor en los aislados P. illinoisensis, P. halotolerans y B. pumilus, donde la degradación hasta la hora 72 es muy poca, a partir de este tiempo, es donde ocurre la mayor pendiente de degradación para estos aislados, sin embargo las degradaciones finales son bajas; Por otro lado, los aislados Alcaligenes sp., E. hirae, Brachybacterium sp., B. cereus y T. flucculiformis, presentan una pendiente mayor de degradación las primeras 24 h y continúan con la degradación hasta el último día del ensayo, de forma gradual. Los

Capítulo 2 47

aislados Alcaligenes sp., M. oxydans, T. oleagri y Brachybacterium sp., además de presentar una pendiente mayor de degradación en las primeras 24 h, la degradación se disminuye entre las horas 24 y 96, para finalmente volver a presentar una pendiente mayor de degradación, este comportamiento puede atribuirse a la formación de enzimas para continuar con la degradación y adaptarse mejor a las condiciones de alta concentración de cianuro. Aunque hay varias rutas descritas para la degración de cianuro, la gran mayoría de bacterias degradadoras s usan la ruta hidrolítica (Gupta et al., 2010) y ésta puede tener, a su vez, varias enzimas involucradas en el proceso, donde primero actúa una sobre el sustrato, formando un intermediario, para finalmente por medio de otra enzima, convertir el intermediario en los productos finales (Gupta et al., 2010). A esta concentración, el control positivo fue quien tuvo el mejor desempeño, mientras que los aislados T. oleagri, M. oxydans y R. corynebacteriodes, presentaron las mejores degradaciones y son estadísticamente iguales. Estos aislados especialmente, se han encontrado en lugares con condiciones ambientales extremas, derrames de petróleo y depósitos de uranio (Chen et al., 2012; Nallapan Maniyam et al., 2013).

El comportamiento de disminuir la degradación de cianuro por parte de los microorganismos en las primeras horas del ensayo y posteriormente disminuir la tasa de degradación, puede obedecer a varios factores, tales como, i) falta de cofactores que induzcan la maquinaria específica para inducir la degradación, como lo han reportado los autores antes descritos; ii) es posible que la fuente de carbono usada, en este caso glicerol, esté actuando como sustrato limitante, debido a su rápido consumo y que éste ocurra dentro de las primeras 48 h. Este fenómeno se ha observado en Rhodococcus sp (Nallapan Maniyam et al., 2013b).

Los ensayos de degradación evidencian de forma general disminución en el porcentaje de degradación de los microorganismos, sin embargo, la cantidad final de cianuro degradado aumentó en todos los aislados, al aumentar la cantidad de cianuro en los ensayos, como se puede ver en la Figura 2-4, otros estudios han obtenido resultados similares (Chen et al., 2008; Naghavi et al., 2012). Este comportamiento podría atribuirse a varios factores como i) la disponibilidad de cianuro en el medio es mayor, haciendo entonces que la degradación aumente en las primeras horas del ensayo, ii) a fuente de carbono esté actuando como sustrato limitante, haciendo entonces que, mientras esté disponible en el medio haya degradación y cuando disminuya su concentración, también lo haga la degradación; estas dos hipótesis podrían actuar al mismo tiempo, haciendo entonces que la degradación sea más efectiva en las primeras horas de los ensayos; iii) otra posible explicación a este fenómeno, se puede atribuir a la razón entre C:N que requieren los microorganismos, la proporción ideal para la degradación de cianuro es C:N de 6:1 (Petrozzi & Dunn, 1994), esto puede no cumplirse para las concentraciones mayores, donde esta proporción disminuye a medida que aumenta la concentración de cianuro, por tanto puede ocurrir un desbalance nutricional, esto se ha estudiado en suelos alcalinos donde esta proporción es un factor importante en la absorción de nutrientes por parte de la comunidad bacteriana (Zhang et al., 2014).

Hubo algunos aislados que degradaron mayores porcentajes de cianuro a 500 ppm (Pisciglobus halotolerans, Lysinibacillus fusiformis, Enterococcus hirae, Brachybacterium sp., Tessaracoccus oleagri, Alcaligenes sp. y P. fluorescens) y 1000 ppm (Rhodococcus corynebacterioides) que a 200 ppm, este fenómeno ha sido reportado anteriormente para la cepa RL2b de Serretia marcescens (Kumar et al., 2013).




El aislado Microbacterium oxydans, fue el que presentó uno de los mayores porcentajes de degradación en cada concentración 39.96%, 32.36% y 19.13% para 200, 500 y 1000 ppm respectivamente. A partir del test T se concluye que una diferencia significativa para el tratamiento con M. oxydans, comparado con los demás tratamientos, en las diferentes concentraciones. El género Microbacterium sp. se ha encontrado en lodos activados contaminados con complejos de cianuro (Zhe-Xue et al., 2006), además varias cepas de M. oxydans ha sido aislada de diversos ambientes, entre ellos de lugares contaminados con arsénico (Aksornchu et al., 2008; Paul et al., 2015), suelos contaminados con aceite (Yan et al., 2013) sedimentos marinos (Yuan et al., 2014) y suelos con presencia de pesticidas (Mostafa & Helling, 2003), parece ser un microorganismo versátil para resistir a ambientes agrestes, con la capacidad de producción de metabolitos extracelulares (Thys et al., 2004), capacidad de biodezulfurización (Li et al., 2005) o resistir moléculas complejas (Aksornchu et al., 2008; Mostafa & Helling, 2003).

Otros aislados que presentaron buena degradación a 200 ppm fueron B. pumilus, Paenibacillus illinoisensis, Enterococcus hirae y el control positivo P. fluorescens cada uno con 27.71%, 19.13%, 19.13% y 22.80% respectivamente. Paenibacillus illinoisensis, aunque no ha sido reportado como degradador de cianuro, ha sido aislado de raíces de Cicer arietinum L. donde tiene exposición a cianuro de hidrógeno (HCN) por acción de las rizobacterias asociadas a la planta (Inam-ul-Haq et al., 2015). P. illinoisensis ha sido reportada como una bacteria fijadora de nitrógeno (Mostafa & Helling, 2003) de esta forma puede tener un papel importante en los ambientes contaminados con cianuro usado el amonio residual del metabolismo de otros microorganismos fijando nitrógeno. Algunas cepas de P. illinoisensis son capaces de producir enzimas capaces de resistir solventes orgánicos formando complejos con varias sustancias químicas (Noriyuki et al., 2003).

Para la concentración de 500 ppm hubo varios aislados que tuvieron degradaciones significativas, Enterococcus hirae, M. oxydans, Brachybacterium sp., T. olagri y el control positivo, cada uno con 16.92%, 32.36%, 20.31%, 19.13% y 31.38% respectivamente. Los aislados Brachybacterium sp. y T. olagri, han sido encontrados en lugares con temperaturas bajas (5-25 ºC) con producción de amoniaco (NH3) (Yadav et al., 2015); por otro lado el género Brachybacterium sp., se ha reportado con capacidad de producir exopolisacáridos como forma de resistencia a amenazas externas (Orsod et al., 2012). Tessaracoccus oleiagri no ha sido reportada como degradadora de cianuro, sin embargo, han aislado miembros del género Tessaracoccus sp. en lugares contaminados con uranio (Chen et al., 2012), alta concentración de sales (Claverías et al., 2015) y suelos contaminados con aceite (Cai et al., 2011), lo que sugiere que sus representantes pueden tener características biotecnológicas importantes, como es el caso de T. flavescens que ha sido reportada con actividad antimicrobiana, también aislada de ambientes salinos (Claverías et al., 2015). Ambos aislados Brachybacterium sp. y T. olagri, tuvieron buen desempeño como degradadores de cianuro y según las características que exhiben cada uno de sus géneros, son resistentes a ambientes extremos, convirtiéndolas en candidatas para un procesos degradativos o producción de metabolitos de interés.

A 1000 ppm la mayoría de aislados tuvieron decaimiento en su actividad, sin embargo, otros mostraron tener buena actividad de degradación, así sea menor que en las concentraciones inferiores (200 y 500 ppm). R. corynebacterioides, M. oxydans, Brachybacterium sp, T. olagri y el control positivo, tuvieron degradaciones de 18.15%, 19.13%, 13.74%, 17.66% y 23.54%, respectivamente.

Capítulo 2 49

Los aislados que presentaron menores porcentajes de degradación en los tratamientos de 200 y 1000 ppm, fueron Pisciglobus halotolerans, Lysinibaillus fusiformis, Aerococcus viridans, Trichococcus flocculiformis, Bacillus cereus y Alcaligenes sp. Sin embargo, presentaron mayor porcentaje de degradación a 500 ppm, esto ha sido reportado para la S. marcescens, que tuvo mayor degradación de cianuro a 12 mM de KCN degradándolo hasta en un 99%, que en 8 mM y 16 mM (Kumar et al., 2013) este fenómeno puede deberse a la proporción ideal C:N, antes mencionada, que favorece la degradación, si hay un balance nutricional entre los sustratos usados en el metabolismo. El aislado Pisciglobus halotolerans degradó hasta 15.46% de cianuro a una concentración de 500 ppm, aunque no ha sido reportada como tolerante o degradadora de cianuro, tuvo buen desempeño; P. halotolerans ha sido descrita como halotolerante (10% w/v NaCl) y ha sido aislada en muestras de pez (Tanasupawat et al., 2011). Lysinibaillus fusiformis; degradó hasta 14.97% de cianuro y ha sido reportado en lugares con altas concentraciones de cromato (He et al., 2011). El aislado Aerococcus viridans, tuvo 11.05% de degradación de cianuro. Trichococcus flocculiformis, Bacillus cereus y Alcaligenes sp., tuvieron degradaciones de 14.48%, 14.48% y 14.23%, respectivamente a 500 ppm. T. flocculiformis ha sido aislada de plantas de tratamiento de aguas residuales (Scheff et al., 1984) y tiene la capacidad de formar 1,3-propanediol (PDP) a partir de glicerol, el PDP puede ser usado como solvente en la industria de aceites para vehículos (van Gelder et al., 2012), este metabolito puede estar influyendo en la degradación del cianuro, ya que las dos rutas metabólicas pueden estar actuando sobre el sustrato y favoreciendo a la que metabólicamente lo beneficie más. Este aislado puede presentar afectos negativos en un posible cultivo mixto al que se someta, ya que no sabemos qué efecto tenga el PDP sobre los otros microorganismos. Por otra parte, el género Bacillus sp. es ampliamente conocido por la versatilidad de miembros que pertenecen a él y sus características biotecnológicas de gran importancia. Miembros de este género han sido reportados como buenos degradadores de cianuro como B. nealsonii, capaz de resistir hasta 6000 ppm de cianuro (Mohanraj Perum et al., 2013), B. megaterium también ha sido estudiado en el metabolismo del cianuro produciendo aminoácidos como asparagina (Castric & Strobel, 1969). Otros miembros reportados como metabolizadores de cianuro han sido B. subtilis (Nwokoro & Dibua, 2014) y B. pumilus (Meyers et al., 1991, 1993; Skowronski & Strobel, 1969), este último anteriormente mencionado. B. cereus también ha sido reportado como resistente y buen degradador de cianuro (Bhalla et al., 2012; Knowles, 1976), también tiene la capacidad de producir exopolisacáridos con actividad antimicrobiana (Orsod et al., 2012). El aislado Alcaligenes sp. ha sido aislado de lugares con concentraciones altas de metales pesados (Abbas et al., 2015) como es el caso de este estudio por ser muestras procedentes plantas de beneficio de oro. Tiene representantes con alta tolerancia al cianuro y con capacidad de degradarlo (Ingvorsen et al., 1991).

El test T reveló que hubo porcentajes más altos de degradación a 200 ppm que en 500 y 1000 ppm, de esta forma, se evidencia que a medida que se aumenta la concentración de cianuro afecta la capacidad celular para degradarlo, disminuyéndola, sin embargo aún a 1000 ppm había degradación por parte de todos los aislados evaluados. La fuente de carbono parece ser esencial para inducir el crecimiento bacteriano y la tasa de degradación de cianuro. Al usar cómo fuente de carbono glicerol y como fuente de nitrógeno sólo el cianuro de sodio, parece afectar la degradación de cianuro; es probable que con otra fuente de carbono bioestimule el crecimiento celular y pueda incrementar la degradación de cianuro. Una posible razón para que la degradación de cianuro no sea mayor, podría ser la represión catabólica de sustrato que sufren algunos microorganismos por uso de otras fuentes de carbono que se degradan rápidamente, inhibiendo la expresión de genes que codifican proteínas (Forero & Sánchez, 2008) que jueguen un papel importante en el metabolismo del cianuro. También se ha reportado, que al agregar además del cianuro otra fuente de nitrógeno, incrementa la degradación favoreciendo el proceso (Kumar et al., 2013). Por lo anterior, sería recomendable utilizar otras fuentes de carbono y nitrógeno para bioestimular el crecimiento celular, y probablemente aumente el porcentaje de degradación de cianuro en el medio.




Los resultados de los cultivos mixtos con los tres aislados elegidos, no superaron los resultados de degradación comparados con los cultivos individuales, de hecho mostraron desempeños muy por debajo de casi todos sus individuales (Figura 2-5). Esto indica que la interacción entre microorganismos no fue sinérgica, que era lo que se buscaba. Esto llevó a evaluar las concentraciones de DNA presentes en el medio cianurado con los tres aislados. En la Figura 2-6, se observó una aparente atenuación de las bandas, con el transcurso de los días. El crecimiento celular parece verse afectado con respecto a los ensayos individuales, ya que un recuento menor se observa en los ensayos con cultivos mixtos, tabla 2-1.

También se observó que el patrón de bandeo del análisis de Regiones Espaciadoras Intergénicas Ribosomal (Figura 2-6), cambió de acuerdo a las concentraciones y días transcurridos del ensayo. Lo anterior sugiere que las concentraciones y los días transcurridos, afectan los microorganismos involucrados, favoreciendo la presencia de uno en especial en cada tratamiento y tiempo determinado.

La disminución de concentración de DNA en el medio, pudo deberse a producción de metabolitos asociados al crecimiento de los microorganismos involucrados. Esto pudo estar ocurriendo con M. oxydans, ya que se ha descrito que la cepa Kr10 produce keratinasa extracelular (Thys et al., 2004) que puede estar afectando de algún modo la sinergia entre los microorganismos involucrados en el proceso. Además, este microorganismo también se ha reportado como productor de H2S (Schumann et al., 1999), altamente tóxico e inhibidor del crecimiento celular. Por otra parte, se han reportado miembros del género Tessaracoccus sp. con actividad antimicrobiana (Claverías et al., 2015). De igual forma, B. cereus ha sido reportada como buena productora de metabolitos antimicrobianos (Akinpelu et al., 2014; Orsod et al., 2012). Todos los factores antes descritos pueden estar jugando un papel negativo en la degradación, causando antagonismo entre ellos. Como se describió antes, B. cereus y el género Tessaracoccus sp., pueden generar antibiosis, causando un efecto en las células. El antagonismo puede generarse por competencia por la fuente de carbono, consumiéndose muy rápidamente y de esta forma agotarse de forma inmediata, de esta forma y como se ha descrito anteriormente si no hay nutrientes esenciales como la fuente de carbono, la degradación de cianuro es mínima o nula. Para M. oxydans y T. oleagri, no se conoce las rutas de degradación de cianuro, sin embargo, para B. cereus, la ruta probable de degradación es la ruta hidrolítica por medio de las enzimas cianuro dioxygenasa y nitrilo hidratasa (Bhalla et al., 2012).

Según el test T, no hubo un ensayo mejor que otro, ya que para 200 ppm se alcanzaron degradaciones de 15.46%, mientras que los ensayos con 500 y 1000 ppm, degradaron 11.29% y 10.31% respectivamente. Estos resultados son similares y caben dentro del error estadístico, por lo que podríamos concluir, que no hubo degradación por parte de los cultivos mixtos

Hurtado & Arturo Berastain (2012), reportaron un fenómeno similar para bacterias degradadoras de complejos metálicos de cianuro en relaves de plantas de beneficio de oro. Un inóculo usado de forma individual degradó en promedio 23.5% del cianuro, sin embargo al usarlo un cultivo mixto, la degradación fue de 11%. Este comportamiento pudo haber sido causado por competencia entre

Capítulo 2 51

poblaciones, reduciendo el crecimiento bacteriano durante este fenómeno (Hurtado & Arturo Berastain, 2012; van Veen et al., 1997).

Los ensayos individuales muestran que el aislado M. oxydans, fue el que mejor degradaciones mostró, con respecto a los demás. Sin embargo hubo otros como T. oleagri, R. corynebacterioides y el control positivo, P. fluorescens, que mostraron buen desempeño y rápida adaptación los medios de cultivo con cianuro. Para la mayoría de los aislados no es conocida la ruta de degradación que usan, pero se ha reportado que cambiando algunas condiciones del medio como fuente de carbono, fuente de nitrógeno adicional además del cianuro, inductores enzimáticos como cofactores metálicos para disminuir la fase lag, proporción entre C:N, entre otros, pueden favorecer el crecimiento bacteriano y aumentar la degradación de cianuro. Por otro lado, los análisis usando cultivos mixtos determinaron que hay un antagonismo entre los aislados usados, inhibiendo la degradación de cianuro, posiblemente por varios factores como producción de metabolitos antimicrobianos, formación de ácido en el medio y/o cambios de rutas metabólicas asoiciadas a presencia de metabolitos en el medio por acción de los demás microorganismos. De esta forma es necesario evaluar cultivos mixtos con los diferentes aislados para detectar relaciones sinérgicas entre algunos de ellos.




3. Capítulo: Conclusiones y recomendaciones.

3.1 Conclusiones

El principal objetivo de esta investigación fue estudiar la diversidad bacteriana presente en efluentes residuales de procesos de cianuración en plantas de beneficio de oro (Capítulo 1) y evaluar su potencial frente a la degradación de cianuro (Capítulo 1 y 2). Las siguientes conclusiones y recomendaciones surgieron de este trabajo:

• Este trabajo es el primer reporte en Colombia que proporciona información sobre los patrones de diversidad bacteriana por métodos dependientes e independientes de cultivo, de lugares contaminados con cianuro y evalúa la capacidad de degradación de cepas nativas, donde algunas de ellas no habían sido reportadas como degradadoras ni habitantes de lugares contaminados con cianuro.

• Las plantas de lixiviación de oro presentan concentraciones relativamente alta cianuro y de algunos metales pesados, por esta razón, los análisis cultivo dependiente e independientes sugieren que hay una diversidad bacteriana baja en estos lugares contaminados con cianuro.

• Por medio de ambas aproximaciones de cultivo, se encuentran en común bacterias del fila Firmicutes y Proteobacteria, sin embargo los análisis cultivo dependiente revelaron presencia de microorganismos del filum Actinobacteria. El filum Firmicutes fue dominante en la Fraccicón Cultivable (FC), mientras que en la Fracción Total (FT) predominó el filum Proteobacteria.

• Los métodos cultivo dependientes permitieron aislar trece microorganismos, para usarlos en aplicaciones futuras. Estos microorganismos corresponden a los géneros Pisciglobus sp., Lysinibacillus sp., Paenibacillus sp., Aerococcus sp., Trichococcus sp., Enterococcus sp., Microbacterium sp., Brachybacterium sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., y Alcaligenes sp. Donde sólo los tres últimos, han sido asociados a cianuro.

• El análisis de la diversidad a través del TTGE, reveló mayor diversidad en la planta artesanal y diferencias entre el patrón de bandeo de las dos plantas, industrial y artesanal. Se encontraron géneros antes reportados en lugares contaminados con cianuro, que no se hallaron por el análisis de la fracción cultivable.

• El estudio de diversidad usando los métodos cultivo dependiente e independiente, fue apropiado, ya que hubo complementariedad, para determinar las comunidades dominantes presentes en lugares contaminados con cianuro.

• Para los ensayos preliminares usando 200 ppm de cianuro en el medio, determinó que el aislado con mejor desempeño fue el A7R2A9 identificado como Rhodococcus corynebacterioides, degradando hasta el 53% de cianuro en el medio LB.

• Por otro lado, en los ensayos usando los trece aislados en tres concentraciones de cianuro (200, 500 y 1000 ppm) en medio mínimo M9, el aislado que mejor desempeño tuvo degradando hasta el 40% de cianuro inicial en el medio a 200 ppm, fue el A8R2A16 identificado como Microbacterium oxydans. Sin embargo hubo otros como Tessaracoccus oleagri,



Rhodococcus corynebacterioides y el control positivo, P. fluorescens, que mostraron buen desempeño y rápida adaptación los medios de cultivo con cianuro.

• Según la test T, la concentración donde mayores porcentajes de degradación fueron observados fue 200 ppm. Y se evidencia de forma general, que a mayor concentración de cianuro en el medio la eficiencia de los ensayos disminuye.

• Los cultivos mixtos usando tres concentraciones de cianuro (200, 500 y 1000 ppm) en medio mínimo M9, determinaron que hay un antagonismo entre los aislados usados, inhibiendo la degradación de cianuro, posiblemente por varios factores como producción de metabolitos antimicrobianos y formación de ácido en el medio.

• Este estudio provee información sobre los distintos beneficios que el proceso de degradación biológica podría aportar, como una alternativa a los métodos convencionales usados a escala industrial, tales como: i) No hay adición de productos químicos tóxicos, ni costosos; ii) no hay requeriento adicional de pH, ya que los microorganismos trabajan a las condiciones que opera una planta industrial; iii) no es necesario alterar la temperatura del proceso para emplear un tratamiento biológico, ya que en esta zona del trópico, la temperatura ambiente, favorece el proceso de degradación por parte de los microorganismos.

3.2 Recomendaciones

• Como recomendación para futuros estudios se sugiere cambiar algunas condiciones de los

medios de cultivo, como fuente de carbono, fuente de nitrógeno adicional además del cianuro, evaluar inductores enzimáticos como cofactores metálicos para disminuir la fase lag, evaluar la proporción entre C:N, entre otros, que puedan favorecer el crecimiento bacteriano (bioestimular) y aumentar la degradación de cianuro.

• Para favorecer la degradación de cianuro, podría evaluarse la adaptación de los inóculos antes de aumentar la concentración de cianuro, es decir, tomar los microorganismos, al final de un ensayo de degradación y usarlo como inóculo para una concentración mayor de cianuro.

• En cuanto a los cultivos mixtos, se sugiere evaluar diferentes aislados para detectar relaciones sinérgicas entre algunos de ellos.

• Un análisis de metabolómica podría dilucidar metabolitos involucrados en los ensayos de degradación de los cultivos mixtos y de esta forma dar entendimiento a este tipo de cultivos.

• Además de lo anterior, sería ideal estudiar la cinética de degradación de los aislados en detalle, haciendo un modelo de consumo de los sustratos principales (fuente de carbono y nitrógeno), para evidenciar de forma más clara, si la fuente de carbono actúa como sustrato limitante.

• Para tratar los residuos contaminados con cianuro, es necesario caracterizar cuantitativamente los efluentes y destinar lugares seguros para el tratamiento que se les aplique; esto no ocurría en la planta artesanal ya que había descargas de residuos cianurados al ambiente, causando daños ambientales importantes, que ya están bien caracterizados en esta zona.

55



A. Anexo: Sitios de muestreo

A-1. Diagrama de flujo de la planta industrial, las muestras M1 y M2 tomadas del espesador 30’ Nº3,

M3 tomada del espesador 24`Nº4 y M4 tomada del espesador 24’ Nº6.

M2

M1

M3

58 Estudio de la diversidad microbiana en efluentes de una planta de beneficio de oro y evaluación de su posible actividad degradadora de cianuro

A-2. Diagrama de flujo del proceso de la planta artesanal. A5 es sólido al borde del tanque de

espesado, A6 es la cachaza semisólida del tanque de espesado, A7 corresponden a arenas del

sedimento de decantación, A8 es un lixiviado del tanque de cianuración, A9 es un efluente

contaminado con cianuro a la salida del proceso y A10 es un efluente contaminado con cianuro a un

metro aproximadamente de la muestra A9.

A6

A5

A8

A7

A9 A10

B. Anexo: Aislados obtenidos con su identificación micro y macroscópica

Para la obtención de aislados se usaron 4 medios de cultivo: LB suplementado con solución cianurada (LBs), LB sin suplementar (LB), R2A suplementado o medio Líquido LB suplementado, respectivamente), para intentar recaudar mayor número de aislados de las diferentes muestras tomadas.

Nomenclatura Foto Características

M1LQA1

Irregular, borde ondulado, convexa, lisa, cremosa, blanca,

translúcida. Gram +

M3LQA5

Circular, borde entero, convexa, lisa, cremosa, amarilla,


M3LBA6

Circular, borde irregular, plana, lisa, cremosa, naranja,


A6LBA7

Irregular, borde ondulado, plana, lisa, cremosa, beige,


A7R2A8

Irregular, borde ondulado, plana, lisa, cremosa, blanca,



A7R2A9

Circular, borde entero, convexa, cremosa, naranja

oscuro, opaca. Gram +

A7LSA10

Circular, borde entero, convexa, lisa, cremosa, café,

opaca. Gram +

A7LBA14

Irregular, borde ondulado, plana, rugosa, cremosa, blanca,

opaca. Gram +

A7LQA15

Irregular borde ondulado convexa, lisa, cremosa, blanca,


A8R2A16

Circular, borde entero, convexa, lisa, cremosa, amarilla

clara, translúcida. Gram +

A9LSA18

Circular, borde ondulado, plana, lisa, cremosa, blanca,


A9LSA19

Irregular, borde ondulado, plana, lisa, cremosa, Amarilla,


A9LBA21

Irregular, borde ondulado, convexa, rugosa, membranosa,

Amarilla, opaca. Gram -

C. Anexo: Resultados análisis estadísticos Fracción Cultivable (FC) y Fracción Total (FT).

Figura C-1. Análisis NMDS de la matriz cuantitativa de la Fracción Cultivable (FC). Los puntos color

aguamarina encerrados en el circulo azul fueron las muestras del medio LBs y los puntos de color

beige fueron las muestras del medio LB sin suplementar con efluente cianurado.

Figura C-2. Análisis NMDS de la matriz cuantitativa de la Fracción Cultivable (FC) y la Fracción

Total (FT). Los cuadrados representan la Fracción Cultivable del medio LB No Suplementado

(FCNS), los triángulos representan la Fracción Cultivable del medio LB Suplementado (FCS) y los

rombos representan la Fracción total.


D. Anexo: Resultados análisis estadísticos de ensayos de degradación

Tabla D-1. Prueba ANAVA para bioensayos de degradación con los 4 aislados en medio LB con 200

ppm de cianuro.

Fuente DF Suma de

cuadrados Cuadrado de

la media F-Valor Pr > F

Modelo 4 2014.140297 503.535074 5.37 0.0470

Error 5 469.193374 93.838675

Total corregido 9 2483.333670

Tabla D-2. Test T para bioensayos de degradación con los 4 aislados en medio LB con 200 ppm de

cianuro.

Alpha 0.05

Grados de error de libertad 5

Error de cuadrado medio 93.83867

Valor crítico de t 2.57058

Diferencia menos significativa 24.901

Las comparaciones importantes del nivel 0.05 están

indicadas por ***.


TTOS

Comparación

Diferenci

a

entre

medias

Límite de

confianza al 95%

P.fluore - A9LSA19( 8.577 -16.325 33.478

P.fluore - M1LQA1(2 9.802 -15.099 34.703

P.fluore - A7LQA15( 12.253 -12.649 37.154

P.fluore - A7R2A9(2 41.604 16.703 66.505 ***

A9LSA19( - P.fluore -8.577 -33.478 16.325

A9LSA19( - M1LQA1(2 1.225 -23.676 26.127

A9LSA19( - A7LQA15( 3.676 -21.226 28.577

A9LSA19( - A7R2A9(2 33.027 8.126 57.929 ***

M1LQA1(2 - P.fluore -9.802 -34.703 15.099

M1LQA1(2 - A9LSA19( -1.225 -26.127 23.676

M1LQA1(2 - A7LQA15( 2.451 -22.451 27.352

M1LQA1(2 - A7R2A9(2 31.802 6.901 56.703 ***

A7LQA15( - P.fluore -12.253 -37.154 12.649

A7LQA15( - A9LSA19( -3.676 -28.577 21.226

A7LQA15( - M1LQA1(2 -2.451 -27.352 22.451

A7LQA15( - A7R2A9(2 29.352 4.450 54.253 ***

A7R2A9(2 - P.fluore -41.604 -66.505 -16.703 ***

A7R2A9(2 - A9LSA19( -33.027 -57.929 -8.126 ***

A7R2A9(2 - M1LQA1(2 -31.802 -56.703 -6.901 ***


indicadas por ***.

TTOS

Comparación

Diferenci

a

entre

medias

Límite de

confianza al 95%

A7R2A9(2 - A7LQA15( -29.352 -54.253 -4.450 ***

Tabla D-3. Prueba ANAVA para ensayos de degradación con los 13 aislados a 200 ppm.

Fuente DF Suma de



Modelo 13 8102.194454 623.245727 296.42 <.0001

Error 14 29.436368 2.102598


Tabla D-4. Test T para ensayos de degradación con los 13 aislados a 200 ppm. Alpha 0.05







indicadas por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias

Límite de confianza al

95%

A7LBA14( - M3LBA6(2 3.401 0.291 6.511 ***

A7LBA14( - M3LQA5(2 3.486 0.375 6.596 ***

A7LBA14( - A9LBA21( 10.302 7.192 13.412 ***

A7LBA14( - A9LSA18( 12.420 9.310 15.530 ***

A7LBA14( - A7R2A8(2 12.520 9.410 15.630 ***

A7LBA14( - A7R2A9(2 14.253 11.142 17.363 ***

A7LBA14( - A7LSA10( 17.768 14.658 20.878 ***

A7LBA14( - A9LSA19( 21.951 18.840 25.061 ***

A7LBA14( - A6LBA7(2 24.872 21.761 27.982 ***

A7LBA14( - A7LQA15( 25.535 22.425 28.645 ***

A7LBA14( - P.fluore 31.857 28.746 34.967 ***

A7LBA14( - M1LQA1(2 41.659 38.548 44.769 ***

A7LBA14( - A8R2A16( 66.828 63.718 69.938 ***

M3LBA6(2 - A7LBA14( -3.401 -6.511 -0.291 ***

M3LBA6(2 - M3LQA5(2 0.084 -3.026 3.195

M3LBA6(2 - A9LBA21( 6.901 3.791 10.011 ***

M3LBA6(2 - A9LSA18( 9.019 5.909 12.129 ***

M3LBA6(2 - A7R2A8(2 9.119 6.009 12.229 ***

M3LBA6(2 - A7R2A9(2 10.851 7.741 13.962 ***

M3LBA6(2 - A7LSA10( 14.367 11.257 17.477 ***

M3LBA6(2 - A9LSA19( 18.549 15.439 21.660 ***

M3LBA6(2 - A6LBA7(2 21.470 18.360 24.581 ***

M3LBA6(2 - A7LQA15( 22.134 19.024 25.244 ***

M3LBA6(2 - P.fluore 28.456 25.345 31.566 ***

M3LBA6(2 - M1LQA1(2 38.258 35.147 41.368 ***

M3LBA6(2 - A8R2A16( 63.427 60.317 66.537 ***

Las comparaciones importantes del nivel 0.05 están indicadas por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias


95%

M3LQA5(2 - A7LBA14( -3.486 -6.596 -0.375 ***

M3LQA5(2 - M3LBA6(2 -0.084 -3.195 3.026

M3LQA5(2 - A9LBA21( 6.816 3.706 9.927 ***

M3LQA5(2 - A9LSA18( 8.935 5.825 12.045 ***

M3LQA5(2 - A7R2A8(2 9.034 5.924 12.145 ***

M3LQA5(2 - A7R2A9(2 10.767 7.657 13.877 ***

M3LQA5(2 - A7LSA10( 14.283 11.173 17.393 ***

M3LQA5(2 - A9LSA19( 18.465 15.355 21.575 ***

M3LQA5(2 - A6LBA7(2 21.386 18.276 24.496 ***

M3LQA5(2 - A7LQA15( 22.049 18.939 25.160 ***

M3LQA5(2 - P.fluore 28.371 25.261 31.481 ***

M3LQA5(2 - M1LQA1(2 38.173 35.063 41.283 ***

M3LQA5(2 - A8R2A16( 63.343 60.233 66.453 ***

A9LBA21( - A7LBA14( -10.302 -13.412 -7.192 ***

A9LBA21( - M3LBA6(2 -6.901 -10.011 -3.791 ***

A9LBA21( - M3LQA5(2 -6.816 -9.927 -3.706 ***

A9LBA21( - A9LSA18( 2.118 -0.992 5.228

A9LBA21( - A7R2A8(2 2.218 -0.892 5.328

A9LBA21( - A7R2A9(2 3.951 0.840 7.061 ***

A9LBA21( - A7LSA10( 7.466 4.356 10.576 ***

A9LBA21( - A9LSA19( 11.649 8.538 14.759 ***

A9LBA21( - A6LBA7(2 14.570 11.459 17.680 ***

A9LBA21( - A7LQA15( 15.233 12.123 18.343 ***

A9LBA21( - P.fluore 21.555 18.444 24.665 ***

A9LBA21( - M1LQA1(2 31.357 28.246 34.467 ***

A9LBA21( - A8R2A16( 56.526 53.416 59.636 ***

A9LSA18( - A7LBA14( -12.420 -15.530 -9.310 ***



indicadas por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias


95%

A9LSA18( - M3LBA6(2 -9.019 -12.129 -5.909 ***

A9LSA18( - M3LQA5(2 -8.935 -12.045 -5.825 ***

A9LSA18( - A9LBA21( -2.118 -5.228 0.992

A9LSA18( - A7R2A8(2 0.100 -3.010 3.210

A9LSA18( - A7R2A9(2 1.832 -1.278 4.942

A9LSA18( - A7LSA10( 5.348 2.238 8.458 ***

A9LSA18( - A9LSA19( 9.530 6.420 12.640 ***

A9LSA18( - A6LBA7(2 12.451 9.341 15.561 ***

A9LSA18( - A7LQA15( 13.115 10.005 16.225 ***

A9LSA18( - P.fluore 19.436 16.326 22.546 ***

A9LSA18( - M1LQA1(2 29.238 26.128 32.348 ***

A9LSA18( - A8R2A16( 54.408 51.298 57.518 ***

A7R2A8(2 - A7LBA14( -12.520 -15.630 -9.410 ***

A7R2A8(2 - M3LBA6(2 -9.119 -12.229 -6.009 ***

A7R2A8(2 - M3LQA5(2 -9.034 -12.145 -5.924 ***

A7R2A8(2 - A9LBA21( -2.218 -5.328 0.892

A7R2A8(2 - A9LSA18( -0.100 -3.210 3.010

A7R2A8(2 - A7R2A9(2 1.733 -1.378 4.843

A7R2A8(2 - A7LSA10( 5.248 2.138 8.358 ***

A7R2A8(2 - A9LSA19( 9.431 6.320 12.541 ***

A7R2A8(2 - A6LBA7(2 12.352 9.241 15.462 ***

A7R2A8(2 - A7LQA15( 13.015 9.905 16.125 ***

A7R2A8(2 - P.fluore 19.337 16.226 22.447 ***

A7R2A8(2 - M1LQA1(2 29.139 26.028 32.249 ***

A7R2A8(2 - A8R2A16( 54.308 51.198 57.418 ***

A7R2A9(2 - A7LBA14( -14.253 -17.363 -11.142 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias


95%

A7R2A9(2 - M3LBA6(2 -10.851 -13.962 -7.741 ***

A7R2A9(2 - M3LQA5(2 -10.767 -13.877 -7.657 ***

A7R2A9(2 - A9LBA21( -3.951 -7.061 -0.840 ***

A7R2A9(2 - A9LSA18( -1.832 -4.942 1.278

A7R2A9(2 - A7R2A8(2 -1.733 -4.843 1.378

A7R2A9(2 - A7LSA10( 3.516 0.406 6.626 ***

A7R2A9(2 - A9LSA19( 7.698 4.588 10.808 ***

A7R2A9(2 - A6LBA7(2 10.619 7.509 13.729 ***

A7R2A9(2 - A7LQA15( 11.283 8.172 14.393 ***

A7R2A9(2 - P.fluore 17.604 14.494 20.714 ***

A7R2A9(2 - M1LQA1(2 27.406 24.296 30.516 ***

A7R2A9(2 - A8R2A16( 52.576 49.466 55.686 ***

A7LSA10( - A7LBA14( -17.768 -20.878 -14.658 ***

A7LSA10( - M3LBA6(2 -14.367 -17.477 -11.257 ***

A7LSA10( - M3LQA5(2 -14.283 -17.393 -11.173 ***

A7LSA10( - A9LBA21( -7.466 -10.576 -4.356 ***

A7LSA10( - A9LSA18( -5.348 -8.458 -2.238 ***

A7LSA10( - A7R2A8(2 -5.248 -8.358 -2.138 ***

A7LSA10( - A7R2A9(2 -3.516 -6.626 -0.406 ***

A7LSA10( - A9LSA19( 4.182 1.072 7.292 ***

A7LSA10( - A6LBA7(2 7.103 3.993 10.213 ***

A7LSA10( - A7LQA15( 7.767 4.657 10.877 ***

A7LSA10( - P.fluore 14.088 10.978 17.198 ***

A7LSA10( - M1LQA1(2 23.890 20.780 27.000 ***

A7LSA10( - A8R2A16( 49.060 45.950 52.170 ***

A9LSA19( - A7LBA14( -21.951 -25.061 -18.840 ***

A9LSA19( - M3LBA6(2 -18.549 -21.660 -15.439 ***



indicadas por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias


95%

A9LSA19( - M3LQA5(2 -18.465 -21.575 -15.355 ***

A9LSA19( - A9LBA21( -11.649 -14.759 -8.538 ***

A9LSA19( - A9LSA18( -9.530 -12.640 -6.420 ***

A9LSA19( - A7R2A8(2 -9.431 -12.541 -6.320 ***

A9LSA19( - A7R2A9(2 -7.698 -10.808 -4.588 ***

A9LSA19( - A7LSA10( -4.182 -7.292 -1.072 ***

A9LSA19( - A6LBA7(2 2.921 -0.189 6.031

A9LSA19( - A7LQA15( 3.584 0.474 6.695 ***

A9LSA19( - P.fluore 9.906 6.796 13.016 ***

A9LSA19( - M1LQA1(2 19.708 16.598 22.818 ***

A9LSA19( - A8R2A16( 44.878 41.768 47.988 ***

A6LBA7(2 - A7LBA14( -24.872 -27.982 -21.761 ***

A6LBA7(2 - M3LBA6(2 -21.470 -24.581 -18.360 ***

A6LBA7(2 - M3LQA5(2 -21.386 -24.496 -18.276 ***

A6LBA7(2 - A9LBA21( -14.570 -17.680 -11.459 ***

A6LBA7(2 - A9LSA18( -12.451 -15.561 -9.341 ***

A6LBA7(2 - A7R2A8(2 -12.352 -15.462 -9.241 ***

A6LBA7(2 - A7R2A9(2 -10.619 -13.729 -7.509 ***

A6LBA7(2 - A7LSA10( -7.103 -10.213 -3.993 ***

A6LBA7(2 - A9LSA19( -2.921 -6.031 0.189

A6LBA7(2 - A7LQA15( 0.663 -2.447 3.774

A6LBA7(2 - P.fluore 6.985 3.875 10.095 ***

A6LBA7(2 - M1LQA1(2 16.787 13.677 19.897 ***

A6LBA7(2 - A8R2A16( 41.957 38.847 45.067 ***

A7LQA15( - A7LBA14( -25.535 -28.645 -22.425 ***

A7LQA15( - M3LBA6(2 -22.134 -25.244 -19.024 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias


95%

A7LQA15( - M3LQA5(2 -22.049 -25.160 -18.939 ***

A7LQA15( - A9LBA21( -15.233 -18.343 -12.123 ***

A7LQA15( - A9LSA18( -13.115 -16.225 -10.005 ***

A7LQA15( - A7R2A8(2 -13.015 -16.125 -9.905 ***

A7LQA15( - A7R2A9(2 -11.283 -14.393 -8.172 ***

A7LQA15( - A7LSA10( -7.767 -10.877 -4.657 ***

A7LQA15( - A9LSA19( -3.584 -6.695 -0.474 ***

A7LQA15( - A6LBA7(2 -0.663 -3.774 2.447

A7LQA15( - P.fluore 6.322 3.211 9.432 ***

A7LQA15( - M1LQA1(2 16.124 13.013 19.234 ***

A7LQA15( - A8R2A16( 41.293 38.183 44.403 ***

P.fluore - A7LBA14( -31.857 -34.967 -28.746 ***

P.fluore - M3LBA6(2 -28.456 -31.566 -25.345 ***

P.fluore - M3LQA5(2 -28.371 -31.481 -25.261 ***

P.fluore - A9LBA21( -21.555 -24.665 -18.444 ***

P.fluore - A9LSA18( -19.436 -22.546 -16.326 ***

P.fluore - A7R2A8(2 -19.337 -22.447 -16.226 ***

P.fluore - A7R2A9(2 -17.604 -20.714 -14.494 ***

P.fluore - A7LSA10( -14.088 -17.198 -10.978 ***

P.fluore - A9LSA19( -9.906 -13.016 -6.796 ***

P.fluore - A6LBA7(2 -6.985 -10.095 -3.875 ***

P.fluore - A7LQA15( -6.322 -9.432 -3.211 ***

P.fluore - M1LQA1(2 9.802 6.692 12.912 ***

P.fluore - A8R2A16( 34.972 31.862 38.082 ***

M1LQA1(2 - A7LBA14( -41.659 -44.769 -38.548 ***

M1LQA1(2 - M3LBA6(2 -38.258 -41.368 -35.147 ***

M1LQA1(2 - M3LQA5(2 -38.173 -41.283 -35.063 ***



indicadas por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias


95%

M1LQA1(2 - A9LBA21( -31.357 -34.467 -28.246 ***

M1LQA1(2 - A9LSA18( -29.238 -32.348 -26.128 ***

M1LQA1(2 - A7R2A8(2 -29.139 -32.249 -26.028 ***

M1LQA1(2 - A7R2A9(2 -27.406 -30.516 -24.296 ***

M1LQA1(2 - A7LSA10( -23.890 -27.000 -20.780 ***

M1LQA1(2 - A9LSA19( -19.708 -22.818 -16.598 ***

M1LQA1(2 - A6LBA7(2 -16.787 -19.897 -13.677 ***

M1LQA1(2 - A7LQA15( -16.124 -19.234 -13.013 ***

M1LQA1(2 - P.fluore -9.802 -12.912 -6.692 ***

M1LQA1(2 - A8R2A16( 25.170 22.060 28.280 ***

A8R2A16( - A7LBA14( -66.828 -69.938 -63.718 ***

A8R2A16( - M3LBA6(2 -63.427 -66.537 -60.317 ***

A8R2A16( - M3LQA5(2 -63.343 -66.453 -60.233 ***

A8R2A16( - A9LBA21( -56.526 -59.636 -53.416 ***

A8R2A16( - A9LSA18( -54.408 -57.518 -51.298 ***

A8R2A16( - A7R2A8(2 -54.308 -57.418 -51.198 ***

A8R2A16( - A7R2A9(2 -52.576 -55.686 -49.466 ***

A8R2A16( - A7LSA10( -49.060 -52.170 -45.950 ***

A8R2A16( - A9LSA19( -44.878 -47.988 -41.768 ***

A8R2A16( - A6LBA7(2 -41.957 -45.067 -38.847 ***

A8R2A16( - A7LQA15( -41.293 -44.403 -38.183 ***

A8R2A16( - P.fluore -34.972 -38.082 -31.862 ***

A8R2A16( - M1LQA1(2 -25.170 -28.280 -22.060 ***


Fuente DF Suma de



Modelo 13 28466.46930 2189.72841 978.04 <.0001

Error 14 31.34450 2.23889


Tabla D-6. Test T para ensayos de degradación con los 13 aislados a 500 ppm. Alpha 0.05






TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A7R2A8(5 - A6LBA7(5 2.671 -0.538 5.880

A7R2A8(5 - A7R2A9(5 9.462 6.253 12.671 ***

A7R2A8(5 - M1LQA1(5 11.973 8.764 15.182 ***

A7R2A8(5 - A9LBA21( 15.423 12.214 18.633 ***

A7R2A8(5 - A7LBA14( 16.649 13.439 19.858 ***

A7R2A8(5 - A7LSA10( 17.130 13.921 20.339 ***

A7R2A8(5 - M3LBA6(5 19.595 16.386 22.804 ***

A7R2A8(5 - M3LQA5(5 20.345 17.136 23.554 ***

A7R2A8(5 - A7LQA15( 26.106 22.897 29.315 ***

A7R2A8(5 - A9LSA19( 41.432 38.223 44.641 ***

A7R2A8(5 - A9LSA18( 45.035 41.826 48.244 ***

A7R2A8(5 - P.fluore 100.771 97.562 103.981 ***

A7R2A8(5 - A8R2A16( 105.576 102.367 108.786 ***


Las comparaciones importantes del nivel 0.05 están indicadas

por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A6LBA7(5 - A7R2A8(5 -2.671 -5.880 0.538

A6LBA7(5 - A7R2A9(5 6.791 3.582 10.000 ***

A6LBA7(5 - M1LQA1(5 9.302 6.093 12.511 ***

A6LBA7(5 - A9LBA21( 12.753 9.543 15.962 ***

A6LBA7(5 - A7LBA14( 13.978 10.769 17.187 ***

A6LBA7(5 - A7LSA10( 14.459 11.250 17.668 ***

A6LBA7(5 - M3LBA6(5 16.924 13.715 20.133 ***

A6LBA7(5 - M3LQA5(5 17.674 14.465 20.884 ***

A6LBA7(5 - A7LQA15( 23.435 20.226 26.644 ***

A6LBA7(5 - A9LSA19( 38.761 35.552 41.970 ***

A6LBA7(5 - A9LSA18( 42.364 39.155 45.574 ***

A6LBA7(5 - P.fluore 98.100 94.891 101.310 ***

A6LBA7(5 - A8R2A16( 102.906 99.696 106.115 ***

A7R2A9(5 - A7R2A8(5 -9.462 -12.671 -6.253 ***

A7R2A9(5 - A6LBA7(5 -6.791 -10.000 -3.582 ***

A7R2A9(5 - M1LQA1(5 2.511 -0.698 5.720

A7R2A9(5 - A9LBA21( 5.961 2.752 9.170 ***

A7R2A9(5 - A7LBA14( 7.186 3.977 10.396 ***

A7R2A9(5 - A7LSA10( 7.668 4.458 10.877 ***

A7R2A9(5 - M3LBA6(5 10.133 6.924 13.342 ***

A7R2A9(5 - M3LQA5(5 10.883 7.674 14.092 ***

A7R2A9(5 - A7LQA15( 16.644 13.435 19.853 ***

A7R2A9(5 - A9LSA19( 31.970 28.761 35.179 ***

A7R2A9(5 - A9LSA18( 35.573 32.364 38.782 ***

A7R2A9(5 - P.fluore 91.309 88.100 94.518 ***

A7R2A9(5 - A8R2A16( 96.114 92.905 99.323 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

M1LQA1(5 - A7R2A8(5 -11.973 -15.182 -8.764 ***

M1LQA1(5 - A6LBA7(5 -9.302 -12.511 -6.093 ***

M1LQA1(5 - A7R2A9(5 -2.511 -5.720 0.698

M1LQA1(5 - A9LBA21( 3.451 0.241 6.660 ***

M1LQA1(5 - A7LBA14( 4.676 1.467 7.885 ***

M1LQA1(5 - A7LSA10( 5.157 1.948 8.366 ***

M1LQA1(5 - M3LBA6(5 7.622 4.413 10.831 ***

M1LQA1(5 - M3LQA5(5 8.372 5.163 11.582 ***

M1LQA1(5 - A7LQA15( 14.133 10.924 17.342 ***

M1LQA1(5 - A9LSA19( 29.459 26.250 32.668 ***

M1LQA1(5 - A9LSA18( 33.062 29.853 36.272 ***

M1LQA1(5 - P.fluore 88.799 85.589 92.008 ***

M1LQA1(5 - A8R2A16( 93.604 90.394 96.813 ***

A9LBA21( - A7R2A8(5 -15.423 -18.633 -12.214 ***

A9LBA21( - A6LBA7(5 -12.753 -15.962 -9.543 ***

A9LBA21( - A7R2A9(5 -5.961 -9.170 -2.752 ***

A9LBA21( - M1LQA1(5 -3.451 -6.660 -0.241 ***

A9LBA21( - A7LBA14( 1.225 -1.984 4.434

A9LBA21( - A7LSA10( 1.706 -1.503 4.916

A9LBA21( - M3LBA6(5 4.172 0.962 7.381 ***

A9LBA21( - M3LQA5(5 4.922 1.713 8.131 ***

A9LBA21( - A7LQA15( 10.683 7.473 13.892 ***

A9LBA21( - A9LSA19( 26.009 22.800 29.218 ***

A9LBA21( - A9LSA18( 29.612 26.403 32.821 ***

A9LBA21( - P.fluore 85.348 82.139 88.557 ***

A9LBA21( - A8R2A16( 90.153 86.944 93.362 ***

A7LBA14( - A7R2A8(5 -16.649 -19.858 -13.439 ***



por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A7LBA14( - A6LBA7(5 -13.978 -17.187 -10.769 ***

A7LBA14( - A7R2A9(5 -7.186 -10.396 -3.977 ***

A7LBA14( - M1LQA1(5 -4.676 -7.885 -1.467 ***

A7LBA14( - A9LBA21( -1.225 -4.434 1.984

A7LBA14( - A7LSA10( 0.481 -2.728 3.690

A7LBA14( - M3LBA6(5 2.946 -0.263 6.156

A7LBA14( - M3LQA5(5 3.697 0.487 6.906 ***

A7LBA14( - A7LQA15( 9.457 6.248 12.667 ***

A7LBA14( - A9LSA19( 24.784 21.574 27.993 ***

A7LBA14( - A9LSA18( 28.387 25.177 31.596 ***

A7LBA14( - P.fluore 84.123 80.914 87.332 ***

A7LBA14( - A8R2A16( 88.928 85.719 92.137 ***

A7LSA10( - A7R2A8(5 -17.130 -20.339 -13.921 ***

A7LSA10( - A6LBA7(5 -14.459 -17.668 -11.250 ***

A7LSA10( - A7R2A9(5 -7.668 -10.877 -4.458 ***

A7LSA10( - M1LQA1(5 -5.157 -8.366 -1.948 ***

A7LSA10( - A9LBA21( -1.706 -4.916 1.503

A7LSA10( - A7LBA14( -0.481 -3.690 2.728

A7LSA10( - M3LBA6(5 2.465 -0.744 5.674

A7LSA10( - M3LQA5(5 3.216 0.006 6.425 ***

A7LSA10( - A7LQA15( 8.976 5.767 12.185 ***

A7LSA10( - A9LSA19( 24.302 21.093 27.512 ***

A7LSA10( - A9LSA18( 27.905 24.696 31.115 ***

A7LSA10( - P.fluore 83.642 80.432 86.851 ***

A7LSA10( - A8R2A16( 88.447 85.237 91.656 ***

M3LBA6(5 - A7R2A8(5 -19.595 -22.804 -16.386 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

M3LBA6(5 - A6LBA7(5 -16.924 -20.133 -13.715 ***

M3LBA6(5 - A7R2A9(5 -10.133 -13.342 -6.924 ***

M3LBA6(5 - M1LQA1(5 -7.622 -10.831 -4.413 ***

M3LBA6(5 - A9LBA21( -4.172 -7.381 -0.962 ***

M3LBA6(5 - A7LBA14( -2.946 -6.156 0.263

M3LBA6(5 - A7LSA10( -2.465 -5.674 0.744

M3LBA6(5 - M3LQA5(5 0.750 -2.459 3.959

M3LBA6(5 - A7LQA15( 6.511 3.302 9.720 ***

M3LBA6(5 - A9LSA19( 21.837 18.628 25.046 ***

M3LBA6(5 - A9LSA18( 25.440 22.231 28.649 ***

M3LBA6(5 - P.fluore 81.176 77.967 84.386 ***

M3LBA6(5 - A8R2A16( 85.981 82.772 89.191 ***

M3LQA5(5 - A7R2A8(5 -20.345 -23.554 -17.136 ***

M3LQA5(5 - A6LBA7(5 -17.674 -20.884 -14.465 ***

M3LQA5(5 - A7R2A9(5 -10.883 -14.092 -7.674 ***

M3LQA5(5 - M1LQA1(5 -8.372 -11.582 -5.163 ***

M3LQA5(5 - A9LBA21( -4.922 -8.131 -1.713 ***

M3LQA5(5 - A7LBA14( -3.697 -6.906 -0.487 ***

M3LQA5(5 - A7LSA10( -3.216 -6.425 -0.006 ***

M3LQA5(5 - M3LBA6(5 -0.750 -3.959 2.459

M3LQA5(5 - A7LQA15( 5.761 2.552 8.970 ***

M3LQA5(5 - A9LSA19( 21.087 17.878 24.296 ***

M3LQA5(5 - A9LSA18( 24.690 21.481 27.899 ***

M3LQA5(5 - P.fluore 80.426 77.217 83.635 ***

M3LQA5(5 - A8R2A16( 85.231 82.022 88.440 ***

A7LQA15( - A7R2A8(5 -26.106 -29.315 -22.897 ***

A7LQA15( - A6LBA7(5 -23.435 -26.644 -20.226 ***



por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A7LQA15( - A7R2A9(5 -16.644 -19.853 -13.435 ***

A7LQA15( - M1LQA1(5 -14.133 -17.342 -10.924 ***

A7LQA15( - A9LBA21( -10.683 -13.892 -7.473 ***

A7LQA15( - A7LBA14( -9.457 -12.667 -6.248 ***

A7LQA15( - A7LSA10( -8.976 -12.185 -5.767 ***

A7LQA15( - M3LBA6(5 -6.511 -9.720 -3.302 ***

A7LQA15( - M3LQA5(5 -5.761 -8.970 -2.552 ***

A7LQA15( - A9LSA19( 15.326 12.117 18.535 ***

A7LQA15( - A9LSA18( 18.929 15.720 22.138 ***

A7LQA15( - P.fluore 74.665 71.456 77.875 ***

A7LQA15( - A8R2A16( 79.470 76.261 82.680 ***

A9LSA19( - A7R2A8(5 -41.432 -44.641 -38.223 ***

A9LSA19( - A6LBA7(5 -38.761 -41.970 -35.552 ***

A9LSA19( - A7R2A9(5 -31.970 -35.179 -28.761 ***

A9LSA19( - M1LQA1(5 -29.459 -32.668 -26.250 ***

A9LSA19( - A9LBA21( -26.009 -29.218 -22.800 ***

A9LSA19( - A7LBA14( -24.784 -27.993 -21.574 ***

A9LSA19( - A7LSA10( -24.302 -27.512 -21.093 ***

A9LSA19( - M3LBA6(5 -21.837 -25.046 -18.628 ***

A9LSA19( - M3LQA5(5 -21.087 -24.296 -17.878 ***

A9LSA19( - A7LQA15( -15.326 -18.535 -12.117 ***

A9LSA19( - A9LSA18( 3.603 0.394 6.812 ***

A9LSA19( - P.fluore 59.339 56.130 62.548 ***

A9LSA19( - A8R2A16( 64.144 60.935 67.353 ***

A9LSA18( - A7R2A8(5 -45.035 -48.244 -41.826 ***

A9LSA18( - A6LBA7(5 -42.364 -45.574 -39.155 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A9LSA18( - A7R2A9(5 -35.573 -38.782 -32.364 ***

A9LSA18( - M1LQA1(5 -33.062 -36.272 -29.853 ***

A9LSA18( - A9LBA21( -29.612 -32.821 -26.403 ***

A9LSA18( - A7LBA14( -28.387 -31.596 -25.177 ***

A9LSA18( - A7LSA10( -27.905 -31.115 -24.696 ***

A9LSA18( - M3LBA6(5 -25.440 -28.649 -22.231 ***

A9LSA18( - M3LQA5(5 -24.690 -27.899 -21.481 ***

A9LSA18( - A7LQA15( -18.929 -22.138 -15.720 ***

A9LSA18( - A9LSA19( -3.603 -6.812 -0.394 ***

A9LSA18( - P.fluore 55.736 52.527 58.945 ***

A9LSA18( - A8R2A16( 60.541 57.332 63.750 ***

P.fluore - A7R2A8(5 -100.771 -103.981 -97.562 ***

P.fluore - A6LBA7(5 -98.100 -101.310 -94.891 ***

P.fluore - A7R2A9(5 -91.309 -94.518 -88.100 ***

P.fluore - M1LQA1(5 -88.799 -92.008 -85.589 ***

P.fluore - A9LBA21( -85.348 -88.557 -82.139 ***

P.fluore - A7LBA14( -84.123 -87.332 -80.914 ***

P.fluore - A7LSA10( -83.642 -86.851 -80.432 ***

P.fluore - M3LBA6(5 -81.176 -84.386 -77.967 ***

P.fluore - M3LQA5(5 -80.426 -83.635 -77.217 ***

P.fluore - A7LQA15( -74.665 -77.875 -71.456 ***

P.fluore - A9LSA19( -59.339 -62.548 -56.130 ***

P.fluore - A9LSA18( -55.736 -58.945 -52.527 ***

P.fluore - A8R2A16( 4.805 1.596 8.014 ***

A8R2A16( - A7R2A8(5 -105.576 -108.786 -102.367 ***

A8R2A16( - A6LBA7(5 -102.906 -106.115 -99.696 ***

A8R2A16( - A7R2A9(5 -96.114 -99.323 -92.905 ***



por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A8R2A16( - M1LQA1(5 -93.604 -96.813 -90.394 ***

A8R2A16( - A9LBA21( -90.153 -93.362 -86.944 ***

A8R2A16( - A7LBA14( -88.928 -92.137 -85.719 ***

A8R2A16( - A7LSA10( -88.447 -91.656 -85.237 ***

A8R2A16( - M3LBA6(5 -85.981 -89.191 -82.772 ***

A8R2A16( - M3LQA5(5 -85.231 -88.440 -82.022 ***

A8R2A16( - A7LQA15( -79.470 -82.680 -76.261 ***

A8R2A16( - A9LSA19( -64.144 -67.353 -60.935 ***

A8R2A16( - A9LSA18( -60.541 -63.750 -57.332 ***

A8R2A16( - P.fluore -4.805 -8.014 -1.596 ***


Fuente DF Suma de



Modelo 13 68969.94762 5305.38059 60.56 <.0001

Error 14 1226.41371 87.60098


Tabla D-8. Test T para ensayos de degradación con los 13 aislados a 1000 ppm.

Alpha 0.05






TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A6LBA7(1 - A7R2A8(1 15.112 -4.962 35.187

A6LBA7(1 - A7LBA14( 19.514 -0.561 39.588

A6LBA7(1 - M1LQA1(1 20.514 0.439 40.588 ***

A6LBA7(1 - M3LQA5(1 24.716 4.642 44.790 ***

A6LBA7(1 - A7LSA10( 35.608 15.534 55.683 ***

A6LBA7(1 - A9LBA21( 44.370 24.295 64.444 ***

A6LBA7(1 - M3LBA6(1 53.461 33.386 73.535 ***

A6LBA7(1 - A9LSA18( 73.924 53.850 93.999 ***

A6LBA7(1 - A7LQA15( 79.010 58.936 99.085 ***

A6LBA7(1 - A9LSA19( 113.317 93.242 133.391 ***

A6LBA7(1 - A7R2A9(1 117.534 97.459 137.608 ***

A6LBA7(1 - A8R2A16( 126.843 106.769 146.917 ***

A6LBA7(1 - P.fluore 172.222 152.148 192.297 ***

A7R2A8(1 - A6LBA7(1 -15.112 -35.187 4.962

A7R2A8(1 - A7LBA14( 4.401 -15.673 24.475

A7R2A8(1 - M1LQA1(1 5.401 -14.673 25.475

A7R2A8(1 - M3LQA5(1 9.604 -10.471 29.678

A7R2A8(1 - A7LSA10( 20.496 0.422 40.570 ***

A7R2A8(1 - A9LBA21( 29.257 9.183 49.331 ***

A7R2A8(1 - M3LBA6(1 38.348 18.274 58.422 ***

A7R2A8(1 - A9LSA18( 58.812 38.738 78.886 ***

A7R2A8(1 - A7LQA15( 63.898 43.824 83.972 ***

A7R2A8(1 - A9LSA19( 98.204 78.130 118.278 ***

A7R2A8(1 - A7R2A9(1 102.421 82.347 122.495 ***

A7R2A8(1 - A8R2A16( 111.731 91.656 131.805 ***

A7R2A8(1 - P.fluore 157.110 137.036 177.184 ***

A7LBA14( - A6LBA7(1 -19.514 -39.588 0.561



por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A7LBA14( - A7R2A8(1 -4.401 -24.475 15.673

A7LBA14( - M1LQA1(1 1.000 -19.074 21.074

A7LBA14( - M3LQA5(1 5.202 -14.872 25.277

A7LBA14( - A7LSA10( 16.095 -3.979 36.169

A7LBA14( - A9LBA21( 24.856 4.782 44.930 ***

A7LBA14( - M3LBA6(1 33.947 13.873 54.021 ***

A7LBA14( - A9LSA18( 54.411 34.337 74.485 ***

A7LBA14( - A7LQA15( 59.497 39.423 79.571 ***

A7LBA14( - A9LSA19( 93.803 73.729 113.877 ***

A7LBA14( - A7R2A9(1 98.020 77.946 118.094 ***

A7LBA14( - A8R2A16( 107.329 87.255 127.404 ***

A7LBA14( - P.fluore 152.709 132.635 172.783 ***

M1LQA1(1 - A6LBA7(1 -20.514 -40.588 -0.439 ***

M1LQA1(1 - A7R2A8(1 -5.401 -25.475 14.673

M1LQA1(1 - A7LBA14( -1.000 -21.074 19.074

M1LQA1(1 - M3LQA5(1 4.202 -15.872 24.277

M1LQA1(1 - A7LSA10( 15.095 -4.979 35.169

M1LQA1(1 - A9LBA21( 23.856 3.782 43.930 ***

M1LQA1(1 - M3LBA6(1 32.947 12.873 53.021 ***

M1LQA1(1 - A9LSA18( 53.411 33.337 73.485 ***

M1LQA1(1 - A7LQA15( 58.497 38.423 78.571 ***

M1LQA1(1 - A9LSA19( 92.803 72.729 112.877 ***

M1LQA1(1 - A7R2A9(1 97.020 76.946 117.094 ***

M1LQA1(1 - A8R2A16( 106.329 86.255 126.404 ***

M1LQA1(1 - P.fluore 151.709 131.635 171.783 ***

M3LQA5(1 - A6LBA7(1 -24.716 -44.790 -4.642 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

M3LQA5(1 - A7R2A8(1 -9.604 -29.678 10.471

M3LQA5(1 - A7LBA14( -5.202 -25.277 14.872

M3LQA5(1 - M1LQA1(1 -4.202 -24.277 15.872

M3LQA5(1 - A7LSA10( 10.892 -9.182 30.967

M3LQA5(1 - A9LBA21( 19.654 -0.421 39.728

M3LQA5(1 - M3LBA6(1 28.745 8.670 48.819 ***

M3LQA5(1 - A9LSA18( 49.208 29.134 69.283 ***

M3LQA5(1 - A7LQA15( 54.294 34.220 74.369 ***

M3LQA5(1 - A9LSA19( 88.601 68.526 108.675 ***

M3LQA5(1 - A7R2A9(1 92.818 72.743 112.892 ***

M3LQA5(1 - A8R2A16( 102.127 82.053 122.201 ***

M3LQA5(1 - P.fluore 147.506 127.432 167.581 ***

A7LSA10( - A6LBA7(1 -35.608 -55.683 -15.534 ***

A7LSA10( - A7R2A8(1 -20.496 -40.570 -0.422 ***

A7LSA10( - A7LBA14( -16.095 -36.169 3.979

A7LSA10( - M1LQA1(1 -15.095 -35.169 4.979

A7LSA10( - M3LQA5(1 -10.892 -30.967 9.182

A7LSA10( - A9LBA21( 8.761 -11.313 28.835

A7LSA10( - M3LBA6(1 17.852 -2.222 37.926

A7LSA10( - A9LSA18( 38.316 18.242 58.390 ***

A7LSA10( - A7LQA15( 43.402 23.328 63.476 ***

A7LSA10( - A9LSA19( 77.708 57.634 97.782 ***

A7LSA10( - A7R2A9(1 81.925 61.851 101.999 ***

A7LSA10( - A8R2A16( 91.235 71.160 111.309 ***

A7LSA10( - P.fluore 136.614 116.540 156.688 ***

A9LBA21( - A6LBA7(1 -44.370 -64.444 -24.295 ***

A9LBA21( - A7R2A8(1 -29.257 -49.331 -9.183 ***



por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A9LBA21( - A7LBA14( -24.856 -44.930 -4.782 ***

A9LBA21( - M1LQA1(1 -23.856 -43.930 -3.782 ***

A9LBA21( - M3LQA5(1 -19.654 -39.728 0.421

A9LBA21( - A7LSA10( -8.761 -28.835 11.313

A9LBA21( - M3LBA6(1 9.091 -10.983 29.165

A9LBA21( - A9LSA18( 29.555 9.481 49.629 ***

A9LBA21( - A7LQA15( 34.641 14.567 54.715 ***

A9LBA21( - A9LSA19( 68.947 48.873 89.021 ***

A9LBA21( - A7R2A9(1 73.164 53.090 93.238 ***

A9LBA21( - A8R2A16( 82.473 62.399 102.548 ***

A9LBA21( - P.fluore 127.853 107.779 147.927 ***

M3LBA6(1 - A6LBA7(1 -53.461 -73.535 -33.386 ***

M3LBA6(1 - A7R2A8(1 -38.348 -58.422 -18.274 ***

M3LBA6(1 - A7LBA14( -33.947 -54.021 -13.873 ***

M3LBA6(1 - M1LQA1(1 -32.947 -53.021 -12.873 ***

M3LBA6(1 - M3LQA5(1 -28.745 -48.819 -8.670 ***

M3LBA6(1 - A7LSA10( -17.852 -37.926 2.222

M3LBA6(1 - A9LBA21( -9.091 -29.165 10.983

M3LBA6(1 - A9LSA18( 20.464 0.390 40.538 ***

M3LBA6(1 - A7LQA15( 25.550 5.476 45.624 ***

M3LBA6(1 - A9LSA19( 59.856 39.782 79.930 ***

M3LBA6(1 - A7R2A9(1 64.073 43.999 84.147 ***

M3LBA6(1 - A8R2A16( 73.382 53.308 93.457 ***

M3LBA6(1 - P.fluore 118.762 98.688 138.836 ***

A9LSA18( - A6LBA7(1 -73.924 -93.999 -53.850 ***

A9LSA18( - A7R2A8(1 -58.812 -78.886 -38.738 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A9LSA18( - A7LBA14( -54.411 -74.485 -34.337 ***

A9LSA18( - M1LQA1(1 -53.411 -73.485 -33.337 ***

A9LSA18( - M3LQA5(1 -49.208 -69.283 -29.134 ***

A9LSA18( - A7LSA10( -38.316 -58.390 -18.242 ***

A9LSA18( - A9LBA21( -29.555 -49.629 -9.481 ***

A9LSA18( - M3LBA6(1 -20.464 -40.538 -0.390 ***

A9LSA18( - A7LQA15( 5.086 -14.988 25.160

A9LSA18( - A9LSA19( 39.392 19.318 59.466 ***

A9LSA18( - A7R2A9(1 43.609 23.535 63.683 ***

A9LSA18( - A8R2A16( 52.919 32.844 72.993 ***

A9LSA18( - P.fluore 98.298 78.224 118.372 ***

A7LQA15( - A6LBA7(1 -79.010 -99.085 -58.936 ***

A7LQA15( - A7R2A8(1 -63.898 -83.972 -43.824 ***

A7LQA15( - A7LBA14( -59.497 -79.571 -39.423 ***

A7LQA15( - M1LQA1(1 -58.497 -78.571 -38.423 ***

A7LQA15( - M3LQA5(1 -54.294 -74.369 -34.220 ***

A7LQA15( - A7LSA10( -43.402 -63.476 -23.328 ***

A7LQA15( - A9LBA21( -34.641 -54.715 -14.567 ***

A7LQA15( - M3LBA6(1 -25.550 -45.624 -5.476 ***

A7LQA15( - A9LSA18( -5.086 -25.160 14.988

A7LQA15( - A9LSA19( 34.306 14.232 54.380 ***

A7LQA15( - A7R2A9(1 38.523 18.449 58.597 ***

A7LQA15( - A8R2A16( 47.832 27.758 67.907 ***

A7LQA15( - P.fluore 93.212 73.138 113.286 ***

A9LSA19( - A6LBA7(1 -113.317 -133.391 -93.242 ***

A9LSA19( - A7R2A8(1 -98.204 -118.278 -78.130 ***

A9LSA19( - A7LBA14( -93.803 -113.877 -73.729 ***



por ***.

TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A9LSA19( - M1LQA1(1 -92.803 -112.877 -72.729 ***

A9LSA19( - M3LQA5(1 -88.601 -108.675 -68.526 ***

A9LSA19( - A7LSA10( -77.708 -97.782 -57.634 ***

A9LSA19( - A9LBA21( -68.947 -89.021 -48.873 ***

A9LSA19( - M3LBA6(1 -59.856 -79.930 -39.782 ***

A9LSA19( - A9LSA18( -39.392 -59.466 -19.318 ***

A9LSA19( - A7LQA15( -34.306 -54.380 -14.232 ***

A9LSA19( - A7R2A9(1 4.217 -15.857 24.291

A9LSA19( - A8R2A16( 13.526 -6.548 33.601

A9LSA19( - P.fluore 58.906 38.832 78.980 ***

A7R2A9(1 - A6LBA7(1 -117.534 -137.608 -97.459 ***

A7R2A9(1 - A7R2A8(1 -102.421 -122.495 -82.347 ***

A7R2A9(1 - A7LBA14( -98.020 -118.094 -77.946 ***

A7R2A9(1 - M1LQA1(1 -97.020 -117.094 -76.946 ***

A7R2A9(1 - M3LQA5(1 -92.818 -112.892 -72.743 ***

A7R2A9(1 - A7LSA10( -81.925 -101.999 -61.851 ***

A7R2A9(1 - A9LBA21( -73.164 -93.238 -53.090 ***

A7R2A9(1 - M3LBA6(1 -64.073 -84.147 -43.999 ***

A7R2A9(1 - A9LSA18( -43.609 -63.683 -23.535 ***

A7R2A9(1 - A7LQA15( -38.523 -58.597 -18.449 ***

A7R2A9(1 - A9LSA19( -4.217 -24.291 15.857

A7R2A9(1 - A8R2A16( 9.309 -10.765 29.384

A7R2A9(1 - P.fluore 54.689 34.615 74.763 ***

A8R2A16( - A6LBA7(1 -126.843 -146.917 -106.769 ***

A8R2A16( - A7R2A8(1 -111.731 -131.805 -91.656 ***

A8R2A16( - A7LBA14( -107.329 -127.404 -87.255 ***


TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

A8R2A16( - M1LQA1(1 -106.329 -126.404 -86.255 ***

A8R2A16( - M3LQA5(1 -102.127 -122.201 -82.053 ***

A8R2A16( - A7LSA10( -91.235 -111.309 -71.160 ***

A8R2A16( - A9LBA21( -82.473 -102.548 -62.399 ***

A8R2A16( - M3LBA6(1 -73.382 -93.457 -53.308 ***

A8R2A16( - A9LSA18( -52.919 -72.993 -32.844 ***

A8R2A16( - A7LQA15( -47.832 -67.907 -27.758 ***

A8R2A16( - A9LSA19( -13.526 -33.601 6.548

A8R2A16( - A7R2A9(1 -9.309 -29.384 10.765

A8R2A16( - P.fluore 45.380 25.305 65.454 ***

P.fluore - A6LBA7(1 -172.222 -192.297 -152.148 ***

P.fluore - A7R2A8(1 -157.110 -177.184 -137.036 ***

P.fluore - A7LBA14( -152.709 -172.783 -132.635 ***

P.fluore - M1LQA1(1 -151.709 -171.783 -131.635 ***

P.fluore - M3LQA5(1 -147.506 -167.581 -127.432 ***

P.fluore - A7LSA10( -136.614 -156.688 -116.540 ***

P.fluore - A9LBA21( -127.853 -147.927 -107.779 ***

P.fluore - M3LBA6(1 -118.762 -138.836 -98.688 ***

P.fluore - A9LSA18( -98.298 -118.372 -78.224 ***

P.fluore - A7LQA15( -93.212 -113.286 -73.138 ***

P.fluore - A9LSA19( -58.906 -78.980 -38.832 ***

P.fluore - A7R2A9(1 -54.689 -74.763 -34.615 ***

P.fluore - A8R2A16( -45.380 -65.454 -25.305 ***

Tabla D-9. Prueba ANAVA para ensayos de degradación con cultivos mixtos.


Fuente DF Suma de



Modelo 2 536796.5144 268398.2572 268177 <.0001

Error 3 3.0025 1.0008


Tabla D-10. Test T para ensayos de degradación con cultivos mixtos.

Alpha 0.05






TTOS Comparación

Diferencia entre

medias Límite de

confianza al 95%

Mixto100 - Mixto500 452.117 448.933 455.301 ***

Mixto100 - Mixto200 725.348 722.164 728.532 ***

Mixto500 - Mixto100 -452.117 -455.301 -448.933 ***

Mixto500 - Mixto200 273.231 270.047 276.415 ***

Mixto200 - Mixto100 -725.348 -728.532 -722.164 ***

Mixto200 - Mixto500 -273.231 -276.415 -270.047 ***

Tabla D-11. Prueba ANAVA para ensayos de degradación con aislados en todas las concentraciones

usadas (200, 500 y 1000 ppm de cianuro).

Fuente DF Suma de



Modelo 25 3346563.789 133862.552 1.96 0.0178

Error 58 3952790.541 68151.561



E. ANEXO: Abstracts presentados en congresos.

E-1. Abstract presentado en la 115th general meeting de la ASM (American Society for

Microbiology).

27/01/15 12:24Oasis, The Online Abstract Submission System

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Control/Tracking Number : 15-A-2637-GM-ASMActivity :AbstractCurrent Date/Time : 1/27/2015 11:23:53 AMTitle:Characterization of Bacterial Diversity Associated with Cyanide Degrading from Colombian Mines

Author:

V. López1,2,3, C. X. Moreno1,2, M. A. Márquez1,3; 1Univ. Natl. de Colombia, Medellín, Colombia, 2Grupo de

Microbiodiversidad y Bioprospección (MICROBIOP), Medellín, Colombia, 3Grupo de Mineralogía Aplicada y Bioprocesos(GMAB), Medellín, Colombia

Topic: N05 Molecular Microbiology Ecology: Communities and Organisms ; Q01 Biodegradation, Biotransformation, and Bioenergy

Keyword: bacterial biodegradation ; Microbial Ecology ; Cyanide

Abstract:Background: The study of microbial ecology in mining areas, specifically contaminated with cyanide, has been of greatinterest in recent decades. As cyanide is highly toxic, it must be detoxified in the effluent before discharging into the sewers.Treatment with the help of microorganisms can effectively be used to reduce the load of harmful chemicals in theenvironment. In Colombia, little information is known regarding microbial communities that inhabit these ecosystems.Methodology: In this study a culture-dependent and molecular analysis approach was used to estimate bacterial diversityassociated with cyanidation processes in an artisanal plant and an industrial gold processing plant. Different bacteria withpositive degrading activity were isolated and characterized by amplifying the variable 16S-23S rDNA intergenic spacer region(ITS). Isolation of cyanide degrading microbes was made in the simulated media. Conditions regarding the pH, concentrationof cyanide and count of microbes were optimized favoring the growth of cyanide degrading bacteria. Phylogenetic affiliationof predominant members was assessed by the determination of the 16S rDNA sequence. Results: Pronounced shiftsbetween bacterial communities collected in two mines were detected. Affiliations to bacteria from the families Bacillaceae,Norcandiaceae, Propionibacteriaceae, Alcaligenaceae, Enterococcaceae were found. Conclusion: Our results giveinformation about microbial diversity associated to contaminated places with cyanide and provide information of the presencecyanide degrading bacterial strains from Colombian mines.

Oral Abstract Presentation:

E-2. Abstract presentado en el XXII Congreso Latinoamericano de Microbiología-ALAM

2014.

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