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Estudio de la fluorescencia de los alacranes de la familia Buthidae
Centruroides del Estado de Guanajuato.
Estudiante: Ing. Daniel López Cabrera
Asesor: Dr. Gabriel Ramos Ortiz
Maestria en optomecatronica
GRADO EN QUE SE PRESENTA LA TESIS
Marzo 2016 León, Guanajuato,
México
2
3
INDICE
Capítulo I ........................................................................................................................................................ 7
1. Introducción ....................................................................................................................................... 7
1.1 Resumen ........................................................................................................................................... 7
1.2 Antecedentes ...........................................................................................................................12
1.3 Generalidad de los alacranes .........................................................................................................13
1.4 Fluorescencia en los alacranes .......................................................................................................14
Capítulo II .....................................................................................................................................................19
2. Alacranismo e Identificación Morfológica........................................................................................19
2.1 Alacranismo en México ..................................................................................................................19
2.2 Identificación de alacranes mediante su morfología .....................................................................23
2.3 Distribución de Alacranes en el mundo y México ..........................................................................27
2.4 Características morfológicas de diferentes familias de alacranes y su identificación ...................29
2.5 Claves para la identificación de familias de alacranes ...................................................................32
2.6 Clave para la identificación de los alacranes de la familia Buthidae, género Centruroides del
Centro Occidente de México. ...............................................................................................................34
Capítulo III ....................................................................................................................................................36
3. Metodología para detección y cuantificación de fluorescencia ......................................................36
3.1 Digitalización de imágenes .............................................................................................................36
3.2 Montaje experimental ....................................................................................................................40
3.3 Método de extracción molecular ...................................................................................................42
3.4 Adquisición de espectros de absorción y fluorescencia de la solución molecular ........................43
Capítulo IV ....................................................................................................................................................45
4. Identificación de especímenes .........................................................................................................45
4.1 Metodología experimental .............................................................................................................45
4.2 Técnicas de Identificación de especímenes a estudiar ..................................................................46
4.3 Centruroides Infamatus..................................................................................................................49
4.4 Centruroides Ornatus .....................................................................................................................51
4
4.5 Ejemplos de Identificación morfológica .........................................................................................53
4.6 Identificación mediante ADN .........................................................................................................56
Capítulo V .....................................................................................................................................................61
5. Resultados ........................................................................................................................................61
5.1 Resultados del método de digitalización de imágenes ..................................................................61
5.2 Resultados del método de extracción molecular ...........................................................................83
5.3 Absorción ........................................................................................................................................85
5.4 Análisis de las componentes principales (ACP) para espectros de absorción ...............................90
5.5 EMISION .........................................................................................................................................92
5.6 Análisis de las componentes principales (ACP) para espectros de emisión.................................100
5.7 Conclusiones .................................................................................................................................101
6. Bibliografía .....................................................................................................................................106
5
Agradecimientos
Al Dr. Gabriel Ramos Ortiz por su asesoría y tiempo invertido en este trabajo de tesis.
Al Dr. Juan Gualberto Colli Mull, del ITESI por su colaboración en la identificación y análisis
mediante ADN.
Al Dr. Rafael Espinosa Luna, por la propuesta del tema de tesis.
6
* Dr. Alfredo Luis Chávez Haro, director vitalicio del Centro de tratamiento de pacientes intoxicados por alacrán, Cruz Roja mexicana, León, Guanajuato, Blvd. Juan Alonso de Torres, León I, C.P. 37235, Tel: (477) 776 1326. Artículos, Cuadro clínico de pacientes picados por alacrán y su tratamiento en la ciudad de León, Guanajuato.
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Capítulo I
1. Introducción
1.1 Resumen
El alacranismo o escorpionismo se refiere a la intoxicación por el veneno de la picadura de alacrán
y representa un problema de salud pública en el Estado de Guanajuato, y en otros muchos estados
de la República Mexicana, ya que esto afecta a grandes núcleos de población, tanto en el medio
rural como en el urbano. Cada año se presentan numerosos casos de picaduras por este arácnido,
de los cuales algunos pueden terminar en fatalidades por falta de atención médica oportuna. Las
especies tóxicas de alacrán o escorpión existentes en nuestro Estado (Guanajuato) son las
pertenecientes al género Centruroides, en específico el alacrán conocido como Ornatus e
Infamatus.
Uno de los problemas más comunes que se presenta con los alacranes es la forma de poderlos
clasificar e identificar. Su clasificación e identificación es importante no solo para la realización de
estudios biológicos, sino también por razones prácticas. Por ejemplo, en el contexto del
alacranismo, su identificación es importante para saber si son venenosos y por ende peligrosos
para el ser humano. Una forma de hacerlo se basa en pistas anatómicas y morfológicas, pero esta
caracterización es difícil pues se requiere de mucha experiencia. De acuerdo a la información
proporcionada por la Cruz Roja en León, Guanajuato, por el Dr. Alfredo Luis Chávez Haro*, cuando
una persona es picada por estos arácnidos generalmente el 10% de las personas
8
tienen la costumbre de llevar el espécimen a la Cruz Roja; de este porcentaje, la mayoría pensado
que se utilizan para generar antiveneno, y también para que el personal de la Cruz Roja identifique
si es venenoso o no lo es. En este sentido es importante identificar si se trata de un alacrán de
importancia médica (venenoso) o no, y por otro lado la posibilidad de identificar alguna especie
diferente a las consideradas que se han dicho que existen en la zona, ya que de esta decisión
depende el tratamiento posible para el paciente (hay que considerar que algunos especímenes
de alacranes de una determinada región pueden aparecer en otra diferente por diversas razones).
En el caso en que el personal de la Cruz Roja identifique que el espécimen es venenoso, dejan al
paciente en observación y dependiendo de los síntomas se decide la aplicación de la vacuna. Los
primeros síntomas generales en una persona que tiene reacciones a la picadura de un alacrán son
ardor, comezón y dolor; si los síntomas no progresan, entonces no hay necesidad de la aplicación
de la vacuna y el paciente se puede retirar. En caso de que los síntomas se agraven, esto es que
el paciente sienta dolor de cabeza, mareo y sensación de un objeto en la garganta que impida la
respiración, junto con taquicardias, entonces se necesita la aplicación de la vacuna, este periodo
de observación varía entre 1 a 3 horas.
Es importante señalar que de manera empírica, y con base a su experiencia de tratar día a día con
el problema del alacranismo, en la Cruz Roja de León, con sede en Alonso de Torres, ha llevado al
Dr. Alfredo Chávez a poder identificar y clasificar a los alacranes mediante pistas morfológicas
que pueden ser observadas en algunas partes claves de su cuerpo, facultad que le permite indicar
si un alacrán es venenoso o no.
Parte del personal de la Cruz Roja, como paramédicos y enfermeras, también realizan tareas de
identificación con lo cual este esquema para determinar si un alacrán es venenoso o no, tiene un
inconveniente, y es el que depende del criterio de cada persona que realice la identificación, por
lo que esto no asegura que un alacrán sea identificado siempre de la misma manera, pudiéndose
dar el caso en que un alacrán se clasificado erróneamente. Por esto es necesario un método o
dispositivo que clasifique a los alacranes y que garantice un alto grado de acierto y que evite el
error humano.
9
Existe un fenómeno relativamente poco conocido y estudiado que se encuentra estrechamente
relacionado con los alacranes, este fenómeno consiste en la emisión de fluorescencia (azul-
verdosa), y se da cuando a los alacranes se les hace incidir una radiación ultravioleta con una
longitud de onda de 350 a 400 nm sobre su cuerpo.
Se desconoce la razón por la cual el caparazón de los alacranes exhibe este fenómeno, existen
diferentes teorías entre las que mencionan que esta fluorescencia es captada por los demás
alacranes, por lo que a distancia un alacrán podría darse cuenta si cerca de él se encuentra una
hembra o un macho, esto permitiría a un alacrán acercarse para un cortejo o alejarse para evitar
una batalla. Otra de las teorías manifiesta que esta fluorescencia les sirve para buscar refugio, ya
que cuando la luz UV contenida en la luz natural entra en contacto con ellos, la fluorescencia
emitida es captada por sus propios ojos, lo cual les indica que deben refugiarse.
En este contexto, el presente trabajo tiene por objetivo estudiar las propiedades luminiscentes
de los alacranes para determinar si estas propiedades son diferenciadas entre alacranes de
diferente especie, género, tamaño, etc. Este objetivo ha sido motivado por el interés de
desarrollar una técnica óptica y/o instrumento óptico capaz de realizar la clasificación o
identificación de un alacrán basada en la fluorescencia.
En este estudio nos enfocaremos en el estudio de especímenes del estado de Guanajuato. En la
ciudad de León Guanajuato, existen dos tipos de alacranes pertenecientes a los géneros
Centruroides Ornatus y Centruroides Infamatus. En este trabajo se encontró, que cuando se
colocan bajo excitación óptica con una longitud de onda de entre 350 y 400 nm, emiten
fluorescencia con una longitud de onda de entre 490 y 520 nm.
La fluorescencia se estudió siguiendo dos metodologías diferentes. En la primera metodología se
digitalizó una imagen de la intensidad de fluorescencia emitida por el cuerpo de un alacrán al ser
iluminado por radiación UV. Con esta información se estudió la posible correlación de esta
intensidad con algunas características propias del alacrán como su tamaño completo, tamaño del
mesosoma, especie y sexo. En la segunda metodología se implementó un procedimiento para
extraer el pigmento del caparazón del alacrán que origina dicha fluorescencia. En este caso se
10
buscó indagar la posible correlación entre la cantidad de pigmento contenido en el cuerpo del
alacrán y los parámetros antes mencionados.
En la primera metodología se encontraron resultados muy interesantes, al estudiar las imágenes
tomadas de los alacranes, en primer lugar se encontró que existe una diferencia en el valor
máximo de intensidad entre dos familias de alacranes, en este caso la familia Centruroides y la
familia Vaejovidae, en donde la mayor intensidad de fluorescencia corresponde a la familia
Centruroides. Otro resultado importante manifiesta que en algunas partes específicas de los
alacranes existe una intensidad de fluorescencia mayor, tal es el caso de las quelas y las quillas
dorsales.
Para el caso de la segunda metodología, una vez extraídas las moléculas causantes de la
fluorescencia del cuerpo del alacrán se tomaron sus espectros de absorción y emisión; para el
caso de la absorción no se encontró relación alguna entre el tamaño del alacrán y sus espectros
de absorción, esto es que se mantiene un promedio sin importar el tamaño, sexo, género o familia
de los especímenes en estudio. En el caso de la emisión no se pudo encontrar una correlación
entre el tamaño completo del alacrán respecto al pico máximo de la intensidad de su
fluorescencia, pero se obtuvieron resultados satisfactorios cuando se trata del sexo del alacrán y
su fluorescencia, o el área bajo la curva de sus espectros de emisión y el tamaño del alacrán, en
el primer caso se encontró que los alacranes machos tienen una longitud de onda de emisión
menor que la longitud de onda de emisión de las de las hembras, en una diferencia de entre 2 y
8 nm, y en el segundo caso se encontró que existe una relación entre la intensidad de emisión y
el tamaño del alacrán.
Con los resultados anteriores se puede corroborar que en los dos métodos se encontraron
resultados similares, esto es que existe una diferencia entre las longitudes de onda de emisión
entre hembras y machos de un mismo género de alacranes, lo cual pudiera aportar información
importante con la intención de diseñar un dispositivo que pudiera servir para poder clasificar un
alacrán en base a las características (longitud de onda, intensidad, distribución del pigmento en
el cuerpo del alacrán) de la fluorescencia emitida. Además de este interés práctico por estudiar
la fluorescencia en los alacranes, se quiere resaltar el hecho de que no existen estudios previos
11
sobre la fluorescencia de los alacranes que se encuentran en la región del Bajío, México, por lo
que estos estudios también aportan información que pudiese ser de interés biológico para las
especies aquí estudiadas.
12
1.2 Antecedentes
Existen diferentes familias de alacranes a lo largo del mundo, y entre ellas se distingue una que
habita en México, conocida como la de los alacranes rayados, esta familia tiene una característica
que los distingue, la cual se encuentra relacionada con la difícil identificación entre sus géneros,
ya que comparten características muy parecidas, lo que hace difícil su identificación, por lo que
se debe tener cuidado, ya que existen tanto alacranes rayados que son muy venenosos, como
alacranes rayados que no lo son. Este es el caso de los alacranes Centruroides, que son alacranes
rayados y venenosos.
Los biólogos o personas especialistas en alacranes en ocasiones usan métodos de identificación
rápida, en especial del género Centruroides. Dichos métodos se basan en la morfología de algunas
partes del alacrán, como son la forma de las quelas, la estructura del carapacho, las líneas dorsales
y la forma del esternón. Si bien es cierto estas marcas ayudan a identificar a un alacrán, ¿Cuál es
la certeza o seguridad de esta identificación que está basada en la apreciación de la persona que
lo realiza y de sus conocimientos de los alacranes?
Fuera de estas claves de identificación rápida, solo existe una forma para identificar con certeza
la familia y género de un alacrán, y esto es mediante pruebas de ADN. Desafortunadamente
existen diversas desventajas de este método, entre ellas podemos mencionar el tiempo largo que
lleva el proceso, el costo y por último es que por este método es imposible identificar si se trata
de una hembra o un macho.
13
1.3 Generalidad de los alacranes
Los escorpiones o alacranes son un grupo muy diverso y de gran proliferación en la Clase Arácnida.
Los alacranes conforman el Orden conocido como Scorpionida, el cual es uno de los 12 Ordenes
de arácnidos vivientes, y está compuesto por 16 Familias, 1 259 especies y 356 subespecies,
distribuidas mundialmente [1].
Actualmente los alacranes tienen una amplia distribución geográfica y viven en todas las grandes
masas terrestres, excepto en la Antártida. Se les encuentra en casi todos los hábitats, incluyendo
los desiertos, sabanas y pastizales, los bosques templados, los tropicales y los bosques lluviosos,
la zona intertidal y algunas montañas nevadas. Varias especies son troglobias, y una especie de
alacrán tartarus se encuentra a profundidades mayores de 800 metros bajo el nivel del mar [2].
Muchos viven sobre la superficie, otros son cavadores superficiales y otros más viven bajo
cortezas, piedras y hojarasca. Son nocturnos y durante el día se esconden en lugares húmedos y
obscuros. Algunos se mantienen quietos en sus guaridas, otros pueden ser vistos durante la noche
en árboles, o explorando sobre el campo en busca de sus presas o para el apareamiento.
Los alacranes, son muy adaptables en su fisiología, pueden soportar temperaturas de congelación
por varias semanas, resisten temperaturas varios grados más altos que las que toleran otros
artrópodos del desierto y algunas especies son capaces de sobrevivir a la inmersión en agua hasta
dos días. Pueden sobrevivir por largos períodos sin alimento o agua, algunos hasta 12 meses.
14
1.4 Fluorescencia en los alacranes
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas desde el nivel
fundamental mediante la absorción de radiación electromagnética a un nivel superior de energía.
Una vez excitadas estas especies se relajan regresando al estado fundamental, liberando así su
exceso de energía en forma de fotones.
Figura 1.1 Diagrama de los estados necesarios para generar fluorescencia.
El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida
media del estado excitado. Por tanto, si la relajación por fluorescencia es rápida con respecto a
los procesos sin radiación, se observa tal emisión (Fig. 1.1). En los alacranes dicho proceso tiene
lugar cuando sobre ellos incide una longitud de onda ente 350 y 400 nm, emitiendo con una
longitud de onda de entre 440 y 520 nm. Existen varias teorías que tratan de establecer una
explicación a la fluorescencia de los alacranes, entre ellas cabe mencionar las siguientes:
15
Los escorpiones son sensibles a su propia fluorescencia, esto se sugiere cuando en una caja
circular se graba la actividad de los alacranes bajo la luz UV, en donde en la misma caja se coloca
un cubo de cartulina fluorescente que bajo la luz UV emite a una longitud de onda similar a la de
los alacranes; en este experimento se encuentra que los alacranes tienen más actividad en
presencia del cubo de cartulina que cuando no está presente [3].
Gracias a esto se han enunciado teorías en donde los alacranes, en función de la percepción de
esta fluorescencia emitida por sus congéneres, pueden discernir si se trata de una hembra o un
macho y así poder tomar la decisión de acercarse o alejarse, ya sea para evitar un encuentro entre
dos machos (ya que algunas especies son carnívoras) o conseguir una pareja para apareamiento.
Se ha encontrado que los alacranes muestran una respuesta fuerte a los niveles de luz UV
equivalentes a la puesta del Sol (0.01 μW/cm2). Mientras que los alacranes se mueven más
rápidamente y de forma esporádica cuando existen niveles de luz UV altos, esto es una hora antes
de la puesta del Sol (0.15 μW/cm2). Esto sugiere que la luz UV puede inhibir la locomoción normal
del alacrán [4].
Figura 1.2 Alacranes bajo luz UV. A. Vietbocap thienduongensis Lourenço y Pham (holotipo macho), B. Chaerilus telnovi Lourenço.
16
Por otra parte, se ha encontrado que en algunas especies de alacranes este fenómeno de
fluorescencia está ausente, tal es el caso de la familia chaerilidae (figura 1.2) [5].
También se han hecho estudios para verificar la sensibilidad de los ojos de los alacranes, en donde
cuatro especies de tres familias han demostrado que los ojos laterales y medios son
máximamente sensibles a la luz verde (alrededor de 500 nm) y en segundo lugar a los rayos UV
(350 - 400 nm). Los escorpiones son fotoactivos, por lo tanto se utilizó este comportamiento para
analizar las respuestas de los alacranes Paruroctonus utahensis, a 395 nm de luz UV, 505 nm de
luz-cian verde, luz verde 565 nm y sin ningún tipo de luz. En los experimentos, sin embargo, los
alacranes respondieron más intensamente (ataques bruscos de la actividad locomotriz) a 395 nm
y 505 nm. Estos resultados sugieren un papel activo de la fluorescencia en la detección de luz.
Otros estudios indican que los elementos fotosensibles en la cola del alacrán son sensibles a la
luz verde. Por tanto, proponen que la cutícula puede funcionar como un colector de fotones a
través de todo el cuerpo, por lo que los alacranes pueden usar esta información para detectar
refugio, ya que el bloqueo de cualquier parte de la cutícula podría disminuir la señal de la luz [6].
Se ha encontrado que las cataratas producidas en el ojo humano y la esclerotización cuticular en
los alacranes son procesos oxidativos, ambas debido a un envejecimiento oxidativo de proteínas,
acompañado de una fuerte fluorescencia [7].
Un estudio realizado a dos especies de alacranes (Vaejovis confusus y Paruroctonus shulovi [8]),
muestran diferencias estadísticamente significativas en la longitud de onda de fluorescencia
emitida entre machos y hembras en cualquiera de las especies. Gracias a este resultado los
autores del estudio sugirieron que la fluorescencia podría funcionar como un parámetro para la
identificación de especies. Sin embargo, las diferencias entre especies son muy pequeñas, de
aproximadamente 2 nm. La discriminación de las especies sobre la base de las diferencias de esta
magnitud requeriría habilidades discriminatorias extremadamente finas del ojo del escorpión,
para poder realizar la discriminación entre una especie y otra [9].
17
Debido a que la fluorescencia es un proceso que viene acompañado del endurecimiento de la
cutícula del alacrán, este fenómeno comienza a parecer en los alacranes después de algunas
semanas de nacidos, como se muestra en la Fig. 1.3.
Figura 1.3 Imagen de un alacrán hembra con sus crías de una semana de nacidas bajo una lámpara UV, donde se observa que las crías no emiten fluorescencia.
Derivado de los trabajos anteriormente citados surge la oportunidad de estudiar la fluorescencia
emitida por los alacranes que habitan en el Estado de Guanajuato, más en específico en la Ciudad
de Léon, que son: Centruroides con especies Ornatus e Infamatus. Este estudio consistió en
primera instancia en encontrar un método que nos permitiera extraer del cuerpo de los alacranes
las moléculas que hacen posible la fluorescencia, y encontrar una posible correlación entre
especies, tamaño, sexo y peso versus las características de fluorescencia (intensidad, pico de
emisión). Con esto se podría ver si existe una diferencia entre estas especies y así tener una
herramienta extra que nos permita poder clasificar de una forma más fácil las especies de
alacranes antes mencionadas. En la literatura se reporta que en algunas especies de alacranes
esta fluorescencia es posible gracias a dos moléculas conocidas como β-carbolina y 7-hidroxi-4-
metilcumarina, las cuales intervienen en un proceso de endurecimiento de su caparazón [7].
18
Cabe mencionar que ningún tipo de estudio de fluorescencia ha sido realizado para los alacranes
que habitan en el la ciudad de León, Gto., lo que surge como una oportunidad para realizarlo.
19
Capítulo II
2. Alacranismo e Identificación
Morfológica
2.1 Alacranismo en México
En México, usamos con más frecuencia la palabra de origen árabe “alacrán” que la de origen
latino “escorpión”, para designar a los arácnidos del orden Escorpiones y el término escorpión, se
aplica incorrectamente, a los reptiles género Heloderma, únicos saurios venenosos que se
conocen.
Los alacranes forman parte del grupo de animales reconocidos como “fauna nociva” por estar
entre los artrópodos venenosos, que por la toxicidad de sus venenos que ponen en peligro la vida
de niños o de ancianos, la mayoría son plagas domésticas en México y en muchas partes del
mundo [10].
Anualmente miles de personas en el mundo sufren las picaduras de alacranes venenosos y
muchas muertes que son causadas por esos animales probablemente jamás sean registradas y en
ocasiones tampoco se llega a saber qué tipo de alacrán la ocasionó.
El alacranismo o escorpionismo se define como la acción de la picadura de los alacranes, en los
seres humanos, lo cual constituye un problema de Salud Pública por el riesgo de envenenamiento
sistémico, con complicación mortal en niños menores de cinco años. México es uno de los países
20
con mayor incidencia de alacranismo en el mundo, es un importante problema médico-social, al
grado que en algunas Instituciones oficiales, uno de sus retos lo constituye el abatir la morbilidad
y mortalidad causada por estos arácnidos. Actualmente la intoxicación por picadura de alacrán es
una enfermedad de notificación obligatoria semanal, de acuerdo con lo dispuesto en la NOM-
017-SSA2-1994 para la vigilancia epidemiológica SUIVE 2000.
El veneno es producido por un par de glándulas venenosas, situadas en el telson, cada glándula
está rodeada por una gruesa pared de células epiteliales secretoras, separadas por una
membrana basal de la potente capa de fibras musculares circulares. Cada glándula tiene un canal.
La contracción muscular expulsa violentamente el líquido ponzoñoso por el orificio del acúleo
(Fig. 2.1).
El veneno es un líquido lechoso de color blanquecino, es una mezcla que contiene moco,
aminoácidos libres, sales inorgánicas, nucleótidos, lípidos, proteínas y péptidos de bajo peso
molecular que constituyen las neurotoxinas, de las que sólo algunas ocasionan envenenamiento,
de leve hasta mortal, en los humanos.
En general la picadura es más frecuente en hombres jóvenes, en ambiente rural y urbano y en
verano. En el caso de la picadura de alacranes Centruroides, como los que se encuentran en el
Estado de Guanajuato, puede causar malestar general, angustia, sudoración, nistagmus,
salivación excesiva y ocasionalmente por descuido, la muerte. El tratamiento que se ha utilizado
en las picaduras ha sido fundamentalmente sintomático, a base de analgésicos y/o
antihistamínicos, actualmente el tratamiento específico es el uso de los sueros que son de alta
confiabilidad.
El cuadro clínico que se presenta, depende tanto de factores propios del alacrán que incluyen:
especie, volumen de la glándula y cantidad de veneno inoculado, como del paciente, que
incluyen: estado de salud, peso, edad y sensibilidad al veneno. El cuadro clínico se inicia entre 5
y 30 minutos después de la picadura, y se ha dividido para el manejo terapéutico en tres etapas
clínicas: leve, moderada y severa. La leve se caracteriza por presentar sólo dolor y parestesias. La
moderada se identifica por la moderada psialorrea, parestesias generales, prurito nasal y faríngeo
21
e inquietud. La etapa clínica severa se presenta cuando el paciente muestra las llamadas “señales
de alerta” que son: psialorrea abundante, sensación de cuerpo extraño en la faringe y nistagmus.
Siendo éste el caso en el que debe aplicarse el suero antialacrán [10]. La muerte puede ocurrir en
pocas horas después del emponzoñamiento, pero por fortuna puede evitarse si se administra el
antiveneno a tiempo.
En general, ocho de cada 10 defunciones ocurridas en México debido al alacranismo, se
concentran en los Estados de Guerrero, Jalisco, México, Nayarit y Puebla. El caso de Morelos es
muy especial porque a pesar de la alta morbilidad, su índice de mortalidad es muy bajo.
Por la toxicidad de sus venenos la familia Buthidae ha sido estudiada ampliamente desde hace
muchos años. Con cerca de 50 géneros y más de 500 especies, es la más grande y la de mayor
distribución de las familias de escorpiones en el Mundo.
Nueve especies de las 31 que viven en nuestro país son conocidas como peligrosas, se distribuyen
en la mitad occidental de la República, en la región Neotropical. Estos alacranes son conocidos
comúnmente como alacranes “güeros”, y llevan manchas negras dorsalmente que les dan
aspecto rayado y son las que se enlistan a continuación:
1. Centruroides elegans elegans “alacrán de la costa de Jalisco”, se distribuye en la parte
occidental de Jalisco y costas de Nayarit y Sur de Sinaloa.
2. Centruroides exilicauda de Sonora, Baja California y Baja California Sur.
3. Centruroides infamatus infamatus “alacrán de Michoacán”, de amplia distribución en
Michoacán, Guanajuato, Zacatecas y Veracruz.
4. Centruroides infamatus ornatus, de Sinaloa, Guanajuato, Durango, Nayarit y Jalisco.
5. Centruroides limpidus limpidus “alacrán de Iguala”, se distribuye ampliamente en Guerrero,
Morelos, Guanajuato, Puebla, Estado de México, Oaxaca y Chiapas.
6. Centruroides limpidus tecomanus “alacrán de Colima”, de Tecomán, Sureste de Jalisco y
Nayarit.
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7. Centruroides meisei “alacrán de la costa de Guerrero”, se distribuye en la costa Sur de Guerrero
y Norte de Oaxaca.
8. Centruroides noxius “alacrán de Nayarit”, de Nayarit y Sinaloa.
9. Centruroides suffusus “alacrán de Durango”, de la Ciudad de Durango, Noroeste de Zacatecas
y Este de Sinaloa.
De acuerdo a lo anterior, los alacranes Ornatus e Infamatus que se estudiaron en este trabajo de
investigación pertenecen a los alacranes rayados Centruroides y se conocen como alacranes
venenosos y peligrosos para el ser humano.
23
2.2 Identificación de alacranes mediante su
morfología
La morfología de los alacranes es tan distintiva que fácilmente pueden reconocerse tanto los
fósiles como los actuales. Lo característico del cuerpo de los alacranes es que están formados por
dos partes principalmente (ver Fig. 2.1), que son el prosoma o cefalotórax el cual está cubierto
por un caparazón no segmentado y el opistosoma. A su vez el opistosoma se divide en dos partes
que son el mesosoma o pre abdomen (cuerpo) de siete segmentos y el metasoma (cola) de cinco
segmentos.
Figura 2.1 Diagrama de las partes principales de un alacrán.
24
En el prosoma están los 8 ojos, un par central y 3 pares en los extremos antero laterales,
delimitando un espacio denominado triángulo ocular. En el prosoma también podemos encontrar
las pinzas, las cuales reciben el nombre de pedipalpos (ver Figuras 2.2 y 2.3) con los que atrapa y
sujeta sus presas, para acercarla a la boca, donde ésta es desmenuzada por los quelíceros,
también terminados en pinza y situados entre los pedipalpos y por debajo del borde anterior del
carapacho.
Figura 2.2 Diagrama donde se muestran los quelíceros de un alacrán.
Figura 2.3 Diagrama de los pedipalpos de un alacrán.
En el mesosoma sobresalen lateralmente los cuatro pares de patas (son característicos de los
arácnidos), constituidas por 8 segmentos que terminan en un par de uñas. Las patas están
25
conformadas por las siguientes articulaciones: coxa, trocánter, fémur, patella, tibia, pretarso,
basitarso y telotarso (ver figura 2.4).
Figura 2.4 Diagrama de las partes de la pata de un alacrán.
Ventralmente, entre las coxas de las patas hay una pieza central, a la que se denomina esternón.
Su forma: triangular o pentagonal, es un carácter para identificar familias de alacranes [11].
El metasoma delgado de cinco segmentos termina en el telson. El telson está constituido por una
parte globosa donde están las glándulas del veneno y el acúleo o aguijón. Así mismo, la presencia
de un tubérculo, de una espina o diente, más o menos cercano a la base del aguijón, tiene
importancia para identificar especies de alacranes (Fig. 2.5).
Figura 2.5 Diagrama de las partes del metasoma.
26
En los alacranes los sexos son difíciles de distinguir, en general los machos tienen pinzas más
robustas que las hembras, el número de dientes pectinales es mayor que el de las hembras, los
segmentos caudales proporcionalmente son más largos y delgados y a veces pueden observarse
en algunas especies las papilas genitales como pequeñas proyecciones en la base de las valvas
genitales (ver Fig. 2.6).
Figura 2.6 Parte inferior del mesosoma.
Los alacranes son vivíparos (a diferencia de las arañas que nacen de huevo, estos se desarrollan
en el cuerpo de la madre), después de un período de desarrollo embrionario de tiempo variable,
nacen las crías vivas, los recién nacidos, “pullis” o “larvas”, suben al dorso de la madre (ver figura
2.7). Después de la primera muda que se lleva a cabo a los 15 ó 20 días de nacidos, la cutícula de
los escorpiones presenta fluorescencia al iluminársele con luz ultravioleta, lo cual facilita su
detección y captura en las noches. Como adultos su tamaño es variable hay especies pequeñas
de 2 cm de longitud hasta especies grandes de 12 cm o más pero la mayoría va de 5 a 8 cm.
Algunas especies viven pocos años pero otras llegan a vivir hasta 4 o 5 años en laboratorio [12].
27
Figura 2.7 Imagen de una madre con sus pullis en su dorso.
2.3 Distribución de Alacranes en el mundo y
México
Familias distribución mundial
Bothriuridae: Principalmente de Australia y Sudamérica.
Buthidae: Distribución mundial.
Chactidae: Norte, Sur y Centroamérica.
Chaerilidae: Sur y Suroeste Asiático.
Diplocentridae: Norteamérica, Centro y Sudamérica, Región Caribeña, Asia.
Euscorpiidae: Africa, Norteamérica, Asia y Europa.
Heteroescorpionidae: África.
Ischnuridae: Todos los continentes excepto Norteamérica.
Iuridae: Norte y Sudamérica, Europa y Asia.
Microchermidae: África.
Pseudochactidae: Asia.
Scorpionidae: África, Asia y Australia.
Scorpiopidae: Asia.
Supertitioniidae: Suroeste de EUA y México
Troglotayosicidae: Europa
28
Vaejovidae: Norteamérica y Centroamérica, Asia y América.
En México viven 7 de las 16 familias conocidas.
Buthidae
Diplocentridae
Chactidae
Euscorpiidae
Luridae
Vaejovidae
Supertitionidae
29
2.4 Características morfológicas de diferentes
familias de alacranes y su identificación
Familia Buthidae
Es la familia más grande de escorpiones, es también la familia que se encuentra en mayor
distribución y en donde están los alacranes más peligrosos para el humano. Incluye 50 géneros y
más de 500 especies y 165 subespecies. Su mayor diversidad se da en África.
En México, de esta familia se han citado tres géneros: Centruroides, Tityopsis y Darchenia. El
género Centruroides incluye 22 especies, Tityopsis conocido únicamente de Oaxaca y el género
Darchenia se duda de su presencia en México.
Estos alacranes son de tamaño mediano, los adultos alcanzan unos 6.5 cm de longitud. Color
general del cuerpo amarillo claro, con manchas en el dorso que le dan el aspecto rayado. El
carapacho es de color claro, con 4 líneas longitudinales obscuras bien definidas. En cada una de
las placas dorsales o terguitos se puede ver que existe una intensa mancha negra en el borde
anterior y otra en el borde posterior, unidas entre sí. Los ejemplares juveniles presentan un diente
subaculear grande pero en los adultos el diente se reduce a un pequeño tubérculo apenas
perceptible. El número de dientes en los peines, en los machos es de 21 a 26 y en las hembras es
de 19 a 23.
Es la especie más común y más importante de los escorpiones, tanto desde el punto de vista
médico, porque su ponzoña es altamente tóxica y capaz de matar a niños menores de cinco años,
como desde el punto de vista taxonómico ya que las especies rayadas forman un grupo difícil de
identificar porque son morfológicamente muy parecidas.
30
Familia Diplocentridae
Alacranes de tamaños pequeños, medianos o grandes. De coloración variable, clara u obscura.
Las quelas de los pedipalpos son grandes y robustas. El esternón es pentagonal y el telson tiene
un tubérculo subaculear grande y cubierto con sedas blanquecinas. Tienen un solo espolón tarsal.
El tarso lleva en su cara inferior dos series longitudinales de espinas gruesas de color café. El borde
anterior del carapacho con una escotadura central. Manos de los pedipalpos con pinzas grandes
y fuertes. Número de dientes en los peines: machos 12-14, hembras 10-13. Se les conoce como
alacranes de tierra.
Familia Vaejovidae
Alacranes de tallas pequeñas a medianas. De coloración obscura o café amarillento, en ocasiones
con manchas de diferente forma en el dorso. Tienen el esternón pentagonal. Dedos de los
pedipalpos con una a siete subfilas continúas de gránulos pequeños. Tarsos con dos espolones
tarsales. Está representada por nueve géneros: Vaejovoidus, Syntropis, Anuroctonus,
Paravaejovis, Smeringurus, Uroctonites, Vaejovis, Pseudouroctonus y Paruroctonus.
La mayor complejidad de especies se presenta en Baja California. El género Vaejovis está
ampliamente distribuido en la República Mexicana.
Familia Luridae
Alacranes grandes de 10 a 12 cm. Con esternón pentagonal. Patela del pedipalpo con más de diez
tricobotrias. Con dos géneros Hadrurus y Anuroctonus. Hadrurus se distingue porque posee un
espolón en la parte ventral del dedo movible del quelícero, por la gran pilosidad y por tener cerca
de 200 tricobotrias; se les conoce como “alacranes velludos” en Baja California y como “alacrán
de caballo” en Puebla y Guerrero.
31
Familia Chactidae
Quelícero con una sérrula (serie de sedas pequeñas) bien definida. Un sólo género Nullibrotheas
de Baja California Sur.
Familia Euscorpiidae
Quelícero sin sérrula. Familia pequeña con tres géneros Troglocormus con 2 especies, de San Luis
Potosí y Tamaulipas; Megacormus, con 4 especies Hidalgo, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí,
Tamaulipas y Veracruz y Plesiochactas con 1 especie, en Veracruz.
Familia Supertitionidae
Con 4 géneros y nueve especies, Supertitionia con una especie; Sotanochactas con 1 especie y
Typhlochactas con 5 especies. Los dos últimos géneros con representantes que habitan dentro de
cuevas tropicales muy húmedas. Dos especies de Typhlochactas de Oaxaca, son epigeas, de
tamaño pequeño, ciegos y carecen de pigmento. El género Alacrán de los sótanos de Huautla,
Oaxaca, se encontró a casi 800 metros de la superficie, es grande, mide 70 mm.
32
2.5 Claves para la identificación de familias de
alacranes
Existen algunas claves morfológicas con las cuales se pueden clasificar los alacranes, con lo cual
se puede diferenciar a que género de alacrán pertenece. Por ejemplo, un alacrán de la Familia
Buthidae Género Centruroides (Marx, 1890) es de apariencia esbelta, con los dedos de la quela
del pedipalpo largos y con 8 a 9 hileras de dientecillos oblicuas e imbricadas (Figura 2.8a.);
esternón de forma triangular (Figura 2.9a.); patela del pedipalpo sin tricobotrias en la cara ventral
(Figura 2.8b); con tubérculo subaculear espinoide, reducido o bien desarrollado.
Figura 2.8 (a) Dedo fijo de la quela de un alacrán del género Centruroides mostrando las hileras de dientecillos oblicuas e imbricadas. (b) Vista ventral de la patela sin tricobotrias. (c) Dedo fijo de un alacrán de la familia Vaejovidae con las hileras en línea. (d) Vista ventral de la patela con tricobotrias.
33
Figura 2.9 (a) Esternón triangular, (b) pentagonal y (c) trapezoidal.
Los alacranes de apariencia variada, generalmente robustos; con hileras de dientecillos en los
dedos de la quela del pedipalpo formando una línea continua en la que las hileras se separan por
dientecillos de mayor tamaño (Figura 2.8c); esternón de forma variable pero nunca triangular;
patela del pedipalpo con 2 ó más tricobotrias ventrales (Figura 2.8d); con o sin tubérculo
subaculear (Figuras 2.10), son ejemplo de alacranes pertenecientes a la Familia Diplocentridae.
Figura 2.10 Telson (Vesícula y aguijón) de Diplocentridae mostrando el tubérculo subaculear grande.
34
2.6 Clave para la identificación de los alacranes
de la familia Buthidae, género Centruroides del
Centro Occidente de México.
Una vez que los alacranes han sido identificados como Centruroides, el siguiente paso es saber
qué tipo de Centruroides es, en este caso existen dos posibilidades ya sea Infamatus u Ornatus.
Las características del Centruroides Infamatus [13], se explican a continuación. Alacranes con el
carapacho cubierto de manera difusa a intensa por pigmento obscuro, sin líneas definidas en el
carapacho (Figura 2.11). Carapacho difusamente pigmentado, sin pigmento en las áreas laterales
junto a los ojos laterales y parte anterior del surco medio; las bandas negras dorsales en el
mesosoma tienen más o menos la misma anchura que la faja clara mesal; longitud corporal mayor
de 55 mm (los machos alcanzan hasta 67 mm); conteo pectinal de 23-24 en machos y 20-21 en
hembras; con amplia distribución en el centro del país (Michoacán, Guanajuato, Querétaro y
parte de Jalisco)
Figura 2.11 Centruroides Infamatus del Estado de Guanajuato.
35
Figura 2.12 C. Ornatus del Estado de Guanajuato.
Las características del Centruroides Ornatus [14], se explican a continuación. Carapacho
generalmente obscuro casi en su totalidad con angostas franjas laterales sin pigmento y pequeñas
áreas claras en la zona de los ojos laterales; las bandas negras dorsales en el mesosoma son
claramente más anchas que la faja clara mesal (ver figura 2.12); longitud corporal menor de 55
mm; conteo pectinal de 20-21 en machos y 18-19 en hembras; especie que habita en el centro
del país preferentemente en zonas altas, pudiendo encontrarse por arriba de los 2400 msnm.
36
Capítulo III
3. Metodología para detección
y cuantificación de
fluorescencia
3.1 Digitalización de imágenes
Para analizar y estudiar la intensidad de la fluorescencia de los alacranes y poderla correlacionar
con algún otro parámetro como género, tamaño, sexo y peso, se utilizó un método de análisis
que consiste en trabajar con imágenes digitalizadas de un alacrán bajo excitación UV.
Descripción del proceso de Formación de la imagen digital
El proceso de formación de una imagen digital obtenida a través de una cámara es el siguiente:
La luz que recolecta la lente de la cámara pasa por el objetivo, atraviesa algunos filtros (depende
del modelo de cámara) y llega hasta el sensor de imagen, denominado CCD, que se encuentra
formado por multitud de receptores fotosensibles, llamados "fotodiodos". (Ver Figura 3.1). La luz
incidente genera una pequeña señal eléctrica en cada receptor. La información que se obtiene
37
del sensor de la cámara digital son datos analógicos. Para que estos datos se puedan almacenar
en la tarjeta de memoria y que el ordenador pueda interpretarlos se deben convertir a formato
binario en arreglos de "bytes" (Fig. 3.2) por un conversor ADC. De esta forma, a cada pixel del
detector se asigna un valor de intensidad de luz.
Figura 3.1 Diagrama de cómo se forma una imagen digital.
Figura 3.2 Ejemplo de los valores tomados por un byte, dependiendo del bit que lo conforma.
38
Píxeles: los puntos de una imagen
Si comparamos la fotografía tradicional o analógica, observamos que una película fotográfica está
formada por pequeños granitos de haluros de plata sensibles a la luz, éstos al encontrarse muy
juntos forman la imagen que vemos. Cada uno de estos granitos es la unidad más pequeña que
hay en una fotografía tradicional. En el caso de una cámara digital las unidades más pequeñas
que constituyen la imagen son los píxeles.
El píxel solo puede ser de color rojo, verde o azul o la mezcla de los tres. Un píxel, solo tiene un
color no puede tener dos colores. Al visualizar todos los píxeles juntos, uno al lado de otro, dan la
impresión de continuidad respecto a la tonalidad del color, formando así la imagen (Fig. 3.3).
Figura 3.3 Imagen donde se representan los píxeles en una imagen.
39
Por otra parte, dependiendo de la cantidad de bits que tenga un píxel, es el tipo de imagen que
se tendrá, como se muestra en la tabla 3.1:
Bits por píxel Tonos Uso recomendado
1 Blanco y negro Dibujo
8 256, grises o colores Foto gris o icono
24 16.7 millones de colores RGB, imágenes a color
32 16.7 millones de colores + negro CMYK para impresión
Tabla 3.1 En esta imagen se muestran los tipos de imágenes, haciendo referencia a la cantidad de bits que pueden contener por píxel para formar la imagen.
En este caso nos interesa en particular las imágenes de 8 bits, ya que trabajaremos con imágenes
en escala de grises, y este tipo de imágenes admiten una escala de 256 tonos de grises,
comparable con una fotografía en blanco y negro, teniendo en color negro un valor de 0 y para el
blanco un valor de 255.
Figura 3.6 Representación de una imagen a color convertida a una imagen en escala de grises (imagen de 8 bits).
40
3.2 Montaje experimental
El experimento para el análisis de la intensidad de la fluorescencia de los alacranes mediante el
análisis digital de las fotografías tomadas, se realizó bajo el siguiente montaje experimental.
Figura 3.7 Fotografía donde se muestra el arreglo experimental utilizado para la toma de las fotografías de la fluorescencia emitida por alacranes.
41
Este arreglo consiste en dos lámparas UV colocadas de forma paralela montadas sobre 4 soportes,
de tal forma que entre ellas quede un espacio aproximado de 7cm, en donde se colocaron dos
filtros (uno de densidad neutra), el primero de ellos sirvió para evitar altas intensidades de
iluminación sobre las muestras, evitando así la saturación en la detección de la cámara, el
segundo de los filtros (de color), se colocó para evitar que la luz de las lámparas UV llegaran a la
lente de la cámara. Las lámparas se colocaron a 20cm de la base, en donde se coloca la muestra
(el alacrán bajo estudio). El tamaño y colocación de las lámparas garantizó una iluminación
uniforme sobre las muestras.
Una vez montado el arreglo experimental (ver figura 3.7) se colocó cada uno de los alacranes a
estudiar debajo de las lámparas teniendo cuidado que se colocaran todos en la misma posición y
que coincidieran con la posición de la lente de la cámara. Después de adquirir las fotos con la
cámara, estas fueron tratadas con un programa comercial (Matlab) para convertirlas a escala de
grises, esto es a imágenes de 8 bits, y posteriormente se obtuvo la matriz de los valores de los
píxeles de las imágenes. Una vez obtenida la matriz de cada una de las imágenes, se graficaron
con Matlab, con el comando contour, para analizar los puntos donde existe una mayor intensidad
de la fluorescencia.
Como parte final de este análisis, se realizó un histograma para cada una de la imágenes de cada
alacrán, con las matrices obtenidas de cada imagen en escala de grises, esto para apreciar cuales
son los niveles máximos de intensidad referidos a los valores tomados por los píxeles de cada
imagen.
42
3.3 Método de extracción molecular
El objetivo general de este método es seccionar una parte del alacrán y mediante un
procedimiento poder aislar la molécula responsable de la fluorescencia emitida bajo la radiación
UV. Dicha molécula se localiza en la epicutícula del cuerpo de los alacranes. Una vez extraída la
molécula se podrán hacer estudios relacionados con su concentración en la epicutícula, así como
las características de su emisión (longitud de onda, intensidad). Al igual que en el caso del método
de digitalización de imágenes, con esta información se busca ver si existe una correlación de la
intensidad de la fluorescencia de los alacranes con parámetros como género, tamaño, sexo y
peso.
Este método se basa en la extracción mediante la separación de las moléculas en una solución de
etanol, el método consiste en los siguientes pasos:
Tomar el espécimen una vez que está muerto y congelarlo por 24 horas.
Retirar las patas, carapacho y prosoma, para quedarse únicamente con el mesosoma y
limpiarlo de los tejidos blandos.
Cortar y pesar la misma cantidad del mesosoma para todos los ejemplares en estudio.
En un mortero moler la cantidad de mesosoma anteriormente pesado hasta quedar un
polvo fino.
Diluirlo en 5 ml etanol y refrigerar por 24 horas.
Sonicar la solución obtenida por 90 minutos.
Filtrar mediante un filtro para jeringa de PTFE.
43
3.4 Adquisición de espectros de absorción y
fluorescencia de la solución molecular
Una vez obtenida la solución de la extracción molecular, ésta se analizó primeramente utilizando
su espectro de absorción, el cual se midió utilizando un espectrómetro Perkin Elmer UV/ VIS/ NIR
Lambda.
En segundo lugar se midió su espectro de emisión con un espectrómetro portátil Ocean Optics
USB2000+, el cual fue montado en un arreglo óptico, como se muestra a continuación (Fig. 3.8).
Figura 3.8 Diagrama del arreglo experimental para la colección de la fluorescencia.
44
Figura 3.9 Imagen del arreglo experimental utilizado para medir la fluorescencia de las soluciones obtenidas de la extracción molecular.
Las soluciones en estudio se excitaron con un diodo láser con una emisión de longitud de onda
de 405nm y potencia de 5 mW.
45
Capítulo IV
4. Identificación de
especímenes
4.1 Metodología experimental
El objetivo principal de la tesis es estudiar la fluorescencia emitida por el caparazón de los
alacranes, con la finalidad de ver si existe una correlación entre esta fluorescencia y las
características del alacrán (género Infamatus u Ornatus, tamaño, sexo, etc.). Esta posible
correlación, en caso de existir, podría servir de base para desarrollar una técnica y un instrumento
capaz de realizar la identificación y clasificación de un alacrán, lo cual no solo es de interés
biológico, sino también práctico, pues hipotéticamente serviría para saber si un alacrán en
específico es o no venenoso.
Para estos estudios se utilizó un total de 30 especímenes recolectados en diversas partes de la
ciudad de león Guanajuato, de los cuales 9 eran Infamatus machos, 14 Infamatus hembra, 3
Ornatos macho, 2 Ornatus hembra y 2 Vaejovidae. Como se mencionó anteriormente, la
metodología consta en dos partes, la primera de ellas es un análisis mediante fotografías y la
segunda consiste en la extracción molecular de la molécula causante de la fluorescencia. En la
primera se correlacionará la intensidad de las imágenes capturadas en escala de grises con
respecto al sexo del alacrán, y con respecto al tamaño completo del alacrán o el tamaño del
mesosoma.
46
En el segundo caso se extrajo la molécula causante de la fluorescencia, de la epicutícula del
mesosoma del alacrán, una vez extraída la molécula en solución de alcohol etílico se midió su
espectro de absorción y emisión, y los puntos máximos obtenidos se correlacionaron nuevamente
contra el sexo del alacrán y el tamaño del alacrán completo y del mesosoma.
4.2 Técnicas de Identificación de especímenes a
estudiar
Los especímenes se caracterizaron en base a las técnicas y guías mostradas en [16], descritas en
el Capítulo 2 de esta tesis, en donde la primer parte de esta caracterización corresponde distinguir
los alacranes para saber si pertenecen a la familia Buthidae, genero Centruroides, en esta
caracterización se toman en cuenta los siguientes pasos:
Alacranes de apariencia esbelta.
Figura 4.1 Fotografía de una alacrán de la familia Buthidae género Centruroides.
47
Dedos de la quela del pedipalpo largos y con 8 a 9 hileras de dientecillos oblicuas e
imbricadas.
Figura 4.2 Imagen donde se muestran los
dedos de la quela.
Esternón de forma triangular, que es una de las características de un alacrán de la familia
Buthidae.
Figura 4.3 En esta imagen se muestra la forma triangular del esternón.
48
Patela del pedipalpo sin tricobotrias (puntos negros) en la cara ventral.
Figura 4.4 Imagen de la patela de un alacrán sin tricobotrias.
Tubérculo subaculear espinoide, reducido o bien desarrollado.
Figura 4.5 Se muestra la imagen del tubérculo subaculear, de un alacrán Centruroides.
49
Una vez reconocidos los puntos anteriores se pudo decir que 28 de los 30 alacranes bajo estudio
pertenecen a la familia Buthidae, genero Centruroides; el siguiente paso es saber a qué especie
el género Centruroides pertenece, para esto se deben tomar en cuenta las características que se
mencionan a continuación.
4.3 Centruroides Infamatus
Carapacho difusamente pigmentado, sin pigmento en las áreas laterales junto a los ojos
laterales y parte anterior del surco medio (Fig. 4.6).
Figura 4.6 Carapacho de un alacrán Centruroides Infamatus.
Las bandas negras dorsales en el mesosoma tienen más o menos la misma anchura que la
faja clara mesal (Fig. 4.7).
Figura 4.7 Bandas del mismo ancho en un alacrán Infamatus.
50
Conteo pectinal de 23-24 en machos y 20-21 en hembras (Fig. 4.8).
Figura 4.8 En esta imagen se muestran los peines que deben ser contabilizados para saber si un alacrán es hembra o macho.
51
4.4 Centruroides Ornatus
Carapacho generalmente obscuro casi en su totalidad con angostas franjas laterales sin
pigmento y pequeñas áreas claras en la zona de los ojos laterales (Fig. 4.9).
Figura 4.9 Carapacho de un alacrán Centruroides Ornatus.
Las bandas negras dorsales en el mesosoma de un alacrán Ornatus son claramente más
anchas que la faja clara mesal (Fig. 4.10).
Figura 4.10 Bandas dorsales de diferente ancho en un alacrán Ornatus.
52
Conteo pectinal de 20-21 en machos y 18-19 en hembras (Fig. 4.11).
Figura 4.11 Imagen de los peines utilizados, para el conteo pectinal en un alacrán Ornatus.
53
4.5 Ejemplos de Identificación morfológica
A continuación se muestran algunos ejemplos de cómo se realiza la clasificación de los
especímenes bajo estudio según las características antes mencionadas.
En la figura 4.12 se muestra la clasificación de una hembra Ornatus que, primeramente, se
distingue como Ornatus por la coloración que tiene en el carapacho, la cual es casi completa a
distinguir de franjas muy delgadas y claras (imagen 4.12c), un segundo parámetro que nos indica
que es Ornatus es la anchura de las franjas dorsales negras, que se debe de cumplir que éstas
sean más anchas que la faja clara mesal (imagen 4.12d), el conteo pectinal nos dice si es hembra
o macho, en este caso se cumple que sea una hembra, ya que su conteo pectinal corresponde a
19 peines.
Figura 4.12 En esta imagen se muestran los parámetros característicos de un alacrán Ornatus hembra; a) Alacrán completo, b) Conteo pectinal y esternón triangular, c) Carapacho pigmentado d) Franjas dorsales de diferente ancho.
54
En la figura 4.13 se muestra la clasificación de un macho Infamatus, primeramente se distingue
como Infamatus por la coloración que tiene en el carapacho, la cual es difusa con franjas anchas
más claras (imagen 4.13c), un segundo parámetro que nos indica que es Infamatus se distingue
por la anchura de las franjas dorsales negras, que se debe de cumplir que estas sean del mismo
ancho que la faja clara mesal (imagen 4.13d), el conteo pectinal nos dice si es hembra o macho,
en este caso se cumple que sea un macho, ya que su conteo pectinal corresponde a 23 peines.
Figura 4.13 En esta imagen se muestran los parámetros característicos de un alacrán Infamatus macho; a) Alacrán completo b) Conteo pectinal y esternón triangular, c) Carapacho poco pigmentado d) Franjas dorsales del mismo ancho.
55
En la figura 4.14 que se muestra a continuación, se presenta la clasificación de un Vaejovidae, el
cual se localiza generalmente en el estado de Guanajuato, esta familia de alacranes se distingue,
primeramente como Vaejovidae por la coloración que tiene en el carapacho, en donde no se
distinguen franjas a lo largo de él y generalmente es oscuro en su totalidad (imagen 4.14c), un
segundo parámetro que nos indica que es Vaejovidae se distingue porque en la parte dorsal no
tiene un rayado a lo largo del mesosoma (imagen 4.14d), el conteo pectinal nos dice si es hembra
o macho, en este caso se cumple que sea una hembra.
Figura 4.14 En esta imagen se muestran los parámetros característicos de un alacrán Vaejovidae hembra; a) Alacrán completo, b) Conteo pectinal y esternón pentagonal, c) Carapacho oscuro en su totalidad, sin franjas visibles, d) Sin franjas dorsales distinguibles.
56
4.6 Identificación mediante ADN
Un segundo método de identificación utilizado fue mediante el ADN, el cual se hizo para una
muestra de 5 alacranes, para el cual se utilizó un kit llamado "ZR Tissue & Insect DNA Miniprep",
este kit ayuda a la separación del ADN de los tejidos del alacrán, en donde una vez obtenidas las
moléculas del ADN, se realiza una secuenciación, para poder saber a qué genero de alacrán
pertenece. Para esto se realiza una comparación de la secuenciación con una base de datos ya
existente en una página de internet [17], la cual nos da una comparación entre la secuencia de
nuestro ADN con su base de datos, cabe mencionar que para este análisis mediante ADN se
utilizaron 5 especímenes los cuales, según la clasificación mediante su morfología, se encontró
que tres pertenecían al género Infamatus, 1 al género Ornatus y el último a la familia Vaejovidae,
donde el objetivo es ver qué tan eficaz es el método de caracterización morfológica comparado
con el método de caracterización mediante ADN.
Figura 4.15 En esta imagen se muestra el blast de uno de los alacranes.
57
En la figura 4.15 se realizó un blast (comparación de ADN con la base de datos), de uno de los
alacranes. En esa imagen se muestran los resultados posibles de la comparación de la secuencia
de nuestra muestra de ADN con la secuencia de ADN de varios alacranes, donde la primera línea
en rojo representa la secuencia de nuestro alacrán, y las demás representan las secuencias de
otros especímenes, esta gráfica nos dice que las líneas que en longitud más se parecen
representan las secuencias que más coinciden con nuestra muestra.
Figura 4.16 Resultados de la comparación del blast.
En la figura 4.16 se muestra una imagen de los resultados de la comparación obtenida en el blast,
en este caso este archivo nos entrega una descripción del espécimen y una columna donde nos
proporciona el porcentaje de identidad con nuestra muestra, y aquí es donde podemos distinguir
a que espécimen pertenece, en este caso al comparar los valores y el tipo de alacrán se puede
llegar a la conclusión de que pertenece al género infamatus, con un valor del 100% de igualdad
en la secuenciación y un 89% de identidad.
58
En la figura 4.17 se presenta el tercer archivo que genera el blast, en este archivo se aprecia la
comparación de cada una de las secuencias, letra a letra, con la secuencia de la muestra; cuando
existe una coincidencia se marca una línea que une la coincidencia entre las letras, y cuando se
ve un hueco no existe esa coincidencia, aquí también se puede ver que tan idénticas son las
secuencias.
Una vez identificados los especímenes se realiza una comparación entre las muestras para saber
si son idénticas y todas son del mismo género, esto se realiza con un programa llamado Bioedit
(figura 4.18), el cual se encarga de alinear las secuencias para una posible comparación, pero
también se utiliza para realizar un árbol genealógico.
Figura 4.17 Imagen donde se muestra la comparación de las secuencias.
59
Figura 4.18 Comparación de las secuencias de ADN, para generar el árbol genealógico.
Figura 4.19 Árbol genealógico.
60
En la figura 4.19 se muestra la creación del árbol genealógico a partir de las secuencias obtenidas
con el programa Bioedit, en este caso las muestras que analizamos resultaron ser del genero
Infamatus y una del género Vaejovidae, como se muestra en la figura. El resultado final del análisis
muestra cuatro especímenes Infamatus y uno Vaejovidae, que comparado con nuestra
clasificación mediante morfología (tres Infamatus, 1 Ornatus y 1 Vaejovidae, ver tabla 4.1),
podemos decir que el método de caracterización mediante morfología es relativamente confiable
ya que solo se tuvo el error de un espécimen con respecto a 5 estudiados, lo que sugiere ser un
método rápido y económico respecto al método mediante ADN, ya que para clasificar un
espécimen mediante ADN se llega a tardar un periodo de tiempo de hasta tres semanas o un mes
y es costoso, en cambio un método mediante caracterización morfológica tarda un tiempo de 5 a
10 minutos y no tiene costo alguno. No obstante, debe observarse que el método de clasificación
morfológica tiene un grado de error. En nuestro caso, la clasificación con el método de
características morfológicas solo fue exitosa para cuatro de cinco especímenes (80 % de
clasificación correcta). Esto puede tener influencia (representar una fuente de error importante)
sobre los resultados que se presentarán más adelante.
Espécimen Caracterización mediante ADN Caracterización morfológica
3 Infamatus Infamatus
5 Infamatus Infamatus
11 Infamatus Infamatus
14 Vaejovidae Vaejovidae
16 Infamatus Ornatus
Tabla 4.1 Comparación de los resultados de caracterización mediante ADN y caracterización morfológica.
61
Capítulo V
5. Resultados
5.1 Resultados del método de digitalización de
imágenes
Para este estudio se usó una muestra de 18 especímenes, de los cuales, de acuerdo a su
clasificación morfológica, 9 eran Infamatus hembra, 4 Infamatus macho, 2 Ornatus macho, 1
Ornatus hembra y 2 Vaejovidae, en la tabla 5.1 se muestran los datos de los especímenes
utilizados para este estudio. En esta tabla se da información sobre el sexo, genero, peso y tamaño
del espécimen, los colores que se presentan en esta tabla ayudan a diferenciar entre sexo, género
y familia a los especímenes en estudio, así por ejemplo el rosa es para los Infamatus hembras, el
azul para los Infamatus machos, el rojo para Ornatus hembra, el verde para Ornatus macho y el
blanco para la familia Vaejovidae.
Tabla 5.1 Datos de los especímenes utilizados en esta parte del experimento.
ESPECIMEN SEXO GENERO FAMILIA PESO
(mg)
COMPLETO
(cm)
Ancho
(mm)
MESOSOMA
(mm)
1 Hembra C. Infamatus Buthidae 274.2 4.9 6 8
2 Hembra C. Infamatus Buthidae 381.2 6 8 9
3 Hembra C. Infamatus Buthidae 229.6 4.9 6 7
62
4 Macho C. Infamatus Buthidae 278.1 5.1 6 7
5 Macho C. Infamatus Buthidae 194.3 4.6 5 6.5
6 Hembra C. Infamatus Buthidae 231.2 4.6 6 7
7 Hembra C. Infamatus Buthidae 377.9 5.8 6 8
8 Macho C. Ornatus Buthidae 219.4 4.9 6 7
9 Macho C. Infamatus Buthidae 336.7 5.3 6 9
10 Hembra C. Ornatus Buthidae 200 4.2 6 7
11 Hembra C. Infamatus Buthidae 198.3 4.5 5 8
12 Hembra C. Infamatus Buthidae 172.1 3.9 7 7
13 Hembra C. Infamatus Buthidae 237.4 4.5 5 7
14 Vaejovidae 628.4 5.4 9 12
15 Macho C. Infamatus Buthidae 338.7 6.3 7 10
16 Macho C. Ornatus Buthidae 184.6 4.9 6 8
17 Vaejovidae 926.5 7.4 1 12
18 Hembra C. Infamatus Buthidae 111.2 4.6 5 7
Como se comentó anteriormente, las fotografías de cada espécimen se tomaron bajo un arreglo
experimental (Figura 3.7) con lámparas UV, que tienen un espectro de emisión con una banda
principal en 369 nm, y dos pequeños picos en 404 y 437 nm, como se muestra en la figura 5.1.
63
Figura 5.1 Espectro de emisión de las lámparas UV.
A manera de ejemplo, en la Figura 5.2 se muestra el espectro de absorción de un alacrán
Infamatus vivo, usando para ello un porta ejemplar (que consistía en una caja de acrílico de 10 x
3 x 4 cm, en donde se colocó el ejemplar sin ocasionarle ningún daño) adaptado al
espectrofotómetro, esto se hizo con el objetivo de saber cuál sería una fuente adecuada de
excitación para generar fluorescencia en los pigmentos de su cuerpo. En el espectro obtenido se
puede observar un punto máximo de absorción en una longitud de onda de 393 nm.
200 300 400 500
3
6
9
12
Ab
so
rcio
n
Longitud de onda (nm)
200 300 400 500 600
15000
30000
45000
60000
In
ten
sid
ad
(u
.a.)
Longitud de onda
Espectro de emision de lampara UV
369 nm
404 nm
437 nm
64
Figura 5.2 Gráfica que presenta el espectro de absorción del cuerpo de un espécimen vivo (infamatus).
En la figura 5.3, se muestra la gráfica del espectro de emisión de un alacrán Infamatus vivo, el cual
fue excitado con una fuente de luz láser de 405 nm (apuntador láser), este espectro muestra un
punto máximo de emisión de fluorescencia centrado en una longitud de onda de 506 nm, este
espectro será utilizado para realizar una comparación con los espectros obtenidos de la solución
de la extracción molecular. Debe resaltarse que la intensidad de radiación láser sobre el cuerpo
del alacrán fue mínima sobre su dorso, para evitar incidencia sobre sus órganos sensoriales.
300 400 500 600 700
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
In
ten
sid
ad
Longitud de onda (nm)
Figura 5.3 En esta gráfica se muestra el espectro de emisión de un alacrán vivo, el cual muestra una fluorescencia con una longitud de onda máxima en 506nm.
Antes de comenzar a tomar las fotografías y para asegurar que la potencia entregada por las
lámparas era constante a lo largo de toda el área donde se colocaría el espécimen, se realizó un
mapeo de dicha intensidad sobre una cuadrícula. Para ello se colocó un medidor de potencia cuyo
detector era de área pequeña (Thorlabs M00215012) y este se recorrió cada medio centímetro a
65
través de la matriz formada por una cuadrícula, tomando la lectura generada por la potencia en
esa coordenada. Al final del recorrido se tomaron esas potencias y se graficaron para darnos una
idea de la homogeneidad de la intensidad de las lámparas en la zona de estudio, teniendo como
resultado la gráfica de la figura 5.4.
2 4 6
320
360
400
440
480
520
2
4
6
Po
ten
cia
mic
row
atts
Coo
rden
ada
Y (c
m)
Coordenada X (cm)
Figura 5.4 Gráfica de las intensidades de la lámpara UV, en un mapeado de 2 por 7 centímetros.
Al observar la gráfica se puede ver fácilmente que existe un área donde la potencia lumínica
permanece casi constante, esta área corresponde a la parte más baja mostrada en la gráfica. En
dicha región (delimitada por la coordenadas 0 ≤x ≤6, 1≤ y ≤3) la iluminación o potencia lumínica
se mantiene constante a lo largo de la coordenada en “x” y tiene variaciones menores del 3 %
sobre el eje “y”. Por lo que en esa zona se colocaron los especímenes, para tomar las fotografías.
Cada uno de los especímenes en cuestión se colocó debajo de esta área y fue fotografiado,
después las fotos fueron procesadas primero con Photoshop para recortar el fondo de cada una
de ellas y solo quedara la imagen del cuerpo, después se procesaron con el programa ImageJ para
convertirlas a imágenes en escala de grises y obtener sus histogramas de intensidad, y por último
se graficaron en Matlab para reconstruir la imagen asignando un color a cada píxel dependiendo
66
de su valor en la escala de grises. Las imágenes se obtuvieron en dos etapas, la primera de ellas
consistió en fotografiar a los especímenes cuando están vivos y la segunda etapa corresponde a
fotografiar a los especímenes cuando tenían 15 días de sacrificados (lo cual se hizo introduciendo
a los especímenes a un refrigerador por un periodo de 2 horas).
A continuación se muestran las imágenes obtenidas de la primera etapa del análisis de las
fotografías digitales, estas fotos son a colores, tomadas cuando el alacrán es iluminado con luz
ultravioleta. En las Figuras 5.5 y 5.6 se muestran las fotografías de alacranes Ornatus vivos,
hembra y macho, respectivamente, en tanto que en las Figuras 5.7 y 5.8 se presentan los
respectivos casos para alacranes Infamatus.
Figura 5.5 Imagen de un alacrán Ornatus hembra vivo, bajo las lámparas UV.
67
Figura 5.6 Imagen de un alacrán Ornatus macho vivo, bajo las lámparas UV.
Figura 5.7 Imagen de un alacrán Infamatus hembra vivo, bajo las lámparas UV.
68
Figura 5.8 Imagen de un alacrán Infamatus macho vivo, bajo las lámparas UV.
En las imágenes anteriores se puede notar a simple vista cómo en la parte que corresponde al
metasoma, a través de las quillas dorsales y en las pinzas y quelas, existe una mayor intensidad
de la fluorescencia, que no se nota en el cuerpo restante del alacrán. Para verificar esta
observación, se procedió a analizar la intensidad registrada en cada píxel de las fotografías. Antes
de analizar la intensidad por píxel, las imágenes fueron tratadas con Photoshop para recortar la
imagen del cuerpo del alacrán para posteriormente convertirla a imágenes de 8 bits (escala de
grises).
Como ejemplo de este procedimiento, se presenta la imagen del caso del alacrán Ornatus hembra
en donde en la figura 5.9 se muestra la imagen del alacrán sin fondo, esto es que solo se tiene un
valor de píxel del cuerpo del alacrán, en la figura 5.10 se muestra la imagen en un formato de 8
bits.
69
Figura 5.9 Imagen de un alacrán Ornatus hembra vivo, sin contorno de la imagen.
Figura 5.10 Imagen de un alacrán Ornatus hembra vivo, en formato de 8 bits.
0
50
100
150
200
250
70
Después de la conversión a un formato de 8 Bits, se obtuvieron las matrices de intensidad de las
imágenes y se graficaron con el comando contourf de Matlab, este comando grafica los valores
de una matriz y les asigna un color dependiendo de su valor. Como ejemplo de los resultados
obtenidos, las siguientes figuras muestran los casos analizados para alacranes de la familia
Buthidae, género Centruroides Ornatus y sexo hembra (figura 5.11), género Centruroides
Infamatus macho (figura 5.12) y de la familia Vaejovidae (hembra) (Figura 5.13). Cabe mencionar
que en las figuras graficadas con Matlab las graduaciones en la parte inferior y lateral izquierda
corresponden al tamaño de la imagen en función de la cantidad de píxeles, por ejemplo la figura
5.11 es una imagen de tamaño correspondiente a 1200 x 900 píxeles.
Figura 5.11 Gráfica de la matriz de 8 bits de un alacrán Ornatus hembra vivo.
200 400 600 800 1000 1200
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0
50
100
150
200
250
71
Figura 5.12 Gráfica de la matriz de 8 bits de un alacrán Infamatus macho vivo.
Figura 5.13 Gráfica de la matriz de 8 bits de un alacrán Vaejovidae hembra vivo.
100 200 300 400 500 600 700 800
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
0
50
100
150
200
250
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
100
200
300
400
500
600
0
50
100
150
200
250
72
En las gráficas anteriores (figura 5.11, 5.12 y 5.13) el comando de Matlab utilizado toma el valor
del píxel y le asigna un color de acuerdo a la escala de intensidad mostrada al lado derecho de la
imagen; así para un valor de 255 (en la escala de grises) que corresponde a un color blanco (en
dicha escala de grises), Matlab asigna un color rojo oscuro en esta nueva figura; de la misma
forma, un valor de 0 (en la escala de grises) que corresponde a un color negro, Matlab asigna un
color azul oscuro. De lo anterior, podemos decir que un valor de píxel cercano al 255, en una
escala de grises correspondería a un color más brillante, que en nuestra nueva imagen procesada
serían los colores más hacia el rojo.
En cada una de las imágenes se ve como en la parte de las pinzas, quelas y quillas dorsales, la
fluorescencia emitida es más intensa; por ejemplo en las figuras 5.11 y 5.12 el color máximo
alcanzado es cian que corresponde a un valor de 100 en las escalas de grises, mientras que en la
figura 5.13 se alcanza un color amarillo verdoso el cual corresponde a un valor de 160
aproximadamente. Cabe mencionar que en esta última imagen no se utilizó ningún tipo de filtro
de atenuación (ya que en la imágenes 5.11 y 5.12 se utilizó un filtro de densidad óptica de 0.4)
para la intensidad de fluorescencia recolectada por la cámara (ver descripción del arreglo
experimental), esto sugiere que la imagen del ultimo alacrán correspondiente a la familia
Vaejovidae tiene una intensidad de fluorescencia menor que los correspondientes a la familia
Buthidae.
El fenómeno donde se observa una mayor intensidad de fluorescencia es en las pinzas, quelas y
quillas de los alacranes, se repite en todos los especímenes estudiados sin importar el sexo,
género (Ornatus o Infamatus) o familia al que pertenecen los alacranes. También, como se
comentó anteriormente, el alacrán Vaejovidae emite una cantidad menor de fluorescencia
respecto a los alacranes Centruroides.
Como segunda etapa se realizó el mismo análisis pero con alacranes muertos, en donde a modo
de ejemplo se muestran algunas imágenes de ellos, en la figura 5.14 y 5.15 se presenta la
fotografía de un alacrán Infamatus hembra y macho, respectivamente, en la figura 5.16 y 5.17 se
muestra la fotografía de un alacrán Ornatus macho y hembra, respectivamente, y en la figura 5.18
se muestra la fotografía de un alacrán perteneciente a la familia Vaejovidae.
73
Figura 5.14 Imagen de un alacrán Infamatus hembra, bajo las lámparas UV.
Figura 5.15 Imagen de un alacrán Infamatus macho, bajo las lámparas UV.
Figura 5.16 Imagen de un alacrán Ornatus macho, bajo las lámparas UV.
74
Figura 5.17 Imagen de un alacrán Ornatus hembra, bajo las lámparas UV.
Figura 5.18 Imagen de un alacrán Vaejovidae, bajo las lámparas UV.
Nuevamente, y como se esperaba, la máxima emisión de fluorescencia proviene de la parte
correspondiente al metasoma, a través de las quillas dorsales, en las pinzas y quelas. De la misma
forma las imágenes originales se trataron con Photoshop para quitar el fondo de la imagen y dejar
75
solo la parte correspondiente al cuerpo del alacrán (figura 5.19), se cargaron nuevamente en
Matlab y se convirtieron a imágenes de 8 bits (escala de grises figura 5.20), obteniéndose
resultados similares a los obtenidos con los especímenes vivos. Este procedimiento se realizó con
la finalidad de verificar que las propiedades de emisión de fluorescencia en los ejemplares vivos
y muertos era la misma.
Figura 5.19 Imagen de un alacrán Infamatus macho, tratada con Photoshop.
Figura 5.20 Imagen de un alacrán Infamatus macho en formato de 8 bites.
Después de la conversión a un formato de 8 Bits, se obtuvieron las matrices de las imágenes y se
graficaron con el comando contourf de Matlab, este comando grafica los valores de una matriz y
les asigna un color dependiendo de su valor, ver figuras 5.21 y 5.22.
0
50
100
150
200
250
76
Figura 5.21 Gráfica de la matriz de 8 bits de un alacrán Infamatus macho.
Figura 5.22 Grafica de la matriz de 8 bits de un alacrán de la familia Vaejovidae.
200 400 600 800 1000 1200
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
200 400 600 800 1000 1200 1400
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
77
De la misma forma que se realizó el análisis de las imágenes digitales de los alacranes vivos, el
análisis se repite con alacranes muertos, en este caso las imágenes mostradas anteriormente
(figura 5.21, 5.22) corresponden a la familia Buthidae, género Centruroides Infamatus macho, y
familia Vaejovidae.
En cada una de las imágenes se ve nuevamente cómo en la parte de las pinzas, quelas y quillas
dorsales, muestran intensidades más altas, correspondientes a esas partes del cuerpo del alacrán,
por ejemplo en la figura 5.21 se alcanzan colores en amarillo y anaranjado correspondiente a
valores entre 120 y 140, y en la figura 5.22 se alcanza un color amarillo verdoso correspondiente
a un valor de 100. En este caso se verifica la conclusión a la cual se llegó en la primera parte del
análisis, la cual corresponde a que el alacrán Vaejovidae tiene una intensidad de fluorescencia
menor que los alacranes de la familia Buthidae. Es preciso mencionar nuevamente que para la
adquisición de la imagen 5.22 (alacrán Vaejovidae) no se utilizó ningún tipo de filtro para atenuar
la intensidad de fluorescencia detectada, en tanto que para la figura 5.21 (alacrán Infamatus) la
intensidad fue atenuada con un filtro de densidad óptica (OD) de 0.4.
Después de haber realizado el análisis de las imágenes digitales de alacranes vivos y muertos, de
la misma familia y género, pero de diferentes especies y sexos, pudimos observar que la
intensidad más alta en todos los casos corresponde a la misma zona del cuerpo del alacrán: pinzas,
quelas y quillas dorsales.
Para la última parte del análisis de las imágenes digitales se realizó un histograma de las
repeticiones de las diferentes intensidades detectadas en los píxeles que conforman la matriz de
cada imagen, correspondiente a cada alacrán utilizado para este estudio (ver tabla 5.1, donde se
presenta la lista completa de especímenes estudiados y sus características). Esto se hizo con la
finalidad de ver si existe una correlación entre la intensidad de fluorescencia emitida por cada
espécimen con el tamaño del cuerpo completo de alacrán o con el sexo del mismo, este
histograma fue realizado con el programa Imagej, obteniendo los resultados que se presentan en
la figura 5.23.
78
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
Repeticio
nes
Valores en la escala de grises
Figura 5.23 Gráfica de los histogramas de las repeticiones de las diferentes intensidades en los píxeles que conforman la matriz de la imagen de 8 bits.
En la figura 5.23 cada histograma corresponde a cada uno de los especímenes, en donde se
muestra que el mayor número de repeticiones de las diferentes intensidades para cada uno de
ellos corresponden a intensidades de grises entre 60 y 140. Para realizar un análisis más detallado
de la intensidad de fluorescencia emitida por los alacranes (Fig. 5.23) se obtuvo el área bajo la
curva de los histogramas y en la figura 5.24 se muestra dicha área bajo la curva graficada contra
el número de espécimen, en donde con diferentes símbolos se denota a los alacranes Infamatus
y Ornatus (machos y hembras) así como a los alacranes Vaejovidae.
79
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
105000
140000
175000
210000
245000
280000
315000
350000
Infamatus hembra
Infamatus macho
Ornatus hembra
Ornatus macho
Vaejovidae
Are
a b
ajo
la
cu
rva
Numero de especimen
140000
Figura 5.24 Relación entre el número de espécimen y el
área bajo la curva, obtenida de los histogramas tomados
de los valores de intensidad.
En la figura 5.24 se puede notar que en general no existe una diferencia notable o tendencia
apreciable entre las intensidades de machos y hembras de un género, al contrario, si en la gráfica
se dibuja una línea cerca del valor 140000 (este valor utilizado se obtuvo al promediar las áreas
bajo la curva de los histogramas obtenidos) sobre el eje “y”, se puede ver que la intensidad de los
alacranes se mantiene en un promedio constante sin importar si son Infamatus u Ornatus y más
aun sin son machos o hembras, o de otra familia como es el caso de los especímenes Vaejovidae.
En la figura 5.25 se graficó el área bajo la curva de los histogramas de la figura 5.23 como función
del tamaño del alacrán. En este caso se puede ver una relación lineal creciente, esto es que a
mayor tamaño existe una mayor intensidad. Llama la atención el hecho de que el alacrán de
mayor tamaño, un Vaejovidae de 7.4 cm de largo (espécimen 17 en la tabla 5.1), tiene la máxima
intensidad detectada, en tanto que el otro alacrán Vaejovidae de 5.4 cm largo (espécimen 14 en
la tabla 5.1) está entre los alacranes con mayor intensidad detectada. No obstante, como se
concluyó de los datos de las figuras 5.13 y 5.22, estos alacranes son los que mostraron menor
80
intensidad por píxel que los alacranes Centruroides, de lo que se deduce que los alacranes
Vaejovidae a pesar de su baja fotoluminiscencia sobresalen de los alacranes Centruroides en la
figura 5.25 debido a su gran tamaño, mas no una mayor concentración de pigmento en su
epicutícula.
3 4 5 6 7 8
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000 Infamatus hembra
Infamatus macho
Ornatus hembra
Ornatus macho
Vaejovidae
Are
a b
ajo
la
cu
rva
Tamano completo del alacran (cm)
Figura 5.25 Relación entre el número de espécimen y el área bajo la curva obtenida de los histogramas tomados de los valores de las escalas de grises.
Por otra parte, de los valores de escala de grises correspondientes a los picos máximos de los
histogramas de la figura 5.23, también se deduce que existe una diferencia de intensidades entre
las familias Centruroides y Vaejovidae, mostrando una mayor intensidad para los alacranes
Centruroides Infamatus u Ornatus, que para los alacranes de la familia Vaejovidae (ver figura
5.26).
81
-4 0 4 8 12 16 20
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
Va
lor
en
esca
la d
e g
rise
s
Infamatus hembra
Infamatus macho
Ornatus hembra
Ornatus macho
Vaejovidae
Numero de especimen
Familia Buthidae
Familia Vaejovidae
Figura 5.26 Relación entre el valor de la intensidad máxima de escala de grises en las fotografías tomadas para la familia Centruroides y la familia Vaejovidae.
Para estudiar si existe una diferenciación en la intensidad de fluorescencia en pinzas, quelas y
quillas dorsales en función de género o familia de alacranes, se realizó un estudio más, el cual
consistió en tomar las imágenes de los alacranes y seccionar la parte correspondiente al
mesosoma. La imagen obtenida sin la parte del mesosoma se trató nuevamente en escala de
grises y del histograma correspondiente se obtuvo el área bajo la curva y se graficó contra el
numero de espécimen y contra el tamaño del alacrán, estos resultados se muestran en la figura
5.27.
82
4 5 6 7 8
100000
200000
300000
400000
500000
600000
0 8 16
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
Are
a b
ajo
la
cu
rva
Numero de especimen
Infamatus hembra
Infamatus macho
Ornatus hembra
Ornatus macho
Vaejovidae
Are
a b
ajo
la
cu
rva
Tamano de especimen (cm)
A
B
Figura 5.27 A) Relación entre el tamaño del espécimen y el área bajo la curva, obtenida de los histogramas de la imagen sin considerar la emisión del mesosoma. B) Relación entre el número de espécimen y el área bajo la curva, obtenida de los histogramas de la imagen sin considerar la emisión del mesosoma.
En la figura 5.27 B, se puede observar que no existe alguna relación entre el área bajo la curva
obtenida de las imágenes de los alacranes sin la parte del mesosoma y el número de espécimen,
lo que indica que en promedio la intensidad de fluorescencia es constante, mientras que en la
figura 5.27 A, existe una relación lineal entre el área bajo la curva y el tamaño del espécimen, esto
es que entre más grande es el espécimen mayor es la intensidad de la fluorescencia, este
resultado es importante ya que las imágenes tratadas no tenían la parte del mesosoma, por lo
que aun sin esta parte del cuerpo (que abarca gran parte del cuerpo), la relación entre la
intensidad de fluorescencia y el tamaño del alacrán se conserva.
83
5.2 Resultados del método de extracción
molecular
Para el método de extracción molecular en total se utilizaron 30 especímenes de los cuales 8 eran
Infamatus machos, 15 Infamatus hembra, 3 Ornatos macho, 2 Ornatus hembra y 2 Vaejovidae
(ver tabla 5.2). Los colores que se presentan en esta tabla ayudan a diferenciar entre sexo, género
y familia a los especímenes en estudio, así por ejemplo el rosa es para los Infamatus hembras, el
azul para los Infamatus machos, el rojo Ornatus hembra, el verde para Ornatus macho y el blanco
para la familia Vaejovidae. Los especímenes del 1 al 18 fueron los mismos que se utilizaron para
el estudio de la fluorescencia mediante el método de digitalización de imágenes.
Tabla 5.2 Datos de especímenes utilizados en la sección de extracción molecular.
ESPECIMEN SEXO GENERO FAMILIA PESO
(mg)
TAMAÑO
(cm)
Ancho
(mm)
MESOSOMA
(mm)
1 Macho C. Infamatus Buthidae 465.49 5.7 7 9
2 Macho C. Infamatus Buthidae 551.45 6 7 10
3 Macho C. Ornatus Buthidae 537.26 5.5 7 9
4 Hembra C. Ornatus Buthidae 415.8 4.7 6 8
5 Hembra C. Infamatus Buthidae 416.26 4.6 6 8
6 Macho C. Infamatus Buthidae 380 5.4 7 9
7 Hembra C. Infamatus Buthidae 351.69 3.9 6 9
8 Hembra C. Infamatus Buthidae 382.14 4 6 9
9 Macho C. Infamatus Buthidae 371.56 5.1 7 9
84
10 Hembra C. Infamatus Buthidae 187.51 3.3 5 7
11 Hembra C. Infamatus Buthidae 200.68 3.5 5 7
12 Hembra C. Infamatus Buthidae 155.14 3.5 5 7
13 Hembra C. Infamatus Buthidae 274.2 4.9 6 8
14 Hembra C. Infamatus Buthidae 381.2 6 8 9
15 Hembra C. Infamatus Buthidae 229.6 4.9 6 7
16 Macho C. Infamatus Buthidae 278.1 5.1 6 7
17 Macho C. Infamatus Buthidae 194.3 4.6 5 6.5
18 Hembra C. Infamatus Buthidae 231.2 4.6 6 7
19 Hembra C. Infamatus Buthidae 377.9 5.8 6 8
20 Macho C. Ornatus Buthidae 219.4 4.9 6 7
21 Macho C. Infamatus Buthidae 336.7 5.3 6 9
22 Hembra C. Ornatus Buthidae 200 4.2 6 7
23 Hembra C. Infamatus Buthidae 198.3 4.5 5 8
24 Hembra C. Infamatus Buthidae 172.1 3.9 7 7
25 Hembra C. Infamatus Buthidae 237.4 4.5 5 7
26 Vaejovidae 628.4 5.4 9 12
27 Macho C. Infamatus Buthidae 338.7 6.3 7 10
28 Macho C. Ornatus Buthidae 184.6 4.9 6 8
85
29 Vaejovidae 926.5 7.4 1 12
30 Hembra C. Infamatus Buthidae 111.2 4.6 5 7
5.3 Absorción
Del método realizado para extracción molecular, se obtuvieron soluciones transparentes, ver
figura 5.28.
Figura 5.28 Imagen de las soluciones obtenidas de la extracción molecular.
Las soluciones obtenidas muestran fluorescencia cuando se les hace incidir una luz UV de 405 nm
de longitud de onda, la cual se obtiene de un apuntador láser, como se muestra en la figura 5.29.
86
Figura 5.29 Imagen donde se muestra la fluorescencia que presentas las soluciones obtenidas de la extracción molecular.
Una vez obtenidas las soluciones de la extracción molecular, se procedió a medir sus espectros
de absorción y emisión para estudiar si existe una correlación entre el género, tamaño y sexo del
alacrán contra los máximos de emisión o absorción. Debe observarse que en este caso la
extracción se hizo a partir del mismo tamaño de muestra (la cual corresponde a una disección del
mesosoma del alacrán una vez que fue sacrificado).
Los espectros de absorción se midieron en una celda de cuarzo de un centímetro cuadrado de
base, se colocaron 3ml de solución de cada una de las muestras. En la figura 5.30 A se muestran,
a manera de ejemplo, los espectros de absorción de un Infamatus hembra, un Infamatus macho,
un Ornatus hembra, un Ornatus macho y un Vaejovidae.
87
250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
220 230 240 250 260 270 280 290 300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Absorc
ion
Longitud de onda (nm)
Ab
sorc
ion
Longitud de onda (nm)
Macho Infamatus
Hembra Infamatus
Hembra Ornatus
Macho Ornatus
Vaejovidae
A B
Figura 5.30 A) Gráfica de los espectros de absorción de los pigmentos extraídos de los cuerpos de alacranes Infamatus, Ornatus y Vaejovidae. B) Gráfica de los espectros de absorción normalizados de los pigmentos extraídos de los cuerpos de alacranes Infamatus, Ornatus y Vaejovidae.
En la figura 5.30 B se muestran los espectros de absorción normalizados al valor máximo de
absorción, en esta figura se puede ver que los espectros de absorción correspondientes a los
alacranes Infamatus (hembra y macho) tienen un máximo en 263 y 262 nm. Mientras que los
alacranes Ornatus (hembra y macho) presentan una absorción máxima a una longitud de onda de
250 y 260 nm. Para el espécimen Vaejovidae se presenta una absorción máxima en una longitud
de onda de 255 nm. De todos los espectros de absorción, la longitud de onda de su valor máximo
oscila entre 250 y 263 nm, por lo estos espectros son muy parecidos y es difícil poder diferenciar
entre ellos. Por esto se necesita procesar los espectros de tal forma que nos ayude a diferenciar
entre la absorción estos especímenes, el cual será tratado más adelante con un análisis de PCA.
En la literatura se reporta que una molécula causante de la fluorescencia en alacranes
Centruroides Vittatus es la β-carbolina [7], en la figura 5.31 se muestra su estructura molecular.
88
Figura 5.31 Estructura molecular de β-carbolina.
Esta molécula fue encontrada en una solución de etanol cuando en ella se depositaron alacranes
Vittatus, la cual presenta un espectro de absorción con un pico máximo cerca de los 360 nm, ver
figura 5.32.
Figura 5.32 Espectro de absorción de la molécula β-carbolina.
Al comparar los espectros de absorción obtenidos (figura 5.30 A) con el espectro de absorción de
la molécula β-carbolina (figura 5.32), se puede observar que existe una gran diferencia (cerca de
100 nm) entre sus longitudes de onda de su absorción máxima ya que nuestros espectros oscilan
entre un valor de 250 a 263 nm, mientras que el de la molécula β-carbolina tiene un pico máximo
en 360 nm. Esto sugiere que en la solución que se obtuvo con nuestro método de extracción
molecular no se encuentra presente dicha molécula. Por otra parte, llama la atención que el
89
máximo de absorción obtenido directamente del cuerpo de un alacrán infamatus (393nm, ver
figura 5.26) es más cercano al valor reportado de 360 nm reportado para un alacrán Vittatus.
Es de interés saber si la concentración de pigmento en los cuerpos de los alacranes guarda una
relación con alguna de sus características específicas (tamaño, género, familia). De todos los
espectros obtenidos se consideró la intensidad registrada a 263 nm, la cual se utilizó por ser el
valor más cercano al máximo del espectro de absorción. En la figura 5.33 se muestra la absorción
a esta longitud de onda de las soluciones obtenidas de todos los alacranes como función de
tamaño de cada uno de ellos; de esta grafica se observa que no existe una relación entre la
absorción y el tamaño del alacrán, por lo que podríamos decir que la absorción no depende del
tamaño del alacrán, esto es que, sin importar el tamaño, la absorción se mantiene en promedio
constante. En otras palabras, se podría decir que la concentración del pigmento contenido en el
cuerpo del alacrán es constante sin importar su tamaño.
3 4 5 6 7 8
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0 Infamatus hembra
Infamatus macho
Ornatus Hembra
Ornatus Macho
Vaejovidae
Absorc
ion
Tamano completo (cm)
Figura 5.33 Gráfica donde se muestran la absorción a 263 nm de las soluciones obtenidas de todos los alacranes contra el tamaño completo del alacrán.
90
5.4 Análisis de las componentes principales
(ACP) para espectros de absorción
Se realizó un segundo análisis a los espectros de absorción, denominado ACP, que es una técnica
estadística de síntesis de la información, o reducción de la dimensión (número de variables). Es
decir, ante un banco de datos con muchas variables, el objetivo será reducirlas a un menor
número perdiendo la menor cantidad de información posible. Los nuevos componentes
principales o factores serán una combinación lineal de las variables originales, y además serán
independientes entre sí.
Un aspecto clave en ACP es la interpretación de los factores, ya que ésta no viene dada a priori,
sino que será deducida tras observar la relación de los factores con las variables iniciales (habrá,
pues, que estudiar tanto el signo como la magnitud de las correlaciones). Esto no siempre es fácil,
y será de vital importancia el conocimiento que el experto tenga sobre la materia de investigación.
Este método fue aplicado a los espectros de absorción, graficando el número de espécimen contra
la longitud de onda en un rango de 220 a 499 nm, en la figura 5.34 se muestran los resultados
obtenidos. Se puede observar (figura 5.34) que la mayor parte de los especímenes Infamatus
machos se encuentran del lado derecho del plano, mientras que la mayoría de los Infamatus
hembras se encuentran del lado Izquierdo del plano, y por último los del género Vaejovidae se
encuentran del lado derecho del plano. Esto sugiere que quizá pueda existir una característica
distintiva en los espectros de absorción entre cada género y sexo de los alacranes, aunque el
resultado aquí obtenido no es estadísticamente significativo.
91
-2 0 2 4
-0,5
0,0
0,5
1,0
Macho Infamatus
Hembra Infamatus
Ornatus
Vaejovidae
CP
2
CP1
Figura 5.34 Gráfica de los resultados obtenidos de los ACP de los espectros de absorción de cada muestra.
92
5.5 EMISION
Una vez analizados los espectro de absorción se tomaron los espectros de emisión de las
soluciones obtenidas de los alacranes, los cuales, como antes se mencionó, se midieron en un
arreglo óptico mediante un espectrómetro, utilizando como fuente de excitación un apuntador
láser a 405 nm (ver el arreglo experimental en las figuras 3.8 y 3.9).
En la figura 5.35 se muestran, a modo de ejemplo, los espectros de emisión de 5 alacranes
(Infamatus hembra y macho, Ornatus hembra y macho y un Vaejovidae), donde se puede notar
que muestran un máximo de emisión entre los 498 y 515 nm. Al igual que en el caso de absorción,
en estos espectros de emisión se observan diferencias distintivas entre cada uno de ellos, por
ejemplo, en los valores de intensidad y en los valores de longitud de onda en los que se observa
el máximo de emisión.
300 400 500 600 700
0
100
200
300
400
500
600
700
Em
isio
n
Longitud de onda (nm)
Infamatus macho
Ornatus macho
Infamatus hembra
Ornatus hembra
Vaejovidae
Figura 5.35 Gráfica donde se muestra los espectros de emisión de la solución obtenida de la extracción molecular.
93
El espectro de emisión de un alacrán Infamatus vivo (figura 5.27) mostró un espectro de emisión
con un pico máximo cerca de los 506 nm, mientras que la solución de la extracción molecular para
alacranes Infamatus (figura 5.35) mostraron picos máximos en 498 y 502 nm (hembra y macho,
respectivamente). La diferencia entre estos valores máximos es de 4 a 8 nm, con lo que podemos
concluir que la molécula causante de la fluorescencia en la epicutícula del alacrán esta presenta
en las soluciones obtenidas.
Al comparar todos los espectros de emisión de los resultados obtenidos en este análisis (figura
5.35), los cuales muestran emisiones a longitudes de onda entre 498 y 515 nm con el espectro de
emisión de la molécula β-carbolina (figura 5.32) que presenta un espectro de emisión máximo a
una longitud de onda de 450 nm, se puede notar una diferencia de 50 nm entre el pico máximo
de un espectro y otro, lo cual reforzaría la conclusión (ya discutida en la sección anterior de
espectroscopia de absorción) de que en la solución obtenida para nuestros análisis podría no
estar presente la molécula β-carbolina.
Respecto a los espectros de emisión, en la literatura se reportan los espectros de emisión de
alacranes Vittatus y Pandinus Imperator (alacrán africano) [21]. En la figura 5.36 se muestra el
espectro de emisión de un alacrán Centruroides Vittatus, el cual muestra una emisión máxima a
una longitud de onda de 490 nm (línea verde). En la figura 5.37 se muestra el espectro de emisión
de un alacrán Pandinus Imperator, el cual muestra un pico máximo a una longitud de onda de 500
nm.
94
Figura 5.36 Espectro de emisión de un alacrán C. Vittatus.
Figura 5.37 Espectro de emisión de un alacrán Pandinus Imperator.
En nuestro estudio se encontraron espectros de emisión con picos máximos entre longitudes de
onda de 498 a 515 nm (figura 5.35), al compararlos con los reportados en la literatura de los
Vittatus y los Pandinus (figura 5.36 y 5.37) podemos darnos cuenta de que estos valore son muy
95
cercanos, pero que a la vez sugieren diferentes longitudes de onda dependiendo del espécimen
que se trate, ya que en el caso de los Infamatus se tienen longitudes de onda entre 498 y 502 nm,
mientras que para el Vittatus se tienen longitudes de onda cerca de los 490 nm, y para el Ornatus
se encontraron longitudes de onda entre 500 y 515 nm. Estas diferencias podrían sugerir un
parámetro de diferenciación entre diferentes géneros ya que los especímenes Infamatus, Ornatus
y Vittatus pertenecen a la familia Buthidae Centruroides.
Para continuar con el análisis de los espectros de emisión, en la figura 5.38, se muestran los
máximos obtenidos de la emisión de cada espécimen contra su tamaño, observándose que en
términos generales la intensidad de emisión de la solución extraída del alacrán no depende del
tamaño del alacrán. Esto era de esperarse porque la extracción se hizo de una sección del
mesosoma de cada espécimen, y en todos los casos el tamaño de la sección extraída del alacrán
fue la misma. Esto implica obviamente la misma conclusión ya obtenida en los estudios de
espectroscopia de absorción: que la cantidad de pigmento fluorescente tiende a ser una
constante en el cuerpo del alacrán, aunque en el caso de los alacranes Vaejovidae la emisión
tiende a ser menor que para los alacranes Centruroides (ver figura 5.38). Esta última observación
relacionada con los alacranes Vaejovidae al parecer está en contradicción con la absorción
medida para las soluciones correspondientes, para las cuales los valores están dentro del
promedio obtenido para los alacranes Centruroides (ver figura 5.33). La conclusión entonces al
analizar estas figuras es que aunque la absorción de las soluciones de pigmentos extraídos de los
alacranes de la familia Vaejovidae es mayor o igual respecto a los alacranes de la familia Buthidae,
tienden a tener una intensidad de emisión menor, lo cual reafirma los resultados encontrados
mediante el método de digitalización de imágenes, ya que en ambos se obtuvo la conclusión de
que los alacranes Vaejovidae tienden a tener una menor intensidad de emisión.
96
3 4 5 6 7 8
0
2000
4000
6000
Infamatus hembra
Infamatus macho
Ornatus hembra
Ornatus macho
Vaejovidae
Em
isio
n
Tamano completo (cm)
Figura 5.38 Gráfica donde se muestra la relación entre la intensidad máxima de fluorescencia de las soluciones y el tamaño completo del alacrán.
Después se realizó un análisis en donde se tomaron los espectros de emisión del género Infamatus
(figura 5.39) y se obtuvieron las longitudes de onda de los puntos máximos de emisión.
300 400 500 600 700 800
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Inte
nsid
ad
Longitud de onda (nm)
Figura 5.39 Gráfica de los espectros de emisión de los alacranes del género Centruroides Infamatus.
97
Las longitudes de onda de los puntos máximos de emisión se graficaron en función de si era una
hembra o un macho, estos resultados se muestran en la figura 5.40. En esta gráfica se observa
una tendencia, donde dependiendo del sexo del alacrán existe un rango de longitudes de onda
en particular, por ejemplo para el caso de los alacranes Infamatus hembra se ve una tendencia a
una longitud de onda de entre 508 a 514 nm, pero para el caso de los alacranes Infamatus macho
la tendencia se ve hacia una longitud de onda de entre 503 a 506 nm, con lo anterior podemos
decir que entre hembras y machos de un mismo género de alacranes se puede observar una
diferencia de 2 a 8 nm entre la longitud de onda de su fluorescencia cuando son excitados con
una longitud de onda de 405 nm. Este resultado es congruente con [9] y reforzaría los resultados
encontrados, ya que en este estudio se analizaron dos especies de alacranes (Vaejovis confusus y
Paruroctonus shulovi [8]), y se encontraron diferencias estadísticamente significativas de 2 nm
entre los machos y hembras de ambas especies.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
504
510
516
Lo
ng
itu
d d
e o
nd
a (
nm
)
Numero de especimen
Infamatus Hembra
Infamatus Machos
Figura 5.40 Gráfica donde se muestra la relación entre la longitud de onda de emisión máxima de la fluorescencia contra el sexo del alacrán. Se analizan únicamente especímenes del género infamatus.
98
En la figura 5.40, a pesar de que la gran cantidad de especímenes, sigue una preferencia de
agrupación a un cierto valor de longitud de onda, donde puede observarse que un espécimen
Infamatus hembra se encuentra en el rango de longitudes de onda de los especímenes Infamatus
machos y dos especímenes Infamatus machos se encuentran en el rango de longitudes de onda
de los especímenes Infamatus hembra. En caso de existir, efectivamente, una diferencia en la
longitud de onda del máximo de emisión en hembras y machos del género Infamatus, entonces
la explicación del porque algunas muestras no siguen este comportamiento en la figura 5.40, es
debido al error encontrado al clasificar los especímenes morfológicamente, recordando que este
error fue del 20% al comparar el método de clasificación morfológica contra el método de
clasificación mediante ADN.
A continuación se presentan los resultados del análisis hecho para la los alacranes Ornatus, donde
se tomó la longitud de onda de la máxima emisión contra el sexo del alacrán (hembra o macho).
En la figura 5.41 se puede observar que para los alacranes Ornatus hembra la longitud de onda
varía de entre 508 y 516 nm, en cambio para el caso de los alacranes Ornatus machos se ve una
tendencia de 502 a 504 nm; al comparar estos resultados se puede notar que existe nuevamente
una diferencia de longitud de onda de la fluorescencia entre las hembras y machos, en este caso
del género Ornatus, donde esa diferencia se ve reflejada en un valor de 4 a 6 nm.
99
0 1 2 3 4 5 6
505
510
515
Lo
ngitu
d d
e o
nda (
nm
)
No. de especimen
Ornatus Hembra
Ornatus Macho
Figura 5.41 Gráfica donde se muestra la relación entre la longitud de onda de emisión máxima de la fluorescencia contra el sexo del alacrán, en este caso Ornatus.
100
5.6 Análisis de las componentes principales
(ACP) para espectros de emisión
Para tener un parámetro más discriminatorio se realizó un análisis de ACP para los espectros de
emisión. En la figura 5.42 se muestran los resultados obtenidos del ACP para los espectros de
emisión, aquí se puede observar que la mayor parte de los especímenes Infamatus hembra se
encuentran del lado izquierdo, mientras que la mayoría de los especímenes Infamatus macho se
encuentran del lado derecho. En esta misma figura también puede verse que los especímenes
Ornatus hembra se encuentran en la parte inferior derecha mientras que los especímenes
Ornatus macho se encuentran sobre la línea cero horizontal. También se ve claramente que los
especímenes de la familia Vaejovidae se encuentran en la parte superior. Finalmente, se observa
que este análisis de ACP sobre los espectros de emisión de las soluciones conteniendo los
extractos de pigmentos fluorescentes en alacranes, presenta una distribución o agrupación de
muestras similar al análisis de ACP para espectros de absorción.
-6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
-2500
-2000
-1500
-1000
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
Infamatus hembra
Infamatus macho
Ornatus hembra
Ornatus macho
Vaejovidae
PC
2
PC1
Figura 5.42 Análisis de PCA para los espectros de emisión.
101
5.7 Conclusiones
Este trabajo se enfocó en detectar y estudiar las características de la fluorescencia de los
alacranes que se encuentran en la ciudad de León, Guanajuato, estos alacranes se dividen en dos
géneros conocidos como Centruroides Infamatus y Centruroides Ornatus, pero en la recolección
de los especímenes se tuvo la oportunidad de encontrar un tercer tipo de alacrán perteneciente
a la familia conocida como Vaejovidae. La metodología seguida para su diferenciación se hizo
mediante una caracterización morfológica, donde se debe tomar en cuenta la coloración y forma
del carapacho, el grosor de sus fajas dorsales y el conteo pectinal para saber si son hembras o
machos.
La primera parte de este trabajo y más importante fue la clasificación de los alacranes para lo cual
se utilizaron claves morfológicas, que ayudan a clasificar a un alacrán dentro de la familia Buthidae
y género Infamatus u Ornatus, este método de clasificación fue comparado contra el método de
clasificación mediante ADN, encontrando un 80% de certeza, lo cual nos proporcionó un nivel de
confianza de nuestras clasificaciones para continuar con los siguientes estudios.
Lo anterior permitió que surgiera la motivación de estudiar la fluorescencia de dicho alacranes
para ver si este fenómeno óptico pudiese servir como un nuevo parámetro que permitiera la
clasificación de alacranes, esto es, poder usar la fluorescencia para clasificar entre un alacrán
Infamatus u Ornatus, y saber si es un macho o una hembra.
La fluorescencia de los alacranes se estudió mediante dos métodos, el primero consistió en
digitalización de imágenes (fotografías de alacranes bajo iluminación UV) y el segundo por
extracción de la molécula responsable de la fluorescencia (que de acuerdo a la literatura se
presume que sea la molécula β-carbolina) y el estudio de su emisión y absorción. El primer
método consistió en tomar una foto de cada alacrán, cambiarla a una escala de grises y trabajar
con los datos de la matriz obtenida, donde cada píxel de la imagen adquiere un valor entre 0 y
255. El estudio en este caso consistió en analizar los histogramas de la intensidad de fluorescencia
emitida por cada espécimen bajo estudio. El segundo método consistió en tomar una disección
102
del mesosoma (con la misma masa para todos los alacranes) y extraer de él la molécula que
propicia la fluorescencia, con lo cual se obtuvo una solución transparente (figura 5.28) la cual
presentaba fluorescencia cuando era excitada con una longitud de onda de 405 nm.
Del análisis realizado por la digitalización de las imágenes pudimos encontrar varias conclusiones
importantes, la primera de ellas es que de todas las imágenes analizadas se verificó que los
alacranes tienen una mayor intensidad de fluorescencia en partes específicas de su cuerpo como
son las quelas y los segmentos correspondientes a las quillas dorsales, este fenómeno se repitió
en todos los alacranes sin importar si eran Infamatus u Ornatus, o si eran hembras o machos, más
aun si se trata de otra familia como es el caso de la familia Vaejovidae. Este resultado podría
aportar algunos elementos de soporte a la teoría propuesta por Gaffin et al. [6], donde explica
que los elementos fotosensibles de la cola permiten a un alacrán detectar refugio.
Una segunda conclusión de este método se obtiene al analizar los histogramas de los valores de
la escala de grises obtenidos a lo largo de toda la matriz que conforma la imagen. Estos
histogramas mostraron un pico máximo de cada espécimen entre el valor en escala de grises de
entre 60 y 120. Al graficar el número de espécimen contra su valor obtenido, se encontró una
relación que diferencia los valores de la escala de grises entre estas dos familias, obteniéndose
una mayor intensidad cuando se trata de la familia Buthidae y una menor intensidad cuando se
trata de la familia Vaejovidae. En particular, se encontró que la intensidad en escala de grises para
la familia Buthidae corresponde a valores entre 120 y 140 (figura 5.19) y para un alacrán de la
familia Vaejovidae se obtuvieron intensidades de un valor de 100 (figura 5.20). Este resultado es
fortalecido nuevamente cuando se realiza el estudio de emisión de la solución obtenida de la
extracción molecular (pigmentos responsables de la fluorescencia), encontrándose que la emisión
por parte de la familia Buthidae es mayor que la emisión de la familia Vaejovidae (ver figuras 5.38
y 5.39). Aunque, por otra parte, al retomar los resultados de los espectros de absorción (figura
5.33) se obtiene que la absorción de los alacranes Vaejovidae es similar al de los de la familia
Buthidae, esto podría sugerir que la concentración de pigmento en ambas familias es la misma
pero, por alguna razón, en la familia Vaejovidae es menos fluorescente.
103
Otra conclusión importante obtenida de este estudio de la digitalización de imágenes nos indica
que mediante este método no se puede encontrar una relación que pueda distinguir entre
géneros o sexo en base a la intensidad de su fluorescencia (ver figura 5.22).
La siguiente conclusión está en función de la relación encontrada entre el área bajo la curva de
los histogramas de las imágenes en la escala de grises y el tamaño del cuerpo del alacrán completo
(figura 5.23). En este caso el área bajo la curva es proporcional a la fluorescencia total emitida por
el cuerpo del alacrán. De la figura 5.23 se obtuvo una relación lineal creciente que nos indica que
entre mayor es el tamaño del alacrán mayor es la intensidad de la fluorescencia. En esta figura se
muestra que los alacranes Vaejovidae son de los especímenes con mayor intensidad de
fluorescencia, aunque debe notarse que la familia Vaejovidae son los alacranes con menor
intensidad de fluorescencia por píxel.
Por parte del análisis de la absorción y emisión de la solución obtenida de la extracción molecular
se tienen los siguientes resultados: en cuestión a la absorción se tomó el punto de absorción a la
longitud de onda de 263 nm (ya que en esta longitud de onda se da el valor muy próximo a la
máxima absorción), de cada espécimen y estos valores obtenidos se graficaron contra el tamaño
del alacrán completo. En este caso no se pudo encontrar una relación creciente entre el tamaño
de alacrán y el valor de la absorción, con lo que podemos concluir que aparentemente la
concentración del pigmento responsable de la fluorescencia que está presente en el cuerpo de
los alacranes no depende del tamaño y que en promedio es constante (figura 5.33).
En la literatura se reporta que la molécula extraída en una solución de etanol de alacranes
Centruroides Vittatus es la molécula β-carbolina la cual presenta dos picos de absorción en
longitudes de onda de 330 y 360 nm, aproximadamente, mientras que en nuestras soluciones los
picos obtenidos de los especímenes de la familia Buthidae y familia Vaejovidae se encuentran en
longitudes de onda entre 250 a 263 nm. Al comparar estos resultados podemos decir dos cosas,
la primera de ellas es que el fluoroforo primario correspondiente a la molécula β-carbolina
aparentemente no se encuentra presente en nuestra solución; la segunda de ellas es que quizá la
molécula β-carbolina si está presente en nuestras soluciones, pero tal vez la presencia de otra
molécula modifica la absorción de la β-carbolina.
104
Tomando estos espectros de absorción también se realizó un análisis de ACP. Los resultados
arrojan una leve clasificación de Infamatus machos e Infamatus hembras, lo cual muestra una
correlación entre cada género y sexo de los alacranes (figura 5.34). Esto significa que existe una
relación entre los espectros de absorción entre machos Infamatus y que por otra parte existe una
relación entre los espectros de absorción de las hembras Infamatus, así como los alacranes de la
familia Vaejovidae. Una clasificación similar se encontró en el análisis del PCA para los espectros
de absorción. Más estudios tendrían que llevarse a cabo para saber si esta tendencia se confirma.
Siendo esto así, entonces los espectros de absorción podrían servir como un parámetro que
ayudaría a poder diferenciar entre familias de alacranes (Buthidae y Vaejovidae) y más aún entre
sexo de géneros (Infamatus u Ornatus ya sea machos o hembras).
Del estudio de emisión obtenido de un alacrán vivo Infamatus (figura 5.27) se obtuvo un espectro
de emisión con un pico máximo cerca de los 506 nm, mientras que para alacranes Infamatus
(figura 5.36) mostraron picos máximos en 498 y 502 nm (hembra y macho, respectivamente). La
diferencia entre estos valores máximos es de 4 a 8 nm, con la obtención de estos resultados
podemos concluir que la molécula causante de la fluorescencia en la epicutícula del alacrán de la
familia Buthidae se encuentra presenta en las soluciones obtenidas a partir de la extracción
molecular.
Al comparar los espectros de emisión de los resultados obtenidos en este análisis (figura 5.35) los
cuales muestran emisiones a longitudes de onda entre 498 y 515 nm con el espectro de emisión
de la molécula β-carbolina (figura 5.32) que presenta un espectro de emisión máximo a una
longitud de onda de 450 nm, se puede notar una diferencia de 50 nm entre el pico máximo de un
espectro y otro, lo cual reforzaría la conclusión de que el fluoroforo primario correspondiente a
la molécula β-carbolina no se encuentra presente en nuestra solución, o que tal vez se encuentre
otra molécula que modifica la emisión de la β-carbolina.
Al realizar el análisis entre la longitud de emisión del punto máximo y el sexo del alacrán se
encontró que existe una diferencia entre la longitud de onda de machos y hembras del género
Centruroides Infamatus y entre hembras y machos del género Centruroides Ornatus. En cuestión
a los Infamatus se observa que los machos emiten con una longitud de onda entre 503 y 506 nm,
105
mientras que para las hembras se tiene una longitud de onda entre 508 y 514 nm. Para los
alacranes Ornatus se observa que los machos emiten con una longitud de onda entre 502 y 504
nm, mientras que para las hembras se tiene una longitud de onda entre 508 y 516 nm. Para
finalizar esta parte podemos decir que se encontró una diferencia entre la longitud de onda de
emisión de fluorescencia entre hembras y machos del mismo género, lo cual nos podría servir
como un criterio extra para diferenciar entre ellos. Esta conclusión apoya la teoría de [9], donde
se encuentra una diferencia de 2 nm entre las hembras y machos de dos especies de alacranes
conocidos como Vaejovis confusus y Paruroctonus shulovi.
De forma general podemos concluir que fueron cubiertos los objetivos principales planteados en
este trabajo, en donde se encontraron parámetros que podrían ayudar a la diferenciación entre
familias de alacranes (Familia Buthidae y Familia Vaejovidae) en base a la intensidad de la
fluorescencia. Si bien la posibilidad de que existan rasgos característicos en la fluorescencia de los
alacranes que permite su clasificación (género o sexo) no fue totalmente establecida en esta tesis,
si se logró mostrar que quizá existan algunas tendencias. Futuros trabajos podrían confirmar o
desechar esta posibilidad, y para ello será necesario considerar muestras de especímenes en lo
que no haya ambigüedad en su clasificación a priori. Debe notarse que los resultados aquí
presentados tienen un error sistemático al clasificar morfológicamente los especímenes bajo
estudio; del estudio de ADN nuestros resultados tuvieron una certeza del 80%, este error podría
no permitirnos ver una tendencia que permita encontrar una diferencia ya sea entre familias,
géneros o sexo de los alacranes.
Como perspectivas de este trabajo de tesis se pretende tomar poblaciones de muestreo de
alacranes de mayor tamaño y de géneros que abarquen otros estados de la República Mexicana
donde se localicen alacranes nocivos para el ser humano. Por otro lado, con los resultados
obtenidos se pretende el diseño de un dispositivo que, en base de los métodos utilizados, nos
permita la clasificación de un espécimen, de una forma más precisa y rápida.
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