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Estudio y Reporte de FrotisSanguíneo
( Lámina Periférica )
Lic TM Boris Valdivia V.
Servicio de Hematología
HNGAI - Essalud
Extensiones Sanguíneas
• El frotis sanguíneo consiste en la extensión uniforme de una gota de sangre sobre un portaobjetos; la misma que se lleva a cabo con otro portaobjetos
• El frotis sanguíneo se realiza de forma manual y automatizada ( spinner )
Partes de una extensión• Cabeza
- es la zona inicial de la extensión- es la región mas gruesa- en esta región se encuentra el mayor número de linfocitos y GR apilados- No es una zona de lectura
• Cuerpo - es la zona media del frotis- su espesor es el apropiado- en ella existe una adecuada proporción de leucocitos- contiene la zona ideal de observación, que corresponde a la zona que limita con la cola
• Cola - es la zona final de la extensión- suele tener un aspecto redondeado- es la región mas fina- mayor proporción de leucocitos grandes, hematíes deformados y tonalidad uniforme
• Características de un buen frotis- la cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta- la cola debe estar cerca de uno de los bordes- toda la extensión ha de ser fina y homogénea- los bordes laterales han de estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente- presencia de barbas en el extremo terminal
Defectos de una extensión
• Presencia de escalones o estrías. originado por una falta de uniformidad en el momento de realizar la extensión
• Un lámina con zonas huecas redondeadas por efecto de restos de grasa y suciedad
• Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud excesivo grosor
• Error en el tamaño de la gota• Error en la velocidad de la extensión• Error por causa de un ángulo inapropiado• Se debe tener en cuenta el Hto del paciente,
dependiendo de esta, se aplicará el ángulo apropiado de extensión
Coloraciones Hematológicas
• Las coloraciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas
• Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y esto permite observarlas con mayor facilidad
• Las tinciones hematológicas se pueden clasificar en :
• De acuerdo al nivel de vitalidad de lo que se quiere coloreara . Vitalesb . No vitales
• De acuerdo a su frecuencia :a . Rutinab . Especiales
Tinciones Habituales
• Colorantes ácidos: tienen especial afinidad por las estructuras alcalinas de las células, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.
• Colorantes básicos : especial afinidad por las estructuras ácidas de las células, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno
• Colorantes neutros : son los que no tienen afinidad con las estructuras ácidas o básicas, uno de ellos es el Sudán III
• Existen también combinaciones de colorantes que dan origen a tinciones polícromas
• El primero de ellos fue Romanowsky, y todos los colorantes hematológicos de la actualidad suelen derivar del que él preparó
• Estos colorantes constan de un colorante ácido (eosina) y otros básicos (tiacinas).las tiacinas son el azul de metileno y los azures
• También existen tinciones panópticas rápidas que producen una coloración fácil y rápida en las estructuras celulares
• Estructuras acidófilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza ácida. Si captan la eosina se llaman eosinófilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosado
• Estructuras basófilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con los tinciones habituales adquieren un color azulado.
• Si se tiñen de lila o púrpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurófilas.
Tinciones especiales
• Solo se usan en condiciones específicas • Tinciones fluorescentes : emplean colorantes
(fluorocromos) que se fijan a las células y que, cuando son estimulados por LUV, emiten una radiación visible caracteristica.
• Tinciones Citoquímicas : demuestran la presencia, mas o menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias y/o enzimas, localizadas en el interior de los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos.
• Sirven para reconocer células normales de las anómalas, y por tanto, reconocer una leucemia de otra. Por ejemplo : PAS, Sudan Black, MPO, alfa – Naftilestearasa, etc
Coloración Ácida
Coloración Básica
Causas de Error en las Tinciones Habituales de Frotis Sanguíneo
Si la tinción de una extensión sanguínea es demasiado rosa, probablemente se deba a :
• Un pH bajo de colorante• Un tiempo de coloración insuficiente• Un lavado excesivamente prolongado
Si la tinción es demasiado azul probablemente sea por :
• Un empleo de portas sucios• Falta de filtración del colorante• Una coloración excesivamente prolongada• Un secado del colorante durante al tinción• Un lavado insuficiente
Preparación del Colorante de Wright ( Merck )• Pesar 2 – 3 gr del colorante en polvo comercial• 1000 ml de metanol• Glicerina ( 5 ml ) – opcional• Colocar en un mortero el colorante y añadir la glicerina• Añadir de a pocos el metanol al mortero e ir machacando hasta que
adquiera una coloración azul intensa y luego verter a un frasco color caramelo o ámbar, previo filtrado con papel filtro
• Repetir la operación hasta que se acabe el metanol• Guardar en lugar oscuro, fuera de la luz para evitar su oxidación por aprox.
una semana hasta que madure• Luego de cumplido el tiempo filtrar nuevamente• Listo para su uso
técnica de tinción :• Cubrir el frotis con el colorante por 1 – 3 minutos• Agregar agua tamponada pH 7.2 – 7.4 por 5 – 7 minutos ( homogenizar )• Verificar la formación de una película plateada sobre el colorante• Lavar con agua corriente y dejar secar• Leer con objetivo de inmersión
• Un aspecto clave es el grosor del extendido. Una extensión de calidad no debe ser gruesa ni muy delgada
• Una extensión gruesa dificultará la observación de la morfología eritrocitaria y la diferenciación entre linfocitos y monocitos. Además de dificultar al ojo inexperto la tinción de las células sanguíneas
• Por el contrario, si es muy fina, la mayoría de neutrófilos y monocitos se hallarán en las áreas periféricas. Esto alterará la relación normal de la distribución celular leucocitaria
• Se recomienda entonces, que el grosor ideal, es aquel que nos permita leer a través de la extensión
Para tener en cuenta
Estudio de Lámina Periférica
• El estudio de lámina periférica comprende la evaluación morfológica de las tres líneas celulares ( elementos formes ) que componen la sangre
• Serie Blanca : Leucocitos
• Serie Roja : Hematíes
• Serie Trombocítica : Plaquetas
Procedimiento del Diferencial Manual de Sangre Periférica
Examen ocular a bajo aumento ( 10X )• Determinar las características de la tinción• Determinar la distribución celular
a. verificar si hay presencia de agregadosplaquetarios que pueden producir errores de conteo en los equipos o llevar a conteos bajos falsos b. Verificar la presencia de Rouleaux en GRc. verificar la presencia de agregados leucocitarios causados por inadecuada mezcla de sangre después de su colección
• Seleccionar la mejor área para una detallada evaluación morfológicaa. buscar una distribución homogénea donde los eritrocitos no se sobrepongan unos a otrosb. evitar áreas huecasc. evitar áreas extremas donde los eritrocitos adopten forman geométricas
• Lectura a mediano aumento ( 40X o 50X )este tipo de lectura nos sirve para tener una visión panorámica y completa del frotis y es de utilidad para el personal adiestrado en el reconocimiento celular, porque nos permite lecturas a mayor velocidad, sin sacrificar la precisión. Se recomienda su uso para láminas de pacientes leucopénicos.
• Algunas personas inclusive pueden calcular el numero de leucocitos pmmc contando las células blancas normales y rotas, contando 10 campos, luego obteniendo su media y posteriormente multiplicandolo por 3000
Lectura a mayor aumento ( 100x )• Se lleva acabo usando un tabulador o contómetro, manual o digital. • Deben incluirse todas las células de la serie blanca, maduras e
inmaduras.• No deben incluirse en el recuento de 100 leucocitos a los GR
nucleados y megacariocitos nucleados• Cualquier leucocito conteniendo una inclusión anormal deberá ser
reportado pero con un conteo en paralelo por las 100 células contadas
• Ejemplo : Ud observó 60 neutrófilos en su conteo de100 de los cuales 20 de ellos tenían cuerpos de Döhle, ud deberá informar al final del recuento : neutrófilos (60%), y cuerpos de Döhle 20%
• Se deberá reportar los siguientes inclusiones : - cuerpos de Döhle- cuerpos de Auer- anomalía de Pelger Huet- anomalía de May – hegglin- inclusiones de Alder – Reilly- inclusiones Chediak – Higashi- granulaciones tóxicas - vacuolas citoplasmáticas o degenerativas
• Usted deberá reportar cualquier célula anormal o indiferenciada que observe
• Deberá reportar GR nucleados si estos exceden al 6% y corregirá su recuento de leucocitos con la siguiente formula :
Leucocitos contados / mm3 x 100 = leucocitos corregidos / mm3
100 + Nº hematíes nucléados
Ejemplo : si un paciente tiene un conteo de 15,000 leucocitos pmmc y 35 % de GRN, su conteo corregido será de 11,111 pmmc
Evaluación de la Serie Roja
• En este punto el observador deberá reportar su minucioso examen de los GR, indicando la presencia de Hipocromía, Anisocitosis y Poiquilocitosis.
• Deberá reportar también inclusiones eritrocitarias y hemoparásitos si los hubiera.
• Tambien indicará la presencia de células inmaduras de la serie roja si las hubieran
MADURACIÓN
SERIE
ROJA
• Hipocromía : cuando una célula roja individual contiene un área pálida central que es mayor a la tercera parte de su diámetro se denomina célula hipocrómica
• Rango medio para denominar hipocrómía en 10 campos microscópicos ( 100 – 160 hematíes por campo )
a. normocromía : 0 - 5b. leve hipocromía : 6 - 15c. moderada hipocromía : 16 - 30d. marcada hipocromía : > 30
• Nota : la hipercromía no esta reportada aquí pero se relaciona con la presencia de esferocitos.
• Hipercromía : se denomina así a las células rojas profundamente coloreadas en relación al resto, y esto debido a su alto contenido en hemoglobina, mayor al que debería contener
• Anisocitosis : cuando se presenta en el campo eritrocitos de diferentes tamaños
• Normocítos :diámetro longitudinal : 7 – 8 µ– Diamatro transversal
( espesor )periférico : 2 µcentral : 1 µ
- Superficie : 120 - 140 µ- Volumen : 80 – 95 µ
• Microcitosis : hematíes con un diámetro inferior a 7 µ y un volumen inferior a 80 µ3
• Macrocitosis : hematíes con un diámetro superior a las 8 µ y un volumen superior a las 100 µ3
• Megalocitos : hematíes con diámetro superior a las 11µ
Rango medio para anisocitosis / 10 campos
Normal Leve Anisocitosis Moderada Anisocitosis Marcada Anisocitosis
0 - 5 6 - 15 15 - 30 > 30
• Poiquilocitosis : cuando se presentan varias formas diferentes en los hematíes en un campo microscópico
• Si se observa solo un tipo leve de anormalidad la poiquilocitosis será leve, pero si coexisten diferentes formas de hematíes, entonces será marcada, no importando que individualmente sean leves
• Se recomienda que cada forma anormal sea evaluada separadamente
Rango medio para tipificar poiquilocitosis /10 campos
• Normal : 0 - 1• Leve : 1 - 5• Moderada : 6 - 15• Marcada : > 15
Acantocitos • AHA• A. sideroblástica• AHM• Enfermedad hepática• Enfermedad renal • Post- esplecnotomía
Drepanocitos • Células facliformes• A. drepanocítica• Enfermedad Hb S - C
Esquistocitos
• Son GR fragmentados• AHM• A. megaloblastica• Talasemia mayor• A. hemolíticas• Leucemia aguda• Hiperesplenismo
Megalocitos
• Anemias megaloblasticas
• Diámetro > a 11 micras
• ANEMIA MEGALOBLASTICA• ELIPTOCITOSIS HEREDITARIA• MIELOFIBROSIS• TALASEMIA MAYOR• TRAUMA MECANICO
Rouleaux • Cuando los GR se
presentan en fila de moneda
• Mieloma Multiple• Incremento de
gamma globulina • Macroglobulinemia de
Waldenstrom
Dianocito Célula en Tiro al Blanco
• ESTOMATOCITOSIS HERDITARIA• LEUCEMIA AGUDA• ALCOHOLISMO CON ENFERMEDAD HEPÁTICA• ARTEFACTOS• TALASEMIAS
Anillo de Cabot Cuerpos de Pappenheimer
Punteado Basófilo Cuerpos de Heinz
Reticulocitos
Policromatofilía
Cuerpos de Howell JollyPappenheimer
• El recuento diferencial leucocitario suministra información sobre aspectos cualitativos y cuantitativos de los diferentes leucocitos de la sangre y permite la detección de células anormales
• Se basa en la observación microscópica de 100 a 200 leucocitos dispuestos en una extensión de sangre ( frotis ) convenientemente teñida
• La calidad de la extensión de la sangre es de vital importancia para la realización de una correcta lectura de la lámina.
Serie Blanca
• La fórmula leucocitaria es la denominación usual que se da al recuento porcentual de los diferentes leucocitos que circulan en la sangre
• En condiciones de normalidad esta constituida por 5 poblaciones de leucocitos :
• Neutrófilos ( en su gran mayoría segmentados )• Eosinófilos • Basófilos • Monocitos • Linfocitos
Variables que pueden influir en la formula leucocitaria realizada mediante el método
visual
• Distribución irregular y no aleatoria de los leucocitos en la extensión
• Realización de la lectura en una zona inapropiada• Variaciones de la calidad y las características de la
tinción ( tinción ácida o básica )• Observación de un número insuficiente de células• Pericia del observador en la identificación celular
– neutrófilos segmentados Vs neutrófilos en banda– monocitos Vs linfocitos activados o atípicos– formas inmaduras de granulocitos neutrófilos
SERIE
MIELOIDE
Mieloblastos :• Es redondeado• Diámetro entre 15 – 20 µ• Su núcleo es grande,
redondeado, rojizo y tiende a centrarse
• Su cromatina es laxa y contiene de 2 a 3 nucleolos visibles
• Su citoplasma es basófilo y algunas contienes finas granulaciones azurófilas
Promielocito :• Se origina por maduración y
maduración del mieloblasto• Es redondeado• Diámetro de 16 – 25 µ• Núcleo grande,
redondeado, menos rojizo y tiende a excentrarase
• Cromatina laxa y generalmente se observa nucleolos en ella, puede presentar zonas de condensación
• Citoplasma abundante, repleto de gránulos primarios muy azurófilos
MIELOCITOS
JUVENILES O METAMIELOCITOS
METAMIELOCITOS
Metamielocitos Vs No Segmentados
Regla de la Mediana : Si al completar mentalmente la circunferencia nuclear y trazamos una línea media imaginaria y esta muestra la hendidura antes de la media estamos frente a un juvenil o metamielocito. Si por el contrario la hendidura esta detrás de la línea media, estamos frente a un abastonado
Juvenil No Segmentado
Metamielocitos Vs No segmentados
Regla del Diámetro : esta se basa en el ancho del núcleo. Si la anchura de esta es similar a la mitad de la longitud del núcleo estamos frente a un metamielocito o juvenil, en cambio si el ancho nuclear es menor a la mitad de la longitud ´ del núcleo, estamos frente a una célula en banda.
Juvenil No Segmentado
CÉLULAS EN
BANDAO
EN CAYADO
OABASTONADOS
Células Neutrófilas en Banda
Neutrófilos Vs No Segmentados
Regla del Tercio• Si la estrangulación
de la continuidad nuclear es menor a un tercio de la parte mas ancha del mismo núcleo, entonces es un segmentado
Regla del Filamento• Se dice que estamos
frente a un segmentado siempre y cuando se observe un núcleo polisegmentado y se observe al menos un puente de cromatina
Neutrófilos Vs No Segmentados
Neutrófilos Células en Banda
Criterios para la diferenciación entre neutrófilos Vs no segmentados
Si seguimos con la mirada la continuidad nuclearY en algún momento esta se entrecruza con otraLínea del mismo núcleo , entonces lo llamamosSegmentado. Del mismo modo si al termino de laObservación de la continuidad de la membranaNuclear sobra núcleo lo llamamos segmentado.( Fig. 1 )
Si al observar la continuidad nuclear no notamosCruce de líneas, entonces lo estamos frente a unAbastonado. ( fig. 2 )
Fig. 2
• Son células redondeadas, de tamaño entre 12 y 14 um.
• Su núcleo está segmentado en 2 a 5 lóbulos, unidos por unos finos puentes cromatínicos.
• El citoplasma es rosa pálido y contiene numerosos gránulos neutrófilos que se tiñen de color marrón con las coloraciones panópticas habituales, así como cierto número de gránulos primarios ( 10 – 20 % ) o azurófilos dificilmente visibles al quedar enmascarados por los neutrófilos.
• Su núcleo es de color violeta oscuro y presenta cromatina densa
• Algunas veces su núcleo presenta un pequeño ápéndice en “palillo de tambor” ( cromatina sexual )
NEUTRÓFILOSPOLISEGMENTADOS
Granulaciones Tóxicas Pelger - Huet
Vacuolas Citoplasmáticas Vacuolas Degenerativas
BASÓFILO
• Poseen un núcleo bilobulado y grandes gránulos esféricos basofílicos y metacromáticos dados por heparina e histamina. Liberan además aminas vasoactivas y sustancia de reacción lenta de la anafilaxia.
• Célula redondeada• 12 – 17 µ• Núcleo violeta,
generalmente bilobulado simétrico unido por un puente de cromatina o en forma de anteojos
• Presenta gránulos, grandes y acidófilos que no cubren el núcleo
• Estos gránulos se tiñen con la eosina y contienen diversas sustancias como la peroxidasa, fosfatasa ácida, hidrolasas, etc
Eosinófilos
Serie Linfoide:
Linfoblasto
Linfocitos
Prolinfocitos
• Diámetro variable de 7 – 18 µ• Pueden diferir en su relación
N / C• El citoplasma es variable
( escaso o abundante )• Su coloración es azul pálida,
pero aumenta en los linfos reactivos ( estimulados )
• Pueden presentar una granulación azurófila escasa en el ciptoplasma
• Núcleo redondeado y cromatina compacta
• La densidad de la cromatina puede variar entre los diferentes estadíos. Es generalmente elevada pero pueden presentar zonas mas laxas
Linfocitos
LINFOCITOS ATÍPICOS
MAS LINFOCITOS ATÍPICOS
Serie Linfocítica : Criterios
Plasmocitos • 8 – 20 µ de diámetro• Relación N/C 2:1 o 1:1• Núcleo redondo u oval• Cromatina densa azul –
purpura con grandes muescas cerca al margen nuclear
• No presenta nucleolos• Citoplasma moderado,
basófilo, con zona clara perinuclear adjacente al núcleo
• Puede contener una o mas vacuolas
• No presenta granulaciones citoplasmáticas
MONOCITOS• Son las células circulantes de
mayor tamaño. Poseen un núcleo excéntrico en forma de U ó en forma “arriñonada”
• El núcleo suele presentar una ubicación central
• 14 – 20 µ de diametro • Citoplasma abundante y de color
lila pálido• Presenta fina granulación azurófila• Presenta cromatina laxa o
filamentosa• En ocasiones se halla vacualizado
• Son los precursores del sistema mononuclear fagocítico, que incluye macrófagos (histiocitos), osteoclastos, macrófagos alveolares, células de Kupfer en el hígado y la microglia en el sistema nervioso central.
Monoblasto
Promonocito
Monocito
Serie Monocítica
Serie Trombocítica
• Debemos reportar la cantidad de plaquetas en lámina ( trombocitopenias o trombosis )
• Debemos dar un informe detallado sobre la citomorfología de las plaquetas
• Reportar si hay plaquetas normales, degranuladas, pequeñas o macroplaquetas
• Se debe informar si existe la presencia de agregados plaquetarios
• Es muy importante una impecable técnica en el momento de realizar el frotis, es decisivo.
Promegacariocito
Megacariocito Granular
Megacariocito en Brotación
Megacariocito Productor de Plaquetas
Serie Trombocítica• Las plaquetas son las
células sanguíneas mas pequeñas del organismo
• Se producen por fragmentación simple del citoplasma de los megacariocitos.
• Son células anucleadas de forma discoide de 2 – 4 micras de diámetro y 8 micras de volumen.
• poseen una vida media de 7 - 10 días y su rango va de 150,000 a 450,000 pmmc
Trombocitopenia :
Leve : 150,000 - 100,000Moderada : 100,000 - 50,000Severa : < 50,000
Macroplaqueta Plaquetas Normales
≥ 450, 000 pmmc se denomina trombocitosis
≥ 1’000,000 pmmc se denomina trombocitemia
Recuento en Lámina Periférica
Damacheck :
• ( Rcto 1000 GR + F ) x 100
• Factor = ?
• Hto ≤ 35 ( + 5 )• Hto : 35 - 39 ( + 3 )• Hto : ≥ 40 ( + 1 )