Estudio de la presentación de péptidos por HLA clase II mediante ... · - Los mecanismos de procesamiento y presentación de autoantígeno por las células epiteliales en enfermedades

Reunion Red Valenciana de Genomica y Proteomica 2004

Estudio de la presentaciEstudio de la presentacióón den de ppééptidosptidos por HLA clase II por HLA clase II mediante tmediante téécnicascnicas proteproteóómicasmicas

Secuenciación de péptidos presentados por HLA-II• Comparación de los repertorios observados en células

transfectadas y en una APC profesional• Influencia de las moleculas Ii y HLA-DM en el repertorio• Proteoma de la célula RIN transfectada• Chaperonas alternativas a Ii y DM• Identificación de péptidos antigénicos en tiroides

autoinmunes humanos

M.Carrascal, L.Muixi1, P.Ruperez, D.Jaraquemada1 y J.AbiánBiological and Structural Mass Spectrometry Unit, IIBB/CSIC-IDIBAPS) and

Immunology Unit, Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UAB, Barcelona, Spain

Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC

MOLÉCULA DE MHC-II

TCR


Class II biosynthetic pathway

ER

TGN

Endosomes

MHC class II Invariant chain (Ii)

HLA-DM

αβ-peptideαβ-CLIP

Antigenic protein

αβ3Ii3


MOLECULAS DE MHC DE CLASE II

- Los mecanismos de procesamiento y presentación de autoantígeno por las células epiteliales en enfermedades autoinmunes podrían ser diferentes a los utilizados por las APC profesionales.

- Las moléculas de MHC de clase II se expresan en células presentadoras de antígenos (APC) y están especializadas en la presentación de antígeno exógeno.

-Las moléculas de clase II también pueden expresarse en células epiteliales y pueden presentar antígenos endógenos. Relevancia: selección tímica, autoinmunidad, aloreconocimiento

- Las interacciones entre células epiteliales y células T son importantes en los procesos autoinmunes y están muy influenciadas por el repertorio peptídico.


Class II biosynthetic pathway

ER

TGN

Endosomes

MHC class II Invariant chain (Ii)

HLA-DM

αβ-peptideαβ-CLIP

Antigenic protein

αβ3Ii3

RIN-DR Ii DM

RIN-DR

RIN-DR Ii

RIN-DR DM

ANALISIS DE PEPTIDOS PROCEDENTES ANALISIS DE PEPTIDOS PROCEDENTES DE MOLÉCULAS DE MHC CLASE IIDE MOLÉCULAS DE MHC CLASE II

. Cantidad de muestra (3 x 109 células)

. Baja concentración de péptidos (30-300 fmol/108cel.)

. Heterogeneidad de pool peptídico.

. Tamaño de los péptidos: 14-28 aa

. Matriz compleja

. Péptidos desconocidos (El inmunoensayo no sirve)

. Cantidad de muestra (3 x 109 células)

. Baja concentración de péptidos (30-300 fmol/108cel.)

. Heterogeneidad de pool peptídico.

. Tamaño de los péptidos: 14-28 aa

. Matriz compleja

. Péptidos desconocidos (El inmunoensayo no sirve)

ESPECTROMETRÍA DE MASASEDMAN


IDENTIFICACION DE PEPTIDOS UNIDOS A MOLECULAS DE MHC DE CLASE II

Purificación por inmunoafinidadde HLA-DR

(anticuerpo monoclonal L243)

RIN-DR or B-LCL cells

A: H2O/AcN/TFA 95/5/0.05B: AcN/H2O/TFA 80/20/0.05

Columna:Vydac Protein & Peptide C18 25*0.21cm

Programa: Time %B0 015 090 6095 90100 90

Flujo: 200 µl/min

Detector: UV a 214 nm

Fracciones: Se recogen desde minuto 20 al 100, una fraccion cada minuto.Para el analisis MS se evaporan a sequedad y se redisuelven en MeOH/H2O 1/1 1% AcOH

Separación de moléculas con Peso molecular < 10KDa(Centricón 10000 MW)

FraccionamientoHPLC-UV

MALDI-TOFMSPeso molecular

nanoESI-MS/MSSecuenciación


ANALISIS DE LOS REPERTORIOS PEPTÍDICOS MEDIANTE MALDI-TOF

DR4IiDM

0.05

0.15

DR4Ii

0.05

0.15

2000 4000 6000

DR4DM

DR4

2000 4000 6000

DR4IiDM

0.05

0.15

DR4Ii

0.05

0.15

2000 4000 6000

DR4DM

DR4

2000 4000 6000

DR4IiDM

0.05

0.15

DR4IiDM

0.05

0.15

DR4Ii

0.05

0.15

2000 4000 6000

DR4Ii

0.05

0.15

2000 4000 6000

0.05

0.15

2000 4000 6000

0.05

0.15

0.05

0.15

2000 4000 60002000 4000 6000

DR4DMDR4DM

DR4

2000 4000 6000

DR4

2000 4000 60002000 4000 60002000 4000 60002000 4000 6000

Histograma de frecuencia de masas de los péptidos asociados a HLA-DR4 en las líneas celulares DR4IiDM, DR4DM, DR4Ii y DR4.

Anchura de Rangos= 100 Da.


SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS PRESENTADOS POR MOLÉCULAS DE MHC DE CLASE IICOMPARACIÓN DE TÉCNICAS

Fr HPLC Técnica secuenciación Mr (Da) Motivo unión DR4 nº aa Proteína origen (aaa-aaf) acceso DB L.* IA**

nESI TOF TOF µLC P

1P2

P3

P4

P5

P6

P7

P8

P9

34 x 1577.8 F V K D Q T V I Q N T D G N 14 Serotransferrin (559-572) 41,42 x 1691.8 D V A F V K D Q T V I Q N T D 15 Serotransferrin (556-570)

42 x 1749.9 D V A F V K D Q T V I Q N T D G 16 Serotransferrin (556-571)

41 x 1805.9 G D V A F V K D Q T V I Q N T D G 17 Serotransferrin (555-571) 41 x 1862.9 D V A F V K D Q T V I Q N T D G N 17 Serotransferrin (556-572) 41 x 1919.9 G D V A F V K D Q T V I Q N T D G N 18 Serotransferrin (555-572)

Q29443 E 6

39 x x 2230.1 K P V V A E F H G T K D N P Q T H Y Y 19 Serotransferrin (96-114) Q29443 E 1.7 31 x 1779.9 I K E K Y G K D A T N V G D E G G 17 α-enolase (196-212) P06733 C 3.4 53 x 1923.0 G V P L Y R H I A D L A G N S E V I 18 α-enolase (126-143) P06733 C 1.8 37 x 1565.8 I E K F E K E A A E M G K G 14 Elongation Factor ? (1-16) P24534 C 0.8 38 x 1241.7 F V R F D S D A A S Q 11 HLA-A2, A69 (57-67, 29-42) 37 x 1397.7 F V R F D S D A A S Q R 12 HLA-A2, A69 (57-68, 29-43) 40 x x x 1626.8 T Q F V R F D S D A A S Q R 14 HLA-A2, A69 (55-68, 27-43)

40,41 x x x 1741.8 D T Q F V R F D S D A A S Q R 15 HLA-A2, A69 (54-68, 26-43) 44 x 1872.9 D T Q F V R F D S D A A S Q R M 16 HLA-A2, A69 (54-69, 26-44) 42 x x 1955.9 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R 17 HLA-A2, A69 (52-68, 24-43) 41 x x 1856.8 D D T Q F V R F D S D A A S Q R 17 HLA-A2, A69 (53-68, 25-43) 44 x 1984.8 D D T Q F V R F D S D A A S Q R M 17 HLA-A2, A69 (53-69, 25-44) 43 x 1998.8 D T Q F V R F D S D A A S Q R M E 17 HLA-A2, A69 (54-70, 26-45)

44,45 x x x 2098.9 D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P 18 HLA-A2, A69 (54-71, 26-46) 44 x 2216.0 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E 19 HLA-A2, A69 (52-70, 24-45) 45 x 2214.1 D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P 19 HLA-A2, A69 (53-71, 25-46) 43 x x 2271.0 D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R 19 HLA-A2, A69 (54-72, 24-47) x 2370.3 D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R 20 HLA-A2, A69 (53-72, 25-45)

46 x x x 2313.0 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P 20 HLA-A2, A69 (52-71, 24-46) 44,45 x x 2469.1 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R 21 HLA-A2, A69 (52-72, 24-45)

51 x x 2823.3 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R A P W 24 HLA-A2, A69 (52-75, 24-48) 52,53 x x 3065.3 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R A P W I E 26 HLA-A2, A69 (52-77, 24-50)

54 x 3327.6 Y V V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R A P W I E 28 HLA-A2, A69 (50-77, 22-50)

P01892P10316 M 3

38 x 1366.7 F V R F D S D A A S P R 12 HLA-B35 /HLA-Cw04 (58-68) 41 x x 1595.8 T Q F V R F D S D A A S P R 14 HLA-B35 /HLA-Cw04 (55-68) 41 x x x 1710.8 D T Q F V R F D S D A A S P R 15 HLA-B35 /HLA-Cw04 (54-68)

39,42 x x 1825.8 D D T Q F V R F D S D A A S P R 16 HLA-B35 /HLA-Cw04 (53-68) 43 x x 1924.8 V D D T Q F V R F D S D A A S P R 17 HLA-B35 /HLA-Cw04 (52-68)

P30685P30481 M 3


SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS PRESENTADOS POR MOLÉCULAS DE MHC DE CLASE II

COMPARACIÓN DE TÉCNICAS

Comparación de resultados en la caracterización del repertorio peptídico mediante nESI-ITMS/MS, MALDI-TOF/TOF y capLC-ESIMS/MS.

Técnica Consumo de muestra (%)

péptidos identificados Automatización proteínas

identificadasepítopos

caracterizados

nESI - ITMS/MS 40% 90 - 22 27MALDI - TOF - TOF 8% 52 + 20 21

capLC - MS/MS 16% 21 +++ 9 7TOTAL - 113 - 25 32

nESI-ITMS/MS

capLC-MS/MS

MALDI-TOF-TOF

48

6

16

728 1

7

nESI-ITMS/MS

capLC-MS/MS

MALDI-TOF-TOF

48

6

16

728 1

7

Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSICm/z

Full MSm/z = 300-2000

736.4

927.1845.6

749.2

817.0 1003.2

1103.6705.3

644.2

1230.0 1390.81572.5502.6

1813.7

1002.8

1003.11002.5

1003.5

1003.8

1001.0 1003.0 1005.0m/z

500 700 900 1100 1300 1500 1700 1900

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

Zoom ScanIón 1002.5 (+3)Mr = 3004.5 Da

FRACCION 49, B-LCL

[M2+2H]+2

[M2+3H]+3

[M1+2H]+2

[M1+3H]+3


400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

791.1

931.4893.0

1047.71425.5

1223.5

1096.6676.5 1334.51567.6530.1

y11-NH3+ y14

+

b12+

b10+

b202+

b192+

y243+

y7+

y233+

y162+

y142+

y112+

y4+

FRACCION 49, B-LCL VDDTQFVRFDSDAAAPRGEPREPWVE

Mr: 3004.4 DaMS/MS m/z 1002.5


FRACCION 31, B-LCL

m/z400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

Full MSm/z = 300-2000

555.2

537.9

402.9 968.11369.4812.4 1105.8924.0726.4 1545.0

1830.41729.2

726 729 732m/z

729.7

729.2730.2

Zoom ScanIón 729.7 (+2)

Mr = 1456.7 Da

Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC400 600 800 1000 1200 1400

m/z

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

729.1

711.3656.5614.9 746.1 940.4

1197.4764.0

1102.5500.8 973.1 1311.5860.41230.8354.4

MS/MS m/z 729.5

LNQELRADGTVNQMr: 1456.7 Da

m/z = 800-1600

FRACCION 31, B-LCL


850 950 1050 1150 1250 1350 1450

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

940.4

825.3

1366.11321.1 1382.31261.7

b7+

1197.4

1102.5973.1 1311.5860.4 873.7

1084.2923.6 997.1

1080.3 1230.81180.1

1153.9 1294.1

b12+

y11+b9

+

y9+

b11+

b8+

y8+

b12-NH3+

y10+b10

+

b11-NH3+y10-H2O+

b8-NH3+

m/z850 950 1050 1150 1250 1350 1450

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

940.4

825.3

1366.11321.1 1382.31261.7

b7+

1197.4

1102.5973.1 1311.5860.4 873.7

1084.2923.6 997.1

1080.3 1230.81180.1

1153.9 1294.1

b12+

y11+b9

+

y9+

b11+

b8+

y8+

b12-NH3+

y10+b10

+

b11-NH3+y10-H2O+

b8-NH3+

MS/MS m/z 729.5

LNQELRADGTVNQMr: 1456.7 Da

m/z = 800-1600L E Q

D G T V N

FRACCION 31, B-LCL





autoinmunes humanos




DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein

Exogenous G D V A F V K D Q T V Y Q N T D G Transferrin (555-571) D L R H T F S G V A S V E S S S G E Fetuin (311-329) Y D R N T K S P L F V G K V V N P T Q A Alpha-1-antiproteinase precursor (397-416) V A Q A S L G E Y L F E R L T L K H D Ferritin light chain (165-183)

Surface membrane N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal Growth Factor Receptor (271-286) Y N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal Growth Factor Receptor (270-286) E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (55-69) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (54-69) E G P E Y W E E Q T Q R A K G H MHC class I (55-71) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G H E MHC class I (54-71) Y V D D T E F V R Y D S D A E N P R MHC class I (28-45) A E Y E V Y V V A E N Q Q G K S K A N-CAM (679-696) N A E Y E V Y V V A E N Q Q G K S K A N-CAM (678-696) G I V Y T G D R T V M G R I ATPase α subunit (258-273) I V Y T G D R T V M G R I A ATPase α subunit (259-274) G I V Y T G D R T V M G R I A ATPase α subunit (258-274) G I V Y T G D R T V m G R I A ATPase α subunit (258-274) V H N Y F A I D P T T G A I H T Protocadherin (1818-1834) E P S V H N Y F A I D P T T G A I H Protocadherin (1815-1833) K N K D Y Y I I S T S N G S L E G Ephrin B2 precursor (129-145) T S W T A E K S I A Q L N S K Neprilysin (180-194)

PEPTIDOS PRESENTADOS POR CELULAS EPITELIALES(CELULAS RIN DR4IiDM)


PEPTIDOS PRESENTADOS POR APC (CELULAS B-LCL)

D R 4 m otif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source prote in

Surface m em brane V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R H LA-A2 (28-48) D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P H LA-A2 (30-47) V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E H LA-A2 (28-46) V D D T Q F V R F D S D A A S Q R H LA-A2 (28-44) D T Q F V R F D S D A A S Q R M H LA-A2 (30-45) D T Q F V R F D S D A A S Q R H LA-A2 (30-44) T Q F V R F D S D A A S Q R H LA-A2 (31-44) V D D T Q F V R F D S D A A S P R T E P R H LA-B35 (27-47) D T Q F V R F D S D A A S P R T E P H LA-B35 (29-46) V D D T Q F V R F D S D A A S P R T E P H LA-B35 (27-46) D D T Q F V R F D S D A A S P R H LA-B35 (28-43) E D L S S W T A A D T A A Q I T Q R H LA-C (122-139) D L S S W T A A D T A A Q I T Q R H LA-C (123-139) L S S W T A A D T A A Q I T Q H LA-C (124-138) L S S W T A A D T A A Q I T H LA-C (124-137) E D L R S W T A A D T A A Q I T Q H LA-C (128-144) D L R S W T A A D T A A Q I T Q H LA-C (129-144) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P R H LA-C (28-48) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P H LA-C (28-47) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P W V E H LA-C (28-51) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P W H LA-C (28-49) V D D T Q F V Q F D S D A A S P R G E P R H LA-C (28-48) E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V Im m unoglobuline kappa cha in (187-205) E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P Im m unoglobuline kappa cha in (187-204) K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V Im m unoglobuline kappa cha in (188-205) E K H K V Y A C E V T H Q G L S Im m unoglobuline kappa cha in (187-202) H K V Y A C E V T H Q G L S S P V Im m unoglobuline kappa cha in (189-205) K H K V Y A C E V T H Q G L S Im m unoglobuline kappa cha in (188-202) H K V Y A C E V T H Q G L S Im m unoglobuline kappa cha in (189-202) H P V T G Q F L Y Q D S N W A S K V E T ransferrin receptor (561-534) K N T L Y L Q M N S L R A E D T A Im m unoglobuline heavy chain (31-47)


ORIGEN DE LOS PEPTIDOS PRESENTADOS POR MHC CLASE II EN LOS DIFERENTES COMPARTIMENTOS CELULARES

3%

22%

4%5%

11%1% 3%

51%

ORIGEN DE LOS PEPTIDOS

3%

11%

3%7%8%

68%

Membrana celularCitoplasmaExógenasRet. endoplasmáticoVesículas endocíticasVesículas secretorasNúcleoUbicuas

Células Epiteliales APC Profesionales(RIN DR4IiDM) (B-LCL)





autoinmunes humanos




PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE Ii Y DM (CELULAS DR4)

Los péptidos naturales asociados a DR4 en ausencia de Ii y de DM, no cumplen el motivo de unión a DR4 y corresponden principalmente a

extremos N y C terminales de proteínas citoplasmáticas.

DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein G F G D L K T P A G L Q V L N D Elongation factor 1-beta (1-16) Y V G D L H P D V T E A M L Polyadenilate-binding protein-1 (14-27) A R K L I G D P N L E F Small GTPASE (158-168) V P I D V D K T K V H N V E P V E S A R I E P P D T G L Y NEFA Precursor (23-53) I I D P G D S D I I R S M P E Q T G E K 60s Ribosomal protein L30 (95-114)

G N G G A A T T A E E N G S M M R HEMC Hydroxymethylbilane synthase(3-19) E A R G A R R G V K K V M V L Integrin A-1 precursor VLA-1 (264-278) L E T L H E A L n-chimaerin (251-258) M K I F V G N V D G A D T T P E E L SYT Interacting protein SIP (1-18) 16kD I G A G G T G A A L Y V M R L A L NADH-Ubiquin. oxidoreductase MLRQ (15-31) S A M T E E A A V A I K A M A K Initiation factor 5A (139-153) N V W Q V N T S R T R I T F V DNA Replication Licensing factor (706-719)


PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE Ii Y DM (CELULAS DR4)

H 2 N - - - - - - M R Y V A S Y L L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - M K IF V G N V D G A D T T P E E L -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - M - G F G D L K T P A G L Q V L N D -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -C O O H H 2 N - - - - - - M S - G N G G A A T T A E E N G S M M R -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - 1 3 A A - Y V G D L H P D V T E A M L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - 2 1 A A - IG A G G T G A A L Y V M R L A L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - 2 4 A A - V P ID V D K T K V H N V E P V E S A R IE P P D T G L Y - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - IV IQ N P T E -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A E F A K S L Q -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - F IS N H A Y - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - N V W Q V N T S R T R IT F V - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - S A M T E E A A V A IK A M A K -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A A V A IK A M A K -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - IID P G D S D IIR S M P E Q T G E K -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Q V T Q P T V G M N F K T P R G A V -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - V A Q A S L G E Y L F E R L T L K H D -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A L S Q D S T Y Q G E R A Y Q H G G V T G L S Q Y -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - R IE P F S S P P E L P D V M K P Q D S G G S A N E Q A V Q - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - P A L A P P E V V M D P A L A A Q Y E H D L E V A Q T T A L P D E D D D L -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A R K L IG D P N L E F - 4 0 A A - - - - - - - C O O H

EL 95% DE LOS PEPTIDOS SECUENCIADOS DE CELULAS HLA-DR4 CORRESPONDEN A EXTREMOS N- Y C- TERMINAL DE LAS PROTEINAS ORIGEN


PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE DM (CELULAS DR4iI)

- En ausencia de DM, DR4 presenta casi exclusivamente péptidos CLIP derivados de la cadena invariante. - Todos los péptidos detectados cumplen el motivo de unión con preferencia por aminoácidos pequeños hidrofóbicos

DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein V G K T P I V G Q P S I P G G P V R Fetuin (331-347) G K T P I V G Q P S I P G G P V R Fetuin (332-347) S G E A F H V G K T P I V G Q P S Fetuin (325-341) S E Q H D I A I D L S P L A Q H E E G Mannose 6-phos./insulin-like growth fact. recep.(324-342) E G P E Y W E E Q T Q R A K G H E MHC class I (57-71) G R P T L L P E E I D D A F P L P58 8296-311) D L L S G K K N T V E G L P P L G G MK Protein tyrosine phosphatases non-receptor type 21(823-842) K P P K P V S K M R MA T P L L M Q A L P Invariant chain (99-119) L P K P P K P V S K M R M A T P L L M Q A L P M Invariant chain (97-120)


PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE Ii (CELULAS DR4DM)

La expresión de DM en presencia o ausencia de Ii, permite la asociación a DR4péptidos estables y que cumplen con el motivo de unión a DR4

DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein V L N Q E L R A D G T V N Q I E G Apolipoprotein D (77-93) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (56-69) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G H E MHC class I (54-71) E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (55-69) E R E G P E Y W E E Q T L V A K MHC non RT1 alpha 1 chain (77-93) E P S V H N Y F A I D P T T G A I H Protocadherin (1815-1833) L Y N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal growth factor receptor (270-287) N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal growth factor receptor (272-287) E P G E P E F K I Y G N M H G N E A Carboxipeptidase H (102-119) S L Q E Y L A E Q N Q R Q L E S N Sulfated glycoprotein-1 (SGP-1) D E F K K F I S D K D A S V V G Protein disulfide isomerase ER-60 (143-158) I S W Y D N E Y G Y S N R V V D GAPDH (308-324) G F P K P P S Y N V A T T L P S Y D E Nedd4WWW (120-138) F P K P P S Y N V A T T L P S Y D E Nedd4WWW (121-138) G F P K P P S Y N V A T T L P S Y D E Nedd4WWW (118-138) F P K P P S Y N V A T T L P S Y D Nedd4WWW (121-137)


ANALISIS DE LOS REPERTORIOS PEPTÍDICOS MEDIANTE MALDI-TOF: INFLUENCIA DE LA EXPRESIÓN DE Ii EN CÉLULAS DM+

1845.84

2168.18

2326.071555.81 1861.841781.85 1967.021067.60 2671.26

Frac. 43DR4DM

2028.92

2168.21

1845.85

1781.861018.75 2013.991523.80

1067.05 2326.09

1000 1400 1800 2200 2600 3000Mass (m/z)

Frac. 43DR4IiDM

20

40

60

80

100

%In

tens

ity

2074.97

2041.951807.862231.09

1964.032288.112415.161230.48 1568.82 2746.47

1846.96

Frac. 40DR4DM

2074.99

1568.86

1846.952283.16

2041.971964.04

1807.87 2384.28

1000 1400 1800 2200 2600 3000

20

40

60

80

100

%In

tens

ity

2196.10

Frac. 40DR4IiDM

Mass (m/z)

Más del 50% de los iones detectados en la línea DR4DM se detectaron también en la triple transfectante(53%), mostrando que la expresión de HLA-DM molécula era suficiente para generar un repertorio estable aunque no igual al de las células DR4IiDM.





autoinmunes humanos




EXPRESIÓN PROTEICA DIFERENCIAL EN CÉLULAS RIN TRANSFECTADAS CON HLA-DR4, Ii Y HLA-DM

(SISTEMA DIGE)

1

8

6

5

4

2

7

3

9

Células RIN Células RIN- DR4IiDM

pI103

pI103


ANÁLISIS DE IMAGEN CON EL SOFTWARE PROGENESIS

Mancha 745T student 0.00046Av. Ratio = -1.62


Mancha 833T student 0.00057

Av. Ratio = 1.7

Mancha 1097T student 3.20E-06Av. Ratio = 1.56



Mancha 1895T student 1.50e-07Av. Ratio = 5.13

Mancha 2012T student 9.70E-0.5

Av. Ratio = 4.79


Av. Ratio = 2.1




Av. Ratio = 1.7






Av. Ratio = 1.7


Av. Ratio = 1.7












Av. Ratio = 4.79


Av. Ratio = 2.1




Av. Ratio = 4.79


Av. Ratio = 4.79


Av. Ratio = 2.1


Av. Ratio = 2.1

MANCHAS DIFERENCIALES

1

8

6

54

2

7

3

9

RIN RIN- DR4IiDM

pI 103 pI 103

Manchas detectadas y emparejadas para cada una de las imagenes obtenidas en el análisis de expresión diferencial mediante el sistema DIGE.

Línea celular Imagen Marcaje Manchas

detectadasManchas

emparejadasDR4IiDM 1* Cy5 2238 2238DR4IiDM 2 Cy5 1815 1311DR4IiDM 3 Cy3 2187 1383DR4IiDM 4 Cy3 1969 1304

RIN 1 Cy3 2238 2238RIN 2 Cy3 1815 1311RIN 3 Cy5 2187 1383RIN 4 Cy5 1969 1304


IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DIFERENCIALES

Regulacióntranscripción

71

71

71

Actividad catalítica

Superoxide dismutase (Mn), mitoch. prec.

Glutathione S-transferase Yb-1

Short chain, 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,mitoch. prec.

Células RIN- DR4IiDM

Peroxiredoxin 1

Thimet oligopeptidaseGlutamate dehydrogenase 1

Creatine kinase, mitoch. 1

HIV-1 tat interactive protein 2, homolog

Oxidoreductasa : Glutamato deshidrogenasa3-hidroxiacil - CoA deshidrogenasaPeroxiredoxina 1Superoxido dismutasa [Mn]

Transferasa: Glutatión S - transferasa Mu 1 Creatina kinase

Quinasa:Creatina kinase

Hidrolasa: Oligopeptidasa Thimet





autoinmunes humanos




IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS QUE INTERACCIONAN CON HLA-DR4 EN UNA CÉLULA EPITELIAL QUE EXPRESA MHCII

- Unión del anticuerpo L243 a las bolas de Sefarosa.

- Lisis “suave de las células”: Solubilización de las moléculas de MHC sin romper las interacciones entre proteínas.

PROTOCOLO:

Separación de las proteínas por SDS-PAGE y 2DE

DR α

1 2 3 4 5 6

- Purificacion por Inmunoafinidad de DR4 y proteínas asociadas.

1) Proteinas no solubilizadas en 2) y solubilizada con 2% SDS 2) Proteinas solubilizado con 1% digitonina3) Fracción no retenida control (incubación con bolas bloqueadas)4) Fraccion retenida control (eluido)5) Fracción no retenida bolas-Ab L2436) Fraccion retenida bolas-Ab L243 (eluido)


SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS AFINES POR HLA-DR4 MEDIANTE SDS-PAGE

kDa

75

50

25

37

20

15

ExtractoTotal

NoRetenido Eluido Extracto

TotalNo

RetenidoEluido

DR4IiDM RIN

αβ


ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS AFINES A HLA-DR4 EN CÉLULAS EPITELIALES TRANSFECTADAS CON DIFERENTES

COMBINACIONES DE LAS MOLÉCULAS HLA-DR, Ii Y HLADM

pI 103 pI 103 pI 103

RIN DR4 DR4Ii

pI 103 pI 103 pI 103

B-LCL (DR4)DR4DM DR4IiDM


ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS AFINES A HLA-DR4 EN CÉLULAS EPITELIALES TRANSFECTADAS CON DIFERENTES COMBINACIONES DE LAS

MOLÉCULAS HLA-DR, Ii Y HLADM

HLA-DRA

HLA-DRB1_0401DR4

RINB-LCL

DR4IiDM4

DR4Ii

DR4DM


SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS AFINES POR HLA-DR4 MEDIANTE 2DEANALISIS DE IMAGEN

27

29

28

65

37

31

34

33

32

41

39

3038

36

64

Específicas DR4IiDM Comunes


PROTEÍNAS DIFERENCIALES IDENTIFICADAS

Proteína identificada Masa (KDa)/pI nº acceso*

78 kDa glucose-regulated protein precursor (BIP) 75 / 5.1 P06761

Glucose regulated protein, 58 kDa 57 / 5.9 38382858

Heat shock cognate protein, 71 kDa 71 / 5.4 5729877

Heat shock 70 kDa protein 9B 74 / 6.0 21040386

Peroxiredoxin 4 (Macht DIGE) 31 / 6.2 Q63716

Protein disulfide isomerase precursor 57 / 4.8 P04785

Similar to protein OS-9 precursor 79 / 5.1 34865783

Similar to reticulocalbin 38 / 4.7 34856626

Vacuolar ATP synthase catalitic subunit A 68 / 5.4 34869154

Vacuolar ATP synthase subunit B 57 / 5.6 17105370





autoinmunes humanos




CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS A

CLASE II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.

FraccionamientoHPLC -UV

Tejido tiroideo autoinmune

Purificación de HLA -DRpor inmunoafinidad

(mAb L243)

Separación de moléculas con Mr < 10KDa

(Centricón 10000 MW)

Homogeneización mecánica yrecuperación de proteinas de membrana

Solubilización de proteinas de membrana (Lisis con 0.5% NP-40)

min

mA

U

Determinación depesos moleculares

MALDI - reTOFMS

Identicación depéptidos

nESI -ITMS/MS

ID tiroides Expresión de clase II Fenotipo para clase II Cantidad (g)

TB-190 ++ DRB1*1101, DRB1*1104, DQB1*0301 < 1 TB-269 ++ DRB1*1101, DRB1*1104, DQB1*0301 2 TB-270 +++ DRB1*0701, DQB1*0202, DQB1*0303 3.3 TB-237 + DRB1*1501, DQB1*0602 1.1 TB-448 ++ DRB1*0407, DRB1*1501, DQB1*0301, 8

Tabla I: Tejido utilizado para la identificación de péptidos asociados a la molécula de MHCII.

min20 40 60

TB2703.3 g

TB190> 1g

min20 40 60

AU

40

80

TB4488 g

min20 40 60

AU

40

80AU

40

80

TB2692 g

min20 40 60

AU

40

80

20 40 60 min

TB2371.1 g

AU

40

80

B-LCL500 x 10 6 células

min20 40 60

AU

40

80

Perfiles HPLC-UV de la línea celular B-LCL (5 x 106 células) y de los tiroides analizados


CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS A CLASE

II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.

Relat

ive A

bund

ance

CPTPCQ LQAEQAFLRTVQMr: 2030.0 Da

MS/MS ión 1016.0

20

40

60

80

100 943.1934.1

965.6763.3

834.2

1528.31162.5

503.1 616.2

1268.3

1091.4

1290.5 1415.4 1684.7

628.0

1197.3 1403.71785.9 1884.7

x4

y 4 y 5y 6

y 7

y 9

y 10

y 11

y 12

b17b16

b15

b14

b13

b12

b11

b17 2+

b17-H2O2+

893.5

A

943.1

m/z

934.1913.6

1015.3901.6

1051.1834.2763.5

1162.7 1529.11268.5

1197.3 1290.7 1684.8

628.2503.1

1415.7

1403.8

1786.5 1884.7347.3

300 500 700 900 1100 1300 1500 1700

20

40

60

80

100

x4B

péptido sintético

peptido tiroides TB448

Tiroglobulina [726-743]




MHCII DQB1*0602 [75-89]Re

lative

Abu

ndan

ce

DVGVYRAVTPQGRPDMr: 1628.9 Da

MS/MS ión 815.4

m/z

20

40

60

80

100

B

300 500 700 900 1100 1300 1500

758.1

700.6 807.0679.2

669.3

940.4961.3

860.2

542.7

1242.8869.2 1382.61186.71079.9

397.01012.5 1260.41129.5271.7 1398.8

x8

20

40

60

80

100

A758.3

700.0807.2

669.5

961.6940.6

860.5

1242.9 1382.81186.71079.7 1259.8

422.2272.0 1012.6 1398.9

x8

y 6

y 9

y 10

y 11

y 12

b12b11b13b8

b13 2+

b13-H2O2+

b2

b9

y 14 2+

péptido sintético

peptido tiroides TB448




261 291 301

381 391

KNYAEAKDVF

401 411

541 551

581

1 11 21 31 41 51 61 71

MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD

81 91 101 111 121 131 141 151

ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK

161 171 181 191 201 211 221 231

KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV

241 251 271 281 311

ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHCIAEVEND

321 331 341 351 361 371

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421 431 441 451 461 471

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481 491 501 511 521 531

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561 571 591 601

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Figura 4: Secuencia aminoacídica de la albúmina sérica humana, con los epítopos caracterizados a partir de los tiroides TB190, 260 y 270 marcados en rojo. Los péptidos identificados para cada epítopo se muestran encuadrados en naranja.


CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS

ASOCIADOS A CLASE II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.

Localización celular de las proteínas origen identificadas a partir de tejido tiroideo.

Membrana (4)

Sangre (3)

Membrana (4)

Sangre (3)(4)(4)Intracelular

Matriz extracelular

(5)

Matriz extracelular

(5)

Matriz extracelular

(5)Coloide (2)Coloide (2)

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Estudio de la presentación de péptidos por HLA clase II mediante ... · - Los mecanismos de procesamiento y presentación de autoantígeno por las células epiteliales en enfermedades