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ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS
CROMOSOMA FILADELFIA NEGATIVAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y DEL
SEGUIMIENTO
TESIS DOCTORAL
Curso 2009-2010
Autora: Marta Anna Sobas
Directores:
Prof. José Luis Bello López
Prof. Manuel Mateo Pérez-Encinas
FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Medicina
ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2 EN PACIENTES CON NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS
CROMOSOMA FILADELFIA NEGATIVAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y DEL
SEGUIMIENTO
Marta Anna Sobas
10 de Junio 2010
FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Medicina
D. José Luis Bello López, Profesor Titular de Hematología, Departamento de
Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela,
CERTIFICO
Que la tesis doctoral titulada “ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL
GEN JAK2 EN PACIENTES CON LAS NEOPLASIAS
MIELOPROLIFERATIVAS CRÓNICAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y
CLINICA”, presentada por Dña. Marta Anna Sobas, ha sido realizada bajo mi
dirección y considero que reúne las condiciones necesarias para ser defendida
frente al Tribunal correspondiente para optar al grado de Doctor en Medicina y
Cirugía.
En Santiago de Compostela, a 10 de junio de 2010
Fdo.: Prof. D. José Luis Bello López
D. Manuel Mateo Pérez Encinas, Profesor Asociado de Departamento de
Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela,
CERTIFICO
Que la tesis titulada “ESTUDIO DE LAS MUTACIONES DEL GEN JAK2
EN PACIENTES CON LAS NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS
CRÓNICAS. UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y CLINICA” presentada por
Dña. Marta Anna Sobas, ha sido realizada bajo mi dirección y considero que
reúne las condiciones necesarias para ser defendida frente al Tribunal
correspondiente para optar al grado de Doctor en Medicina y Cirugía.
En Santiago de Compostela, a 10 de junio de 2010
Fdo.: Prof. D. Manuel Mateo Pérez Encinas
A mi familia en Polonia y en España
Mojej rodzinie w Polsce i w Hiszpanii
AGRADECIMIENTOS
Al Prof. José Luis Bello López, por haber aceptado la dirección de este proyecto y sobre
todo por su ejemplo personal como Jefe de Servicio de Hematología y Hemoterapia del
Hospital Clínico de Santiago de Compostela, con su dedicación al trabajo ha contribuido a
formarme como hematóloga y como médico.
Al Prof. Manuel M. Pérez-Encinas, por su ayuda en iniciar, proseguir y finalizar este
trabajo. Y sobre todo por su tiempo, paciencia y cariño. Sin su ayuda, la realización de
este trabajo no sería posible.
Al Prof. Radek Skoda (Department of Biomedicine, University Hospital Basel), por
introducirme en el apasionante mundo de anomalías genéticas de las neoplasias
mieloproliferativas, por dejarme participar en alguno de sus proyectos de investigación y
por su amistad.
A Dra. Teresa González López y Dra. Celsa Quinteiro García por sus enseñanzas para no
“perderme” en el mundo de la genética, por su ayuda en el laboratorio de Medicina
Xenómica y sobre todo por su infinita paciencia y apoyo.
Al Dr. Francisco Gude Sampedro, por su paciencia y por su ayuda en esa materia, para mí
tan complicada, que es la estadística.
A todo el personal del Servicio de Hematología y Hemoterapia, médicos, enfermeros,
auxiliares y técnicos de laboratorios, todos en algún momento me han ayudado y animado
a seguir. Pero sobre todo quiero agradecer a los médicos hematólogos y MIR que han
colaborado directamente en el manejo de los pacientes que han sido motivo de análisis, es
decir a Aída Fernández Montero, María Ángeles Bendaña López, María José Rabuñal
Martinez, Natalia Alonso Vence, José Ángel Díaz Arias, María Dolores Vilariño López y
Eugenia Fernández Mellid.
A mis amigos del “Department of Biomedicine” en el Hospital Universitario de Basilea:
Renate Looser, Pontus Lundberg, Franz Schaub, Ralph Tiedt, Hui Hao-Shen, Li Sai por
su desinteresada ayuda en mi aprendizaje de las técnicas del estudio molecular y por su
amistad.
Deseo expresar mi agradecimiento a todos los pacientes diagnosticados de neoplasias
mieloproliferativas crónicas (especialmente a Victoria y a su familia), que han participado
con su consentimiento en este estudio. Sin ellos, nuestro trabajo carecería de sentido.
Por último, mencionar que este trabajo ha sido subvencionado por la beca de la
“Consellería de Sanidade, Xunta de Galicia” (PS08/01), por lo tanto quiero dar las gracias
al tribunal y autoridades administrativas que han confiado en este proyecto.
ÍNDICE
1
ABREVIATURAS 4
I. REVISIÓN DEL TEMA 6
1. Introducción 7
2. Epidemiología y factores pronósticos 8
3. Criterios diagnósticos 10
4. Tratamiento 11
5. Patogénesis 12 5.1. Introducción 12 5.2. Mutación JAK2V617F 13 5.3. Mutaciones del gen MPL 16 5.4. Mutaciones del gen JAK2-exón 12 18 5.5. Relación entre genotipo y fenotipo 19
6. JAK2V617F y clínica 21 6.1. JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg 21 6.2. JAK2V617F: la carga alélica 21 6.3. JAK2V617F: evolución en el tiempo de la carga alélica 22 6.4. Metodología para la detección de la mutación JAK2V617F 23
6.4.1. Secuenciación 24 6.4.2. Pirosecuenciación 24 6.4.3. PCR alelo-específica 25
7. Citogenética convencional 26
8. Alteraciones inmunológicas en /MP 27
II. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 28
1. Justificación del trabajo 29
2. Hipótesis de estudio 30
3. Objetivos del estudio 31 3.1. Objetivo general 31 3.2. Objetivos específicos. 31
III. MATERIAL Y MÉTODOS 32
1. Muestra del estudio 33
2. Metodología 34 2.1. Variables del estudio 34
2.1.1. Variables clínicas 34 2.1.2. Variables analíticas 36
2.2 Estudio de las mutaciones 36 2.3 Estudio morfológico de médula ósea 37 2.4 Revisión de los criterios diagnósticos de WHO 38
ÍNDICE
2
3. Procedimientos y técnicas utilizadas 40 3.1. Análisis de la mutación JAK2V617F 40 3.2. Análisis de otras mutaciones en NMP 43
3.2.1. Estudio de las mutaciones en el exón 12 del gen JAK2 43 3.2.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL 43
3.3. Estudio citogenético de la médula ósea 43 3.4. Subpoblaciones linfocitarias 44
4. Análisis estadístico 45
IV. RESULTADOS 46
1. Criterios diagnósticos WHO 49 1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación 49
1.1.1. Grupo con sospecha de PV 49 1.1.2. Grupo con sospecha de TE 50 1.1.3. Grupo con sospecha de MFP 51 1.1.4. Grupo con progresión 51
1.2. Estudio histopatológico de las NMP (WHO 2008) 52
2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en /MP (WHO 2008) 54 2.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg 54 2.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg 55 2.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos 56 2.4. Estado JAK2V617F y estudio histopatológico 58
2.4.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg 58 2.4.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg 58 2.4.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos 59
3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas 60 3.1. Carga alélica JAK2V617F y diagnóstico según WHO 2008 60 3.2. Carga alélica JAK2V617F en el diagnóstico diferencial entre la PV y la TE. Curva ROC. 62 3.3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas 64 3.4. Carga alélica JAK2V617F y estudio histopatológico 68
4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica 69 4.1. Seguimiento del grupo JAK2V617F-neg 69 4.2. Seguimiento del grupo JAK2V617F-pos 70
4.2.1. Grupo completo de pacientes. 70 4.2.2. Grupo sin tratamiento citorreductor 72 4.2.3. Grupo con tratamiento citorreductor con HDU 73 4.2.4. Grupo con trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos 79 4.2.5. Grupo con progresión de NMP 80
4.2.5.a. Progresión a otra NMP 80 4.2.5.b. Progresión de una NMP a LMA 82
5. /uevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico 83 5.1. Estudio de las mutaciones en el gen JAK2-exón 12 83 5.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL 83
6. Cariotipo y JAK2V617F 85
7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F 87
8. Factores pronósticos y JAK2V617F 89
ÍNDICE
3
8.1. Supervivencia y JAK2V617F 89 8.2. Eventos vasculares y JAK2V617F 90 8.3. Progresión y JAK2V617F 91
V. DISCUSIÓN 92
1. Criterios diagnósticos WHO 93 1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación 93 1.2. Estudio histopatológico de las NMP WHO 2008 94
2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en /MP (WHO 2008) 98
3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas 101
4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica 104
5. /uevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico 113
6. Cariotipo y JAK2V617F 116
7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F 117
8. Factores pronósticos y JAK2V617F 119 8.1. Supervivencia 119 8.2. Eventos trombóticos 119 8.3. Progresión a MFsec o LMA 121
VI. CONCLUSIONES 123
VII. BIBLIOGRAFÍA 127
ABREVIATURAS
4
• Alo-TPH: transplante alogénico de progenitores hematopoyéticos
• ANA: anagrelida
• AMO: aspirado de médula ósea
• BMO: biopsia de médula ósea
• ELN: European LeukemiaNet
• EPO: eritropoyetina
• FAL: fosfatasa alcalina leucocitaria
• HDU: hidroxiurea
• INF-α : interferón α
• JAK2V617F-neg: ausencia de la mutación V617F en el gen JAK2
• JAK2V617F-pos: mutación V617F en el gen JAK2
• JAK2-exón 12: mutación en el exón 12 del gen JAK2
• LDH: lactato dehidrogenasa
• Linfocitos NK: linfocitos natural killer
• TNK: linfocitos T con actividad de linfocitos NK
• LMA: leucemia mieloide aguda
• LMC: leucemia mieloide crónica
• MFP: mielofibrosis primaria
• MFsec: mielofibrosis secundaria
• MO: médula ósea
• MPL: gen que codifica el receptor de la trombopoyetina
• NMP: neoplasia mieloproliferativa
• NRh: no respuesta hematológica
• NFg: no respuesta genética (se refiere a la mutación JAK2V617F)
• PCR: reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)
• Ph-neg: cromosoma Filadelfia negativo
• PV: policitemia vera
ABREVIATURAS
5
• PVSG: Polycythemia Vera Study Group
• RCh: respuesta hematológica completa
• RCg: respuesta genética completa (se refiere a la mutación JAK2V617F)
• RPh: respuesta hematológica parcial
• RPg: respuesta genética completa (se refiere a la mutación JAK2V617F)
• SNP: Single ucleotide Polymorphisms
• SP: sangre periférica
• TE: trombocitemia esencial
• TPO: trombopoyetina
• WHO: World Health Organization
6
I. REVISIÓN DEL TEMA
I. REVISIÓN DEL TEMA
7
1. Introducción
Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) engloban un grupo de entidades hematológicas
que se originan en la expansión clonal de una célula germinal pluripotencial. Comparten
ciertas características clínicas y biológicas como son la presencia de una médula ósea
hipercelular, una incidencia aumentada de complicaciones trombóticas y hemorrágicas y, a
largo plazo, un riesgo aumentado de evolución a leucemia aguda [1]. Se caracterizan por la
proliferación incontrolada en la médula ósea de una o más líneas celulares mieloides con
maduración [2]. Dentro de las NMP diferenciamos: NMP cromosoma Philadelfia positivos
(Ph-pos) y Ph negativos (Ph-neg). Bajo el término de NMP Ph-neg (llamadas a partir de
ahora NMP) se incluyen, entre otras entidades, la policitemia vera (PV), la trombocitemia
esencial (TE) y la mielofibrosis primaria (MFP).
El descubrimiento en el año 2005 de la mutación V617F del gen JAK2V617F en el 95% de
los pacientes con PV y en la mitad de los casos de TE y MFP ha venido a apoyar la
agrupación de estas tres entidades en una posición nosológica común [3-7]. El aumento de la
masa eritrocitaria en la PV, la trombocitosis en la TE y la fibrosis medular en la MFP son las
características fundamentales de cada una de estas tres entidades.
I. REVISIÓN DEL TEMA
8
2. Epidemiología y factores pronósticos
La incidencia anual de PV y de TE es de 2 a 3 casos por 100,000 habitantes, mientras que la
de MFP es de solo 0,5 casos por 100,000 habitantes año [8-9]. A raíz de la incorporación de
los nuevos criterios diagnósticos WHO 2008 [10], se ha observado un aumento de la
incidencia de TE mientras que la de PV y MFP se mantiene estable [11]. Dicho aumento se
debe al descenso de cifra de plaquetas y a la incorporación de las mutaciones JAK2V617F y
del gen MPL en los criterios diagnósticos.
La edad media de presentación de la PV y de la TE es de unos 60 años y ambas entidades
son poco frecuentes en pacientes jóvenes. Solamente el 5% de los enfermos con PV tienen
menos de 40 años, el 1% menos de 25 años y el 0,1% menos de 20 años. En la TE el 15-
20% de los pacientes tienen menos de 40 años de edad en el momento del diagnóstico. En la
MFP la edad media de presentación de MFP es de unos 65 años [9,12-14].
La supervivencia media de los pacientes diagnosticados de PV o TE es de 15 años, la cual
según algunos estudios es similar a la de la población general [13-16], pero podría estar
acortada según otros estudios [17-18]. La supervivencia de estos pacientes puede verse
acortada sobre todo por el desarrollo de las complicaciones trombóticas y por progresión de
la enfermedad a mielofibrosis secundaria (MFsec) o a leucemia mieloide aguda (LMA). El
riesgo a 10 años de desarrollar mielofibrosis es <5% para la TE y <10% para la PV, y el
riesgo para desarrollar una LMA es de <2% en la TE y <6% en la PV [19-20]. Los pacientes
con MFP tienen una supervivencia media de 4-5,5 años y entre las causas fundamentales de
la muerte se encuentran: progresión a LMA (en 20% de los casos a 10 años de seguimiento),
alteraciones relacionadas con el fallo medular (anemia, sangrado), alteraciones hepáticas y
trombosis [17].
I. REVISIÓN DEL TEMA
9
La patogénesis de la trombosis en las NMP es multifactorial y en parte se atribuye a la
hiperviscosidad sanguínea y a factores de riesgo cardiovascular como el tabaquismo, la
hipertensión arterial, la hipercolesterolemia, la diabetes o las trombofilias hereditarias.
También se valora la posible influencia de otros factores, entre ellos la cifra de plaquetas y
leucocitos, la interacción entre ambos y finalmente la presencia de la mutación JAK2V617F
[15-16,19,21-35].
Respecto a la progresión a mielofibrosis secundaria (MFsec) o leucemia mieloide aguda
(LMA) se dispone de escasa información. La duración de la enfermedad es el único factor
de riesgo claramente asociado con la progresión a MFsec [35-36]. En cuanto a la progresión
a LMA, la edad superior a 70 años y el empleo de citostáticos diferentes de la hidroxiurea
(HDU) y el interferón α (INF-α) fueron los únicos factores relacionado con el riesgo de
progresión [36]. Recientemente se ha sugerido que la leucocitosis ≥ 15000 x 109/L, podría
ser otro factor de riesgo de progresión a MFsec o a LMA [31,37]. Además en varios
estudios se analizó la relación entre la mutación JAK2V617F y el desarrollo de la
progresión, sin poder sacar conclusiones definitivas [5,17,32,38-46].
I. REVISIÓN DEL TEMA
10
3. Criterios diagnósticos
El diagnóstico tradicional de las NMP se basaba en un conjunto de datos clínicos, en el
recuento celular en sangre periférica (hematimetría), el estudio morfológico de la médula
ósea y la sangre periférica, y en la exclusión de otros cuadros tumorales o reactivos que
pueden cursar con una expresión hematológica similar. Varios grupos, especialmente el
Polycythemia Vera Study Group (clasificación PVSG) cuya primera clasificación data del
año 1975 [47] y un grupo de expertos de la Organización Mundial de la Salud (clasificación
WHO revisada periódicamente) [48] han elaborado unos criterios diagnósticos, basados
esencialmente en la exclusión. Con el descubrimiento de la mutación V617F en el gen JAK2
en año 2005, se planteó su estudio con finalidad diagnóstica. Además se vio que la TE con
mutación JAK2V617F, presentaba un curso de la enfermedad similar al de la PV por lo que
se sugirió que los pacientes TE JAK2V617F-pos son realmente enfermos con PV inaparente
[43]. En este sentido, se han realizado muchos trabajos de distintos grupos de investigación
tanto básica como clínica [3-7,43-51], que llevaron en el año 2008 a la última actualización
de los criterios diagnósticos WHO [10], incluyendo un cambio de nomenclatura,
actualmente llamadas neoplasias mieloproliferativas (NMP), en los que se incluye el estudio
de la mutación JAK2V617F (véase la Tabla 2, 3 y 4).
La incorporación de los criterios anatomopatológicos dentro de los criterios diagnósticos de
las NMP, ocurrió por la primera vez en la clasificación de la Organización Mundial de la
Salud, WHO 2001 [48]. El papel diagnóstico de la biopsia de médula ósea (BMO) ha sido
ratificado en la nueva clasificación de la WHO 2008 aunque la reproductibilidad de los
criterios histopatológicos, sobre todo de la morfología de la línea celular megacariocítica ha
sido cuestionada en publicaciones recientes [52-53].
I. REVISIÓN DEL TEMA
11
4. Tratamiento
El tratamiento de las NMP varía según el diagnóstico (PV vs TE vs MFP) y en función de
riesgo trombótico de cada pacientes [33,54-59]. En pacientes jóvenes, sin gran componente
proliferativo ni factores de riesgo trombótico, se recomienda la abstención terapéutica o la
administración de antiagregantes (ácido acetilsalicílico) en dosis bajas [60]. En la PV
también debe realizarse sangrías con el objetivo de mantener el hematocrito (Hematocrito)
<0,45% en hombres y <0,42% en mujeres [55-56]. El tratamiento citorreductor se reserva
cuando han fracasado otras medidas, así como para los pacientes mayores y/o con factores
de riesgo trombótico asociados y/o gran componente proliferativo. Los fármacos
citorreductores más frecuentemente utilizados son: hidroxiurea (HDU), anagrelida (ANA) y
en algunos casos Interferón-α (INF-α) [61]. El tratamiento de los enfermos con MFP es
fundamentalmente paliativo y dirigido a controlar síntomas [62-63]. En los pacientes
jóvenes con el diagnóstico de la MFP o mielofibrosis secundaria (progresión de PV o TE)
puede estar indicada la realización de un trasplante alogénico de progenitores
hematopoyéticos (alo-TPH) [62-66].
I. REVISIÓN DEL TEMA
12
5. Patogénesis
5.1. Introducción
La policitemia vera, fue mencionada por primera vez en el año 1892 por Vaquez [67] y su
primera descripción fue publicada por Osler en 1903 [68]. En 1951 Dameshek sugirió que
en las NMP había un incremento en la proliferación de células mieloides, debido
probablemente a una alteración desconocida que estimulaba dicha proliferación [1]. Además
este autor estableció la relación entre la PV, la TE y la MFP, englobándolas en el grupo
llamado “enfermedades mieloproliferativas”. En 1974, se describió que los progenitores
eritroides de la médula ósea de los pacientes con PV podían cultivarse in vitro en ausencia
de eritropoyetina [69]. La existencia de un crecimiento autónomo de los progenitores
eritroides sugería un comportamiento neoplásico y, por lo tanto, un origen clonal de la
enfermedad. Dicho origen clonal se demostró estudiando los patrones de inactivación del
cromosoma X en mujeres con PV [2,70].
Sin embargo, los genes implicados en la etiopatogenia de la PV permanecieron ocultos hasta
muy recientemente, cuando Kralovics et al [71] refirieron que el 33% de los pacientes con
PV presentaban una pérdida de la heterocigosidad en el brazo corto del cromosoma 9. Dicho
hallazgo reforzaba el origen clonal de la PV y señalaba al brazo corto del cromosoma 9
como el lugar donde se encontraba el gen causal de la PV. Finalmente, en el año 2005 cinco
grupos independientes demostraron de forma simultánea que la mayoría de pacientes con
PV presentaban una mutación puntual localizada en el gen de la cinasa JAK2, localizado en
el brazo corto del citado cromosoma 9 [3-7].
I. REVISIÓN DEL TEMA
13
5.2. Mutación JAK2V617F
JAK2 (cr9p24), es un gen que codifica una proteína citoplasmática con actividad
tirosincinasa que interviene en la cascada de transducción de señales intracelulares [72-73],
al activarse los receptores de citocinas tipo I como son los receptores de la eritropoyetina,
del G-CSF, del GM-CSF o de la trombopoyetina (MPL). La mutación V617F afecta a un
aminoácido situado en el dominio JH2 y se produce por un cambio de una guanina en el
alelo salvaje por una tirosina del alelo mutado en el nucleótido 1849 (en el exón 14) que
origina la sustitución de una valina por una fenilalanina en la posición 617 de la proteína
madura (véase Figura 1) [3-7].
El dominio JH2 tiene actividad pseudocinasa y su función consiste en inhibir al dominio
cinasa JH1 interaccionando con el bucle de activación [75]. Como consecuencia de la
mutación V617F no se produce la inhibición del dominio cinasa JH1, lo que resulta en una
activación constitutiva de la proteína JAK2 en ausencia de la unión del ligando al receptor
Figura 1. La mutación JAK2V617F. A: Secuencia de los aminoácido del gen JAK2 mutado (mutación V617F). B: Secuencia de los aminoácidos del gen JAK2 no mutado (74 modificado).
I. REVISIÓN DEL TEMA
14
hematopoyético. Se trata, por tanto, de una mutación que provoca una ganancia de función
[3-7], es decir, una activación permanente de diferentes vías de transducción de señales
implicadas en la señalización de los receptores de citocinas de tipo I (EPO, G-CSF, c-MPL)
como JAK-STAT, PI3K, AKT, MAPK y ERK (véase Figura 2) [3-7,76-78].
EPO
JH1 JH1
JH2JH2
FERM FERM
JAK2 WT SI/ERITROPOYETI/A
JAK2 WT CO/ERITROPOYETI/A
JAK2 CO/ MUTACIÓ/ V617F
JH1 JH1P P
JH2 JH2
FERM FERM
AUSE/CIA DE SEÑAL,JH1 I/HIBIDA POR JH2
ACTIVACIÓ/ VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ACTIVACIÓ/ CO/STITUTIVA VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
JH1
JH2
FERM
PJH1
P
JH2
FERM
R-EPO R-EPOR-EPOR-CSFc-MPL
ERITROPOYESIS PANMIELOPOYESIS
CITOPLASMA
ESPACIO EXTRACELULAR
EPO
JH1 JH1
JH2JH2
FERM FERM
JAK2 WT SI/ERITROPOYETI/A
JAK2 WT CO/ERITROPOYETI/A
JAK2 CO/ MUTACIÓ/ V617F
JH1 JH1P P
JH2 JH2
FERM FERM
AUSE/CIA DE SEÑAL,JH1 I/HIBIDA POR JH2
ACTIVACIÓ/ VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ACTIVACIÓ/ CO/STITUTIVA VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
JH1
JH2
FERM
PJH1
P
JH2
FERM
JH1
JH2
FERM
PJH1
JH2
FERM
PJH1
P
JH2
FERM
JH1P
JH2
FERM
JH1P
JH2
FERM
R-EPO R-EPOR-EPOR-CSFc-MPL
ERITROPOYESIS PANMIELOPOYESIS
CITOPLASMA
ESPACIO EXTRACELULAR
Figura 2. Mecanismo de acción de JAK2. Cuando el receptor de la eritropoyetina (R-EPO) no está unido a su ligando, la proteína JAK2 permanece desfosforilada, sin que se transmita ninguna señal al interior celular. Tras la unión con la eritropoyetina, el R-EPO se activa y se produce la fosforilización de JAK2, la cual, a su vez, fosforila diferentes proteínas que intervienen en la transmisión de señales al interior celular, lo que resulta en un estímulo de la eritropoyesis. Cuando la proteína JAK2 alberga la mutación V617F, permanece fosforilada en ausencia de ligando, dando como resultado una activación continua de las vías de transmisión de señales. Como la mutación se produce en un progenitor hematopoyético, da lugar a un estímulo de las tres series, ya que JAK2 está implicada en la transmisión de señales de la EPO, el G-CSF y la TPO [79 modificado].
I. REVISIÓN DEL TEMA
15
En condiciones normales, al unirse la eritropoyetina al receptor, éste se dimeriza, de forma
que las dos moléculas de JAK2 unidas al dominio yuxtamembrana citoplasmático del
receptor se aproximan y se activan mutuamente por fosforilación [80-83]. Una vez activada
JAK2, recluta a las proteínas STAT, que se fosforilan y dimerizan, entrando en el núcleo,
donde activan la transcripción de genes implicados en la proliferación y la supervivencia
[72-73].
Existen evidencias sólidas que demuestran que la mutación JAK2V617F es un evento
fisiopatogénico importante en el desarrollo de las NMP [3-7,84-86]. Entre ellas el hecho de
que es una mutación somática y adquirida, cuyo origen es un precursor hematopoyético
pluripotencial, ya que células mieloides, eritroides, megacariocitos y linfocitos presentan la
mutación [3,87-88]. Pero sobre todo los estudios funcionales con JAK2V617F en líneas
celulares y en modelos animales transgénicos han demostrado el carácter oncogénico de
dicha mutación y su potencial para causar la enfermedad [4-5,84-86].
La frecuencia de aparición de la mutación JAK2V617F en las tres principales entidades de
NMP es variable, según la técnica de detección usada: 65-97% en pacientes con PV, 23-
57% con TE y 35-95% con MFP [3-6]. Además, dicha mutación puede encontrarse con
frecuencias bajas en leucemia mieloide aguda (5%), síndromes mielodisplásicos (3%),
leucemia mielomonocítica crónica (6%), síndromes mieloproliferativos atípicos (20%),
síndrome hipereosinofílico (1%), mastocitosis sistémica (6%) y aislados casos de leucemia
mieloide aguda (LMA) primaria o leucemia mieloide crónica (LMC) [87-94]. En caso de la
LMC, se detecta la coexistencia del cromosoma Ph y de la mutación JAK2V617F [90-94].
Además, la mutación JAK2V617F, no aparece en enfermos con eritrocitosis o trombocitosis
secundaria [3-6], enfermedades linfoproliferativas [95-96]. En caso de individuos sanos, su
detección es posible en 2% de los casos, solamente utilizando técnicas muy sensibles [97-
I. REVISIÓN DEL TEMA
16
99]. Por este motivo estudio de la mutación JAK2V617F promete ser de gran ayuda para el
diagnóstico diferencial de estas entidades.
Sin embargo, JAK2V617F no es la única mutación presente en las NMP [100-111]. En 2006
se describieron mutaciones en el gen MPL [102-103] y en 2007 en el exón 12 del gen JAK2
[104]. Recientemente, se han comunicado nuevas mutaciones en las NMP como: TET2
[105-107], CBL [107-108], ASXL1 [109], IDH [110] y IKZF1 [111] de las cuales la más
frecuente es la mutación TET2 que aparece en 16% de PV, 5% de TE y MFP 17%. Hasta la
fecha no se ha demostrado su papel patogénico primario, siendo probablemente eventos
secundarios [109-111]. Además, se esta analizando su probable relación con la progresión a
LMA, ya que casi 20% de los casos de NMP en la fase blástica presentan alguna de estas
mutaciones [101,105-111].
5.3. Mutaciones del gen MPL
La mutación MPL-W515L afecta al aminoácido 515 del gen que codifica el receptor de la
trombopoyetina y provoca la dimerización del receptor en ausencia del ligando y la
activación constitutiva de la vía de transducción de señales dependiente de este receptor
[102-103] (véase Figura 3).
I. REVISIÓN DEL TEMA
17
Se han descrito otras mutaciones, funcionalmente relevantes, en el gen MPL como: MPL-
W515K, MPL-W515A y MPL-S505N [101,112-113]. Las mutaciones MPL W515K/L/A
están presentes aproximadamente entre 1 y 9% de los pacientes con MFP y TE y la
mutación MPL-S505N está descrita tanto en casos de trombocitosis familiar como en la TE
esporádica. Las mutaciones en el gen MPL no se encuentran en los pacientes con PV, lo que
sugiere que dichas mutaciones favorecerían el desarrollo preferencial de la línea
megacariocítica con respecto a la eritroide. Esta hipótesis ha sido confirmada in vitro
demostrando la mutación en progenitores hemopoyéticos multipotentes con diferenciación
megacariocítica espontánea [114]. El papel etiopatogénico de la mutación W515L de MPL
en la MFP se puso de manifiesto en un modelo murino en el que los ratones trasplantados
CITOPLASMA
ESPACIO EXTRACELULAR
W515K, W515L, W515R, W515A
RECEPTOR MPL SI/TROMBOPOYETI/A
RECEPTOR MPL U/IDO A TROMBOPOYETI/A
RECEPTOR MPLMUTADO
AUSE/CIA DE SEÑAL,JH1 I/HIBIDA POR JH2
ACTIVACIÓ/ VÍATRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ACTIVACIÓ/ CO/STITUTIVA VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ESTIMULACIÓ/ MEGACARIOPOYESIS
JAK2 JAK2P
JAK2JAK2
PJAK2
P PJAK2
TPO
CITOPLASMA
ESPACIO EXTRACELULAR
W515K, W515L, W515R, W515A
RECEPTOR MPL SI/TROMBOPOYETI/A
RECEPTOR MPL U/IDO A TROMBOPOYETI/A
RECEPTOR MPLMUTADO
AUSE/CIA DE SEÑAL,JH1 I/HIBIDA POR JH2
ACTIVACIÓ/ VÍATRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ACTIVACIÓ/ CO/STITUTIVA VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ESTIMULACIÓ/ MEGACARIOPOYESIS
JAK2 JAK2P
JAK2JAK2
PJAK2
P PJAK2
TPO
RECEPTOR MPL SI/TROMBOPOYETI/A
RECEPTOR MPL U/IDO A TROMBOPOYETI/A
RECEPTOR MPLMUTADO
AUSE/CIA DE SEÑAL,JH1 I/HIBIDA POR JH2
ACTIVACIÓ/ VÍATRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ACTIVACIÓ/ CO/STITUTIVA VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ESTIMULACIÓ/ MEGACARIOPOYESIS
ACTIVACIÓ/ VÍATRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ACTIVACIÓ/ CO/STITUTIVA VÍAS TRA/SDUCCIÓ/ DE SEÑALES
ESTIMULACIÓ/ MEGACARIOPOYESIS
JAK2 JAK2P
JAK2
PJAK2JAK2
PJAK2
PJAK2
P PJAK2
TPO
Figura 3. Mecanismo de acción del receptor de MPL. En condicionales normales cuando el receptor de la trombopoyetina (MPL) no está unido a su ligando la proteína JAK2 permanece desfosforilada, sin que transmita ninguna señal al interior celular. Tras la unión con la TPO, el MPL se dimeriza y activa, produciéndose la fosforilización de JAK2, la cual, a su vez, fosforila diferentes proteínas que intervienen en la transmisión de señales al interior celular lo que resulta en un estímulo de la megacariopoyesis. Cuando el receptor MPL alberga la mutación W515K o W515L, se produce la dimerización del receptor en ausencia de ligando, dando como resultado una activación continua de las vías de transmisión de señales [79 modificado, 102-103].
I. REVISIÓN DEL TEMA
18
con progenitores portadores de dicha mutación desarrollaron un síndrome mieloproliferativo
rápidamente progresivo, caracterizado por leucocitosis, trombocitosis, esplenomegalia y
fibrosis medular, pero no eritrocitosis [102].
5.4. Mutaciones del gen JAK2-exón 12
Las mutaciones en el gen JAK2-exón 12 (véase Figura 4) fueron descritas en
aproximadamente el 3-5% [101,113] de los pacientes con PV JAK2-neg. Hasta la fecha, se
han descrito más de 10 distintas mutaciones del gen JAK2-exón 12 [104,115-122].
Los casos de PV que presentan mutaciones en el exón 12 tienen valores más altos de
hemoglobina en el momento del diagnóstico que los casos de PV JAK2V617F-pos, así
como valores de leucocitos y de plaquetas normales [104,115,117,121].
Se conoce, que tanto las mutaciones MLP como las del exón 12 están implicados en la
fisiopatología de las NMP [102,104,113]. Además, ambas mutaciones han sido incluidas
Mutaciones en el exón 12535 547
SH2 JH2 JH1FERM
V617F
Carboxi-terminal
Amino-terminal
Mutaciones en el exón 12535 547
Mutaciones en el exón 12535 547
Mutaciones en el exón 12535 547
SH2 JH2 JH1FERM
V617F
Carboxi-terminal
Amino-terminal
SH2 JH2 JH1FERM
V617F
Carboxi-terminal
Amino-terminal
Figura 4. Esquema de la proteína JAK2. La proteína JAK2 consta de un dominio FERM de
interacción con el receptor de citoquinas, un dominio SH2 donde se unen proteínas inhibidoras de JAK2, un dominio JH1 con actividad cinasa y un dominio JH2 con actividad pseudocinasa cuya función es inhibir el dominio JH1. Localización de las mutaciones en el exón 12 y de JAK2V617F en la proteína JAK2 [116 modificado].
I. REVISIÓN DEL TEMA
19
como los marcadores clonales de las NMP JAK2V617F-neg en la nueva revisión de los
criterios diagnósticos WHO 2008 [10].
5.5. Relación entre genotipo y fenotipo
Existen muchos motivos para pensar que exista otra alteración genética, aparte de la
mutación JAK2V617F, que influye en el desarrollo de las NMP, entre ellos el hecho de que
dicha mutación no aparece en todas las NMP y que la mayoría de estos casos son procesos
clonales [123]. Además tampoco está claro como una mutación única JAK2V617F puede
causar tres diferentes fenotipos: PV, TE y MFP y qué proceso regula la aparición de la
eventual progresión. Se ha postulado que las combinaciones de factores como el número de
copias (carga mutacional) de la mutación JAK2V617F, predisposición alélica, factores
dependientes del huésped, y mutaciones adicionales darían lugar al fenotipo tan heterogéneo
de las NMP [84,100,113,124-127].
Por otro lado, aunque la mutación JAK2V617F es un evento fisiopatogénico fundamental en
PV, se postula que no es el evento clonogénico inicial ni en la PV ni en otras NMP (véase
Figura 5) [128].
Homocigoto V617F
Heterocigoto V617F
Mutación desconocida?
Mutación V617F (50%)
Recombinación mitótica 9pLOH (25%)
Figura 5. Modelo de patogénesis de las NMP [100 modificado].
I. REVISIÓN DEL TEMA
20
Es probable que las mutación JAK2V617F constituyan un evento genético secundario que
acontece sobre una predisposición genética heredada y sobre una probable adquisición
previa de un clon tumoral en la stem cell [100,113,127]. Igualmente, las mutaciones JAK2-
exón 12 y las del gen MPL, a pesar de su implicación fisiopatogénica demostrada en las
NMP, son probablemente eventos secundarios [100,113,116].
I. REVISIÓN DEL TEMA
21
6. JAK2V617F y clínica
6.1. JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg
En varios estudios se ha observado la asociación entre la mutación JAK2V617F y el
fenotipo tipo PV es decir con cifras altas de hematocrito, de hemoglobina, y de leucocitos y
con cifras bajas de plaquetas y de EPO [4, 43-44]. Sin embargo, los resultados acerca de la
asociación entre la mutación JAK2V617F con eventos clínicos como la progresión o la
trombosis es el tema que aún se está debatiendo [3-5,43-44,49,129].
6.2. JAK2V617F: la carga alélica
De acuerdo con la teoría de un continum entre la PV y la TE JAK2V617F-pos [43], el
desarrollo de la PV podría estar favorecido por adquisición de homocigosidad para
JAK2V617F ya que el estado de homocigosis aparece en el 30% de los casos con PV pero
muy raramente en la TE (véase Tabla 1) [3-6,43,123,130]. El estado de homocigosis aparece
como el efecto de la recombinación mitótica, promovido a su vez por la inestabilidad
genética inducida por la mutación JAK2V617F [131]. De acuerdo con el estudio de Tiedt et
al, los niveles bajos de expresión de JAK2V617F (heterocigosis) dan lugar a desarrollo de la
TE, y niveles más elevados (homocigosis) sucesivamente a MFP y PV [132]. Por lo tanto, es
probable que la cantidad del alelo mutado JAK2V617F afecte al fenotipo de las NMP.
Recientemente, con la utilización de las técnicas de detección cuantitativas, surgió el
término de la carga alélica (la ratio entre el alelo JAK2V617F mutado y no mutado) [87].
Hasta la fecha parece que hay acuerdo entre los autores sobre la relación directa entre la
carga alélica de JAK2V617F y la cifra de hemoglobina, leucocitos, presencia de
esplenomegalia y prurito e indirecta con la cifra de plaquetas. Sigue habiendo controversia
I. REVISIÓN DEL TEMA
22
acerca de la relación entre la carga alélica JAK2V617F y aparición de eventos trombóticos,
progresión a LMA y a MFsec, supervivencia y necesidad de citorreducción [45-46,124,133-
140].
6.3. JAK2V617F: evolución en el tiempo de la carga alélica
Hasta la fecha, se han publicado muy pocos estudios acerca de los cambios de la carga
alélica durante el seguimiento de los pacientes y su implicación clínica.
En relación a los pacientes JAK2V617F-neg, hay un consenso según el cual dichos
pacientes no adquieren la mutación JAK2V617F a lo largo del seguimiento [43,140-141].
En las NMP JAK2V617F-pos, se sugiere que la carga alélica en la mayoría de los casos se
mantiene estable a lo largo del tiempo [142-143], pero en algunos pacientes, se han visto
variaciones de la carga alélica JAK2V617F durante el seguimiento. Se observó el descenso
o incluso negativización de la carga alélica JAK2V617F en relación con el tratamiento
administrado: hidroxiurea (HDU), INF-α, alo-TPH [142,144-149]. Además recientemente,
se han publicados criterios de respuesta molecular según European LeukemiaNet (ELN) en
estos pacientes [150]. Sin embargo, la implicación clínica de la reducción de la carga alélica
JAK2V617F en estos casos no esta clara [145]. Por otro lado, es probable que la carga
alélica JAK2V617F se modifique en contexto de la larga evolución de la enfermedad y del
desarrollo de la progresión de una NMP a otra o a LMA. Según algunos autores la cantidad
de la mutación JAK2V617F puede aumentar con el tiempo en la PV y la MFP [40,137]. En
caso de TE, no existen datos concluyentes: se encuentran estudios según cuales la carga
alélica se mantiene estable [133] o aumenta [134]. Se sugiere que el aumento de la carga
alélica JAK2V617F, en caso de la PV y MFP, se asocia con el desarrollo de una MFsec
I. REVISIÓN DEL TEMA
23
post-PV, marcada esplenomegalia y aumento de la necesidad de citorreducción [45-
46,137,140,151]. En este momento no se dispone de estudios prospectivos de seguimiento
de la carga alélica JAK2V617F en este tipo de pacientes.
6.4. Metodología para la detección de la mutación JAK2V617F
La mutación JAK2V617F puede detectarse en sangre total, granulocitos, plaquetas,
preparaciones de médula ósea e incluso en biopsias de médula ósea (siempre y cuando éstas
no hayan sido procesadas con reactivos que contengan mercurio). Asimismo puede
detectarse en progenitores hemopoyéticos obtenidos de cultivos celulares in vitro. Se pueden
aplicar diferentes técnicas para detectar la presencia de la mutación de JAK2V617F. De
entre las técnicas disponibles, una de las que tiene una mayor sensibilidad es la PCR-
aleloespecífica cuantitativa (véase Tabla 1).
Autor ref.
Método de detección
PV JAK2V617F-pos (homocigotos)
TE: JAK2V617F-pos (homocigotos)
MFP: JAK2V617F-pos (homocitogos)
4 Secuenciación 89 (30) 43 43 6 Secuenciación 74 (25) 32 (3) 35 (9) 5 Secuenciación 65 (27) 23 (3) 57 (22)
3 Secuenciación/PCR
alelo-específica 97 (26) 57 (0) 50 (19)
130 ARMS/piro
secuenciación 81 (33) 41 (7) 43 (29)
123 Taqman alelo-
específica 99 72 39
97 Sondas de hibridación 87 61 50 Tabla 1. Frecuencias y métodos de detección de la mutación JAK2V617F en las NMP clásicas [152 modificado].
I. REVISIÓN DEL TEMA
24
6.4.1. Secuenciación
En esta técnica, una secuencia amplificada de DNA se procesa a través de un secuenciador
automático, que está basado en el principio de secuenciación de Sanger [153]. Este método
utiliza didesoxinucleótidos (ddNTP), derivados sintéticos de los nucleótidos que, al
incorporarse a la cadena naciente, impiden que continúe la polimerización. Cada uno de los
4 ddNTP empleados tiene un marcador fluorescente distinto. En el proceso se lleva a cabo
una reacción de síntesis de DNA en la que se incluyen los ddNTP, además del DNA que se
desea secuenciar, una polimerasa y nucleótidos (dNTP). El producto de esta síntesis es una
colección de cadenas de DNA de longitudes crecientes en función de dónde se haya
incorporado el ddNTP. La mezcla de cadenas de DNA se separa de una en una mediante
electroforesis. La electroforesis está conectada a un detector de fluorescencia que determina
el ddNTP que lleva cada fragmento, con lo que se obtiene la secuencia de nucleótidos de la
cadena original. El método es semicuantitativo; puede distinguirse entre homocigoto y
heterocigoto en ausencia de poblaciones heterogéneas. La sensibilidad obtenida es de
alrededor del 20% [3-5,87,152].
6.4.2. Pirosecuenciación
Dicha técnica está basada en la detección de la bioluminiscencia de la reacción de la
luciferasa. Se someten a pirosecuenciación los productos de una PCR realizada previamente.
Los pirofosfonatos liberados por la incorporación de nucleótidos llevada a cabo por la
polimerasa durante la síntesis de DNA in vitro son utilizados como fuente de ATP. Los
nucleótidos específicos son adicionados mediante la reacción para determinar la secuencia
de la hebra de DNA de interés. El método es adecuado para la determinación cuantitativa y
puede distinguir entre homocigotos y heterocigotos de la mutación. Se estima que posee una
sensibilidad del 5% [128,130,152].
I. REVISIÓN DEL TEMA
25
6.4.3. PCR alelo-específica
Los métodos PCR alélo-específica (PCR-AS) son los más adecuados para realizar medidas
cuantitativas en PCR a tiempo real [123]. Es un ensayo muy sensible (0,01-0,1%). Se
emplea un oligonucleótido mutado para la amplificación de la secuencia, que es detectada
posteriormente mediante electroforesis capilar. En otros procedimientos de AS-PCR se
emplean dos parejas de cebadores que amplifican el gen normal y el gen mutado en una sola
reacción. Con este sistema, llamado ARMS (Amplification Refractory Mutation System), se
obtiene una sensibilidad del 1-2% [130,152,154].
En nuestro laboratorio se utiliza la técnica de la PCR a tiempo real alélo-específica por su
alta sensibilidad (2%) y por su capacidad de determinar la carga alélica de células mutadas
ya que, como se comenta posteriormente, puede ser un factor pronóstico, que determine
decisiones terapéuticas y permitiría, además, evaluar la respuesta a un posible tratamiento.
En el año 2009, se publicaron por la primera vez unos criterios de la respuesta molecular
según ELN, valorados por la cuantificación de la carga alélica JAK2V617F [150].
I. REVISIÓN DEL TEMA
26
7. Citogenética convencional
Las alteraciones citogenéticas en NMP no son frecuentes ni específicas: aparecen
aproximadamente en el 20% en la PV, menos de 5% en la TE y en el 40% de los pacientes
con MFP. Las alteraciones más frecuentes incluyen la: del(20q), del(13q), +8, +9 y las
alteraciones del cromosoma 1. Además, están descritas las alteraciones en los cromosomas 5
y 7 [97,155-164].
En un tercio de los pacientes con PV se observó la disomía uniparenteral del brazo corto del
cromosoma 9 (9pUPD) lo que condujo al descubrimiento de la mutación JAK2 [5]. Según
Campell et al, es posible, que la trisomía del cromosoma 9, +9p y del(20q) estén
relacionadas con la mutación JAK2V617F [38].
No se ha encontrado un significado pronóstico a las alteraciones citogenéticas en la PV y en
la TE [157-158]. En cambio en la MFP el cariotipo anómalo parece asociarse a peor
supervivencia, pero no se conoce la importancia de cada una de las alteraciones
cromosómicas más frecuentes [16,156,162-164].
I. REVISIÓN DEL TEMA
27
8. Alteraciones inmunológicas en NMP
El reciente descubrimiento de la mutación puntual V617F en el gen JAK2, nos ayudó a
entender la fisiopatogenia de las NMP. El gen JAK2 pertenece a la familia de Janus
quinasas (JAK1, JAK3 y Tyk2) que intervienen en la cascada de transducción de señales
intracelulares entre ellos señales cruciales en el desarrollo, proliferación y diferenciación de
los linfocitos T. Las deficiencias de JAK1 y JAK2 resultan ser letales, la deficiencia de
JAK3 cursa con ausencia de linfocitos T y NK y alteración de la función de linfocitos B; y la
deficiencia de Tyk2 cursa con alteraciones en la respuesta pro-inflamatoria y el aumento en
la respuesta Th2 [165-166]. La mutación en JAK2V617F se ha descrito no solo en la serie
mieloide sino también en subpoblaciones linfocitarias B, T y NK [167-168], por ello parece
razonable esperar que dicha mutación afecta de alguna manera a su número o función. Este
aspecto no ha sido analizado hasta ahora en ninguna publicación.
28
II. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS
Y OBJETIVOS
II. JUSTIFICACIÓN, HIPOTESIS Y OBJETIVOS
29
1. Justificación del trabajo
Las NMP constituyen un grupo heterogéneo de patologías mieloproliferativas que cursan
con diferentes presentaciones clínicas y analíticas, diferentes rasgos anatomopatológicos y
precisan de diferentes tratamientos. Bajo el término de NMP se engloban, tanto patologías
de baja agresividad (TE y PV) con supervivencia similar a la de población general como de
mayor agresividad y peor pronóstico (MFP).
Los criterios diagnósticos utilizados tradicionalmente se basaban en muchos criterios de
exclusión y alguno de inclusión. El descubrimiento de las nuevas mutaciones en el gen
JAK2 (V617F y en el exón 12) y en el gen MPL provocó la revisión de los criterios
diagnósticos.
En varios estudios se han observado claras diferencias analíticas y algunas clínicas y
biológicas (citogenéticas) en los pacientes portadores de la mutación respecto a los que no
presentan la mutación. Además se ha visto que en algunos casos la carga alélica varía con el
tiempo y con el tratamiento. Aún no se sabe si gracias a la mutación JAK2V617F se puede
cambiar la clasificación de las NMP o utilizar la mutación JAK2V617F como el factor
pronóstico (seguimiento de la evolución de la enfermedad o de la respuesta al tratamiento).
Actualmente la única indicación claramente establecida para el estudio de las mutaciones
JAK2 (V617F y exón 12) y MPL es establecer un diagnóstico pero con la limitación de no
ser una anomalía completamente específica de las NMP y sobre todo con la limitación de no
estar presente en todos los casos. Tampoco se conoce si la presencia de la mutación
JAK2V617F puede asociarse a alteraciones en la distribución de subpoblaciones
linfocitarias (linfocitos T, B, NK y TNK) en enfermos con NMP.
II. JUSTIFICACIÓN, HIPOTESIS Y OBJETIVOS
30
2. Hipótesis de estudio
Tras la descripción de la mutación JAK2V617F en el año 2005, los criterios diagnósticos de
las NMP fueron modificados. De esta forma, se introdujeron cambios en la clasificación
WHO 2008 derivados del estudio de la de la mutación de este gen.
La mutación JAK2V617F aparece de forma prácticamente constante en la PV. Sin embargo,
sólo aparece en aproximadamente la mitad de los casos con TE y MFP. Es posible que las
características clínicas y biológicas de la enfermedad incluyendo anomalías citogenéticas y
subpoblaciones linfocitarias sean diferentes en pacientes portadores o no portadores de la
mutación. Asimismo, la carga alélica de la mutación varía de unos pacientes a otros, siendo
posible que a mayor carga alélica más sintomática sea la enfermedad.
También se han descrito cambios en la carga alélica de JAK2V617F en el seguimiento de
estos pacientes, lo cual sugiere una nueva utilidad del estudio de la mutación con fines de
evaluación de la respuesta a los tratamiento y como marcador evolutivo.
Como se ha mencionado, la mutación del JAK2V617F aparece en la mitad de los pacientes,
habiéndose descrito otras dos mutaciones: JAK2-exon12 y c-MPL que, al igual que la
mutación JAK2V617F, están jugando un papel en la etiopatogenia de las NMP. Se postula
que las características biológicas y clínicas podrían ser diferentes en los portadores de estas
mutaciones.
II. JUSTIFICACIÓN, HIPOTESIS Y OBJETIVOS
31
3. Objetivos del estudio
3.1. Objetivo general
Estudio de las características clínico-biológicas de la mutación JAK2V617F en los pacientes
diagnosticados de NMP.
3.2. Objetivos específicos.
Validar y comparar los criterios WHO 2008 en relación a los anteriores de 2001 para
clasificar a los pacientes con NMP.
Determinar si los pacientes con mutación JAK2V617F presentan características clínico-
biológicas diferentes a los que no tienen la mutación.
Determinar si la carga alélica de la mutación JAK2V617F se asocia a un fenotipo
hematológico y clínico y si supone una mayor carga de la enfermedad.
Investigar si el cambio de la carga alélica a lo largo del seguimiento comporta un cambio en
las características clínico-evolutivas/pronósticas de los pacientes.
Estudiar el interés diagnóstico y el significado clínico de nuevas mutaciones tales como
JAK2-exón 12 y MPL en los pacientes diagnosticados de NMP JAK2V617F-neg.
32
III. MATERIAL Y MÉTODOS
III. MATERIAL Y MÉTODOS
33
1. Muestra del estudio
Se realiza el estudio de seguimiento (ambispectivo) de una cohorte de 183 pacientes con el
diagnóstico clínico de NMP: PV (n=45; 24,6%), TE (n=128; 70%) y MFP (n=10; 5%). Los
pacientes fueron atendidos de forma rutinaria en el Servicio de Hematología del Hospital
Universitario de Santiago de Compostela. El diagnóstico de estos pacientes fue realizado en
el período de tiempo comprendido entre el 15 de noviembre de 1975 hasta el día 31 de
diciembre de 2008 y la recolección de los datos se realizó entre el 20 de enero de 2006 y el
31 de diciembre de 2009.
Criterios de inclusión:
• Enfermos con la sospecha o diagnóstico de NMP tipo PV, TE o MPF según
diagnóstico que consta en el informe el clínico,
• Acceso a los datos clínicos y analíticos de los pacientes tanto en el momento del
diagnóstico como a lo largo del seguimiento.
• Determinación de la mutación JAK2V617F.
Se excluyen del estudio a los pacientes con el diagnóstico de otras NMP distintas de las
mencionadas, así como los síndromes mieloproliferativos/mielodisplásicos y con las
sospechas de alteraciones analíticas reactivas.
Este estudio se ajustó a los criterios de Helsinki. Todos los pacientes dieron su
consentimiento informado por escrito para la recogida de datos de su historia clínica como
para la obtención, almacenamiento y estudio de muestras sanguíneas con los fines
específicos de este estudio. Dicho estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación
Clínica de Galicia.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
34
2. Metodología
2.1. Variables del estudio
Todas las variables clínicas y analíticas fueron obtenidas de las historias clínicas, e incluye
tanto datos al diagnóstico como evolutivos. Los datos se resumen en la Tabla 6 del apartado
de resultados.
2.1.1. Variables clínicas
• Datos demográficos: edad y sexo
• Factores de riesgo cardio-vascular: tabaquismo, diabetes mellitus, hipertensión
arterial, hiperlipemia, historia previa (máximo dos años antés del diagnóstico de la
NMP) de trombosis
• Esplenomegalia: objetivada en el examen físico ó por pruebas de imagen
• Presencia de prurito
• Eventos vasculares:
o Trombosis mayor (arterial y venosa): infarto cerebral y miocárdico, angina,
trombosis arterial periférica, trombosis venosa profunda incluida la cerebral
y trombosis de la vena esplénica, embolismo pulmonar. Se consideraron
todos los que ocurrieron en los 2 años previos al diagnóstico y los que
ocurrieron posteriormente
o Hemorragia mayor: un descenso de la Hb de >= 2 g/dL, necesidad de
transfusión de hematíes o de la intervención quirúrgica. Se recogieron tanto
los eventos al diagnóstico como durante el seguimiento
• Progresión de la enfermedad: de una NMP a otra NMP o a LMA
III. MATERIAL Y MÉTODOS
35
• Tipo de tratamiento citorreductor
• Respuesta hematológica al tratamiento citorreductor según se ha definido por un
grupo de expertos de ELN [150]:
o En la TE:
� Respuesta hematológica completa (RCh): plaquetas < 400 x 109/L y
no síntomatología relacionada con la enfermedad (eventos
microvasculares, prurito, cefalea) y bazo de tamaño normal (por
pruebas de imagen) y cifra de leucocitos ≤ 10 x 109/L
� Respuesta hematológica parcial (RPh): pacientes que no cumplen
criterios para RC, plaquetas < 600 x 109/L o descenso > 50% desde
los valores iniciales
� Falta de respuesta: cualquier respuesta que no cumple los criterios de
RP
o En la PV:
� RCh: Hematocrito < 45% sin necesidad de flebotomía y plaquetas ≤
400 x 109/L y cifra de leucocitos ≤ 10 x 109/L y bazo de tamaño
normal (por pruebas de imagen) y no síntomatología relacionada con
la enfermedad (eventos microvasculares, prurito, cefalea).
� RPh: no cumple criterios de RC pero Hematocrito < 45% sin
necesidad de flebotomía o cumplimiento de ≥ 3 de otros criterios
� No respuesta (NR): cualquier respuesta que no cumple los criterios
de RP
• Respuesta molecular al tratamiento citorreductor según ELN:
III. MATERIAL Y MÉTODOS
36
o Respuesta genética completa (RCg): disminución de la alteración molecular (la
carga alélica JAK2V617F) hasta su total desaparición
o Respuesta genética parcial (RPg):
� Disminución ≥ 50% de la carga alélica JAK2V617F respecto al valor
basal (si valor basal de JAK2V617F < 50%)
� Disminución ≥ 25% de la carga alélica JAK2V617F respecto al valor
basal (si valor basal de JAK2V617F > 50%)
o No respuesta (NRg): todos los cambios de la carga alélica JAK2V617F que no
cumplan al menos criterios de RP
2.1.2. Variables analíticas
• Hematimetría: valores de hemoglobina, leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos,
plaquetas
• FAL leucocitaria
• Lactato deshidrogenasa sérica (LDH)
• Nivel de eritropoyetina sérica
2.2 Estudio de las mutaciones
A todos los pacientes se les realizó una determinación cuantitativa de la mutación
JAK2V617F. En 124 pacientes se realiza la determinación periódica de dicha mutación y la
frecuencia del estudio depende de la accesibilidad a las muestras según visitas asistenciales
y consentimiento de los pacientes.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
37
En algunos pacientes JAK2V617F-neg se realizó una determinación de mutación JAK2-
exon12 (n=2) y c-MPL (n=45) (véase apartado 4 de metodología).
2.3 Estudio morfológico de médula ósea
Se revisaron 146 (85%) cilindros de biopsia de médula ósea (BMO) y 109 (64%) muestras
de aspirados medulares (AMO) de los pacientes incluidos al estudio. El análisis de la BMO
fue realizado, en nuestro centro hospitalario, por un anatomopatólogo y la revisión del AMO
por un hematólogo experto en citología, ambos sin conocimiento previo del diagnóstico ni
de datos analíticos ni del estado mutacional de JAK2V617F. Se analizaron solamente las
muestras extraídas al diagnóstico y previamente al inicio del tratamiento citorreductor. En el
análisis de BMO se valoraron: celularidad total, cantidad de megacariocitos, sincitios y
fibrosis; la serie eritroide y mieloide fueron analizados en AMO. Para la valoración de las
muestras se utiliza una escala semicuantitativa previamente descrita [169-170]: normal: 0,
levemente aumentado 1+, moderamente aumentado 2+ y muy aumentado 3+.
Finalmente, según los datos obtenidos, se emitió un diagnóstico confirmatorio o se excluyó
el diagnóstico de la NMP.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
38
2.4 Revisión de los criterios diagnósticos de WHO
Finalmente, se revisó el diagnóstico clínico de los pacientes siguiendo los criterios WHO
2001 y WHO 2008 (véase Tablas 2-4). Se clasificó a los enfermos como PV, TE o MFP
según los datos analíticos y clínicos que presentaba cada enfermo en el momento del
diagnóstico. Los casos que no cumplían criterios diagnósticos de la WHO en el momento
del diagnóstico, se revisaron de nuevo el diagnóstico al finalizar el estudio.
WHO 2001 para PV (criterios A1 y A 2 más: otro A o dos B)
WHO 2008 para PV
(el primero de los mayores y dos menores o los dos mayores y uno menor)
A1. ME >25%, ó Hb > 18,5 g/dl (varón) ó > 16,5 g/dl (mujer), ó Hb >99% de percentil A2. No causa de eritrocitosis secundaria:
• No eritrocitosis familiar • No elevación de EPO por hipoxia • Hb de alta afinidad para el oxígeno • Receptor de eritropoyetina truncado • Inapropiada producción de EPO
(tumor) A3. Esplenomegalia A4. Anomalía clonal (no BCR-ABL) A5. Formación de colonias eritroides endógenas B1. Trombocitosis > 400 x 109L B2. Leucocitosis > 12 x 109L B3. Cambios en BMO tipo PV B4. Bajo nivel de EPO
Criterios mayores 1. Aumento de la ME:
• Hb >18,5 g/dl (varón) o Hb > 16,5 g/dl (mujer)
• Hb>17g/dl (varón) ó > 15g/dl (mujer) si se asocia a aumento de >=2g/dl no atribuído a corrección de déficit de hierro
• Aumento percentil 99 para edad, sexo o altitud
• Aumento de la masa eritrocitaria >25% 2. Mutación JAK2V617F (o JAK2-exón12) Criterios menores 1. Cambios en BMO tipo PV (panmielosis) 2. Bajo nivel de EPO 3.Formación de colonias eritroides endógenas
Tabla 2. Criterios diagnósticos de WHO 2001 y WHO 2008 para PV. Abreviaturas: ME - masa eritrocitaria, Hb - hemoglobina, EPO - eritropoyetina, BMO - biopsia de médula ósea.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
39
Tabla 3. Criterios diagnósticos de WHO 2001 y WHO 2008 para TE. *Valoración clínica: excluir neoplasia, inflamación, infección, esplenectomía u otro tipo de cirugía reciente, falta de hierro, otros. Abreviaturas: BMO - biopsia de médula ósea, LMC - leucemia mieloide crónica, SMD – síndrome mielodisplásico.
WHO 2001 para MFP WHO 2008 para MFP (tres mayores y dos menores)
MPF prefibrótica 1. BMO de MFP precoz 2. Leve anemia 3. Leve leucotrombocitosis 4. Esplenomegalia presente u ausente 5. No signos MPF en SP MPF en fase fibrótica 1. BMO de MFP con fibrosis 2. Anemia 3. Leucocitos, plaquetas: normales,
aumentados o descendidos 4. Hepatoesplenomegalia 5. Cambios morfológicos en SP
Criterios mayores 1. BMO compatibles con MFP 2. No criterios WHO para PV, LMC, SMD, otros
NMP 3. Marcador clonal (JAK2V617F o
MPL515W>L/K) 4. En ausencia de marcador clonal: descartar
fibrosis medular por proceso neoplásico (tricoleucemia, linfoma, metástasis) o inflamatorio ó tóxico
Criterios menores 1. Leucoeritroblastosis 2. Elevación de la LDH 3. Anemia 4. Esplenomegalia palpable
Tabla 4. Criterios diagnósticos WHO 2001 y WHO 2008 para MFP. Abreviaturas: BMO - biopsia de médula ósea, LMC - leucemia mieloide crónica, SMD – síndrome mielodisplásico, LDH – lactato dehidrogenasa.
WHO 2001 para TE (todos los criterios)
WHO 2008 para TE (todos los criterios)
Criterios apoyo
Plaquetas >= 600 x 109/L Cambios tipo TE en BMO
Plaquetas >= 450 x 109/L (mantenidas) Cambios tipo TE en BMO
Criterios exclusión
No reunir criterios WHO para PV, MFP, LMC o SMD Excluir trombocitosis reactiva por valoración clínica*
No reunir criterios WHO para PV, MFP, LMC, SMD otras NMP. Excluir trombocitosis reactiva por: JAK2V617F (u otro marcado) positivo ó Valoración clínica*.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
40
3. Procedimientos y técnicas utilizadas
3.1. Análisis de la mutación JAK2V617F
Todos los casos disponen de al menos una determinación, en el momento de ser incluidos en
el estudio, lo cual pudo ser al diagnóstico o en un momento posterior. En un subgrupo se
realizó una determinación periódica (aproximadamente cada 3-12 meses) de la carga
mutacional JAK2V617F.
El estudio se realiza a partir de DNA de granulocitos de sangre periférica. La separación de
granulocitos de sangre periférica se realizó utilizando la técnica de Ficoll Paque, en las
primeras 24 post extracción. Se confirmó la pureza de separación de granulocitos (tiene que
ser >=90-95%) preparando las extensiones en portas (tinción May Grünwald-Giemsa). La
extracción de DNA de los granulocitos de SP se realizó utilizando Qiagen Tissue DNA
extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), siguiendo las recomendaciones del
fabricante. Una vez extraído, la concentración y calidad del ADN fue medida utilizando un
espectrofotómetro modelo Nanodrop (NanoDrop® ND-1000 spectrophotometer, USA). La
muestra de DNA se conserva en congelador a –20ºC.
A todos los pacientes incluidos en el estudio se le realizó la determinación cuantitativa
(utilizando la técnica de Real-Time PCR) de la mutación JAK2V617F. Además, en caso de
n=124 pacientes se realizó también la determinación periódica (cada 3-12 meses) de la carga
mutacional JAK2V617F.
Se llevó a cabo un análisis de discriminación alélica (PCR-AS, kit comercial
MutaScreenTMKit, IPSOGEN), que nos permitirían detectar y cuantificar la existencia del
III. MATERIAL Y MÉTODOS
41
alelo mutado y/o no mutado usando sondas fluorescentes específicas (TaqMan) para cada
alelo. Sondas TaqMan alelo específicas (Applied Biosystem):
-gen no mutado: TCT CCA CAG ACA CAT AC; marcados con VIC, HPLC
-gen mutado (V617F): TCC ACA GAA ACA TAC; marcados con 6-FAM, HPLC
La sonda que identifica al alelo mutado está marcada con el fluorocromo FAM y la de alelo
normal con VIC. Durante la PCR, cada sonda se une específicamente con su secuencia
complementaria amplificada mediante el uso de dos cebadores comunes y la AmpliTaq
Gold DNA polimerasa. Esta enzima es capaz de producir la liberación del fluorocromo de la
sonda que hibrida perfectamente con el alelo, el incremento de fluorescencia así generado
indica que el alelo complementario a la sonda está presente en la muestra.
El análisis cuantitativo precisa de una curva de calibración, que se realizó en una mezcla de
diluciones seriadas de ADN extraído de células HEL (homocigotas para la mutación
JAK2V617F) y un ADN control normal. Se realizaron los estudios de validación de la
técnica (precisión, exactitud, linealidad, límite de detección).
La diferencia en la fluorescencia entre ambos alelos nos permitió diferenciar la
amplificación de cada alelo. Se estimó el porcentaje del alelo mutado que existe en la
muestra según la siguiente fórmula:
Valor del alelo mutado (V617F)/ valor del alelo no mutado.
El resultado se presenta de dos maneras:
III. MATERIAL Y MÉTODOS
42
• En rangos (referidos a la curva estándar realizada con las muestras calibradoras): <2%:
negativo, 2-5%, 5-12,5%, 12,5-31%, 31-50%, 50-78% y >78%.
• Como el valor único aproximado; se construye una curva de calibración con los valores
de los mismos estándares usados para la determinación de JAK2V617F por rangos.
Con este abordaje la detección teórica del alelo mutado sería posible si está presente en tan
sólo un 2% de las células (el límite de detección de la técnica es de aproximadamente un
2%).
Para el análisis del seguimiento de la carga alélica JAK2V617F, se hace el cálculo de dos
variables:
• Cambio absoluto:
% JAK2V617F primero - % JAK2V617F último
Para considerar que hay un cambio debe haber un aumento o descenso de al menos un 10%
por lo que si el valor basal es menor del 10% no pueden analizarse los posibles descensos de
la carga alélica.
• Variación ó cambio relativo:
% JAK2V617F primero - % JAK2V617F último
% JAK2V617F último x 100
Los casos que presenten doble cambio en la carga alélica JAK2V617F (inicial subida con
posterior bajada o al revés) se denominan como con el patrón tipo “pico sierra”. En estos
casos se valora solamente el cambio absoluto por lo tanto quedan excluídos del análisis de la
variación de la carga alélica JAK2V617F.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
43
3.2. Análisis de otras mutaciones en NMP
En las muestras de los pacientes con diagnóstico de PV que no presentaron la mutación
JAK2V617F se realizó la determinación de las mutaciones en el exón 12 del gen JAK2. En
las muestras de los pacientes con diagnóstico de TE y de MFP que no presentaron la
mutación JAK2V617F se realizó un estudio de las mutaciones en el gen MPL.
3.2.1. Estudio de las mutaciones en el exón 12 del gen JAK2
Dicho estudio fue realizado en el Department of Reseasech, Experimental Hematology,
University of Basel, Basilea, Suiza. En total se estudiaron en pacientes con poliglobulia y
negativos para la mutación JAK2V617F (n=2).
Se utilizaron dos técnicas de estudio: secuenciación y pirosecuenciación que ya fueron
previamente descritas.
3.2.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL
El estudio de las mutaciones del gen MPL se realizó mediante la amplificación por PCR y
posterior secuenciación cíclica del exón 10 del gen del receptor de trombopoyetina MPL.
3.3. Estudio citogenético de la médula ósea
Los estudios citogenéticos se realizaron según práctica asistencial en el Laboratorio de la
Fundación Pública de la Medicina Xenómica. Se ha recogido los datos de estudio
citogenético realizado al diagnóstico y durante del seguimiento.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
44
3.4. Subpoblaciones linfocitarias
El estudio de subpoblaciones linfocitarias se realizó mediante citometría de flujo (BD FACS
Calibur), en la unidad de citometría de nuestro servicio, en sangre periférica y utilizando los
siguientes anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson): anti-CD3, CD4, CD8, CD16,
CD56, CD19. Se analizaron las subpoblaciones linfocitarias como corresponde: linfocitos T
(CD3+) con sus subpoblaciones (CD4+/CD8- y CD4-/CD8+), linfocitos TNK
(CD3+/CD56+), linfocitos NK (CD3-/CD56+ y/o CD16+) y linfocitos B (CD19+). Los
valores obtenidos se compararon con los rangos de referencia utilizados habitualmente en
nuestro laboratorio (véase Tabla 5).
Subpoblaciones linfocitarias
Anticuerpos monoclonales
Valor relativo (%) Valor absoluto (cels/uL)
CD3+ 60-80 850-3600
CD4+/CD8- 35-55 500-2500 Linfocitos T
CD4-/CD8+ 15-40 200-1800
Linfocitos TNK CD56+/CD3+ 1-5 14-70
Linfocitos NK CD16+/CD3- y/o
CD56+/CD3- 5-20 70-900
Linfocitos B CD19+ 5-25 70-1135
Tabla 5. Valores normales de subpoblaciones linfocitarias
III. MATERIAL Y MÉTODOS
45
4. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa SPSS 15.0. El valor p<0,05 se
consideró como estadísticamente significativo. Se contó con la colaboración de la Unidad de
Epidemiología Clínica del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela.
Los resultados de las variables cualitativas se expresan en frecuencias absolutas y en
porcentaje, mientras que los resultados de las variables cuantitativas están expresados en
medias ± desviación estándar.
Para la comparación de variables cualitativas se utilizó el test chi-cuadrado. Las variables
cuantitativas se analizaron utilizando los test de t-student o Mann-Whitney, ANOVA o
Kruskal-Wallis y Wicoxon según los datos siguieran o no una distribución normal, y los
datos fuesen o no pareados. Para explorar la presencia de asociación entre variables
continuas, se usó la correlación de Spearman o de Pearson según fuese apropiado.
Se utilizó el índice Kappa para valorar el grado de concordancia entre los criterios
diagnósticos de WHO 2001 y WHO 2008. Los valores Kappa fueron categorizados según
los valores propuestos por Fleiss [171]: >0,75: muy buena concordancia, 0,4-0,75:
concordancia intermedia, y <0,4: mala concordancia.
En el grupo de pacientes JAK2V617F-pos, se analizó el mejor punto de corte para poder
diferenciar la PV de TE utilizando la curva de ROC. La sensibilidad se define como la
proporción de individuos con mutaciones prueba con una probabilidad de detección de
portadora o mayor que un determinado valor (de corte), y la especificidad es la proporción
de los individuos sin mutaciones con una probabilidad de detección inferior a la de corte.
46
IV. RESULTADOS
IV. RESULTADOS
47
Se realizó el estudio en 183 pacientes con el diagnóstico previo de NMP según historial
clínico. Las características principales son las siguientes: la edad media fue de 61 ± 16 años,
con un rango de 16 a 93 años, el 55% fueron mujeres y el 45% hombres. El tiempo medio de
seguimiento fue de 72 meses (rango 0 a 406). La esplenomegalia fue encontrada en 60 casos
(33%), prurito en 29 casos (16%), durante el seguimiento se observó una progresión de una
NMP a otra NMP o a LMA en 23 casos (13%) y eventos vasculares, en su mayoría
trombóticos se encontraron en 36 casos (20%). La mutación JAK2V617F estaba presente en
128 casos (70%) y la MPL en 4 casos (9%) de los 45 estudiados. En la Tabla 6 se presentan
los valores clínicos y analíticos del grupo de estudio; los casos están clasificados según el
diagnóstico inicial con el que estaban catalogados en la historia clínica.
IV. RESULTADOS
48
Características PV TE p** MFP
Nº de pacientes 45 129 - 9
Edad (años) 60 ±82 61±33 0,858 66±16
Mujeres 23 (51%) 75 (58%) 0,259 3 (33%)
Riesgo trombótico:
-Alto
-Intermedio
-Bajo
30 (67%)
9 (20%)
6 (13%)
89 (69%)
20 (15,5%)
20 (15,5%)
0,765
7 (78%)
2 (22%)
0 (0%)
Prurito 19 (42%) 8 (6%) 0,000 2 (22%)
Esplenomegalia 24 (54%)1 30 (23%) 0,000 6 (67%)
Eventos vasculares totales 7 (16%) 24 (19%) 0,090 5 (56%)
Progresión 4 (9%) 18 (14%) 0,275 1 (11%)
Citorreducción 42 (93%) 115 (89%) 0,312 5 (56%)
JAK2V617F:
-Negativo
-2-31%
-31-100%
1 (2%)*
15 (33,5%)
29 (64,5%)
51 (39,5%)
62 (48%)
16 (12,5%)
0,000
3 (33,3%)
3 (33,3%)
3 (33,3%)
Mutación c-MPL - 3 (7%)1 - 1 (22%)2
Hemoglobina (g/dL) 18,8 ± 1,7 13,8 ± 1,7 0,000 11,8 ± 2,5
Leucocitos (x109/L) 12,52 ± 6,23 9,80 ± 2,94 0,001 13,55 ± 10,7
Neutrófilos (x109/L) 9,29±5,053 6,66±2,64 0,000 10,44±10,62
Linfocitos (x109/L) 2,04±1,363 2,07±0,72 0,861 1,83±0,62
Plaquetas (x109/L) 531 ± 240 861 ± 358 0,000 360 ± 244
EPO4 (mU/mL) 3,6±4,5 22,2±32,9 0,000 143,5±132,1
FAL5 * 111±66 70±52 0,000 152±109
LDH6 (UI/L) 389,6±129,6 311,7±128 0,001 801,7±469,8
MO compatible con NMP8 32 (91%)5 93 (93%)6 - 9 (100%)7
Tabla 6. Datos clínico-analíticos de NMP al diagnóstico. 1datos para 41 pacientes, 2 datos para 4 pacientes, 3 datos para 44 pacientes, 4datos para 42 pacientes con PV, 59 con TE y 5 con MFP, 5datos para 38 pacientes con PV, 86 con TE y 5 con MFP, 6datos para 42 pacientes con PV, 125 con TE y 8 con MFP, 7datos para 44 pacientes con PV, 127 con TE y 9 con MFP, 8datos para 35 pacientes con PV, 100 con TE y 9 con MFP. *valores normales de 20 a 100 unidades arbitrarias, **el valor p se refiere a la comparación entre el grupo de PV y TE.
IV. RESULTADOS
49
1. Criterios diagnósticos WHO
El diagnóstico según la clasificación WHO 2001 se basaba en criterios de exclusión
seguidas de estudios confirmatorios. La novedad de criterios WHO 2008 es la inclusión de
un marcador genético, es decir de las mutaciones en el gen JAK2 (V617F y JAK2-exón12) y
MPL.
Con el objetivo de valorar la utilidad de los nuevos criterios WHO 2008 en la práctica diaria
se analizó el cumplimiento de dichos criterios en 171 pacientes con el diagnostico de NMP
(44 PV, 118 TE y 9 MFP). Para la revisión de los criterios WHO se utilizan los datos
clínicos y analíticos del diagnóstico. De esta parte del estudio quedan excluidos 12 pacientes
por falta de datos (1 PV, 10 TE y 1 MFP): en todos estos pacientes no se realizó el estudio
de médula ósea y en el caso de PV falta además el valor de la EPO.
1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación
1.1.1. Grupo con sospecha de PV
El diagnóstico de PV fue confirmado, según los criterios WHO 2001 y WHO 2008, en 42
(95%) de 44 pacientes con sospecha de PV (véase Tabla 7) y la concordancia entre ambos
criterios diagnósticos fue muy buena con el índice kappa = 1 (p<0,001).
WHO 2008 PV No cumple
PV 42 0 WHO 2001 No cumple 0 2
Tabla 7. Concordancia de los criterios WHO 2001 y WHO 2008 en pacientes con PV.
Los pacientes, que no cumplieron los criterios WHO 2001 ni 2008, presentaban el estudio
histopatológico de médula ósea insuficiente para el diagnóstico de NMP. Uno de estos
IV. RESULTADOS
50
pacientes fue negativo para ambas mutaciones en el gen JAK2 (V617F y JAK2-exón 12) y
presentaba niveles altos de EPO, por lo que el diagnóstico fue modificado a eritrocitosis
idiopática. El segundo fue diagnosticado de PV si bien en el momento del diagnóstico no
cumplía criterios estrictos WHO pero con el seguimiento sí adquirió los criterios
diagnósticos de PV (aumento de cifra de hemoglobina).
1.1.2. Grupo con sospecha de TE
De los 118 pacientes con el diagnóstico clínico de TE, 96 (81%) cumplían criterios WHO
2001 y 111 (93%) WHO 2008 (véase Tabla 8). El índice kappa de concordancia entre
ambos criterios de la WHO fue igual a 0,43 (p<0,001).
WHO 2008 TE No cumple
TE 96 0 WHO 2001 No cumple 15 7
Tabla 8. Concordancia de los criterios WHO 2001 y WHO 2008 en pacientes con TE.
En 15 de 111 pacientes con el diagnóstico clínico de TE, no se pudo confirmar el
diagnóstico de acuerdo con los criterios WHO 2001, pero sí según los criterios WHO 2008,
en todos los casos debido un recuento de plaquetas menor de 600 x 109/L. De estos
pacientes, 14 (93%) presentaban la mutación JAK2V617F-pos. Dichos pacientes eran más
jóvenes que los que cumplían los criterios WHO 2001 y WHO 2008 y más de la mitad
presentó el riesgo trombótico intermedio o alto (véase Tabla 9). Además, 6 de estos 15
(40%) pacientes presentaron progresión a lo largo de su seguimiento: cuatro progresaron a
una PV y dos a una MFsec (véase Tabla 9 y Tabla 10). En el grupo que cumplía ambos
criterios diagnósticos solo 12 (13%) pacientes presentaron progresión durante el
seguimiento.
IV. RESULTADOS
51
Características WHO 2001 (-) WHO 2008 (+)
WHO 2001 (+) WHO 2008 (+)
p
Número de pacientes 15 96 - Edad (años) 53 ± 17 62 ± 17 0,042 Mujeres 10 (67%) 51 (53%) 0,243 Prurito 2 (13%) 6 (6%) 0,295 Esplenomegalia 3 (20%) 23 (24%) 0,514 Eventos vasculares totales 1 (7%) 22 (23%) 0,132 Progresión 6 (40%) 12 (13%) 0,016 Riesgo trombótico:
-Alto -Intermedio -Bajo
5 (33%) 4 (27%) 6 (40%)
70 (73%)
12 (12,5%) 14 (14,5%)
0,009
Citorreducción total 13 (87%) 91 (95%) 0,240 JAK2V617F: -Negativo -2-31% -31-100%
1 11 3
45 39 12
0,013
Mutación c-MPL 1 negativo1 35 negativos, 2 positivos2
0,947
Hemoglobina (g/dL) 13.7 ± 1.7 13.7 ± 1.7 0,897 Leucocitos (x109/L) 7.85 ± 2.16 10.06 ± 3.10 0,009 Plaquetas (x109/L) 528 ± 51 946 ± 370 0,000 Tabla 9. Datos analíticos y clínicos en pacientes con TE diagnosticados según WHO 2001 y WHO 2008. WHO 2001 (-)/WHO 2008 (+) significa que estos pacientes no cumplen criterios WHO 2001 y si WHO 2008; WHO 2001 (+)/WHO 2008 (+) significa que estos enfermos cumplen ambos criterios. 1determinado en 1 paciente, 2 determinado en 37 pacientes. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.
1.1.3. Grupo con sospecha de MFP
Todos los casos (n=9) con MFP cumplieron criterios WHO 2001 y WHO 2008 (kappa =1,
p<0,00).
1.1.4. Grupo con progresión
De los 171 pacientes, 23 (13%) presentaron progresión de una NMP a otra o a LMA durante
el seguimiento. El estudio de la mutación JAK2V617F fue positivo en 19 y negativo en 4 de
estos pacientes. Subrayar que 6 de los 18 pacientes con TE (33%) al diagnóstico no
IV. RESULTADOS
52
cumplían criterios WHO 2001: cuatro de ellos presentaron progresión a PV y dos a MFsec.
En la Tabla 10 se presenta el resumen de todos los pacientes diagnosticados de NMP según
WHO 2008 que presentaron progresión durante el seguimiento.
Progresión a: Diagnostico inicial (WHO 2008) PV MFsec LMA
PV (n=4) - 3 1
TE (n=18)* 4 12 2
MFP (n=1) - - 1
Tabla 10. Pacientes con NMP (WHO 2008) y progresión durante el seguimiento. * 6 de estos pacientes no cumplían criterios WHO 2001.
1.2. Estudio histopatológico de las NMP (WHO 2008)
Se revisaron 146 muestras de BMO: 37/44 (84%) con sospecha de PV, 100/118 (85%) con
probable TE y 9/9 (100%) con probable MFP. También se revisaron 109 AMO: 30/44
(68%) con sospecha de PV y 79/118 (67%) con sospecha de TE.
Tras revisión de los diagnósticos iniciales (según historia clínica) y aplicando los criterios
WHO 2008, los pacientes se clasificaron como: PV (35 de 37 casos), TE (93 de 100) y MFP
(9 de 9). Además 9 de los pacientes no cumplieron criterios WHO 2008. En la Tabla 11 se
presentan los resultado del análisis de estudio morfológico frente a los diagnósticos
revisados según criterios WHO 2008 (PV, TE, MFP y el grupo que no cumplía criterios
WHO 2008). Los hallazgos morfológicos fueron en general los esperables para cada grupo
diagnóstico. Así la TE se caracterizó por el aumento de los megacariocitos, mientras que la
PV se caracterizó por el aumento de la serie eritroide con diferencias significativas al
comparar el grado y tipo de celularidad.
IV. RESULTADOS
53
Valoración morfológica (grado 2+/3+)
PV (n=35)
TE (n=93)
p* MFP (n=9)
No cumple (n=9)
Celularidad total, n (%) 28 (80%) 34 (36%) 0,000 1 (11%) 0 (0%)
Megacariocitos, n (%) 7 (20%) 73 (78%) 0,000 3 (33%) 0 (0%)
Sincitios, n (%) 12 (34%) 83 (89%) 0,000 3 (33%) 1 (11%)
BM
O (n
=14
6)
Fibrosis, n (%) 0 (0%) 1 (1%) 0,727 7 (78%) 0 (0%)
PV (n=29)
TE (n=73)
p* - No cumple
(n=7)
Serie eritroide, n (%) 17 (59%) 0 (0%) 0,000 - 0 (0%)
AM
O
(n=
109)
Serie mieloide, n (%) 8 (27%) 6 (18%) 0,015 - 0 (0%)
Tabla 11. Estudio morfológico de MO y fenotipo de NMP (WHO 2008). Valoración morfológica (la escala de 0 a 3+): grado 2+ significa moderadamente aumentado y grado 3+ muy aumentado. *valor de la p: comparación PV vs TE. En la MFP no se valoraron los AMO. En el grupo definido como “no cumple” corresponde a hallazgos morfológicos inespecíficos.
En caso de PV, la coincidencia entre el diagnóstico morfológico y el diagnóstico clínico fue
muy buena con discrepancia en solo 2 (5%) casos (véase Tabla 11). Uno de los pacientes fue
JAK2V617F-pos y adquirió los criterios de WHO 2008 para PV durante el seguimiento
(aumento de cifra de hemoglobina). El otro caso (JAK2V617F y JAK2-exón 12 negativa,
niveles altos de EPO) después de la revisión diagnóstica fue reclasificado como eritrocitosis
idiopática.
En la TE, la coincidencia también fue buena, con solo 7 (7%) casos discrepantes por
ausencia de hallazgos morfológicos significativos (véase Tabla 11). De estos pacientes seis
(86%) fueron JAK2V617F-pos y la evolución clínica fue compatible con la sospecha inicial
de TE.
IV. RESULTADOS
54
2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en NMP (WHO 2008)
2.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg
En el grupo de pacientes con NMP diagnosticadas de acuerdo con los nuevos criterios WHO
2008, la mutación JAK2V617F fue detectada en 100% de PV, 58% de TE y 56% de MFP.
Tal como se muestra en la Tabla 12 (datos al diagnóstico): el grupo de pacientes
JAK2V617F-pos comparado con el grupo JAK2V617F-neg mostró valores más altos de la
concentración de hemoglobina, cifra de leucocitos y valor de fosfatasa alcalina leucocitaria
(FAL), mientras que la cifra de plaquetas y el nivel sérico de la EPO fueron
significantemente más bajos. No se detectaron diferencias significativas en los niveles
séricos de LDH, el sexo, edad al diagnóstico, progresión, prurito, eventos vasculares,
esplenomegalia al diagnóstico y necesidad de citorreducción.
IV. RESULTADOS
55
Características NMP, JAK2V617F-pos NMP, JAK2V617F-neg P
Nº pacientes 112 50 -
Edad (años) 61 ± 16 60 ± 17 0,701
Mujeres 61 (54%) 25 (50%) 0,361
Prurito 23 (20%) 5 (10%) 0,075
Esplenomegalia 41 (37%)1 13 (26%) 0,118
Eventos vasculares totales
23 (20%) 12 (24%) 0,381
Eventos trombóticos 21 (19%) 10 (20%) 0,505
Progresión: TE a PV TE/PV a MFsec TE/PV/MFP a LMA
19 (17%) 4 11 4
4 (8%) 0 4 0
0,100
Citorreducción total 101 (90%) 46 (92%) 0,482
Hemoglobina (g/dL) 15,8 ± 2,9 12,9 ± 2,1 0,000
Leucocitos (x109/L) 11,42 ± 5,51 9,09 ± 2,9 0,006
Plaquetas (x109/L) 688 ± 3351 934 ± 428 0,000
EPO (mU/mL) 14,2 ± 35,02 44,3 ± 71,43 0,008
FAL * 103 ± 654 66 ± 575 0,004
LDH (UI/L) 348 ± 1456 379 ± 2767 0,364 Tabla 12. Datos analíticos y clínicos en NMP (WHO 2008) según el estado mutacional de JAK2V617F. *valores normales de 20 a 100 unidades arbitrarias. 1datos para 111 pacientes. 2datos para 71 pacientes, 3datos para 24 pacientes, 4datos para 75 pacientes, 5datos para 37 pacientes, 6datos para 107 pacientes, 7datos para 49 pacientes. Eventos vasculares totales significa eventos trombóticos y hemorrágicos mayores juntos. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.
2.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg
Al comparar las características clínico-analíticas (datos al diagnóstico), el grupo de TE
JAK2V617F-pos comparado con el TE JAK2V617F-neg mostró: concentración de
hemoglobina y FAL fueron más altas y recuento de de plaquetas más bajo. No se
encontraron diferencias significativas en la cifra de leucocitos, niveles séricos de EPO y
LDH, sexo, edad al diagnóstico, en frecuencia de progresión o aparición de eventos
IV. RESULTADOS
56
vasculares al diagnóstico ni durante el seguimiento, prurito, esplenomegalia al diagnóstico o
necesidad de citorreducción (véase Tabla 13).
Características TE, JAK2V617F-pos TE, JAK2V617F-neg p
Nº pacientes 65 46 -
Edad (años) 61 ± 18 60 ± 17 0,762
Mujeres 37 (57%) 24 (52%) 0,381
Prurito 3 (5%) 5 (11%) 0,188
Esplenomegalia 17 (26%) 9 (19%) 0,283
Eventos vasculares totales
14 (21%) 9 (19%) 0,497
Eventos trombóticos 12 (18%) 8 (17%) 0,546
Progresión TE a PV TE/PV a MFsec TE/PV/MFP a LMA
14 (30%) 4 8 2
4 (6%) 0 4 0
0,058
Citorreducción total 58 (89%) 45 (98%) 0,084
Hemoglobina (g/dL) 14,1 ± 1,5 13,2 ± 1,9 0,004
Leucocitos (x109/L) 10,14 ± 3,2 9,23 ± 2,7 0,124
Plaquetas (x109/L) 816 ± 345 997 ± 390 0,013
EPO (mU/mL) 22 ± 381 29 ± 322 0,475
FAL * 90 ± 573 58 ± 474 0,013
LDH (UI/L) 309 ± 1415 313 ± 1176 0,875 Tabla 13. Datos analítico-clínicos en TE (WHO 2008): JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg. *valores normales de 20 a 100 unidades arbritarias. 1valores para 28 pacientes, 2valores para 22 pacientes, 3valores para 34 pacientes, 4valores para 38 pacientes, 5valores para 63 pacientes, 6valores para 45 pacientes. Eventos vasculares totales significa eventos trombóticos y hemorrágicos mayores juntos. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.
2.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos
El grupo con PV (WHO 2008) al compararlo con el grupo TE (WHO 2008) JAK2V617F-
pos presentó (datos al diagnóstico): valores significativamente más altos de concentración de
hemoglobina, cifra de leucocitos y niveles séricos de LDH, frecuencia de prurito y de
esplenomegalia. Por contrario el grupo con TE JAK2V617F-pos presentó un valor de
IV. RESULTADOS
57
plaquetas y niveles de EPO más altos que el grupo con PV. No se encontraron diferencias
estadísticamente significativas en el sexo, edad al diagnostico, en frecuencia de eventos
trombo-hemorrágicos al diagnóstico y durante el seguimiento, necesidad de tratamiento
citorreductor o progresión de la enfermedad durante el seguimiento (véase Tabla 14).
Características PV, JAK2V617F-pos TE, JAK2V617F-pos P
Nº pacientes 42 65 -
Edad (años) 60 ± 15 61 ± 18 0,845
Mujeres 22 (52%) 37 (57%) 0,396
Prurito 18 (43%) 3 (5%) 0,000
Esplenomegalia 21 (51%)1 17 (26%) 0,008
Eventos vasculares totales
7 (17%) 14 (21%) 0,360
Eventos trombóticos 7 (17%) 12 (18%) 0,514
Progresión TE a PV TE/PV a MFsec TE/PV/MFP a LMA
4 (9%) - 3 1
14 (21%) 4 8 2
0,085
Citorreducción total 39 (93%) 58 (89%) 0,394
Hemoglobina (g/dL) 18,9 ± 1,5 14,1 ± 1,5 0,000
Leucocitos (x109/L) 12,57 ± 6,221 10,14 ± 3,25 0,001
Plaquetas (x109/L) 523 ± 2101 816 ± 345 0,000
EPO (mU/mL) 2,9 ± 42 21,5 ± 383 0,003
FAL * 115 ± 66 90 ± 57 0,080
LDH (UI/L) 397 ± 1302 309 ± 1414 0,002 Tabla 14. Datos clínico-analíticos de pacientes con PV y TE JAK2V617F-pos (WHO 2008). *valores normales de 20 a 100 unidades arbitrarias 1datos de 41 pacientes, 2datos para 40 pacientes, 3datos para 28 paciente, 4datos para 63 pacientes. Eventos vasculares totales significa eventos trombóticos y hemorrágicos mayores juntos. Citorreducción total engloba el tratamiento con HDU, ANA u otro tipo de tratamiento.
IV. RESULTADOS
58
2.4. Estado JAK2V617F y estudio histopatológico
2.4.1. Grupo completo: JAK2V617F-pos vs JAK2V617F-neg
Hemos comparado las características morfológicas (celularidad total, eritroide y mieloide,
megacariocitos, fibrosis colágena y sincitios) frente al estatus JAK2V617F. Los pacientes
con NMP JAK2V617F-pos presentaron el patrón medular más “eritrocítico” y los
JAK2V617F-neg más “trombocitósico” (véase Tabla 15).
JAK2V617F Valoración morfológica
(grado 2+/3+) Negativo (n=46)
Positivo (n=100)
p
Celularidad, n (%) 13 (28%) 50 (50%) 0,011
Megacariocitos, n (%) 35 (76%) 47 (47%) 0,001
Sincitios, n (%) 39 (85%) 60 (60%) 0,002
BM
O (n
=14
6)
Fibrosis, n (%) 3 (6%) 5 (5%) 0,488
Negativo (n=31)
Positivo (n=78)
p
Serie eritroide, n (%) 0 (0%) 17 (22%) 0,002
AM
O
(n=
109)
Serie mieloide, n (%) 3 (10%) 11 (14%) 0,393
Tabla 15. Análisis histopatológico y estatus de JAK2V617F en pacientes con NMP según WHO 2008. Solo se presentan valores morfológicos grado 2+ (moderadamente aumentado) y 3+ (muy aumentado). En la MFP los AMO no se pudieron valorar.
2.4.2. Grupo TE JAK2V617F-pos vs TE JAK2V617F-neg
Al analizar por separado el grupo de pacientes con TE (n=93), no se observaron diferencias
significativas en las características analizadas (celularidad total, eritroide y mieloide, cifra de
megacariocitos y fibrosis) entre los casos JAK2V617F-pos (n=53) vs JAK2V617F-neg
(n=40).
IV. RESULTADOS
59
El mismo análisis no se pudo realizar en el grupo de PV puesto que el 100% de los pacientes
fueron JAK2V617F-pos.
2.4.3. Grupo PV vs TE JAK2V617F-pos
Al comparar el grupo PV frente a TE JAK2V617F-pos encontramos que la PV mostraba
más celularidad a expensas de la serie eritroide, mientras que la TE JAK2V617F-pos
mostraba un mayor número de megacariocitos (véase Tabla 16).
NMP JAK2V617F-pos Valoración morfológica
(grado 2+/3+) PV (n=35)
TE (n=53)
P
Celularidad, n (%) 28 (80%) 21 (40%) 0,000
Megacariocitos, n (%) 7 (20%) 39 (74%) 0,000
Sincitios, n (%) 12 (34%) 46 (87%) 0,000
BM
O (n
=88
)
Fibrosis, n (%) 0 (%) 1 (2%) 0,602
PV (n=29)
TE (n=44)
P
Serie eritroide, n (%) 17 (59%) 0 (0%) 0,000
AM
O
(n=
73)
Serie mieloide, n (%) 8 (28%) 3 (7%) 0,016
Tabla 16. Análisis histopatológico en pacientes con PV y TE según WHO 2008 JAK2V617F-pos. Solo se presentan valores morfológicos grado 2+ (moderadamente aumentado) y 3+ (muy aumentado).
IV. RESULTADOS
60
3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas
3.1. Carga alélica JAK2V617F y diagnóstico según WHO 2008
Primero analizamos la distribución de la carga alélica JAK2V617F en el grupo total (n=119)
de los pacientes JAK2V617F-pos (véase Figura 6). De este análisis se excluyeron 9
pacientes en los que no se pudo establecer el diagnóstico WHO 2008 por falta de datos. Los
valores de la carga alélica JAK2V617F fueron significativamente (p=0,000) más altos en los
casos de PV (mediana de la carga alélica de 37% con el rango de 5 a 100%) que en TE
(mediana de la carga alélica de 23% con el rango de 4 a 71%). La mediana de la carga
alélica JAK2V617F en MFP fue de 37% con el rango de 16 a 57% y en los casos que no
cumplían los criterios WHO 2008, la mediana de la carga alélica JAK2V617F fue de 10%,
con el rango de 7 a 41%.
Dada la posibilidad de influencia del tratamiento citorreductor, tiempo de evolución y/o
presencia de progresión sobre la carga alélica JAK2V617F, dividimos a los pacientes en dos
grupos: grupo 1): casos con la primera determinación de JAK2V617F realizada al
diagnóstico (n=57) y grupo 2): casos con la primera determinación de JAK2V617F realizada
posteriormente, durante el seguimiento (n=62) y analizamos la distribución de la carga
alélica JAK2V617F (véase Figura 6B y 6C). No se objetivo una diferencia estadísticamente
significativa, respecto a la distribución de la carga alélica por diagnósticos entre estos grupos
ni con el grupo total de los pacientes (véase Figura 6A, 6B, 6C y Tabla 17).
IV. RESULTADOS
61
PV TE p* MFP No cumple
Total
(n=119)
n=42 Mediana: 37% Rango: 5-100%
n=65 Mediana: 23% Rango: 4-71%
0,000 n=5
Mediana: 37% Rango: 16-57%
n=7 Mediana 10% Rango: 7-41%
Grupo 1
(n=57)
n=16
Mediana: 40,5% Rango: 9-100%
n=33
Mediana: 23% Rango: 4-44%
0,000
n=3**
Sólo 3 valores: 16, 37 y 57%
n=5
Mediana 10% Rango: 7-29%
Grupo 2 (n=62)
n=26 Mediana: 37% Rango: 5-100%
n=32 Mediana: 23% Rango: 4-71%
0,000
n=2** Solo 2 valores:
27 y 49%
n=2** Solo 2 valores:
10 y 41%
Tabla 17. Distribución de la carga alélica según el fenotipo en el grupo total, en pacientes con la primera determinación de JAK2 al diagnóstico (grupo1) y en pacientes con la primera determinación de JAK2 realizada posteriormente al diagnóstico (grupo 2). *el valor p se refiere a la comparación entre el grupo de PV y TE, **No se presenta valor de la mediana en los grupos con el número de casos < 5.
IV. RESULTADOS
62
No cumple (n=7)
MFP (n=5)
TE(n=65)
PV (n=42)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=7)
PMF (n=5)
ET (n=65)
PV(n =42)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple (n=7)
MFP (n=5)
TE(n=65)
PV (n=42)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple (n=7)
MFP (n=5)
TE(n=65)
PV (n=42)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=7)
PMF (n=5)
ET (n=65)
PV(n =42)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=7)
PMF (n=5)
ET (n=65)
PV(n =42)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=5)
MFP (n=3)
TE (n=33)
PV (n=16)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=5)
PMF (n=3)
ET (n=33)
PV (n=16)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=5)
MFP (n=3)
TE (n=33)
PV (n=16)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=5)
MFP (n=3)
TE (n=33)
PV (n=16)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=5)
PMF (n=3)
ET (n=33)
PV (n=16)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple(n=5)
PMF (n=3)
ET (n=33)
PV (n=16)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple (n=2)
MFP(n=2)
TE (n=32)
PV (n=26)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
PMF (n=2)
No cumple(n=2)
PV(n=26)
ET(n=32)
No cumple (n=2)
MFP(n=2)
TE (n=32)
PV (n=26)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
No cumple (n=2)
MFP(n=2)
TE (n=32)
PV (n=26)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
PMF (n=2)
No cumple(n=2)
PV(n=26)
ET(n=32)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
PMF (n=2)PMF (n=2)
No cumple(n=2)
No cumple(n=2)
PV(n=26)
PV(n=26)
ET(n=32)
ET(n=32)
A
B
C
Figura 6. La distribución de la carga alélica JAK2V617F según el diagnóstico (WHO 2008) representada por un gráfico de dispersión (a la izquierda) y un diagrama de cajas (a la derecha): A). en el grupo total (n=119), B) en el grupo 1 (n=57) y C) en el grupo 2 (n=62).
IV. RESULTADOS
63
3.2. Carga alélica JAK2V617F en el diagnóstico diferencial entre la PV y la TE. Curva ROC.
Para el siguiente análisis, se seleccionan los casos con sospecha de PV y TE en los que se
determinó la carga alélica JAK2V617F en el momento del diagnóstico, previamente al inicio
del tratamiento citorreductor. Mediante el análisis de la curva ROC, se valora la utilidad de
la carga alélica de JAK2V617F en el diagnóstico diferencial entre una PV y una TE
JAK2V617F-pos. Se establecen los valores de sensibilidad y especificidad para cada punto
de corte (véase Figura 8). Con el valor de la carga alélica igual a 40%, el test presenta una
sensibilidad del 50% y una especificidad del 97% para el diagnóstico de PV mientras que
con el valor de 45%, la sensibilidad es de 44%, con una especificidad del 100%.
Figura 7. Punto de corte de JAK2V617F para diferenciar PV de TE para pacientes con JAK2V617F determinado en el momento del diagnóstico (solo pacientes JAK2V617F-pos; n=49). [Curva ROC: AUC=0,788; EE (AUC)=0,075 ; p=0,001]
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sen
sibi
lidad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Curva ROC
1 - Especificidad1,00,80,60,40,20,0
Sen
sibi
lidad
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Curva ROC
JAK2V617F Sensibilidad Especificidad 10% 0,93 0,27 20% 0,81 0,47 30% 0,62 0,80 35% 0,56 0,90 40% 0,50 0,97 45% 0,44 1 54% 0,31 1 65% 0,25 1
IV. RESULTADOS
64
3.3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas
En el siguiente análisis se seleccionaron los pacientes del grupo 1, con la primera
determinación de JAK2V617F al diagnóstico (n=63); se incluyeron tanto casos con el
diagnóstico de NMP confirmado (n=52) como no confirmado, sea por falta de datos (n=6) o
por no cumplimiento de los criterios WHO 2008 (n=5). En la Tabla 18 se muestran las
características al diagnóstico de los pacientes con NMP en función de la carga alélica al
diagnóstico. La carga alélicas JAK2V617F se analizó como variable continua y en rangos:
de 2 a 30%, de 31 a 50% y > de 50%. Los valores altos de la carga alélica de JAK2V617F se
asociaron con la presencia de prurito. La frecuencia de esplenomegalia y de eventos
vasculares presentan tendencia a aumentar con la mayor carga alélica JAK2V617F, sin
alcanzar los valores estadísticamente significativos (p=0,083 y 0,084 respectivamente).
Además, tal y como puede observarse en la Figura 7, se encontró una relación positiva,
estadísticamente significativa, entre la carga alélica JAK2V617F y los valores de
hemoglobina (r = 0,370; p = 0,003) o cifra de leucocitos (r = 0,251; p = 0,047) y la relación
inversa, sin alcanzar valores estadísticamente significativos (r = - 0,176; p = 0,168), con la
cifra de plaquetas.
El mismo análisis se ha realizó en el grupo total de los pacientes (incluyendo los casos con
el diagnóstico no confirmado tanto por falta de datos como por no cumplimiento de los
criterios WHO 2008). La Tabla 19 muestra el análisis de la primera determinación de la
carga alélica (al diagnóstico o posteriormente) con las características de la enfermedad en el
momento del diagnóstico. A pesar de la probable influencia del tratamiento y del tiempo de
evolución puede observarse que las principales asociaciones entre JAK2V617F y las
IV. RESULTADOS
65
características clínico y analíticas están mantenidas. Además encontramos una asociación
entre la mayor carga alélica y presencia de esplenomegalia y elevación de la LDH sérica.
JAK2V617F carga alélica Características
clínico-analíticas Grupo 1 2-30%
Grupo 1 2-30%
Grupo 1 2-30%
P
Nº pacientes 45 12 6 -
Edad, años 65 ± 17 60 ± 19 67 ± 17 0,614
Mujer 25 (56%) 5 (42%) 4 (67%) 0,558
Esplenomegalia 8 (18%) 5 (42%) 3 (50%) 0,083
Prurito 0 (0%) 2 (17%) 2 (33%) 0,002
Eventos vasculares totales
6 (13%) 2 (17%) 3 (50%) 0,084
Eventos trombóticos 6 (13%) 1 (8%) 3 (50%) 0,051
Progresión 2 (4%) 1 (8%) 0 (0%) 0,723
Hemoglobina (g/dL) 14,7 ± 2,1 16,4 ± 2,7 17,4 ± 3,1 0,008
Leucocitos (x109/L) 9,9 ± 2,7 10,8 ± 4,3 20,1 ± 12,1 0,000
Plaquetas (x109/L) 748 ± 330 592 ± 180 466 ± 245 0,052
EPO (mU/mL)1 24 ± 53 7 ± 8 1 ± 0,8 0,438
FAL2 71 ± 46 106 ± 67 154 ± 82 0,013
LDH (UI/L)3 309 ± 100 283 ± 107 389 ± 127 0,172
Tabla 18. Características clínico-analíticas de las NMP (WHO 2008) según la carga alélica JAK2V617F al diagnóstico. 1datos para 27 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 8 entre 31-50% y 5 pacientes con >50%; 2FAL: datos para 25 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 8 entre 31-50% y 5 pacientes con >50%; 3LDH: datos para 43 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 11 entre 31-50% y 5 pacientes con >50%. * FAL valores normales de 20 a 100 de unidades arbitrarias
IV. RESULTADOS
66
Carga alélica JAK2 (%)
100806040200
Hem
oglo
bina
(g/
dL)
21,00
18,00
15,00
12,00
9,00
Carga alélica JAK2 (%)
100806040200
Hem
oglo
bina
(g/
dL)
21,00
18,00
15,00
12,00
9,00
Carga alélica JAK2 (%)
100806040200
Leuc
ocito
s (x
109 /
L)
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Carga alélica JAK2 (%)
100806040200
Leuc
ocito
s (x
109 /
L)
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Carga alélica JAK2 (%)
100806040200
Pla
quet
as (
x10
9 /L)
2000
1500
1000
500
0
Carga alélica JAK2 (%)
100806040200
Pla
quet
as (
x10
9 /L)
2000
1500
1000
500
0
Figura 8. Diagrama de puntos que presenta la correlación entre la carga alélica de JAK2V617F y los valores analíticos tales como: cifra de hemoglobina (A), leucocitos (B) y plaquetas (C) en 63 pacientes con determinación de JAK2V617F realizada en el momento del diagnóstico.
C
B
A
IV. RESULTADOS
67
JAK2V617F carga alélica Características
clínico-analíticas Grupo 1 2-30%
Grupo 2 31-50%
Grupo 3 >50%
p global
Nº pacientes 80 29 19 -
Edad, años 62 ± 17 61 ± 16 62 ± 15 0,933
Mujer 46 (57%) 17 (57%) 9 (44%) 0,696
Esplenomegalia 16 (22%)1 14 (46%) 15 (78%) 0,000
Prurito 8 (11%) 8 (28%) 8 (44%) 0,002
Eventos vasculares totales
11 (15%) 6 (21%)2 7 (37%) 0,065
Eventos trombóticos 11 (14%) 4 (14%)2 7 (37%) 0,051
Progresión 9 (11%) 4 (14%) 6 (28%) 0,080
Citorreducción total 69 (89%) 26 (89%) 18 (94%) 0,793
Hemoglobina (g/dL) 15,1 ± 2,3 15,9 ± 3 17,9 ± 3 0.000
Leucocitos (x109/L) 10,6 ± 4,4 10,3 ± 3,4 16,2 ± 8,2 0.000
Plaquetas (x109/L) 766 ± 335 612 ± 238 494 ± 2603 0.001
EPO (mU/mL)4 20± 42 6 ± 7 2 ± 0,9 0.104
FAL5 91 ± 61 94 ± 67 118 ± 64 0.329
LDH (UI/L)6 317 ± 119 354 ± 133 449 ± 140 0,002
Tabla 19. Características clínico-analíticas de NMP (WHO 2008) según carga alélica JAK2V617F. 1datos para 79 pacientes, 2datos para 28 pacientes, 3datos para 18 pacientes, 4datos para 46 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 20 entre 31-50% y 14 pacientes con >50%, 5datos para 51 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 21 entre 31-50% y 16 pacientes con >50%, 6datos para 78 pacientes con JAK2V617F entre 2-31%, 28 entre 31-50% y 17 pacientes con >50%.
IV. RESULTADOS
68
3.4. Carga alélica JAK2V617F y estudio histopatológico
Finalmente, hemos analizado la relación de la carga alélica y el patrón morfológico. Al
analizar por separado a los pacientes con PV o TE, no se encontró ninguna asociación entre
la carga alélica y las variables analizadas (celularidad total, eritroide y mieloide,
megacariocitos y fibrosis). Solamente al analizar el grupo total (PV, TE, MFP y pacientes no
clasificados) observamos una asociación entre la carga alélica con el grado de celularidad
total, eritroide y mieloide y número de megacariocitos (véase Tabla 20).
Carga alélica JAK2V617F Valoración morfológica
(grado 2+/3+) 2-30% (n=63)
31-50% (n=23)
>50% (n=14)
p
Celularidad, n (%) 26 (41%) 13 (56%) 11 (78%) 0,032
Megacariocitos, n (%) 36 (57%) 10 (43%) 1 (7%) 0,003
Sincitios, n (%) 42 (67%) 13 (56%) 5 (36%) 0,094
BM
O (n
=10
0)
Fibrosis, n (%) 1 (2%) 3 (13%) 1 (7%) 0,090
2-30% (n=49)
31-50% (n=18)
>50% (n=11)
p
Serie eritroide, n (%) 6 (12%) 5 (28%) 6 (54%) 0,007
AM
O
(n=
78)
Serie mieloide, n (%) 3 (6%) 2 (11%) 6 (54%) 0,000
Tabla 20. Análisis histopatológico en pacientes con NMP (WHO 2008) según la carga alélica JAK2V617F. Solo se presentan valores morfológicos grado 2+ (moderadamente aumentado) y 3+ (muy aumentado).
IV. RESULTADOS
69
4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica
La evolución de la carga alélica JAK2V617F fue analizada en 124 de 183 (68,3%) pacientes
incluidos en el estudio. Se realizaron determinaciones seriadas de la mutación JAK2V617F
en el periodo de junio de 2005 a diciembre de 2009. Los pacientes fueron seleccionados si
cumplían los siguientes criterios de inclusión: presencia de al menos dos determinaciones de
JAK2V617F, periodo de seguimiento de al menos 12 meses (salvo un caso de seguimiento
de 5 meses por éxitus relacionado con el transplante) y suficiente documentación clínica. Se
analizaron por separado los pacientes JAK2V617F-neg (n=28) y los JAK2V617F-pos
(n=96). Se valoró el cambio absoluto y el cambio relativo de la carga alélica JAK2V617F
según se describió en el apartado 4.1 de Metodología. Además, en el grupo de pacientes con
el inicio del tratamiento con hidroxiurea (HDU) posterior a la primera determinación de
JAK2V617F, se analizó la respuesta molecular según los criterios de ELN (véase el apartado
4.1. de Metodología).
4.1. Seguimiento del grupo JAK2V617F-neg
Se realizó análisis seriado de mutación JAK2 en 28 pacientes, en 10 desde el diagnóstico, y
en 18 con la primera determinación realizada posterior al diagnóstico.
El seguimiento medio del grupo total (n=28), fue de 25 ± 9 meses (rango de 11 a 47) con
una media de 3 muestras por paciente (rango de 2 - 5 muestras). Todos los pacientes
permanecieron negativos a lo largo de seguimiento.
IV. RESULTADOS
70
4.2. Seguimiento del grupo JAK2V617F-pos
4.2.1. Grupo completo de pacientes.
Se estudió la evolución de la carga alélica en 96 pacientes JAK2V617F-pos, con un
seguimiento medio de la carga alélica JAK2V617F de 31 ± 11 meses (rango de 12 a 52) y
media de 4 muestras por pacientes (rango de 2 a 11).
Al analizar el cambio absoluto de la carga alélica en el grupo total (n=96): en 39 (41%)
pacientes permaneció estable, y 57 (59%) presentaron cambio (≥10% respecto al valor basal
de la carga alélica JAK2V617F): 31 presentaron aumento, 15 disminución y en 11 casos se
observó una evolución de la carga alélicas tipo “pico de sierra” (véase Tabla 21). El patrón
tipo “pico de sierra” incluye tres tipos de pacientes: 5 casos con el reciente inicio del
tratamiento con hidroxiurea, 3 casos de interrupción e reintroducción del tratamiento y 3
casos con el inicial aumento de la carga alélica JAK2 durante la progresión de TE a MFsec y
posterior negativización de la misma una vez realizado el alo-transplante de médula ósea
(n=2) o diagnosticada progresión a LMA (n=1). Estos casos se comentarán con más detalles
en otro apartado de este estudio. En aquellos casos que parten de un nivel bajo de la carga
alélica JAK2V617F, la definición del cambio absoluto (≥10%) puede limitar su análisis. En
16 casos el nivel basal de la carga alélica JAK2V617F era menor de 10% (3 PV y 13 TE), de
los cuales en 3 aumentó el nivel al menos un 10%. En los otros 13 se descarta el aumento de
la carga alélica, pero con los criterios utilizados no podemos diferenciar entre un valor
estable o descenso. El análisis de la evolución de la carga alélica JAK2V617F (cambio
absoluto) según fenotipo mostró una proporción similar de los pacientes con PV y TE que
cambiaron o no su carga alélica (véase Tabla 21).
IV. RESULTADOS
71
CARGA ALELICA JAK2V617F
Aumento Descenso Estable Pico sierra Total (n=96) 31 (32%) 15 (16%) 39 (41%) 11 (11%) PV (n=37) 12 (32%) 8 (22%) 14 (38%) 3 (8%) TE (n=56) 17 (30%) 7 (13%) 25 (45%) 7 (12%) MFP (n=3) 2 (67%) - - 1 (33%)
Tabla 21. Cambios de la carga alélica JAK2V617F en el grupo total (n=96) de pacientes clasificados según diagnóstico. En 13 casos con valores iniciales bajos no podemos diferenciar claramente entre valores estables o descenso o un patrón en pico de sierra
A continuación se realiza el cálculo de la variación de la carga alélica JAK2V617F (es decir
el valor relativo del cambio) del cual se excluyen los casos con el patrón “pico de sierra”
(véase el apartado 4.1. de Metodología). En nuestra serie, la mediana de variación de la
carga alélica JAK2V617F para todos los casos, presentó ligera desviación positiva (+22%)
desde la línea basal (la línea basal significa no cambios en la variación de la carga alélica
JAK2V617F). No se objetivó una diferencia estadísticamente significativa (p=0,644) entre
la mediana de variación de la carga alélica JAK2V617F en caso de PV y TE: +5% y +42%
respectivamente (véase Figura 9).
TE (n=49)PV (n=34)
Cam
bio
rela
tivo
(var
iaci
ón J
AK
2)
300
200
100
0
-100
p=0,644
TE (n=49)PV (n=34)
Cam
bio
rela
tivo
(var
iaci
ón J
AK
2)
300
200
100
0
-100
p=0,644
Figura 9. Diagrama de cajas que representa la variación de la carga alélica JAK2V617F según el fenotipo: PV y TE. La mediana de variación en la PV fue del +5% y en la TE del +42%, sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa. En el gráfico faltan 2 valores atípicos (1 de PV y 1 de TE). No se estudia la variación de la carga alélica en el grupo de MFP por escaso número de casos (n=3). Tampoco están incluidos 10 pacientes con el patrón “pico sierra”.
IV. RESULTADOS
72
A continuación, valoramos si los cambios de la carga alélica JAK2V617F puedan tener
relación con el tratamiento recibido o progresión de la enfermedad.
Finalmente, valoramos si los cambios de la carga alélica JAK2V617F podría tener relación
con el tratamiento recibido o con la progresión de la enfermedad.
En nuestra serie, en 45 de los pacientes (47%), la primera determinación JAK2V617F fue
realizada en el momento del diagnóstico. Durante el seguimiento, 10 de estos pacientes
permanecieron sin tratamiento citorreductor, mientras que en los 35 restantes se inició dicho
tratamiento: en 34 pacientes con hidroxiurea (HDU) y 1 con anagrelida (ANA). En los 51
pacientes restantes (53%), la primera determinación de JAK2V617F fue realizada
posteriormente al momento del diagnóstico. Mientras que en 2 de estos pacientes no se
inició el tratamiento citorreductor, en 49 de ellos la citorreducción (39 con HDU y 10 con
otro tipo de citorreducción) fue iniciada de media de 88,7 ± 93 meses (rango de 2 a 369
meses) previo a la primera determinación de JAK2V617F.
De los 96 pacientes, 17 presentaron progresión de una NMP a otra o a LMA: 8 durante el
seguimiento de la carga alélica JAK2V617F y 9 previo al inicio del seguimiento.
4.2.2. Grupo sin tratamiento citorreductor
Se dispone de la evolución de la carga alélica JAK2V617F en 10 pacientes (1 PV, 7 TE, 1
MFP) que durante el estudio permanecieron sin tratamiento citorreductor. La primera
determinación de la carga alélica JAK2 en estos pacientes fue realizada en el momento del
diagnóstico.
El seguimiento medio de estos enfermos fue de 28 ± 10 meses (rango de 12 a 43) y con la
media de 4 muestras (rango de 2 a 7) por paciente. Al analizar el cambio absoluto de la
IV. RESULTADOS
73
carga alélica JAK2V617F, en 7 pacientes (70%) se observó un discreto aumento ( ≥ 10%)
de la carga alélica JAK2V617F, en otros 2 (20%) casos no se observaron cambios y en 1
(10%) descenso (véase Figura 10A). Sin embargo, al comparar la media de la carga alélica
JAK2 basal con la del final del seguimiento (véase Figura 10B), no se observó una
diferencia estadísticamente significativa (p=0,084) entre los valores medios en ambos
grupos (20% frente a 30% respectivamente).
NMP sin citoreducción - JAK2 al diagnóstico
0
20
40
60
80
100
1 12 23 34
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A B
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
JAK2-finalJAK2-basal
60
50
40
30
20
10
0
p=0,084NMP sin citoreducción - JAK2 al diagnóstico
0
20
40
60
80
100
1 12 23 34
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A B
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
JAK2-finalJAK2-basal
60
50
40
30
20
10
0
p=0,084
JAK2-finalJAK2-basal
60
50
40
30
20
10
0
p=0,084
4.2.3. Grupo con tratamiento citorreductor con HDU
Este grupo de pacientes se dividió en dos subgrupos homogéneos: 34 casos con el primer
estudio de la carga alélica JAK2V617F al diagnóstico (grupo 1) y 39 posterior al inicio del
tratamiento con HDU (grupo 2).
La media del seguimiento entre la primera determinación de JAK2V617F y el inicio de
tratamiento con HDU en el grupo 1 de los pacientes, fue de 5 ± 7 meses (rango de 0 a 23) y
el seguimiento medio de la carga alélica JAK2V617F desde el inicio de HDU fue de 29 ± 12
(rango de 12 a 52) meses con la mediana de 3 ± 1,4 (rango de 2 a 7) muestras por paciente.
Figura 10. Evolución de la carga alélica JAK2V617F, desde el diagnóstico, en pacientes sin citorreducción. A). En la eje X se presentan los meses de seguimiento y en la eje Y valores de la carga alélica JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde).
IV. RESULTADOS
74
Los resultados del cambio absoluto de la carga alélica JAK2V617F en este grupo de
pacientes, se presenta en la Tabla 22. Un descenso de la carga alélica JAK2V617F, en
valores absolutos (cambio ≥ 10%), se encontró solo en el 29% de los pacientes; 40% en PV
y 26% en TE. En los demás casos, la carga alélica JAK2V617F permaneció estable en el
38% o aumentó en el 18% de los casos. Finalmente, un 15% de los casos (n=5) mostraron
el patrón tipo “pico de sierra” (el aumento durante los primeros meses del tratamiento con
el posterior descenso de la carga alélica JAK2V617F).
CARGA ALELICA JAK2V617F Aumento Descenso Estable Pico sierra
Total (n=34) 6 (18%) 10 (29%) 13 (38%) 5 (15%) PV (n=10) 2 (20%) 4 (40%) 2 (20%) 2 (20%) TE (n=23) 4 (17%) 6 (26%) 11 (48%) 2 (9%) MFP (n=1) - - - 1 (100%)
Tabla 22. Cambios de la carga alélica JAK2V617F en el grupo de pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada al diagnóstico y tratados con HDU (n=34).
Al comparar la media de la carga alélica JAK2V617F basal frente a la del final del
seguimiento no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ambos
valores ni en PV (46% vs 36%; p=0,400) ni en TE (18% vs 13%; p=0,092) (véase Figura 11
y Figura 12).
Finalmente, se valoró la respuesta molecular, según los criterios de ELN (véase Tabla 23).
En nuestra serie, no se detectó ningún caso de respuesta completa. En cambio la respuesta
parcial fue detectada en 40% (n=4) pacientes con PV y en 22% de TE (n=5). Basándonos en
la recomendación de ELN, no se valoró la respuesta molecular en los casos con la carga
alélica JAK2V617F basal ≤ 10%. Los criterios ELN no se pueden aplicar en pacientes con
evolución de la carga alélica JAK2V617F (%) tipo “pico de sierra” que, en nuestra serie,
representaron un 15% de los casos. Nosotros excluimos estos pacientes del análisis de la
respuesta molecular.
IV. RESULTADOS
75
PV con HDU de reciente inicio
0
20
40
60
80
100
-24 -12 0 12 24 36
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
JAK2-basal JAK2-final
p=0,400A BPV con HDU de reciente inicio
0
20
40
60
80
100
-24 -12 0 12 24 36
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
JAK2-basal JAK2-final
p=0,400
100
80
60
40
20
0
JAK2-basalJAK2-basal JAK2-finalJAK2-final
p=0,400A B
FFigura 11. Evolución de la carga alélica JAK2V617F, desde el diagnóstico, en PV con citorreducción con HDU. A). En la eje X se presentan los meses de seguimiento y en la eje Y valores de la carga alélica JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento de inicio de HDU.
JAK2-finalJAK2-basal
40
30
20
10
0
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
p=0,092BTE con HDU de reciente inicio
0
10
20
30
40
50
60
70
-24 -12 0 12 24 36 48 60
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A
JAK2-finalJAK2-basal
40
30
20
10
0
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
p=0,092BTE con HDU de reciente inicio
0
10
20
30
40
50
60
70
-24 -12 0 12 24 36 48 60
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A
Figura 12. Evolución de la carga alélica JAK2V617F, desde el diagnóstico, en TE con citorreducción con HDU. A). En la eje X se presentan los meses de seguimiento y en la eje Y valores de la carga alélica JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento del inicio de HDU.
IV. RESULTADOS
76
Diagnóstico Número JAK2V617F basal (%)
JAK2V617F último (%)
Variación JAK2V617F
1 4 6 +50
2 4 6 +50
3 6 7 +17
4 8 4 -50
5 10 4 -60
6 10 4 -70
7 10 2 -80
8 17 3 -82
9 Pico de sierra
10 Pico de sierra
11 18 33 +83
12 19 39 +105
13 19 14 -26
14 21 23 +9
15 22 19 -14
16 23 10 -56
17 23 13 -43
18 23 15 -35
19 24 29 +21
20 24 36 +12
21 26 2 -92
22 31 11 -64
Pacientes con TE
23 40 2 -92
1 9 25 +16
2 19 12 -36
3 21 10 -52
4 26 41 +58
5 32 17 -70
6 70 49 -30*
7 91 98 +8
8 100 38 -62
9 Pico de sierra
Pacientes con PV
10 Pico de sierra
MFP 1 Pico de sierra
Tabla 23. Cambios individuales de la carga alélica JAK2V617F en pacientes con PV y TE con el inicio de HDU posterior a la primera determinación de JAK2V617F. Pacientes con la carga alélica JAK2V617F basal ≤ 10% (color azul), pacientes con criterios de RC (color rojo). * JAK2V617F basal >50%.
IV. RESULTADOS
77
Para obtener datos a más largo plazo sobre la evolución de la carga alélica JAK2V617F en
pacientes a tratamiento con HDU, también se realizó el seguimiento de la mutación
JAK2V617F en 39 pacientes (24 PV, 13 TE, 2 MFP) con la primera determinación de
JAK2V617F realizada posteriormente al inicio del tratamiento con HDU (grupo 2). La
media del periodo del tiempo entre el inicio de HDU y la primera determinación de
JAK2V617F fue de 74 ± 50 meses (rango de 1 a 230). El seguimiento medio de la carga
alélica JAK2V617F en este grupo fue de de 108 ± 51 meses (rango de 33 a 266) con la
mediana de 4 muestras por pacientes (rango de 2 a 8). Al analizar el cambio absoluto de la
carga alélica JAK2V617F, en la mayoría de los casos se observó estabilidad o discreto
aumento (≥10%) a lo largo del periodo de seguimiento (véase Tabla 24). Solo en 4 casos de
PV se observó el descenso de la carga alélica JAK2V617F y en 1 caso de TE el patrón tipo
“pico de sierra”. Al comparar la media de la carga alélica JAK2V617F basal frente a la del
final del seguimiento, en caso de PV (véase Figura 13) no se detectó diferencia
estadísticamente significativa (p=0,456) entre ambos valores (56% vs 69%; p=0,456),
mientras que en TE (véase Figura 14) se observó el aumento de los valores del 22% al 34%
alcanzando la diferencia estadísticamente significativa (p=0,013).
CARGA ALELICA JAK2V617F Aumento Descenso Estable Pico sierra
Total (n=39) 15 (39%) 4 (10%) 20 (51%) - PV (n=24) 8 (33%) 4 (17%) 12 (50%) - TE (n=14) 6 (43%) - 7 (50%) 1(7%) MFP (n=1) 1 (100%) - -
Tabla 24. Cambios de la carga alélica JAK2V617F en el grupo de pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada posteriormente al tratamientos con HDU (n=39).
IV. RESULTADOS
78
100
80
60
40
20
0
JAK2-basal JAK2-final
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
PV con HDU de larga evolución
0
20
40
60
80
100
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A Bp=0,456
100
80
60
40
20
0
JAK2-basal JAK2-final
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0
JAK2-basalJAK2-basal JAK2-finalJAK2-final
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
PV con HDU de larga evolución
0
20
40
60
80
100
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A Bp=0,456
TE (HDU pre JAK2)
0
20
40
60
80
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a J
AK
2 (%
)
A B
JAK2-finalJAK2-basal
80
60
40
20
0
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
p=0,013TE (HDU pre JAK2)
0
20
40
60
80
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a J
AK
2 (%
)
A TE (HDU pre JAK2)
0
20
40
60
80
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a J
AK
2 (%
)
A B
JAK2-finalJAK2-basal
80
60
40
20
0
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
JAK2-finalJAK2-basal
80
60
40
20
0
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
p=0,013
En 3 de los pacientes (2 con TE y 1 con PV) se dispone de estudio evolutivo durante el
tratamiento citorreductor y después de su suspensión (véase Figura 15) cuando se observó el
incremento de la carga alélica de la mutación JAK2V617F. Además en un paciente
(seguimiento en verde) tras reintroducir el tratamiento con HDU se observó de nuevo el
descenso de la carga alélica de JAK2V617F.
Figura 13. Evolución de la carga alélica en PV con el tratamiento con HDU de larga evolución (la primera determinación de JAK2V617F fue realizada posteriormente al inicio del tratamiento). A). En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento de inicio de HDU.
Figura 14. Evolución de la carga alélica en TE con el tratamiento con HDU de larga evolución (la primera determinación de JAK2V617F fue realizada posteriormente al inicio del tratamiento). A). En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). B). Diagrama de cajas que compara la carga alélica JAK2V617F basal (azul) y del final del seguimiento (verde). La flecha indica el momento de inicio de HDU.
IV. RESULTADOS
79
4.2.4. Grupo con trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos
Se dispone de seguimiento da la carga alélica en dos pacientes con MFsec sometidos a
trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos (alo-TPH). En ambos pacientes se
observó negativización de la carga alélica de JAK2V617F (véase Figura 16): en el paciente
p237 al día +30 post trasplante y en el paciente p236 al día +141 post trasplante.
PV y retirada del tratamiento con HDU
0
20
40
60
80
100
-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
TE y retirada del tratamiento con HDU
0
10
20
30
40
50
60
70
-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a J
AK
2 (%
)
Reinicio HDU
PV y retirada del tratamiento con HDU
0
20
40
60
80
100
-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
TE y retirada del tratamiento con HDU
0
10
20
30
40
50
60
70
-44 -36 -28 -20 -12 -4 4 12 20 28 36
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a J
AK
2 (%
)
Reinicio HDU
Figura 15. Incremento de la carga alélica al retirar el tratamiento con HDU en pacientes con PV (A) y TE (B). En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). Las flechas rojas indican el momento de suspensión del tratamiento con HDU. En un pacientes (marcado en verde) se suspendió dos veces HDU (descenso de la carga alélica JAK2V617F con la reintroducción de HDU).
Alo-TPH
0
20
40
60
80
100
1 6 11 16 21 26 31Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Alo-TPH
0
20
40
60
80
100
1 6 11 16 21 26 31Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Figura 16. Evolución de la carga alélica en 2 pacientes sometidos a un trasplante alógenico de progenitores hematopoyéticos. En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%). Las flechas indican el momento de realización de trasplante
IV. RESULTADOS
80
4.2.5. Grupo con progresión de NMP
Hemos definido la progresión como evolución de una NMP a otra NMP o a leucemia
mieloide aguda (LMA). Este hecho se presentó en 20 JAK2V617F-pos y se disponía de
análisis evolutivo de la carga alélica en 17 de estos casos: 14 (82,4%) con la progresión de
una NMP a otra NMP y 3 (17,6%) a LMA. El seguimiento medio de estos enfermos, desde
el diagnóstico hasta la fecha de finalización del estudio, fue de 118 ± 80 meses (rango de 49
a 364) y el tiempo medio desde el diagnóstico de la NMP hasta la progresión fue de 89 ± 58
meses (rango de 24 a 256) meses.
4.2.5.a. Progresión a otra NMP
De los 14 pacientes: 4 presentaron progresión de TE a PV y 10 a MFsec (7 TE y 3 PV). El
seguimiento medio del estudio de la mutación JAK2V617F fue de 26 ± 11 meses (rango de
5 a 45) con la media de 4 muestras por paciente (rango de 2 a 11). Dichos pacientes durante
el seguimiento recibieron diferentes líneas de tratamientos: 2 casos estaban sin
citorreducción, 3 con HDU de reciente inicio, 3 con HDU de inicio antiguo, en 3 casos se
administraron varias líneas de tratamiento y en 3 se retiró el tratamiento citorreductor. En
todos los casos de progresión de una TE a una PV (n=4) se observó el aumento de la carga
alélica JAK2V617F durante el seguimiento, alcanzando la diferencia significativa (p=0,012)
entre el valor basal y el final. La media de la carga alélica JAK2V617F pre-progresión fue
de 25 % ± 2, mientras que post-progresión fue de 40% ± 6 (véase Figura 17).
En el grupo que progresó de una TE o una PV a una MFsec (n=10) solamente en un caso se
disponía de valores pre-progresión (véase Figura 17) con un claro aumento de la carga
alélica a lo largo del seguimiento (de 27% a 69%). Este caso inicialmente fue diagnosticado
de TE, luego de PV y finalmente de MFsec (véase Figura 18A). En los 9 enfermos restantes,
IV. RESULTADOS
81
el seguimiento de la carga alélica JAK2V617F fue iniciado una vez diagnosticada la
progresión, objetivándose igualmente un discreto (≥10%) aumento o estabilidad de la carga
alélica JAK2V617F (véase Figura 18B). No se alcanzó la diferencia estadísticamente
significativa (p=0,066) entre la carga alélica JAK2V617F basal y la final en este grupo de
pacientes.
Progresión TE-MFsec
0
15
30
45
60
75
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Casos con progresión (excepto a LMA)
0
20
40
60
80
100
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A B
TE
¿PV?MFsec
Progresión TE-MFsec
0
15
30
45
60
75
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Casos con progresión (excepto a LMA)
0
20
40
60
80
100
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A BProgresión TE-MFsec
0
15
30
45
60
75
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Casos con progresión (excepto a LMA)
0
20
40
60
80
100
1 13 25 37 49
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
A B
TE
¿PV?MFsec
Figura 19. Evolución de la carga alélica JAK2V617F en casos de progresión a MFsec. A). Progresión durante el seguimiento desde TE a probable PV y finalmente a MFsec. B). Progresión previa al inicio del seguimiento. En la eje X se representan los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F.
100
80
60
40
20
0 JAK2-finalJAK2 basal
Progresión de TE a PV (n=4)
p=0,012
Progresión de TE/PV a MFsec (n=10)
p=0,066
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
100
80
60
40
20
0 JAK2-finalJAK2 basalJAK2-finalJAK2 basal
Progresión de TE a PV (n=4)
p=0,012
Progresión de TE a PV (n=4)Progresión de TE a PV (n=4)
p=0,012
Progresión de TE/PV a MFsec (n=10)
p=0,066
Progresión de TE/PV a MFsec (n=10)
p=0,066
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Figura 18. Evolución de la carga alélica JAK2V617F en pacientes con progresión de una NMP a otra NMP (TE a PV y TE/PV a MFsec).
IV. RESULTADOS
82
4.2.5.b. Progresión de una NMP a LMA
Se dispone de datos evolutivos (pre- y post-progresión) de la carga alélica en 3 casos con
transformación a una LMA: de PV (n=1), de TE (n=1) y de MFP (n=1). Dos casos habían
sido tratados con HDU y el otro con varias líneas de tratamiento. En el caso con PV la carga
JAK2V617F descendió del 100% a 59-66%. Los casos con TE y con MFI mostraron previo
a la progresión aumento de la carga alélica con posterior descenso en la fase de LMA,
incluso hasta objetivarse negativización de la mutación en el paciente con TE (véase Figura
19).
Transformación a LMA
0
20
40
60
80
100
1 13 25 37 49 61
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Transformación a LMA
0
20
40
60
80
100
1 13 25 37 49 61
Seguimiento (meses)
Car
ga a
lélic
a JA
K2
(%)
Figura19. Evolución de la carga alélica de JAK2V617FV617F en los pacientes con la progresión a LMA. Las flechas indican éxitus. En la eje X se representa los meses de seguimiento y en la eje Y los valores de la carga alélica de la mutación JAK2V617F (%).
IV. RESULTADOS
83
5. Nuevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico
Los casos de NMP JAK2V617F-neg se estudiaron para determinar la frecuencia de las
mutaciones en el gen JAK2-exón 12 (en pacientes con sospecha de PV) y MPL (en
pacientes con sospecha de TE y MFP).
5.1. Estudio de las mutaciones en el gen JAK2-exón 12
Se estudiaron dos casos con poliglobulia y el diagnóstico no definido. La mutación JAK2-
exón 12 en ambos pacientes resultado ser negativa. El primer caso, tras revisión de los
criterios diagnósticos, fue reclasificado como eritrocitosis idiopática y el segundo se
clasificó como una TE (con moderada elevación de la hemoglobina).
5.2. Estudio de las mutaciones en el gen MPL
Se ha realizado el estudio de las mutaciones en el gen MPL en 45 de 54 pacientes
JAK2V617F-neg con el diagnóstico clínico de TE (n=41) y MFP (n=4).
La mutación MPL fue detectada en 4 de 45 pacientes (9%): en 2 con diagnóstico de MFP y
en los otros 2 con una TE. Se han detectado dos variantes de la mutación en el gen MPL: la
W515L en tres pacientes y la W515A en un paciente.
Las características clínicas y analíticas de este grupo de pacientes con MPL-pos se muestran
en la Tabla 25.
IV. RESULTADOS
84
DiagnósticoWHO 2008
MPL variante
Cariotipo Leucocitos (x109/L)
Hemoglobina (g/L)
Plaquetas (x109/L)
LDH al dx
Espleno- megalia
Transfor- mación
TE W515L 1996 (al dx): 46,XY.
2000: 46,XY,del(20)(q11) 7,00 14,6 900
379
SI MFsec
MFP
W515L Al dx: 46,XX 5,30 12,3 412 582 SI NO
MFP
W515L 1995 (al dx): 46,XY
2006: del cr 13 11,30 11,3 236
894
SI NO
TE
W515A Al dx: 46,XX 16,06 13,7 1301 329 NO MFsec
Tabla 25. Características clínico-analíticas de pacientes portadores de la mutación MPL. Abreviaturas: al dx significa realizado en el momento del diagnóstico.
IV. RESULTADOS
85
6. Cariotipo y JAK2V617F
Se dispone del estudio citogenético en 121 pacientes: 25 con diagnóstico de PV, 90 con TE
y 6 con MFP. En 119 casos el estudio fue realizado al diagnóstico. Dentro de este grupo,
solo en 7 (5,9%) pacientes se detectaron alteraciones del cariotipo: 1 (4%) con PV, 5 (5,5%)
con TE y 1 (16,7%) con MFP.
En 7 casos se dispone del estudio citogenético en el momento de la sospecha de la
progresión a MFsec o a LMA: todos los pacientes presentaron alteraciones en el cariotipo, la
mayoría con cariotipo complejo. En 6 de estos pacientes se disponía del cariotipo previo: 4
de ellos presentaban inicialmente el cariotipo normal y 2 patológico pero menos complejo
que en el estudio posterior (véase Tabla 26).
Las alteraciones citogenéticas parecen independientes del status de JAK2V617F, aunque el
limitado número de casos impide sacar conclusiones firmes.
IV. RESULTADOS
86
Diagnóstico Citogenética al diagnóstico
Citogenética seguimiento
JAK2V617F (%)
PV 47,XX,+9. N.D. 37 PV-AML 2002: N.D. 2008 (progresión a LMA):
64-69,XY,+der(1p),+del(2p),+3, +3,-4,+6,+6,+8,+8,+10, +11,+12,13,+14,+19,+19,del(20q12)x2,der(22q),+6marc[15]
100
TE 46,XY,del(9)(q22q23)[17] y 46,XX[3] N.D. 0 TE 46,XY,t(6;11),(q21;q23)[20]
SP: no alts. numéricas, ni estructurales N.D.
0
TE 45,X,-Y[20] N.D. 0 TE 46,XX [20]/47,XX,+19[3] N.D. 6 TE-MFsec 1998: 46,XX[28]/45,X[3] 2009 (progresión a MFsec): 46,XX/46,XX,del(1q),+1q,
del(5q),der(12q),-18 [7]; FISH: 5q33 (15%)
28
TE-MFsec 1996: 46,XY
2000: 46,XY,del(20)(q11.2)[4]/46,XY[16] 2004 (progresión a MFsec): 46,XY,del(20)(q11,2)[8]
0
TE-AML 2000: 46,XX 2009 (progresión a LMA): 44,XX, del(5q), +9, add(11p), add(12p),-13,-15,-16,-17,+marc [17]
25
TE-AML 2001: 46,XY 2008 (progresión a LMA): 5,XY,del(5q),del(7q), -8,-8, -11,-16,-17,-17,+5marc [9]
42
MFP
1995: 46,XY 2006: del(13)-30% gen Rb 0
MFP-AML 2002: 47,XY,+9 [14]/46,XY [9]; 2008 (progresión a LMA): 46,XY [11]/47,XY,+8 [9], más roturas cromosómicas [4 de 20]
37
Tabla 26. Pacientes con estudio citogenético anormal al diagnóstico o/y durante el seguimiento.
IV. RESULTADOS
87
7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F
Se analizó la distribución de subpoblaciones linfocitarias (definidas previamente en el
apartado 3.4 de Material y Métodos) en el grupo de 56 pacientes: 11 con PV, 44 con TE y 1
con MFP. La mutación JAK2V617F estaba presente en 39 (70%) de estos pacientes. El
seguimiento medio de los pacientes fue de 77 ± 71 meses (rango de 2 a 364 meses) y 8 de
estos pacientes presentaron datos de progresión: 3 casos de progresión de TE a PV y 5 de
TE o PV a MFsec. La mayoría de los pacientes recibió el tratamiento con HDU (n=39), 4
pacientes no recibieron ningún tratamiento y los demás (n=13) varias líneas del tratamiento.
De acuerdo con nuestros resultados, la única alteración constante (en 55% de los casos), fue
el discreto aumento de los valores de los linfocitos TNK (por encima de los valores de la
normalidad utilizados en nuestro laboratorio), mientras que en otras subpoblaciones
(linfocitos T CD3+, CD4-/CD8+, CD4+/CD8-, linfocitos NK CD3+/CD56+ y/o CD16+ y
linfocitos B CD19+) se detectaron valores normales o en una minoría valores descendidos
(véase Tabla 27).
Subpoblaciones linfocitarias
Anticuerpos monoclonales
Valores disminuidos
Valores aumentados
Valores normales
CD3+ 11 (20%) - 45 (80%) CD4+/CD8- 10 (18%) - 46 (82%) Linfocitos T CD4-/CD8+ 7 (12,5%) - 49 (87,5%)
Linfocitos TNK CD3+/CD56+ - 31 (55%) 25 (45%) CD3-/CD56+ 4 (7%) - 52 (93%)
Linfocitos NK CD3-/CD16+ 7 (12,5%) - 49 (87,5%)
Linfocitos B CD19+ 15 (27%) - 41 (73%) Tabla 27. Valores de subpoblaciones linfocitarias.
IV. RESULTADOS
88
No se encontró ninguna relación entre dichas alteraciones y la mutación JAK2V617F.
Tampoco hubó relación con otros datos clínicos o analíticos (trombosis, prurito,
esplenomegalia, cifra de hemoglobina, leucocitos ni plaquetas, progresión).
IV. RESULTADOS
89
8. Factores pronósticos y JAK2V617F
Los factores que puedan modificar la supervivencia de los pacientes con NMP son en su
mayoría los eventos vasculares y la progresión a MFsec u a LMA. En este apartado se
analiza la relación entre la mutación JAK2V617F y el pronóstico de los pacientes con NMP.
8.1. Supervivencia y JAK2V617F
La supervivencia global acumulada, analizada en la totalidad de NMP (n=175; 8 casos
excluidos), fue de 89% a los 5 años y de 78% a los 10 años. Por grupos la supervivencia a 5
años fue de 96% para la PV, 90% para la TE y 75% en el grupo con MFP. No hubo
diferencia entre la supervivencia en los pacientes con NMP JAK2V617F-pos y
JAK2V617F-neg (véase Figura 20). No se estudió la relación entre supervivencia y la carga
alélica JAK2V617F dado el pequeño número de casos. Durante el seguimiento fallecieron
19 (10%) pacientes y sólo en 5 de ellos la causa estaba relacionada probablemente con la
NMP: hemorragia digestiva aguda (n=1), isquemia intestinal (n=1), progresión a LMA
(n=3). Hubo dos éxitus por complicaciones asociadas al trasplante de precursores
hematopoyéticos. En los 12 casos restantes la muerte fue relacionada con: carcinoma
gástrico (n=1), cirugía de estenosis aórtica severa (n=1), neoplasia de pulmón (n=1) o causas
desconocidas (n=9).
IV. RESULTADOS
90
8.2. Eventos vasculares y JAK2V617F
Durante el seguimiento se produjeron 36 (20%) eventos vasculares graves: 32 trombóticos y
4 hemorrágicos. La distribución de las complicaciones vasculares según diagnóstico y
estatus JAK2V617F se muestra en las Tablas 12, 13 y 14.
No encontramos diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de
complicaciones trombóticas (p=0,521) al comparar los grupos JAK2V617F-pos y
JAK2V617F-neg.
Al analizar exclusivamente al grupo de NMP JAK2V617F-pos, los pacientes con la carga
alélica más alta presentaban tendencia a tener más eventos trombóticos, pero sin alcanzar la
diferencia estadísticamente significativa (véase Tablas 18 y 19). La carga alélica
JAK2V617F fue similar entre los pacientes con y sin eventos trombóticos (33% vs 25%
respectivamente; p=0,256). No hemos analizado por separado los eventos trombóticos
arteriales y venosos debido al bajo número de eventos.
Seguimiento (meses)
Sup
ervi
venc
ia a
cum
ulad
a
5004003002001000
1,00
0,95
0,90
0,85
0,80
0,75
0,70
CURVA KAPLAN MEIER
JAK2-POSJAK2-NEG
p=0,849
Seguimiento (meses)
Sup
ervi
venc
ia a
cum
ulad
a
5004003002001000
1,00
0,95
0,90
0,85
0,80
0,75
0,70
CURVA KAPLAN MEIER
JAK2-POSJAK2-NEGJAK2-POSJAK2-NEG
p=0,849
Figura 20. Comparación de la supervivencia entre los pacientes con NMP JAK2V617F-pos y NMP JAK2V617F-neg.
IV. RESULTADOS
91
8.3. Progresión y JAK2V617F
En nuestra serie, 23 pacientes presentaron progresión a lo largo del seguimiento: 4 casos de
TE a PV, 15 de TE/PV a MFsec y 4 de TE/PV/MFP a LMA. El tiempo medio desde el
diagnóstico de la NMP hasta la aparición de datos de progresión fue de 95,7 ± 54,6 meses
(rango de 24-256). El tiempo medio desde el diagnóstico de TE hasta la progresión a PV fue
de 50,6 ± 32,2 meses (rango de 24 a 100), de TE o PV a MF fue de 115,6 ± 57,8 meses
(rango de 46 a 256) y de TE o PV o MFP a LMA fue de 82,2 ± 22,4 meses (rango de 65-
114).
Como era de esperar todos los casos con transformación de una TE a una PV (n=4) fueron
JAK2V617F-pos. Pero también fueron JAK2V617F-pos todos los casos con transformación
a una LMA (n=4), y la mayoría de los pacientes con progresión a MFsec (11 casos
JAK2V617F-pos y 4 casos JAK2V617F-neg). A pesar de una más alta frecuencia de
progresión en la NMP JAK2V617F-pos frente a las NMP JAK2V617F-neg, la diferencia no
alcanzó significado estadístico (p=0,100).
La evolución de la carga alélica en relación a la progresión ya fue descrita previamente en el
apartado 4.2.5. de los Resultados.
92
V. DISCUSIÓN
V. DISCUSIÓN
93
1. Criterios diagnósticos WHO
1.1. Criterios diagnósticos WHO - validación
En nuestra experiencia, hay una alta concordancia entre las clasificaciones WHO 2001 y
2008 para los casos con sospecha de PV (factor kappa = 1), observación que compartimos
con Kondo et al. [172]. Además, según Girodon et al, la incidencia de PV fue estable en el
período del tiempo de 1980 a 2007 [11] a pesar de la incorporación del estudio de la
mutación JAK2V617F. Por lo tanto la principal ventaja de la nueva clasificación WHO
2008 en el estudio del paciente con sospecha de PV es su simplicidad lo cual se debe sobre
todo a la incorporación de los nuevos marcadores clonales (JAK2V617F y JAK2V617F-
exón 12) y a la eliminación de los criterios de exclusión [10-11,161,173]. En la mayoría de
nuestros pacientes el diagnóstico se realizó o hubiera podido realizarse sin necesidad de una
biopsia ósea. Nuestros datos están de acuerdo con las recomendaciones de los expertos [10-
11,161,173]: el diagnóstico de PV en la mayoría de los pacientes puede realizarse solamente
al detectar la mutación JAK2V617F y los niveles bajos de la EPO. Esto no significa que el
estudio medular carezca de capacidad diagnóstica – véase el apartado 1.2 de la Discusión -
pero sí que puede ser omitido sin perder seguridad diagnóstica.
En cambio en la TE observamos una discordancia relevante entre los criterios WHO 2001 y
2008 (factor kappa = 0,43). Utilizando los criterios WHO 2008, pudimos confirmar el
diagnóstico en más pacientes con sospecha de TE, sobre todo en los que anteriormente no
fueron diagnosticados al presentar la cifra de plaquetas discretamente elevada. Nuestros
resultados son concordantes con un análisis similar recientemente publicado, en el cual
destaca como principal ventaja de los criterios WHO2008 para la TE JAK2V617F-pos, la
posibilidad de hacer diagnósticos más tempranos [11,174]. Destacamos que el análisis de
V. DISCUSIÓN
94
riesgo trombótico de TE en la que nosotros interpretamos como fase temprana de la
enfermedad (pacientes diagnosticados según criterios WHO 2008 y no según WHO 2001),
reveló que más de la mitad de ellos pertenecían al grupo de riesgo intermedio y alto. Así
que, la nueva clasificación WHO 2008 permite clasificar mejor a un grupo de pacientes con
patología probablemente en la fase más temprana pero no por ello de menos riesgo y que
por lo tanto se pueden beneficiar de un diagnóstico y tratamiento más precoz.
En conclusión la nueva clasificación WHO 2008 supone una clara mejora sobre la
clasificación anterior al simplificar el diagnóstico de las NMP y permitir el diagnóstico en
fases más tempranas de la TE. El diagnóstico en fases más precoces de la TE aumenta el
riesgo de confusión con una PV o una MPF en fases precoces o enmascaradas - véase el
Apartado 1.2 de la Discusión -. El estudio de la mutación de JAK2V617F (y otros
marcadores clonales) debe incorporarse en el estudio de los pacientes con sospecha de una
NMP.
1.2. Estudio histopatológico de las NMP WHO 2008
En los nuevos criterios WHO 2008, se ratifica la importancia del estudio morfológico de la
médula ósea como criterio mayor para el diagnóstico de TE y MFP y como criterio menor
para la PV [10]. La motivación del estudio morfológico medular viene dado en primer lugar
por la necesidad de excluir otros procesos que pueden cursar con trombocitosis, sobre todo
el SMD con trombocitosis [161]. Pero también la WHO le aporta al estudio morfológico de
la MO un valor diagnóstico propio [161]. En este aspecto hemos encontrado limitaciones del
estudio morfológico, a pesar de una revisión exhaustiva de las biopsias y aspirados de
médula ósea.
V. DISCUSIÓN
95
La principal limitación la encontramos en la ausencia de criterios morfológicos en algunos
pacientes con un claro diagnóstico clínico de NMP. Esta limitación afecta en mayor medida
a la TE ya que para su diagnóstico se exige el cumplimiento de todos los criterios, incluido
el estudio morfológico de la MO. En nuestra experiencia, la coincidencia entre el criterio
clínico y morfológico fue bastante buena, pero encontramos 7 casos (7%) de TE,
diagnosticados clínicamente y en 6 también con el apoyo del estudio mutacional de
JAK2V617F, los cuales sin embargo no podrían ser diagnosticados por falta de criterios de
diagnóstico morfológico (véase Tabla 8 y Tabla 11). Es destacable que dichos pacientes al
diagnóstico presentaban un recuento plaquetario menor de 800 x 109/L, por lo que se podría
especular que fueran formas incipientes de TE las cuales todavía no hubieran adquirido un
patrón morfológico característico. La evolución clínica después de varios años de
seguimiento sigue siendo compatible con el diagnóstico de una TE. Por ello el estudio
morfológico aporta información útil tanto para el diagnóstico positivo como para la
exclusión, pero no puede hacerse un diagnóstico firme de exclusión de NMP basado solo en
“ausencia de atipias morfológicas”. Teniendo en cuenta nuestros resultados pensamos que el
criterio morfológico de diagnóstico de la TE debería ser menos estricto al menos en
términos asistenciales [53,161,174].
En nuestra experiencia la coincidencia entre el diagnóstico morfológico y el clínico en la PV
fue muy alta, detectamos solamente discrepancia en dos casos (5%) que no presentaban
hallazgos morfológicos característicos. En la PV el estudio morfológico de la MO no es un
criterio imprescindible para el diagnóstico [10,161], pero dada la alta concordancia
encontrada entre el diagnóstico morfológico y el diagnóstico clínico, pensamos que el
estudio medular puede ser útil para excluir o confirmar los raros casos de PV negativos para
JAK2V617F y JAK2V617F-exón 12. Por lo tanto en la PV nuestra experiencia apoya la
utilidad de los nuevos criterios diagnósticos WHO.
V. DISCUSIÓN
96
La segunda limitación, que creemos que presenta el estudio morfológico, se refiere a la
dificultad para diferenciar entre si las distintas NMP. Según algunos autores [175], el estudio
morfológico de MO es capaz de detectar las formas incipientes de las NMP. Así fue
adoptado por la clasificación WHO 2001, donde las formas incipientes (junto con formas
tardías caracterizadas por marcada mielofibrosis) se catalogaban dentro de la entidad
llamada enfermedades mieloproliferativas crónicas (EMP) no clasificables [48]. En la
clasificación 2008 se reafirma la necesidad y la validez del estudio morfológico para
distinguir la verdadera TE de formas incipientes de PV o MFP (fase prefibrótica de MFP),
aunque dichas formas ya no se engloban dentro de una entidad “no clasificable”. Sin
embargo, otros autores señalan la baja reproducibilidad de la clasificación morfológica [52]
y reconocen que existen limitaciones de la morfología para diferenciar algunas fases de las
NMP [52-53]. Además se sugiere que la PV, la TE y la MFP pueden evolucionar a lo largo
del tiempo y la morfología de la MO es el reflejo actual de cada estadio de la NMP [53]. De
acuerdo con esta teoría, los pacientes se deben diagnosticar según las características del
momento del estudio, asumiendo como normal que una proporción de estos pacientes
evolucionará a otra NMP (cuadros de MFsec post-TE y post-PV) o que algunos no podrán
ser correctamente clasificados. Nuestra experiencia confirma estas observaciones,
especialmente por la limitación de los criterios morfológicos para el diagnostico de las
formas “incipientes” de NMP. En nuestra serie tuvimos 6 casos que al diagnóstico cumplían
criterios (analíticos y morfológicos) de TE según WHO 2008 y con el paso del tiempo
adquirieron rasgos típicos de una PV (n=4) o de una MFsec post-TE (n=2) (véase Tabla 10).
La nueva valoración morfológica, de la MO extraída al diagnóstico, no fue capaz de
diagnosticarlas como formas “incipientes” de PV o MFP, sino que confirmó el diagnóstico
de TE. Además, al realizar el seguimiento de la carga alélica JAK2V617F en los cuatro
casos con progresión a PV (véase apartado de Resultados) y en un caso de progresión a
V. DISCUSIÓN
97
MFsec, se detectó el progresivo aumento de su valor, correspondiente con su presentación
fenotípica en aquel momento, lo que estaría de acuerdo con la teoría de progresión de la
enfermedad con el tiempo. Curiosamente, estos pacientes en el momento del diagnóstico, no
cumplían los criterios de WHO 2001 para TE ya que sus cifras de plaquetas fueron < 600 x
109/L. Por lo tanto al bajar el nivel de cifra de plaquetas necesario para el diagnóstico de TE,
nos encontramos con más “fallos” diagnósticos al no poder diferenciar una TE de una fase
incipiente de la PV o MFP con trombositosis. Sin embargo, desde el punto de vista clínico
este hecho no supone ningún cambio en la actitud terapéutica respecto a estos pacientes.
Al comparar la morfología medular (BMO y AMO) del grupo de TE JAK2V617F-pos
frente al de grupo de PV encontramos un patrón más mieloproliferativo y “eritrocítico” en la
PV y más trombocitósico en TE (véase Tabla 15). En el estudio de Campbell el at, se
observó que los pacientes con TE JAK2V617F-pos presentaban mayor grado de celularidad
total, a expensas de serie mieloide y eritroide, que los pacientes con TE JAK2 V617F-neg
[43]. En nuestra serie, el estatus de JAK2V617F entre los pacientes con TE, no se asoció
con características morfológicas específicas.
En conclusión nuestro estudio confirma que los nuevos criterios WHO 2008 simplifican el
proceso del diagnóstico de las NMP y en la TE ayudan en el diagnóstico de pacientes con
cifra de plaquetas no muy elevada, que no necesariamente presentan el riesgo trombótico
bajo. Además, sugerimos que la ausencia de hallazgos morfológicos anormales no es
suficiente para excluir el diagnóstico de una TE en presencia de un conjunto de datos
analíticos, clínicos y biológicos específicos. Por lo tanto la clasificación WHO para el
diagnóstico de la TE tiene limitaciones que deben tenerse en cuenta en la práctica clínica.
Sin embargo pensamos que la clasificación debería seguirse de modo estricto en los ensayos
clínicos.
V. DISCUSIÓN
98
2. Estado JAK2V617F y características clínico-analíticas en NMP (WHO 2008)
Nuestros resultados confirman que la mutación JAK2V617F está presente en la mayoría de
los pacientes con PV y en más de la mitad de los pacientes con TE y MFP [3-6]. Además, al
igual que en los estudios previos observamos (véase Tabla 12) la presencia del fenotipo
“tipo PV” en pacientes con NMP JAK2V617F-pos frente al fenotipo “tipo TE” en los casos
JAK2V617F-neg [4,43-44,46]. In vivo, se ha reproducido el fenotipo policitémico en
modelos murinos al realizar transplante de progenitores hematopoyéticos con células madre
hematopoyéticas transfectadas con la mutación JAK2V617F, caracterizado por eritrocitosis,
neutrofilia y descenso de cifra de plaquetas [84-86]. Algunos animales, después de unos
meses de seguimiento desarrollaban MFsec [4]. En nuestra serie, el fenotipo JAK2V617F-
pos se caracterizó por presentar valores más altos de hemoglobina, de recuentos
leucocitarios y de fosfatasa alcalina leucocitaria (FAL), mientras que la cifra de plaquetas y
el nivel sérico de la EPO están más bajos. Estos resultados son concordantes con estudios
previamente publicados [4,43-44]. Respecto a las características clínicas, la frecuencia de
esplenomegalia y progresión (de una NMP a otra o a LMA) parecen ser más frecuenten en
casos JAK2V617F-pos, sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa, mientras
que no detectamos diferencia en la frecuencia de eventos trombóticos ni en la presencia de
prurito entre los pacientes JAK2V617F-pos y JAK2V617F-neg. Los estudios publicados no
son concluyentes acerca de la presencia de la asociación de esplenomegalia, prurito,
complicaciones trombóticas y progresión en NMP JAK2V617F-pos [3-5,43-44,46]. En el
apartado 8 de la Discusión profundizaremos el papel del estado de la mutación JAK2V617F
como factor de riesgo para trombosis.
V. DISCUSIÓN
99
En el análisis por subgrupos, los casos de TE (criterios WHO 2008) JAK2V617F-pos, en
comparación con los JAK2V617F-neg, se asemejan al cuadro de PV, tanto en nuestros
resultados (véase Tabla 13) como en los de otros autores [43]. Nuestros pacientes con TE
JAK2V617F-pos se caracterizaban por presentar los valores más altos de hemoglobina y
FAL así como más bajos los de plaquetas. Según algunos autores se sugería que los
pacientes con TE JAK2V617F-pos son formas “frustradas” de PV que con el paso de tiempo
se transforman en PV [43]. Sin embargo, a pesar de que las progresiones desde TE a PV
ocurren, no son tan frecuentes como se predecía de acuerdo con este modelo [43,176].
Además, los pacientes con TE JAK2V617F-pos presentan características biológicas
diferentes de los pacientes con PV, por ejemplo casi nunca presentan colonias homocigotas,
mientras que casi todos los pacientes con PV lo hacen [3-6,130,176]. Además, de acuerdo
con nuestros resultados, existen diferencias clínicas y analíticas entre los casos de TE
JAK2V617F-pos y la PV. La PV se caracteriza por un fenotipo más eritrocitósico y menos
trombopoyético (mayor frecuencia de esplenomegalia y prurito, cifra más altas de
hemoglobina, leucocitos y niveles séricos de LDH y más bajas de plaquetas en PV) (véase
Tabla 14) que al grupo de TE JAK2V617F-pos. En este momento se valora la posibilidad de
que el fenotipo final de la NMP depende de muchos factores como la carga alélica de
JAK2V617F (véase el apartado 3 de la Discusión), predisposición alélica, factores
dependientes del huésped y mutaciones adicionales [101,124-125,127,176].
A continuación valoramos si el estatus JAK2V617F guardaba alguna relación con la
morfología medular. Al estudiar el grupo total de NMP encontramos que los pacientes
JAK2V617F-pos presentaban el mayor grado de la celularidad total y de la serie eritroide y
los JAK2V617F-neg la mayor cantidad de megacariocitos. Nuestros datos no coinciden con
los publicados por Bousquet et al, según el cual no existía ninguna relación entre la
morfología de la MO y el estatus de JAK2V617F [177] en pacientes con NMP (PV, TE y
V. DISCUSIÓN
100
MFP). Esta diferencia tal vez se deba a la amplia variabilidad conocida entre diferentes
profesionales respecto a la interpretación del estudio morfológico [52]. El siguiente paso fue
analizar la relación entre la morfología de MO y el estatus JAK2V617F exclusivamente en
el grupo de TE. Al igual que en el estudio publicado por Larsen et al [178], no se encontró
relación entre las variables estudiadas (celularidad total, serie eritroide, mieloide y
megacariocitos) y el estatus de JAK2V617F. Sin embargo, otros autores describen mayor
celularidad total en TE JAK2V617F-pos frente a la TE JAK2V617F-neg [43,52] así como
aumento de la serie eritroide y mieloide en TE JAK2V617F-pos [43]. Es posible que la falta
de asociación detectada en nuestro estudio se deba a la pequeña cantidad de casos estudiados
en nuestra serie. Finalmente se analizó la morfología de MO exclusivamente en pacientes
JAK2V617F-pos comparando la distribución de las características morfológicas entre dos
grupos diagnósticos: PV vs TE JAK2V617F-pos (WHO 2008). Observamos, que cada
grupo diagnóstico (PV o TE) conservaba las características morfológicas propias, es decir la
mayor celularidad a expensas de serie eritroide en PV y la mayor cifra de megacariocitos en
TE.
Con el descubrimiento de la mutación en JAK2V617F surgió la propuesta de clasificar a las
NMP según la presencia o no de la mutación en JAK2V617F. El grupo de Cambell et al.
[43] defiende la clasificación de las NMP según su estado mutacional, sin embargo la nueva
clasificación WHO conserva la tradicional separación entre TE y PV en base a parámetros
analíticos y morfológicos sin considerar el estado mutacional en JAK2V617F. En nuestra
opinión, el estatus JAK2V617F-pos frente JAK2V617F-neg no aporta suficiente rasgo
diferencial para definir las NMP como entidades basadas en el estado mutacional Por lo
tanto consideramos adecuado mantener todavía la clasificación tradicional de las NMP en
base a su fenotipo clínico-analítico.
V. DISCUSIÓN
101
3. Carga alélica JAK2V617F y características clínico-analíticas
Una hipótesis postula que la TE JAK2V617F-pos y la PV deberían ser vistas como
“continuum biológico” y no como dos entidades distintas [43]. El fenotipo de estas
entidades podría estar influenciado por varios factores fisiológicos y genéticos [42,100,113,
124-125,127,178-179], entre ellos por la cantidad del alelo mutado JAK2V617F. Se ha visto
que los valores de la carga alélica de JAK2V617F se solapan entre diferentes fenotipos de
las NMP [136,140,142,178-179], pero también se ha descrito la asociación de la TE con la
carga alélica JAK2V617F menor de 50% [180], lo cual coincide con nuestros resultados.
Por lo tanto, en el caso de un paciente con sospecha de NMP con trombocitosis y carga
alélica de JAK2V617F >50%, el diagnóstico más probable es de PV o de fase prefibrótica
de MFP, mientras que el diagnóstico de TE es poco probable [180]. Vannucchi et al,
comenta la distribución de la carga alélica JAK2V617F entre las tres entidades (PV, TE y
MFP) en rangos: 1-15%, 26-50%, 51-57% y 76-100%. Según esta distribución, observamos
que más de 90% de pacientes con TE presenta valores bajos (<51%) de la carga
JAK2V617F, mientras que en los pacientes con PV los valores de la carga alélica están
distribuidos entre los cuatro rangos de manera bastante uniforme (1-25%: cerca de 20%; 26-
50% cerca de 35%, 51-75% cerca de 30% y 76-100% cerca de 20%) [136]. Los estudios que
analizan la homocigosidad señalan que cerca de 30% de pacientes con PV y solo una
proporción muy pequeña de pacientes con TE (<10%) presentan la mutación JAK2V617F
en estado de homocigosis, lo cual en términos cuantitativos se asocia con cargas alélicas ≥
de 50% [3-6,130,179]. Por lo tanto, de nuevo parece que los pacientes con TE tienen la
carga alélica menor de 50%. En nuestro estudio, la mediana de la carga alélica, determinada
al diagnóstico, en la PV fue de 40,5% (rango de 9 a 100%), en TE fue de 23% (rango de 4 a
44%) y en MFP de 37% (solo tres valores de 16, 37 y 57%). Hemos podido encontrar un
V. DISCUSIÓN
102
claro punto de corte (curva ROC) que separa la PV de la TE JAKV617F-pos: el valor entre
40 y 45% de la carga alélica de JAK2V617F diferencia con claridad entre estas dos
entidades. Por lo tanto, sugerimos igualmente que en estudios previos [179], que ante una
carga alélica JAK2V617F >50% y un cuadro clínico compatible con NMP no MFP se debe
sospechar PV con independencia del valor de la hemoglobina (PV “enmascarada”).
En el conjunto completo de casos, la carga alélica parece influir en la presentación clínico-
analítica de la enfermedad. En nuestra serie observamos, que existe una relación positiva
entre la carga alélica JAK2V617F y los valores de la hemoglobina, cifra de leucocitos y el
valor de FAL, así como una relación inversa con el recuento de plaqueta, estos resultados
son concordantes con otros estudios [124,133-137,139]. Respecto a la clínica, los pacientes
con la carga alélica JAK2V617F más alta presentaban mayor frecuencia de prurito y de
esplenomegalia, aunque ésta última no alcanzaba los valores significativos, estos datos son
concordantes con estudios previos [124,133,135-139]. Acerca de las complicaciones
trombóticas y progresión la literatura muestra resultados discrepantes [135,137,141]. En
nuestro estudio, los eventos trombóticos parecen ser más frecuentes en pacientes con la
carga alélica más alta, pero sin alcanzar diferencia significativa (p=0,051) (véase el apartado
8 de la Discusión). No encontramos relación entre la carga alélica JAK2V617F y la
aparición de progresión (véase el apartado 8 de la Discusión).
Finalmente, hemos estudiado el significado de la carga alélica JAK2V617F y la morfología
de MO, encontrando una relación positiva con el grado de celularidad total a expensas de
serie eritroide y mieloide. Al contrario, la carga alélica más baja se asoció con el aumento de
megacariocitos. No hemos encontrado ningún estudio que analice las características
morfológicas con la carga alélica JAK2V617F como hemos hecho nosotros.
V. DISCUSIÓN
103
En conclusión, además del estado mutacional, la carga alélica aporta información de utilidad
diagnóstica al asociarse valores muy altos con la PV, en cambio valores bajos no pueden
discriminar una PV de una TE JAK2V617F-pos. Como ya comentamos antes la ausencia de
la mutación en JAK2V617F permite excluir la PV casi en el 100% de los casos. En los
criterios diagnósticos actuales WHO 2008, se incorporó el estatus de la mutación
JAK2V617F como marcador clonal. Nuestro estudio sugiere que la incorporación del
estudio de la mutación JAK2V617F en términos de carga alélica podría añadirse a la
clasificación diagnóstica, mejorando la discriminación entre la TE y la PV.
Además, hemos visto que carga alélica JAK2V617F se asocia con algunos parámetros
clínicos y analíticos - cifras altas de hemoglobina y de leucocitos, mayor frecuencia de
prurito y de esplenomegalia. Sin embargo pensamos que sería necesaria una serie mucho
más grande para conocer el significado de la carga alélica JAK2V617F en términos clínicos
(relación con trombosis y progresión). El estudio evolutivo de la carga alélica JAK2V617F,
que discutimos en el apartado 4 de la Discusión, sugiere necesidad de valorar su utilización
como un marcador de la evolución de las NMP.
V. DISCUSIÓN
104
4. Seguimiento de la carga alélica JAK2V617F – evolución clínica
En el apartado anterior hemos comentado la relación entre la carga alélica de JAK2V617F
en un momento concreto con las características clínico-analíticas de los pacientes. En este
apartado analizamos los resultados de la evolución de la carga alélica en el tiempo.
Se dispone de escasa información sobre la evolución de la carga alélica de la mutación
JAK2V617F y su implicación clínica en los pacientes con NMP.
En los pacientes JAK2V617F-neg, al igual que en estudios previos, hemos demostrado que
el estatus mutacional se mantiene sin cambio a lo largo del seguimiento [43,140-141]. Por lo
tanto las NMP JAK2V617F-neg son procesos biológicamente diferentes de las NMP
JAK2V617F-pos. Además, con las técnicas de detección altamente sensibles (sensibilidad
de AS-PCR en general es de 0,01-0,1% y en nuestro laboratorio es de 2%), es posible
descartar razonablemente que ni siquiera una minoría de las NMP JAK2V617F-neg pueden
presentar la mutación en niveles por debajo de la sensibilidad de nuestra técnica. En la
práctica clínica diaria, la implicación de este hecho es la no necesidad de repetir el estudio
mutacional en JAK2V617F-neg a lo largo del seguimiento en las NMP JAK2V617F
negativas.
En los pacientes JAK2V617F-pos, todos los estudios realizados hasta la fecha fueron
retrospectivos y los grupos analizados fueron muy heterogéneos tanto respecto a la duración
de la enfermedad y tratamientos recibidos como a las técnicas y el material (DNA de
granulocitos de sangre periférica o de médula ósea) utilizado para la determinación de la
carga alélica JAK2V617F. Tampoco están bien definidos los criterios según los cuales se
valoraba el cambio de la carga alélica JAK2V617F [133,141,143,147,181-182].
V. DISCUSIÓN
105
Nosotros hemos realizado el seguimiento de la carga alélica JAK2V617F de manera
ambispectiva en el grupo de 96 pacientes con NMP JAK2V617F-pos. Además, a la hora de
realizar comparaciones, hemos dividido a los pacientes en subgrupos bastante homogéneos.
Sin embargo, nuestro estudio en el seguimiento se adaptó a la práctica asistencial lo que
limita la cantidad de información obtenida y su interpretación.
Primero observamos, que la variación de la carga alélica JAK2V617F (valor relativo) en el
conjunto de los casos analizados en nuestra serie fue casi estable, objetivándose sólo una
ligera desviación positiva (+22%) desde la línea basal (que significa no cambio de la carga
alélica JAK2V617F). Hay dos pequeñas series, una en 48 pacientes con PV y TE [143] y
otra en 19 TE [141] que también indican que la carga alélica JAK2V617F se mantiene
estable durante el seguimiento en la mayoría de los pacientes. Pero también encontramos
estudios según cuales la carga alélica JAK2V617F presenta tendencia al aumento a lo largo
del seguimiento como el estudio de Hussein et al, realizado en 145 casos (39 TE, 14 PV y 92
MFP) y determinación de JAK2V617F en muestras de MO [180] o el estudio de Antonioli
et al, realizado en 64 casos (40 PV y 24 TE) con larga evolución de la enfermedad [183]. El
planteamiento de otros estudios ha sido comparar la carga alélica de JAK2V617F en
diferentes grupos de pacientes con distinto seguimiento, pero los resultados tampoco son
concordantes [133,138]. Por un lado, Tefferi et al [138] analizando la carga alélica
JAK2V617F en muestras de MO en 123 pacientes con PV (57 pacientes a 1 año del
diagnóstico, 20 a 5 años y 16 con más de 5 años de seguimiento), encontró que los pacientes
con el seguimiento mayor de 5 años presentan la carga alélica más alta en comparación con
otros grupos. En cambio, Kittur et al, en 96 casos de TE (40 pacientes a 1 año del
diagnóstico, 31 entre 1-5 años y 25 más de 5 años post diagnóstico) no vieron diferencia en
la carga alélica JAK2V617F entre los tres grupos (en SP) [133]. Finalmente Barosi et al, en
un estudio realizado en 64 casos de MFP, con el seguimiento mayor de 8 años, sugiere el
V. DISCUSIÓN
106
aumento de la cantidad de la mutación JAK2V617F con el paso del tiempo al observar
frecuente transformación del estado de heterocigosis a homocigosis en estos pacientes [40].
Con estos datos, en nuestra serie profundizamos en el estudio de la evolución de la carga
alélica JAK2V617F en casos individuales teniendo en cuenta el tiempo de evolución de la
enfermedad, el tratamiento administrado y evolución clínica (progresión) de los pacientes.
El cambio (absoluto) de la carga alélica lo definimos como la diferencia ≥ 10% de la carga
alélica JAK2V617F entre la primera y la última determinación y encontramos que más de la
mitad de los pacientes con NMP presentaron dicho cambio. Los cambios absolutos
ocurrieron tanto en la PV como en la TE, y presentaron bien un patrón en ascenso, o
descenso o en picos de sierra.
Primero analizamos la posible relación entre la evolución de la carga alélica JAK2V617F y
el tratamiento. En nuestra serie, la mayoría de los pacientes (n=73) recibieron HDU y en
casi la mitad (n=34) el tratamiento fue iniciado posteriormente a la primera determinación
de JAK2V617F (inicio reciente). En un tercio de estos pacientes, detectamos el descenso
absoluto (≥ 10%) de la carga alélica JAK2V617F, este fue generalmente discreto o
moderado (entre 10 y 20%), y la comparación de los valores medios basales y finales no fue
estadísticamente significativo (p=0,074). En el estudio realizado por Theocharides et al, en 5
de 6 de los pacientes con el inicio reciente de HDU, se observó el descenso de la carga
alélica JAK2V617F después de 6 meses del seguimiento [143]. Igualmente Girodon et al,
describen el descenso de la carga JAK2V617F en 36 pacientes con PV y TE desde el valor
medio al diagnóstico de 43% a 24% después de 5 meses del tratamiento con HDU [147].
Ricksten et al [184] describen un importante descenso de la carga alélica (sin presentar
valores) de la carga alélica después del seguimiento de 4 meses en 18 pacientes (9 PV de y 9
V. DISCUSIÓN
107
de TE). Finalmente, Antoniolli et al [183], al analizar 44 pacientes con el seguimiento medio
de 29 meses, observa sólo un discreto descenso de la carga alélica JAK2V617F en pacientes
con el inicio reciente de HDU (de 45% a 41% con p=0,7 en PV y de 38% a 35% con
p=0,024 en TE).
No hemos podido en nuestra serie, analizar con detalle la secuencia de la evolución de la
carga alélica JAK2V617F a largo plazo de modo prospectivo, si bien parece que el descenso
ocurre más frecuentemente antes de los primeros 24 meses del tratamiento. Sin embargo, de
acuerdo con nuestros resultados, no es improbable encontrar casos de descenso de la carga
JAK2V617F más tarde de los 24 meses de seguimiento. Estos resultados están en
concordancia con estudios que, al igual que nosotros, han analizado el papel de la HDU en
la carga alélica y apoyan que hay un rápido descenso de la carga alélica en los pacientes con
PV y TE en los que se iniciaba el tratamiento con HDU [143,145,147,183-184].
El papel de la HDU en la carga alélica se refuerza con las observaciones de aumento de la
carga alélica JAK2V617F-pos al suspender el tratamiento con HDU y su posterior descenso
al reiniciarlo. Al igual que nosotros, este hecho también ha sido descrito en otra pequeña
serie [143].
Recientemente, los expertos de European LeukemiaNet (ELN) publicaron la propuesta de
valoración de criterios de respuesta molecular en pacientes con NMP. De acuerdo con estos
criterios, la respuesta molecular completa se define por la negativización de la mutación y la
respuesta parcial se define como disminución ≥ 50% desde la línea basal en pacientes con la
primera determinación de JAK2V617F entre 10 y 50% y ≥ 25% en pacientes con la primera
determinación JAK2V617F > 50% [150]. Además, la respuesta molecular no puede
valorarse con estos criterios en pacientes con un valor basal de JAK2V617F < 10%. Hasta
V. DISCUSIÓN
108
ahora, solo en un estudio se analizó la respuesta molecular en los pacientes tratados con
HDU [183]: no se encontró ningún caso de la respuesta completa y la respuesta parcial fue
vista en un 15% (n=3) de TE y 12% (n=3) de PV. Utilizando los criterios de ELN, en
nuestra serie no se dio ningún caso de la respuesta completa, pero si detectamos varios casos
con respuesta parcial (RP): en PV 40% (n=4) y en TE 35% (n=8). La aplicación de los
criterios de respuesta molecular del ELN tiene dificultades. En nuestra serie no pudimos
aplicarlos en 32% (n=7) casos con TE por partir de valores bajos de TE, y tampoco es
posible interpretar el cambio de la carga alélica en términos de respuesta molecular en
aquellos casos con evolución de la carga alélica en patrón de pico de sierra lo cual ocurrió en
el 15% de nuestros pacientes.
Se ha sugerido [43,145,185] que dicha reducción de la carga alélica JAK2V617F con HDU
durante los primeros meses del tratamiento podría estar en relación con la inicial
hipersensibilidad del clon mutado JAK2V617F-pos a HDU. En nuestra serie no observamos
diferencias en la tasa de respuesta hematológica entre las NMP JAK2V617F-pos y
JAK2V617F-neg, pero no hemos analizado la dosis de HDU. Al menos dos estudios
sugieren que las NMP JAK2V617F-pos [43] o las NMP con alta carga alélica [185] son más
quimiosensibles a la HDU que las JAK2V617F-neg o con baja carga alélica lo cual se
traduce en una menor necesidad de HDU. El descenso de la carga alélica JAK2V617F
también se ha descrito con el IFN, pero parece que el grado o el mecanismo de acción son
diferentes. Con HDU no se ha visto respuesta citogenética ni la reversión a la hematopoyesis
policlonal, lo cual si puede ocurrir con INF [145]. No se conoce si el descenso de la carga
alélica JAK2V617F tiene implicación en la evolución clínica de los enfermos.
Otro grupo que analizamos fueron los pacientes con el tratamiento con HDU de larga
evolución (la primera determinación de JAK2V617F realizada después del inicio del
V. DISCUSIÓN
109
tratamiento con HDU). Al comparar nuestros resultados con las publicaciones previas, no
podemos sacar conclusiones firmes acerca de este tema. Por un lado, de acuerdo con Larsen
et at [179], los valores de la carga JAK2V617F en PV y TE recientemente diagnosticados,
frente a los valores de JAK2V617F en casos ya previamente tratados y con el seguimiento
más largo (media de 64 meses), tienden a ser más altos aunque no se alcanza la diferencia
estadísticamente significativa. Girodon et al, comparan la carga alélica en pacientes al
diagnóstico frente al grupo que ya estaba con HDU (de media de 32 meses) antes del estudio
y observan que en caso de PV la carga JAK2V617F es más baja en el grupo tratado frente al
grupo de diagnóstico (44% vs 54% respectivamente), mientras que en el grupo de TE no se
detectaba la diferencia [147]. Otros autores aportan resultados totalmente opuestos: Tefferi
et al, describe el aumento de la carga alélica JAK2V617F en PV [138] y Antoniolli et al
[183] con TE.
Nosotros también hemos estudiados el seguimiento de la carga alélica en el grupo de
pacientes con la primera determinación pos tratamiento y habitualmente de larga evolución.
Este análisis reveló, que la mayoría de los pacientes presentaba estabilidad (50% con PV y
57% con TE) o aumento (33% con PV y 43% con TE) de la carga alélica JAK2V617F, y
solo en el 17% de pacientes con PV observamos un descenso de la carga alélica
JAK2V617F. Al comparar las medias de las cargas alélicas basales con los valores finales,
observamos un discreto aumento tanto en PV como en TE (56 y 60% vs 22% y 34%
respectivamente), sin embargo la diferencia estadísticamente significativa fue detectada
solamente en casos de TE (p=0,013), pero no en la PV (p=0,456), resultados comparables al
estudio de Antonioli et al [183].
En nuestro estudio analizamos también el seguimiento de la carga alélica en un pequeño
grupo de pacientes (n=10) sin citorreducción con HDU. Encontramos un aumento de la
V. DISCUSIÓN
110
carga alélica durante el seguimiento (desde 20 a 30%) sin alcanzar diferencia significativa.
La mayoría de los estudios publicados hasta la fecha presentan datos compatibles con la
estabilidad de la carga alélica en estos casos [141,143,183] por ejemplo en el estudio
realizado por Antonioli, la carga alélica en PV aumentó de 44% a 49% y en TE de 27% a
31% respectivamente sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa. Solamente, en
el estudio publicado por Carobbio et al, realizado en TE con el seguimiento mayor de 10
años, se comenta el aumento significativo de la carga alélica JAK2V617F [134].
En el caso de alo-TPH, hemos confirmado la negativización de la mutación JAK2V617F,
como se reportaba en estudios previos [143,148-149]. Se sugiere que la determinación
cuantitativa de JAK2V617F podría servir como un marcador de respuesta post transplante
alo-TPH [148-149].
Otra causa de variabilidad de la carga alélica podría ser la progresión de la enfermedad. En
nuestro estudio, todos los enfermos con progresión de TE a PV (n=4) presentaron una
duplicación de la carga alélica en el momento del cambio (de 25,2 % al inicio a 40% post
diagnostico de PV con p significativa). El cambio de la carga alélica asociado a la evolución
de una TE a una PV es esperable, pues pensamos que son casos de PV en fase “incipiente”.
Esta evolución también ha sido descrita en otras pequeñas series [180,186] de pacientes. En
la progresión a MFsec, sugerimos que la carga alélica JAK2V617F podría presentar un
aumento durante y post-progresión. Sin embargo, nuestros resultados no son concluyentes
ya que en nuestra serie no encontramos diferencia estadísticamente significativa entre el
valor medio inicial y final en este grupo (52% vs 69% respectivamente) y solamente en un
caso se disponía de valores previos y posteriores a la progresión a MFsec (27% vs 69%
respectivamente). Algunos autores comentan que la carga alélica JAK2V617F en pacientes
con MFsec es más alta al compararla con la carga alélica de JAK2V617F en casos con otros
V. DISCUSIÓN
111
diagnósticos (PV, TE y MFP) [140]. En otro estudio realizado por Guglielmelli et al, se
observó que la carga alélica JAK2V617F en MFsec post PV es cercana a 100% y en la
MFsec post TE es mayor del 50% [187]. Por ello se ha sugerido que uno de los mecanismos
de evolución hacia la MFsec podría estar relacionado con el “acúmulo” de los alelos
mutados JAK2V617F [187]. Sin embargo, para poder sacar conclusiones firmes acerca de la
evolución temporal de la carga alélica JAK2V617F en estos pacientes habría que realizar el
estudio de seguimiento prospectivo, en un amplio grupo de pacientes.
La carga alélica JAK2V617F también cambia cuando se produce una progresión de una
NMP a una LMA, esto ocurrió en tres de nuestros pacientes: dos casos con descenso de la
carga alélica JAK2V617F y un caso con negativización de la mutación JAK2V617F. De
acuerdo con los trabajos publicados hasta la fecha, la progresión a LMA aparece tanto en
pacientes JAK2V617F-pos como JAK2V617F-neg [43-44,142,188-189]. Además, en
pacientes JAK2V617F-pos, en alrededor de 50% de los casos, en el momento del
diagnóstico de LMA se objetiva negativización de la mutación JAK2V617F [38,143,188].
En el momento actual, coexisten dos teorías para la explicación de este fenómeno. Para
ambas existen estudios que le apoyan [39,106,116,143,189-190]. La primera es que la LMA
y NMP se desarrollan en dos diferentes clonas JAK2V617F-neg y JAK2V617F-pos
respectivamente. La otra propone que tanto la LMA como NMP son subclonas que
provienen de una clona común JAK2V617F-neg y en la patogénesis de la NMP aparece otro
evento adicional que es responsable de la adquisición de la mutación JAK2V617F [38-
39,190-191].
Resumiendo nuestros resultados y el análisis de la literatura, la carga alélica JAK2V617F en
el grupo total de los pacientes se mantiene bastante estable. Sin embargo, puede cambiar a lo
lardo de seguimiento en algunos de los pacientes. De acuerdo con los estudios mencionados
V. DISCUSIÓN
112
previamente y nuestros resultados, el tratamiento citorreductor con HDU se puede asociar a
descenso inicial de la carga alélica, pero sólo en algunos de los pacientes. La nueva
propuesta de respuesta molecular necesita ser validada para poder sacar conclusiones sobre
su utilidad en el control de la respuesta al tratamiento con HDU. Otro factor que pueda
tener influencia en la carga alélica de JAK2V617F es el tiempo de evolución de la
enfermedad y aparición de progresión de una TE o PV a MFsec. Estas variables son la causa
de aparentes discrepancias en los distintos estudios publicados acerca de la evolución de la
carga alélica JAK2V617F. Para un conocimiento más profundo de la evolución de la carga
alélica y su relación con la clínica en NMP se precisa de otro diseño de estudio (prospectivo)
en grupos muy homogéneos de pacientes y probablemente utilizando otro tipo de análisis
estadístico (medidas repetidas). Sin embargo el interés de este tipo de estudios estaría
asociado a nuevos tratamientos con mayor capacidad de modificar la carga alélica, como se
sugiere con los inhibidores del JAK2 [192-193].
V. DISCUSIÓN
113
5. Nuevas mutaciones – su interés diagnóstico y significado clínico
La mutación JAK2V617F no está presente en todas las NMP, aparece en más de 95% de
pacientes con PV y pero solo en el 50% de la TE y MFP [3-6,161]. Además, aunque se ha
visto que dicha mutación tiene un papel importante en la patogénesis de las NMP [4-5, 84-
86], se postula que no es el evento clónico inicial para el desarrollo de NMP [100,105-
109,127-128]. Por lo tanto, se están buscando otras mutaciones para las NMP JAK2V617F-
neg, e incluso en las NMP JAK2V617F-pos podría haber otros eventos genéticos que
precedan a la adquisición de la mutación JAK2V617F.
Las nuevas mutaciones descritas hasta la fecha fueron la mutación JAK2V617F-exón 12,
MPL y más recientemente las mutaciones TET, CBL, ASXL1, IHD, IKZF1 [100-116].
Actualmente, ya se conoce la implicación de la mutación JAK2V617F-exón 12 y MPL en la
patogénesis de las NMP y el hecho de que, al igual que la mutación JAK2V617F, son los
eventos secundarios a otro evento genético inicial [103,105-114,117,128]. Además, ambas
mutaciones JAK2-exón 12 y MPL han sido incorporadas en los nuevos criterios
diagnósticos de NMP WHO 2008, especialmente para facilitar el diagnóstico en casos de
pacientes JAK2V617F-neg [10].
En nuestra serie, estudiamos solo dos pacientes para la mutación JAK2V617F-exón 12,
ambos resultaron negativos. La mutación en el gen JAK2V617F-exón 12, a pesar de su baja
frecuencia en pacientes con PV (3-5%) es el marcador típico de la PV JAK2V617F-neg
[161]. Dicha mutación está además asociada invariablemente con los niveles bajos de EPO y
con la presencia de formación de colonias eritroides, por lo tanto los pacientes portadores de
dicha mutación ya cumplen los criterios de WHO 2008 para la PV [161]. En caso de uno de
V. DISCUSIÓN
114
los pacientes estudiados por nosotros para la mutación JAK2V617F-exón 12, su negatividad
junto con niveles altos de EPO nos ayudó a descartar el diagnóstico de NMP.
La mutación MPL aparece en pacientes con TE (4%) y MFP (11%), sobre todo en casos
JAK2V617F-neg [103-104,113-115], sin embargo hay casos descritos de coexistencia de las
dos mutaciones [113-115,194-195]. En nuestro trabajo, la mutación MPL fue estudiada en
los pacientes JAK2V617F-neg y la encontramos solo en 2/41 (5%) de pacientes con TE
JAK2V617F-neg, frecuencia que es similar a la publicada [103-104]. En cambio en la MFP
encontramos la mutación MPL en 2 de 4 (50%) MFP JAK2V617F-neg, es decir con la
frecuencia más alta de la esperada. Sin embargo, teniendo en cuenta el número limitado de
casos, no se puede sacar conclusiones firmes acerca de estos resultados. Hasta la fecha se
han descrito diferentes variantes de la mutación MPL, de las cuales funcionalmente
relevantes, son la mutación MPL-W515K, MPL-W515L, MPL-W515A y MPL-S505N
[112-114]. En nuestro estudio detectamos dos de estas variantes: W515L (n=3) y W515A
(n=1). La variante W515L es la que aparece con mayor frecuencia y la W515A en casos
aislados [112,195]. Finalmente, dada el pequeño número de casos portadores de la mutación
MPL en nuestra serie, no podemos sacar conclusiones firmes acerca de la presentación
clínico-analítica de estos pacientes. Cabe subrayar, que los dos pacientes inicialmente
diagnosticados como TE MPL-pos presentaron progresión a MFsec. En la literatura hay
varias publicaciones que analizan la implicación clínico-analítica de la mutación MPL en la
presentación clínica de las NMP. Según el modelo realizado en ratones, la mutación en el
gen MPL induce mieloproliferación caracterizada por esplenomegalia, leucocitosis, marcada
trombocitosis, hematopoyesis extramedular y mielofibrosis [103]. La mutación
MPLW515L/K en MFP, según el estudio retrospectivo realizado en 217 pacientes, se asocia
con mayor severidad de anemia y por lo tanto mayor requerimiento transfusional, sexo
femenino y edad avanzada [196]. En caso de TE, la mutación MPLW515L/K se relaciona
V. DISCUSIÓN
115
con mayor edad, anemia y mayor cifra de plaquetas, sintomatología microvascular y mayor
riesgo de trombosis arterial posterior al diagnóstico [197-198].
Finalmente, en nuestro estudio no pudimos valorar la utilidad de la detección de MPL a la
hora de diagnosticar a los pacientes con NMP JAK2V617F-neg dado el pequeño número de
casos. Es posible que al estudiar la mutación MPL con la técnica de secuenciación, no
fuimos capaces detectar todos los casos en nuestra serie. Sin embargo, en general el valor de
la mutación MPL como marcador clonal es limitado dada su baja frecuencia en NMP
JAK2V617F-neg [161].
En conclusión la mutación en exón 12 de JAK2V617F ofrece una importante ayuda
diagnóstica para los pocos casos de PV JAK2V617F-neg, la ausencia de ambas mutaciones
en nuestra experiencia descarta una PV de modo absoluto. En cambio el estudio de la
mutación MPL tiene menos utilidad diagnóstica pues sólo está presente en una minoría de
TE JAK2V617F-neg, pero su presencia tiene un alto valor confirmatorio de NMP tipo TE o
MFP.
V. DISCUSIÓN
116
6. Cariotipo y JAK2V617F
En nuestra serie las frecuencia de anomalías citogenéticas fue solo del 5,9% (n=7) y
comparable a la informada en otros estudios [155-158,162-164]. La mayor frecuencia de
alteraciones citogenéticas se presentan en la MFP (cerca de 40%), seguidos de PV (35%) y
TE (3%). En nuestro análisis, la frecuencia por subgrupos fue algo diferente: 4% en PV
(n=1), 5,5% en TE (n=5) y 16,7% en MFP (n=1), sin embargo, dado limitado número de
casos, no se puede sacar conclusiones firmes acerca de estos resultados.
En nuestra serie, no hemos encontrado asociación entre la presencia o ausencia de la
mutación JAK2V617F y anomalías citogenéticas. En la literatura hay informes discrepantes
acerca de este tema. Por un lado Campbell et al, al analizar un amplio grupo de pacientes
(n=767), opina que existe asociación de la mutación JAK2V617F con dos anomalías
citogenéticas, la del20q y la trisomía 9, y la ausencia de la mutación JAK2V617F con la del
13q y la pérdida del cromosoma 7 [38] Otras series más pequeñas no han corroborado estos
datos [3,43,157-158].
De acuerdo con la literatura, no se han encontrado claras asociaciones entre alteraciones
citogenéticas y el pronóstico en la PV y la TE [157-158,162], mientras que en MFP se está
valorando la incorporación del estudio citogenético dentro de los criterios pronósticos
[66,155-156,163-164]. Nosotros basándonos en nuestra casuística no podemos aportar
información relevante en este aspecto.
En conclusión la citogenética en las NMP puede ser de utilidad diagnóstica como marcador
de clonalidad aunque su frecuencia es baja. Probablemente la nuevos métodos de estudio
citogenético puedan ampliar el conocimiento. Como continuación de este proyecto tenemos
ya iniciada una línea de investigación con SNP array [199].
V. DISCUSIÓN
117
7. Subpoblaciones linfocitarias y JAK2V617F
El sistema inmunológico puede participar en la patogenia de las enfermedades tumorales a
través del inadecuado desarrollo de la respuesta defensiva e incluso puede llegar a facilitar la
supervivencia de las células neoplásicas. Apenas se han estudiado las alteraciones
inmunológicas en los pacientes con NMP. En una serie de 8 casos con PV se encontró una
pobre respuesta linfocitaria T in vitro a mitógenos [200]. En nuestro grupo a estudio, en un
porcentaje pequeño de los pacientes, observamos un discreto descenso de los linfocitos T
CD3+ (tanto CD4+ como CD8+), las células NK (CD56+/CD3-) y linfocitos B (CD19+).
En cambio los linfocitos TNK (CD3+/CD56+) estaban aumentados en más de la mitad de
los pacientes.
No podemos comparar nuestros resultados con otros estudios, ya que hasta ahora no se
realizó un estudio similar. En la LMC se ha sugerido una asociación entre el descenso de la
subpoblación de linfocitos NK y la evolución a progresión [201-203]. Nosotros no hemos
hallado una relación entre las alteraciones descritas previamente con presencia de progresión
ni con otros datos clínicos ni analíticos. Nuestro estudio fue realizado en distintos momentos
evolutivos, lo que puede dificultar la explicación para estas alteraciones inmunológícas.
En los modelos animales, la deficiencia del gen JAK2 resulta ser letal [165-166], por lo
tanto no se dispone de estudios acerca de su papel en el sistema inmunológico. En este
momento se están ensayando varios inhibidores del gen JAK2V617F en pacientes con
NMP. De estos ensayos aprendremos si es seguro inhibir o no el gen JAK2V617F. En
nuestro estudio no encontramos relación entre las alteraciones cuantitativas en las
subpoblaciones linfocitarias y el estatus de la mutación JAK2V617F.
V. DISCUSIÓN
118
En conclusión los pacientes con NMP presentan alteraciones cuantitativas en
subpoblaciones linfocitarias T y NK de SP. Son necesarios más estudios para conocer su
significado. Solamente podemos afirmar que estas alteraciones no guardan relación con el
estado mutacional en JAK2V617F
V. DISCUSIÓN
119
8. Factores pronósticos y JAK2V617F
8.1. Supervivencia
La supervivencia de los pacientes con NMP está principalmente afectada por aparición de
eventos trombóticos y en segundo lugar por progresión a una MFsec o una LMA.
En nuestra serie no observamos diferencia entre la supervivencia en NMP JAK2V617F-pos
frente a JAK2V617F-neg, pero sería necesaria una casuísticas más grande para sacar
conclusiones firmes. Tampoco encontramos resultados definitivos acerca de este tema en la
literatura [17,49,139].
8.2. Eventos trombóticos
La patogénesis de las complicaciones trombóticos en las NMP no está de todo conocida y
parece tener un origen multifactorial. Entre los factores tradicionalmente involucrados en
este proceso se encuentra la hiperviscosidad relacionada con el hematocrito alto, la
trombocitosis [15,21-22], así como los factores de riesgo cardiovascular como diabetes,
hipertensión, etc. [23]. En los estudios recientes se ha encontrado un importante papel de la
activación de las plaquetas y de los leucocitos [24,28,34] y de la cifra de los leucocitos [29-
31]. En varios estudios retrospectivos, se ha sugerido que la mutación JAK2V617F podría
estar asociada con el riesgo de trombosis. El grupo de Campbell et al, encontró una mayor
frecuencia de complicaciones trombóticos venosas en la TE JAK2V617F-pos frente a la
JAK2V617F-neg [43]. También se ha descrito un mayor riesgo trombótico en la TE con la
mutación JAK2V617F en estado de homocigosis, frente a los casos heterocigotas o los
carentes de la mutación [45-46]. No obstante, publicaciones posteriores presentan resultados
V. DISCUSIÓN
120
discordantes [44,140]. En nuestra serie, no detectamos diferencia en la frecuencia de eventos
trombóticos entre las NMP JAK2V617F-pos y JAK2V617F-neg. Tampoco observamos
diferencia entre los pacientes TE JAK2V617F-pos y JAK2V617F-neg ni entre los casos de
TE JAK2V617F-pos y PV. Estudios recientemente publicados establecen la comparación en
función de la carga alélica de JAK2V617F. En nuestra serie, analizamos la relación entre la
carga alélica JAK2V617F y la frecuencia de eventos trombóticos en dos grupos de
pacientes: 1) pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada al
diagnóstico y 2) pacientes con la primera determinación de JAK2V617F realizada tanto al
diagnóstico como durante el seguimiento. En ambos grupos observamos tendencia de
presentar mayor frecuencia de eventos trombóticos con mayor carga mutacional
JAK2V617F, sin alcanzar la diferencia estadísticamente significativa (p=0,051). El diseño
de nuestro estudio no permite sacar conclusiones firmes acerca de relación entre trombosis y
la mutación JAK2V617F. Sin embargo, tampoco se puede descartar posibilidad de
asociación entre la carga alélica JAK2V617F y eventos trombóticos. En la literatura
publicada hasta la fecha, dos series de pacientes con TE, muestran que tanto la presencia de
la mutación JAK2V617F como su carga alélica se asocian con mayor riesgo trombóticos
[133,137,140]. En cuanto a la PV, aunque no existe evidencia de diferencia entre pacientes
homocigotos y heterocigotos, el riesgo trombótico aumenta significativamente cuando se
analiza respecto a la carga alélica: mayor cuando ésta es superior al 75-80% al diagnóstico
[137], aunque el grupo de Tefferi no corrobora estos resultados [138].
Resumiendo, de acuerdo con nuestros resultados y con los estudios previos, podemos
sugerir la posibilidad de que la carga alélica JAK2V617F tenga algún papel en el desarrollo
de los eventos trombóticos. Sin embargo, para confirmar estos resultados se precisa de
nuevos estudios prospectivos en un amplio grupo de pacientes.
V. DISCUSIÓN
121
8.3. Progresión a MFsec o LMA
Nuestro grupo a estudio (PV y TE) experimentó progresión a MFsec en el 8% de los casos
(7% en PV y 11% en TE) con una media de tiempo de evolución de la enfermedad de 9
años. Nuestros resultados son concordantes con estudios previos [18-19,35,139].
Acerca de la relación entre la mutación JAK2 y el riesgo de progresión a MFsec no hay
resultados concluyentes. En nuestra serie, la mayoría de las MFsec (73%) fueron precedidos
de una NMP (TE o PV) JAK2V617F-pos, pero no hemos alcanzado una diferencia
estadísticamente significativa en el riesgo de transformación en función del estatus de
JAK2V617F. Algunas publicaciones no encuentran relación entre el estatus de JAK2V617F
y la progresión a MFsec [32,43-44]. Sin embargo, otros estudios sugieren la existencia de
esta relación, sobre todo en pacientes con la mutación JAK2V617F en estado de
homocigosis [5,45-46] y en la PV la asociación se ha descrito con la carga alélica más alta
[204]. Un modelo animal, apoya el papel de la mutación JAK2V617F como un factor de
riesgo de desarrollo de MFsec en la PV [84-86]. La evolución de la carga alélica
JAK2V617F en este grupo de pacientes ya se ha comentado previamente en el apartado 4 de
la Discusión.
Respecto a la progresión a LMA, en nuestro grupo ocurrió en el 2% de casos (n=4) con la
media de tiempo desde el diagnóstico de 7 años, resultados que coinciden con los datos
previamente publicados [18-19,35-36,139]. Curiosamente, todos los pacientes fueron JAK2-
pos (2TE, 1 PV y 1 MFP), aunque dado el bajo número de casos analizados y diseño
retrospectivo de nuestro estudio no pudimos analizar ese aspecto. En la literatura los
resultados acerca de progresión a LMA son escasos y no concluyentes [5,43-44,143,188].
Gangat et al, en un estudio retrospectivos realizado en 605 TE, observó que la progresión a
LMA aparece tanto en casos JAK2-pos como JAK2-neg, sin poder encontrar diferencias
V. DISCUSIÓN
122
entre ambos grupos [189]. En un estudio realizado en 174 MFP observaron que la presencia
de mutación JAK2 predice un curso más agresivo con esplenomegalia gigante, necesidad de
esplenectomía y progresión a LMA [40]. En cambio Tefferi et al, no encontraron un valor
predictivo del estado JAK2 para progresión a LMA, pero entre los JAK2-pos la evolución a
LMA fue más frecuente en el grupo con baja carga alélica [41]. En conclusión parece que el
aumento de la carga alélica en la NMP JAK2-pos puede asociarse a evolución a MFsec,
pero el estatus JAK2 no es el predictor de la evolución. El significado clínico del estatus
JAK2 en la evolución a LMA precisa de más estudios, dada la rareza de esta evolución sólo
analizando grandes registros podría sacarse conclusiones válidas.
123
VI. CONCLUSIONES
VI. CONCLUSIONES
124
1. Hay muy buena concordancia entre los criterios WHO 2001 y WHO 2008 para la PV y
solamente intermedia para la TE. Los criterios WHO 2008 diagnostican más casos de
TE en fase temprana, gracias al estudio mutacional y al bajar la cifra de plaquetas.
2. La incorporación del estudio mutacional, sobre todo de la mutación JAK2V617F, en
los criterios WHO 2008 ha simplificado el diagnóstico de la PV y la TE.
3. Es posible realizar el diagnóstico de una TE en ausencia de la mutación JAK2V617F,
mientras que en nuestra serie no se detectó ningún caso de PV JAK2V617F-neg.
4. El estudio medular aporta información diagnóstica en la PV. Sin embargo, su
realización se considera necesaria solamente en caso de poliglobulia (en ausencia de
causas secundarias) y ausencia de la mutación JAK2V617F y JAK2-exón 12. Ante
sospecha de PV y presencia de la mutación JAK2V617F, dicho estudio no es
imprescindible.
5. La mutación JAK2V617F no es específica de ninguna NMP y su presencia o ausencia
debe ser interpretada junto a la clínica, hematimetría y hallazgos morfológicos de la
MO y la SP.
6. La ausencia de criterios diagnósticos morfológicos no debería excluir el diagnóstico de
TE en las trombocitosis JAK2V617F-pos.
7. La presencia de la mutación JAK2V617F se asocia con determinadas características
hematológicas y clínicas. En la TE le confiere un fenotipo “eritrocitósico” con aspectos
comunes con la PV. Sin embargo el estatus de la mutación JAK2V617F en las NMP no
permite por sí solo definir una entidad clínico-biológica o morfológica.
VI. CONCLUSIONES
125
8. Cambios en la distribución de las subpoblaciones linfocitarias, observadas en nuestra
serie, son independientes del estatus JAK2V617F y en este momento se desconoce su
significado.
9. La carga alélica JAK2 es muy variable en función del fenotipo hematológico y clínico,
pero también dentro de un mismo diagnóstico hay una gran variación interindividual.
En nuestra experiencia ante una aparente TE con la carga alélica JAK2V617F mayor de
45-50%, deberíamos sospechar una PV enmascarada.
10. Las cargas alélicas altas se asocian a valores más altos de hemoglobina y menores de
plaquetas. La carga alélica alta también se asocia a leucocitosis, esplenomegalia, prurito
y posiblemente a trombosis.
11. En nuestra experiencia, el aumento de la carga alélica con el tiempo de la evolución
puede asociarse a la progresión de la NMP. Creemos que el seguimiento de la carga
alélica JAK2V617F estaría justificado en estos casos para valorar mejor la aparición de
cambios hematimétricos o de necesidades terapéuticas.
12. La carga alélica JAK2V617F puede descender asociada al tratamiento con HDU, sobre
todo en fases iniciales del tratamiento. El descenso es discreto y probablemente sin
significado clínico. En este momento no creemos necesario la realización de
determinaciones seriadas de la carga alélica JAK2V617F en los pacientes tratados con
HDU fuera de ensayos clínicos, salvo en las circunstancias descritas en el párrafo
anterior.
13. En el estudio de la poliglobulia JAK2V617F-neg, la ausencia de la mutación en el gen
JAK2-exón 12 ayuda para descartar el diagnóstico de PV.
VI. CONCLUSIONES
126
14. En el estudio de una trombocitosis JAK2V617F-neg, la mutación MPL a pesar de su
baja frecuencia, fue útil en establecer el diagnóstico de TE o MFP.
127
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