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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA-UVG
INFORME FINAL
Estudio del ciclo de transmisión de Trypanosoma cruzi entre Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata mediante
la tipificación genética de este parásito
PROYECTO FODECYT No. 085-2006
Laura María Grajeda Díaz Investigador Principal
GUATEMALA, ENERO 2009.
Agradecimientos:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-.
INDICE
Lista de cuadros
Lista de figuras
Resumen i
Abstract ii
I.1 Introducción 1
I.2 Planteamiento del Problema 3
I.2.1 Antecedentes 3
I.2.2 Justificación 5
I.3 Objetivos e hipótesis 6
I.3.1 Objetivos 6
I.4 Metodología 8
I.4.1 Variables 8
I.4.2 Indicadores 8
I.4.3 Estrategia metodológica 9
I.4.4 Método 9
I.4.5 Técnica estadística 12
I.4.6 Instrumentos a utilizar 13
II.1 Marco teórico 14
II.4.1 Enfermedad de Chagas 14
II.4.2 Vectores 14
II.4.3 Trypanosoma cruzi 15
II.4.4 Trypanosoma rangeli 17
II.4.5 Análisis de minicírculo 17
II.4.6 Diversidad genética de T. cruzi 18
II.4.7 Trabajos realizados en Guatemala 24
III.1 Resultados y discusión 26
III.1.1 Análisis de minicírculo para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa 26
III.1.2 Análisis de miniexón para muestras (n=160) de Chiquimula, Jalapa
y Zacapa
29
III.1.3 Análisis de microsatélites para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa 33
IV.1 Conclusiones 42
IV.2 Recomendaciones 43
IV.3 Referencias bibliográficas 44
IV.4 Anexos 50
IV.4.1 Diagrama de flujo de estrategia metodológica 50
IV.4.2 Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de
triatominos recolectadas en Chiquimula
51
IV.4.3 Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de
triatominos recolectas en Jalapa y Zacapa
66
Lista de figuras
Página
1. Detección de T.cruzi y T. rangeli en heces de vectores 3
2. Electroferograma que muestra los alelos del microsatélite MS5. 13
3. Tiempos estimados de divergencia para los riboclados de Trypanosoma cruzi
y su correlación con grupos definidos mediante otros métodos.
20
4. Esquema de la estrategia de amplificación del gen miniexón y localización
de sondas específicas para determinar el grupo al que pertenece
23
5. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa
y Zacapa mediante el ensayo de minicírculo
27
6. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa
y Zacapa mediante el ensayo de miniexón
28
7. Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de
heces de triatominos colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula
31
8. Electroferograma que muestra tetrámeros o dímeros de cebadores en la
región menor a 100 pares de bases.
33
9. Electroferograma que muestra la señal debida a ruido, menor a 50 unidades
de fluorescencia y tres picos verdaderos.
34
10. Electroferograma que muestra un microsatélite con un múltiplo de repetición
de 3 bases.
34
11. Electroferograma que muestra artefactos de la amplificación que no son
picos verdaderos.
35
12. Distribución de alelos para el locus MS3 37
13. Distribución de alelos para el locus MS5 38
14. Árbol filogenético que relaciona aislados de T. cruzi de heces de R. prolixus
y T. dimidiata. Outgroup PR6456. 1000 reiteraciones.
40
Lista de cuadros
Página
1. Diferenciación genética y genotípica de cepas de T. cruzi 4
2. Clasificación sistemática de T. cruzi según The Taxomicon & Sistema
Naturae, 2000
16
3. Diferencias entre el género Rhdonius y Triatoma 21
4. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa
y Zacapa mediante el ensayo del minicírculo
26
5. Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores de Jalapa/Zacapa y
Chiquimula
28
6 Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de
heces de triatominos colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula
31
7. Distribución de TCI y TCI/TCII en T. dimidiata y R. prolixus (Fisher exacto) 32
8. Frecuencia de alelos que no se consideraron picos verdaderos 35
9. Diferencia estadística entre la frecuencia de alelos no verdaderos entre los
vectores
36
10. Diferenciación génica y genotípica (Fisher exacto) de la distribución de
alelos según locus
38
11. Diferenciación génica y genotípica (Chi2) evaluando ambos loci 38
Resumen
La enfermedad de Chagas es causada por Trypanosoma cruzi. En Guatemala, este
parásito es transmitido por las heces de Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata. Se ha
observado que los vectores tienen diferentes hábitats, nichos ecológicos, focos y
reservorios siendo R. prolixus arborícola y T. dimidiata terrestre. En Sur América se
identificaron dos grandes linajes de T. cruzi asociados a los ciclos de transmisión arbóreo
y terrestre. En Guatemala, estudios preliminares (n = 28) mostraron que posiblemente hay
diferencia génica (p = 0.00000) y genotípica (p = 0.00355) entre las cepas de T. cruzi que
están infectando las heces de cada vector. Estos estudios sugieren la existencia de
coespeciación vector-parásito. Este proyecto tiene el objetivo de profundizar en el estudio
del ciclo de transmisión mediante la tipificación genética del parásito usando los
marcadores moleculares de minicírculo, miniexón y microsatélites y además estudiar su
asociación con diferentes vectores. Con el marcador de Miniexón se encontró que a nivel
de linajes, no hay diferencia significativa entre los aislados de cada vector. Sin embargo,
con los microsatélites que tienen una tasa de mutación más alta se encontró una
diferencia génica (p = 0.00000) y genotípica (p=0.00551) significativa. Estos resultados
dan evidencia que los ciclos de transmisión son diferentes y de la necesidad de analizar
con más detalle el comportamiento ecológico de los linajes en Guatemala. Se
recomienda aumentar el número de muestras de triatominos así como estudiar aislados de
reservorios o casos humanos.
ABSTRACT Chagas is a disease caused by Trypanosoma cruzi. In Guatemala this parasite is
transmitted by the feaces of the triatomines vectors Rhodnius prolixus y T. dimidiata. It
has been observed that these vectors have different habitats, ecological niches, focus and
reservoirs being R. prolixus arboreal and T. dimidiata terrestrial. In South America were
identified two major lineages of T. cruzi associated to the arboreal or terrestrial
transmission cycle. In Guatemala, preliminary studies (n = 28) showed a possible genic
(p = 0.00000) and genotypic (0.00355) differences between the strains of T. cruzi
infecting the feaces of each vector. These studies suggest the existence of coespiciation
vector-parasite. This Project has the objective of getting a deeper understanding about the
transmission cycle, using a genetic typification of the parasite based on molecular
markers such as minicírculo, miniexon and microsatellites, also study their association
with each vector. With the miniexon marker it was find no significant difference
between the isolates from each vector. Nevertheless, with the microsatellites, which have
a higher mutation rate, it was find a genic (p = 0.00000) and genotypic (p = 0.00551)
differences statistically significant. These results give evidence that the transmission
cycles are different and that there is a necessity of analyze the ecological behavior of the
lineages in Guatemala. Furthermore, we recommend increasing the number of triatomine
samples, study isolates from reservoirs and include human cases.
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
Entre el género de los Trypanosomas se encuentra la especie T. cruzi y la T.
rangeli, el primero es el causante de la enfermedad de Chagas, la cual afecta a 18
millones de personas en Latinoamérica (WHO, 1991), mientras que el segundo es un
parásito entomopatógeno no patogénico para humanos. Ambos parásitos son transmitidos
por insectos de la familia Reduviidae.
En Guatemala destacan como principales vectores Rhodnius prolixus y Triatoma
dimidiata. R. prolixus es considerada una especie doméstica en Guatemala, ya que no se
han identificado focos silvestres. Su nicho silvestre es arborícola y los principales
reservorios asociados a este nicho son marsupiales. En cambio, T. dimidiata se encuentra
en hábitats domésticos y silvestres, siendo considerado un vector cavernícola asociado
posiblemente a roedores (Nakagawa et al, 1999). Estas diferencias ecológicas sugieren
una evolución independiente y separada en los dos vectores.
Se ha descrito una amplia variabilidad genética en T. cruzi, por ejemplo, en base a
comportamiento biológico la especie se ha subdividido en biodemos; mientras que por
análisis bioquímicos se habla de zimodemos. Así mismo, estudios realizados
principalmente en Sur América mediante métodos moleculares basados en el gen del
miniexón, han diferenciado dos grandes linajes de T. cruzi. Estos linajes se han asociado
a diferentes ciclos de transmisión: el TCI se ha encontrado asociado a marsupiales y a
ecótopos domésticos en toda América mientras el TCII se encuentra asociado a mapaches
en Norte América y a armadillos en Sur América y a ecótopos domésticos principalmente
en Sur América. Gaunt y Miles propusieron en el 2000 una asociación entre Rhodnius
spp. Y TCI y T. rangeli y entre miembros de la tribu Triatomini y TCII.
La diferencia entre la ecología de los triatominos, la extensa variabilidad genética
de T. cruzi y las asociaciones estudiadas por Gaunt y Miles permiten sugerir la existencia
2
de coespeciación vector-parásito que puede ser aplicada a Guatemala. Esta información
es relevante a nivel clínico porque la mayor parte de la evidencia relaciona a los
hospederos humanos con TCII y a su vez con la tribu Triatominii. Además, las estrategias
de control y prevención deben ser estratificadas y enfocadas considerando esta
información.
En el marco de la competencia vectorial, en Sur América, se ha propuesto que R.
prolixus es un mejor vector para la enfermedad de Chagas, esto se ha dicho basándose en
patrones biológicos de alimentación, defecación y comportamiento. No obstante, por
métodos moleculares se ha observado que R. prolixus esta frecuentemente infectado por
T. rangeli en lugar de con T. cruzi. En el microscopio es fácil confundir entre ambos
tripanosomas ya que la morfología es similar, produciendo en algunos casos falsos
positivos. Por esas razones, es necesario prestar atención a T. dimidiata pues se encuentra
más asociado a los reservorios y a humanos. Además el control mediante la aplicación de
insecticida residual a probado ser inefectiva ya que por habitar en el área peridoméstica
ocurre reinfestación.
Para este estudio se propuso utilizar marcadores moleculares basado en miniexón
y microsatélites para estudiar la diversidad genética de T. cruzi en los principales
vectores: R. prolixus y T. dimidiata. Debido a la potencial infección de R. prolixus con
T. rangeli, se utilizaron métodos moleculares para verificar la especie del parásito
flagelado observado en el vector. Esta información permitirá determinar si hay diferencia
en los ciclos de transmisión asociados a estos vectores.
3
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes
En algunos países se ha propuesto que R. prolixus es un mejor vector para la
enfermedad de Chagas, en Guatemala es necesario prestar atención a T. dimidiata
pues se encuentra más asociado a los reservorios y R. prolixus esta
frecuentemente infectado por T. rangeli. Así pues, la ampliación de este estudio
es de suma importancia para entender con más detalle el ciclo de transmisión y
que esto ayude en los programas de control.
En un estudio anterior se estudiaron 103 muestras de Chiquimula de ADN
extraídas de heces de los vectores, 31 de T. dimidiata y 72 de R. prolixus. En el
análisis de minicírculo, en todas las muestras provenientes de T. dimidiata se
detectó T. cruzi. Por el contrario, en R. prolixus sólo se detectó T. cruzi 5
muestras, mientras que 59 resultaron T. rangeli, hacer referencia a figura 1. Sin
embargo, existe la posibilidad de que haya una infección mixta en donde la alta
concentración de T. rangeli no permita la detección de T. cruzi. Aún así se
sugirió, que en Guatemala R. prolixus se encuentra más frecuentemente infectado
que con T. rangeli que con T. cruzi.
Figura 1: Detección de T.cruzi y T. rangeli en heces de vectores
5
31
59 0
8
0
01020304050607080
R.prolixus T. dimidiata
Vectores
Mue
stra
s no amplificóT. rangeliT. cruzi
4
El estudio continuó con el análisis con microsatélites desarrollados por
Rivera 2001, se tamizaron las 103 muestras de heces además de 9 de los
reservorios. Los resultados obtenidos en Genepop muestran que en base a MS3 y
MS5 hay diferencia genética (p = 0.00000) y genotípica (p = 0.00355) en las
cepas transmitidas por cada vector. Así mismo se encontró diferencia genética (p
= 0.00101) entre las cepas detectadas en R. prolixus y reservorios, hacer
referencia a cuadro 1. Los datos encontrados son determinantes porque indican
que el ciclo de transmisión en cada vector es diferente y que por lo tanto las
características del ciclo también lo podrían ser. Además el vector que más se
relaciona con las cepas encontradas en los reservorios es T. dimidiata. De modo
que los resultados resaltan la importancia de diseñar programas de control que
tomen en cuenta la diferencia en los ciclos de transmisión y que los focos
silvestres de T. dimidiata que pueden volver a reinfestar ciclos domésticos.
Cuadro 1: Diferenciación genética y genotípica de cepas de T. cruzi.
No obstante en el locus MS3 únicamente amplificaron 22 muestras de T.
dimidiata, 6 muestras de R. prolixus y 7 de reservorios; y en MS5 fueron 16
muestras de T. dimidiata, 8 de R. prolixus y 3 de reservorios. Como se dijo
anteriormente, la mayor parte de las muestras de R. prolixus estaban infectadas
con T. rangeli. Además, fue necesario optimizar un PCR anidado puesto que las
heces poseen inhibidores que no permiten la amplificación. También existen los
casos de alelos nulos porque algunas muestras solo amplificaron con un locus.
5
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
El ciclo de transmisión de T. cruzi es muy complejo, aún no esta bien
entendido ni se conoce con profundidad. El ciclo vectorial abarca R. prolixus y T.
dimidita, estudios en Sur América indican que sus reservorios y hábitats son
diferentes. Por otro lado, se han diferenciado dos grandes linajes de T. cruzi, los
cuales se han asociado a diferentes ciclos de transmisión: por un lado se encuentra
Rhodnius spp. infectado con TCI y T.rangeli y por el otro están los miembros de
la tribu Triatomini y TCII. Esto permite sugerir la existencia de coevolución
vector-parásito. Mediante moléculas antigénicas de superficie de tripomástigotes
se puede diferenciar infecciones por TCI y TCII. El resultado de estos análisis
realizados en muestras de pacientes de Argentina indica que las infecciones en
humanos están fuertemente asociadas con TCII.
Si se detecta diferencia significativa entre las cepas de T. cruzi que son
transmitidas por T. dimidiata de las que son transmitidas por R. prolixus se dirá
que los ciclos de transmisión en los vectores son diferentes. Esta información es
de gran utilidad para el control y prevención de la enfermedad puesto que cada
ciclo requerirá diferentes estrategias para su control y prevención. Un ejemplo es
que lo insecticidas residuales resultan eficientes con R. prolixus pero no en T.
dimidiata ya que esta última es capaz de reinfestar. De modo que el conocimiento
de los ciclos de transmisión ayudarán a predecir el rol que jugará T. dimidiata
cuando R. prolixus sea eliminado.
En Sur América, se ha propuesto que R. prolixus es un mejor vector para
la enfermedad de Chagas, esto se ha dicho basándose en patrones biológicos. No
obstante, en Guatemala es necesario prestar atención a T. dimidiata pues se
encuentra más asociado a los reservorios y R. prolixus esta frecuentemente
infectado por T. rangeli. Así pues, este estudio es de suma importancia para
entender con más detalle el ciclo de transmisión y que esto ayude en los
programas de control.
6
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
• Determinar si existen diferencias en los ciclos de transmisión de
Trypanosoma cruzi entre Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata
mediante la tipificación genética de los parásitos encontrados en estos
vectores.
I.3.1.2 Específicos
• Utilizar un marcador molecular basado en la secuencia del minicírculo
para diferenciar la infección de Trypanosoma cruzi y Trypanosoma
rangeli en contenidos fecales de Triatoma dimidiata o Rhodnius prolixus.
• Utilizar un marcador molecular basado en la secuencia del mini-exón para
diferenciar la infección con Trypanosoma cruzi I o Trypanosoma cruzi II
en contenidos fecales en Rhodnius prolixus o Triatoma dimidiata.
• Determinar si existe diferencia significativa entre la frecuencia alélica de
Trypanosoma cruzi en contenidos fecales de Triatoma dimidiata o
Rhodnius prolixus simpátricos, mediante el análisis de dos microsatélites.
7
I.3.1.3 Hipótesis
• Existe diferencia entre el linaje de Trypanosoma cruzi encontrado en el
ADN extraído de heces de Rhodnius prolixus y Triatoma dimidiata.
Ho: Los linajes de Trypanosoma cruzi encontrados en Rhodnius prolixus y
Triatoma dimidiata son iguales.
Ha: Los linajes de Trypanosoma cruzi encontrados en Rhodnius prolixus y
Triatoma dimidiata no son iguales.
• Existe diferencia genética entre las cepas de Trypanosoma cruzi
transmitidas por Triatoma dimidiata y Rhodnius prolixus en condiciones
simpátricas.
Ho: Las cepas de Trypanosoma cruzi en contenidos fecales de Triatoma
dimidiata y Rhodnius prolixus simpátricos son genéticamente iguales.
Ha: Las cepas de Trypanosoma cruzi en contenidos fecales de Triatoma
dimidiata y Rhodnius prolixus simpátricos no son genéticamente iguales.
8
I.4 METODOLOGIA
Localización: Este estudio se realizó con muestras de triatominos obtenidas en la
encuesta entomológica basal casa por casa (2002) el en los departamentos de Chiquimula
municipios: Chiquimula (latitud 14°48’0N, longitud 89°32’60W, altitud 419m), Olopa
(14°40’60N, 89°20’60W, 1243m), Camotán (14°49’0N, 89°22’0W, 576m), Jocotán
(14°49’0N, 89°22’60W, 480m), San Juan Ermita (14°46’0N, 89°25’60W, 601m),
Quezaltepeque (14°37’60N, 89°27’0W, 684m), Concepción las Minas (14°31’0N,
89°27’0W, 802m) y Esquipulas (14°34’0N, 89°20’60W, 765m); Jalapa: San Pedro
Pinula (14°40’0N, 89°50’60W, 1044m), Monjas (14°30’0N, 89°52’0W, 955m),
Mataquescuintla (14°31’45N, 90°11’3W, 1727m); Zacapa: la Unión (14°58’0N,
89°16’60W, 1228m), Zacapa (14°58’45N, 89°31’20W, 185m), Usumatlán (14°56’60N,
89°46’60W, 246m) y Río Hondo (15°4’0N, 89°34’60W, 379m).
I.4.1 Las Variables
1.4.1.1 Variables dependientes
La variable dependiente de este estudio es el perfil genético que se
encuentre en las cepas de T. cruzi aisladas de los vectores. Específicamente, el
perfil genético se refiere al linaje y a la distribución de alelos de microsatélites.
1.4.1.2 Variables Independientes
Las variables independientes son los vectores de la enfermedad de Chagas
en Guatemala, R. prolixus y T. dimidita. A partir de las heces se aisló ADN de T.
cruzi, con el fin de analizarlo genéticamente.
I.4.2 Indicadores
Los indicadores de este proyecto para el análisis de minicírculo y de
miniexón es el tamaño de los fragmento de ADN amplificados mediante PCR. El
Tamaño de la banda indica si una muestra de heces de vectores es positiva para T.
9
cruzi (330 pb) o para T. rangeli (450 pb) en el ensayo del minicírculo. Por su
parte, en el ensayo de miniexón, las bandas de 250, 200, 150, 100 pares de bases
corresponden a la presencia de T. cruzi I, T. cruzi II, zimodemo 3 y T. rangeli
respectivamente.
El indicador para el análisis de microsatélites es la distribución del
tamaño de los alelos de T. cruzi que se encuentre en las heces de cada vector. En
este caso el tamaño de los alelos se determinó mediante electroforesis capilar.
I.4.3 Estrategia Metodológica
I.4.3.1 Población y Muestra
Se recolectaron chinches del departamento de Chiquimula (103 muestras):
municipios de Chiquimula, Olopa, Camotán, Jocotán, San Juan Ermita,
Quezaltepeque, Concepción las Minas y Esquipulas; Jalapa (16 muestras): San
Pedro Pinula, Monjas, Mataquescuintla; Zacapa (41): La Unión, Zacapa,
Usumatlán, Río Hondo. Los especimenes del campo fueron disectados en el
laboratorio y las heces se recolectaron por punción rectal en tubos Eppendorf
1.5mL. Estas se preservaron dejándolas secar bajo campana.
I.4.4 El Método
1. Extracción de ADN:
Se extrajo el ADN de las heces preservadas en seco de Jalapa y
Zacapa con el Kit de Isoquick, Orca Research Inc, siguiendo las instrucciones del
manufacturador y la modificación de acuerdo a Schwartz et al 1997. El ADN de
las muestras provenientes de Chiquimula fue previamente extraído.
10
2. Análisis del minicírculo para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa:
a. PCR y tamizaje: El locus del ADN del minicírculo se amplificó usando el
cebador degenerado S35: 5´AAA TAA TGT ACG GGK GAG ATG CAT GA 3´
y el cebador S36: 5´GGG TTC GAT TGG GGT TGG TGT 3´(Avila et al 1990).
La reacción se realizó a un volumen final de 25uL con: buffer Taq 1x; 1mM
MgCl2 (cf: 1.5mM buffer Taq + 1mM extra = 2mM total); 0.025mM dNTP´s c/u;
0.4 uM cada cebador; 0.4U/uL Taq ADN polimerasa y 1uL de templado. El
programa (Icycler, Biorad, Hércules CA) consiste en desnaturalización inicial de
94°C por 5 minutos seguido de 30 ciclos de: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a
64°C y 50 segundos a 72°C. Luego una extensión final de 7 minutos a 72°C.
Los amplicones se analizaron con un gel de agarosa 2% por 30 minutos y tinción
con bromuro de etidio. Los productos esperados son de 330 y 450 pares de bases
característico de T. cruzi y T. rangeli respectivamente (Vallejo et al 1999).
3. Análisis del miniexón para muestras (n=160) de Chiquimula, Jalapa y
Zacapa:
a. La amplificación se realizó utilizando un volumen final de 20 µL con 1
µL de ADN; 0.20 µM de cada cebador KMe1F (TTC TGT ACT ATA TTG GTA)
y KMe1R (CAA TAT AGT ACA GAA ACT G)(Sturn et al 1989); mix de dNTPs
0.15mM c/u; 1.5mM de MgCl2(CLP), 0.04U/µL de Taq Polimerasa (CLP) en
Buffer de Amonio 1X (CLP). Se agregó 2 gotas de aceite mineral a cada tubo, con
una pipeta de 1000 µl. El programa de amplificación (Icycler Biorad, Hercules,
CA). consistió en desnaturalización inicial a 94º C por 5 min., seguido de 30
ciclos de: desnaturalización 30 seg a 94º C, hibridación 30 seg a 48º C,
extensión 30 seg a 72º C. Por último una extensión final de 10 min a 72º C.
11
b. Reacción interna múltiplex. La reacción interna se preparó con: 1 µL de
ADN de la reacción externa , cebadores TC1F(ACA CTT TCT GTG GCG CTG
ATC G), TC3F(CCG CGA ACA ACC CCT AAT AAA AAT G), TRF(CCT ATT
GTG ATC CCC ATC TTC G), MER (TAC CAA TAT AGT ACA GAA ACT G)
(Fernandes et al 2001) todos 0.15 µM; mix de dNTPs 0.15mM c/u; 1.5mM de
MgCl2(CLP, San Diego, CA); 0.04U/µL de Taq Polimerasa (CLP, San Diego,
CA) en Buffer de Amonio 1x (CLP, San Diego, CA). El programa de
amplificación (Icycler Biorad, Hercules, CA) consistió en desnaturalización
inicial a 94º C por 5 min., seguido de 30 ciclos de: desnaturalización 30 seg a
94º C, hibridación 30 seg a 55º C, extensión 30 seg. a 72º C. Por último una
extensión final de 10 min a 72º C. Los productos de amplificación son de
200pb para T. cruzi I, 150pb para T. cruzi Zimodemo 3 y 100 pb para T. rangeli.
c. Reacción interna para T. cruzi II. Se utilizó el producto de la reacción
externa del PCR anidado anterior para realizar el PCR interno. La reacción
interna se preparó usando: 1 µL de ADN, cebadores TC2F(TTG CTC GCA CAC
TCG GCT GCA T) y MER a 0.15 µM c/u; dNTPs 0.15mM c/u; 1.5mM de
MgCl2(CLP); 0.04U/µL de Taq Polimerasa (CLP, San Diego, CA) en Buffer de
Amonio 1x (CLP, San Diego, CA). El programa de amplificación (Icycler
Biorad, Hercules, CA) consistió en desnaturalización inicial a 94º C por 5 min.,
seguido de 30 ciclos de: desnaturalización 30 seg a 94º C , hibridación 30 seg a
55º C, extensión 30 seg a 72º C. Por último una extensión final de 10 min a 72º
C. El producto de amplificación es de 250 pb.
4. Análisis de microsatélites para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa:
a. Cada microsatélite se amplificó por separado en un PCR anidado (MS5) y
semianidado (MS3) de un solo tubo, es decir sobre el producto de la primera
reacción, se agrega el segundo master mix. La reacción se realizó a un volumen
total de 40uL, 20uL para cada etapa. Las concentraciones finales (c.f.) de ambas
12
reacciones son las siguientes: buffer 1X, 1.5mM MgCl2, 0.15mM dNTP´s,
0.20uM cada primer externo y 0.125uM (sobre el volumen total) para cada
interno. 0.04U/uL Taq ADN polimerasa únicamente en la primera reacción y 1uL
de templado. El programa consistió en: desnaturalización inicial 5 min a 94°C;
25 ciclos de: 30 s a 94°C, 30 s a 58°C y 30 s a 72°C; extensión final de 45 s a
72°C. Se tamizó mediante una electroforesis nativa en geles de poliacrilamida
29:1 al 10% y el revelado se hizo con tinción plata siguiendo el protocolo de
Castillo 2002 (información no publicada).
b. Análisis de Fragmentos por electroforesis capilar: se realizó en la
Universidad de Arizona con el equipo ABI 3100 de Applied Biosystems. Los
electroferogramas se analizaron con el programa Peak Scanner v 1.0 (Applied
Biosystems). Con este programa se obtuvo el tamaño de los picos en pares de
bases su intensidad y área. El método utilizado consiste en incluir en cada
muestra una escalera estándar de pares de bases, en este caso fue Rox, a la cual se
le aplica el método “Local Southern” para obtener la mejor línea recta y de ahí se
extrapola para aproximar el tamaño del fragmento. En la figura 2 se muestra un
ejemplo de un electroferograma.
I.4.5 La Técnica Estadística
Se realizó una prueba exacta de Fisher (Fisher’s exact test)
comparando los linajes de T. cruzi encontrados en las heces de los vectores R.
prolixus y T. dimidiata. También se compararon los linajes encontrados en T.
dimidiata en cultivos y heces. Las diferencias fueron consideradas
estadísticamente significativas con p≤0.05.
Los picos obtenidos para cada muestra poseen un tamaño en pares
de bases cuantificado como números reales. Para hacer la aproximación al
número discreto correspondiente se usó el programa Allelogram desarrollado por
Idury y Cardon en 1997 que se basa en una aproximación por mínimos cuadrados.
13
Una vez obtenidos los picos verdaderos se obtuvieron distribuciones de
frecuencias para muestras de Triatoma dimidiata y Rhodnius prolixus por
separado. Se compararon las frecuencias mediante el análisis genético y
genotípico con el programa GenePop proporcionado por la Escuela de Ciencias
Biomédicas, Universidad de Tecnología Curtin, Australia y disponible en línea en
http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/.
Figura 2: Electroferograma que muestra los alelos del microsatélite MS5. Este
microsatélite es un trinucleótido amplificado mediante una estrategia anidada. El
eje “y” muestra la intensidad de fluorescencia (unidades arbitrarias) y el eje “x” es
el tamaño del fragmento en pares de bases.
I.4.6 Los Instrumentos a utilizar
En este estudio se utilizó el termiciclador Apolo 201 de la casa
comercial CLP y el iClycler de BIORAD para la amplificación del minicírculo, el
gen del miniexón y los microsatélites. Así mismo se utilizó equipo de
elctroforesis horizontal para los geles de agarosa y vertical para los geles de
poliacrilamida. La electroforesis capilar se llevó a cabo en un Genetic Analyser
de Applied Biosytems en la Universidad de Arizona.
14
PARTE II MARCO TEÓRICO
1. Enfermedad de Chagas
La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es una zoonosis producida
por el protozoario flagelado Trypanosoma cruzi. Es una enfermedad crónica debilitante
que afecta la salud, el bienestar y la productividad de un gran número de seres humanos y
representa un problema de salud pública en América Latina. Se estima que en
Latinoamérica 16 a 18 millones de personas son infectadas por la enfermedad de Chagas
y de los infectados, 50,000 morirán cada año (CDC, 2003). En la República de
Guatemala se estima que 730,000 personas están infectadas y la incidencia anual
estimada es de 30,000 casos (OPS, 2000).
2. Vectores
La infección se propaga a los seres humanos de varias maneras: la principal es
vectorial y ocurre después de la picadura una “chinche picuda” que deposita heces en la
piel de la persona y cuando esta se frota introduce los parásitos en la herida, o bien puede
infectarse cuando las heces están en contacto con un corte abierto, ojos o boca (CDC,
2003). Los vectores de la enfermedad de Chagas que se consideran en Guatemala de
importancia epidemiológica son: Rhodnius prolixus (Stal, 1859) Triatoma dimidiata
(Latreille, 1811), son insectos hematófagos del orden Hemiptera, familia Reduviidae y
subfamilia Triatominae.
En Centroamérica R. prolixus es estrictamente domiciliar y sus poblaciones son
genéticamente muy restringidas inhábiles de colonizar diferentes hábitats (Schofield y
Dujardin, 1997). Se asocia principalmente con viviendas construidas con material
vegetal, frecuentemente es encontrado en la cara interna de los techos y paredes palma,
donde son muy activos y están protegidos de los factores climáticos (Tabaru et al, 1999).
T. dimidiata, por su lado, se encuentra en casas de adobe y bajareque y se desarrolla en el
área domiciliar, peridomocialiar y selvática (Zeledón 1981). Los vectores no son
comunes en casa de blocks de concreto (Tabaru et al, 1999). La estricta condición
15
intradomiciliar de R. prolixus los hace susceptibles a los insecticidas de acción residual y
a los cambios socioeconómicos de modo que permite tener un mejor control vectorial, a
diferencia de T. dimidiata que vive en las profundidades de las grietas.
Se ha sugerido que los vectores pueden diferir en su habilidad de transmitir T. cruzi,
ya que se han encontrado diferentes frecuencias de infecciones en humanos dependiendo
del vector con el que están relacionados. En el departamento de Zacapa donde R. prolixus
es el principal vector la seroprevalencia fue de 38.8% mientras que en Santa Rosa donde
habita T. dimidiata se encontró 8.9% (Paz-Bailey et al, 2002). Estos datos proponen a R.
prolixus como principal vector de la enfermedad de Chagas en Guatemala. Se ha
reportado que R. prolixus esta más frecuentemente infectado y se encuentra en mayor
densidades que T. dimidiata, lo que lo hace ser un mejor vector (Ponce, 1999; WHO,
2002). Por otro lado, la habilidad de transmitir T. cruzi está directamente asociado con el
comportamiento del vector respecto a patrones de alimentación y defecación, y en este
ámbito R. prolixus no parece evidenciar una coevolución con T. cruzi que favorezca su
transmisión (Takano y Edman, 2002). No obstante T. dimidiata tiene la ventaja de que
esta más ampliamente distribuido en Guatemala y además está adaptado tanto al ciclo
selvático como el doméstico.
3. Trypanosoma cruzi
Es un parásito unicelular que altera su vida entre dos hospedadores multicelulares,
uno invertebrado y uno vertebrado, presentando un ciclo de vida digenético. Los
tripanosomas tienen los componentes celulares típicos de los eucariotas: núcleo,
microtúbulos, retículo endoplasmático, aparato de Golgi y mitocondria. También posee
un kinetoplástido que es el componente celular al cual se debe el orden taxonómico.
Hacer referencia a cuadro 2. El kinetoplástido es una condensación de ADN extranuclear
que se encuentra cerca de la base del flagelo dentro de la región ocupada por la
mitocondria y que tiene forma de bastón. Este DNA conforma el 30% del total y es
análogo ADN mitocondrial encontrado en otros eucariotas (de Souza, 1999).
Básicamente esta formado por maxicírculos y una red de 20,000 a 30,000 minicírculos
16
altamente asociados, los primeros con un largo de 6 a 11um y los segundos de 0.45um
que corresponde a 1440 pares de bases (Englund et al, 1996).
Cuadro 2. Clasificación sistemática de T. cruzi según The Taxomicon & Sistema
Naturae, 2000
Dominio Eucariota
Reino Protozoa (Goldfuss, 1818; R.Owen, 1858)
Subreino Biciliata
Infrareino Excavata (Cavalier-Smith, 2002)
Filo Euglenozoa (Cavalier-Smith, 2002)
Subfilo Saccostoma (Cavalier-Smith, 2002)
Clase Kinetoplastea (Honigberg, 1963; L.Margulis, 1974)
Orden Trypanosomatida (Kent, 1880; Hollande, 1952)
Familia Trypanosomatidae (Doflein, 1901)
Género Trypanosoma (Gruby, 1843)
Subgénero Trypanosoma Schizotrypanum (Chagas, 1909)
Especie cruzi
(Brands, 2007)
a. Ciclo de transmisión de T. cruzi:
• Ciclo silvestre: prefiere ambientes ecológicamente cerrados o semiabiertos,
variando en las proporciones de hospederos a vectores dependiendo de una serie
de factores como el clima, altitud, humedad, características fauno florísticas y
disponibilidad de alimentos. En este contexto se encuentra en toda América,
albergándose el parásito en mamíferos de medio y pequeño tamaño y en los
insectos vectores. (Rodríguez et al, 2004)
• Ciclo doméstico: Se caracteriza en que el hombre es el principal reservorio de la
infección. Este ciclo resulta como producto de la tasa de migraciones desde áreas
rurales hacia zonas urbanas, acciones sobre el medio natural como quema o
deforestación y construcción de viviendas con materiales que pueden prestar
abrigo a los vectores. (Rodríguez et al, 2004)
17
• Ciclo peridoméstico: en este ciclo intervienen mamíferos (roedores domésticos,
marsupiales, gatos, perros) que libremente entran y salen de las domicilios así
como los triatomas silvestres que son atraídos por la luz de las casas y por el
alimento. Este ciclo sirve de unión a los ciclos silvestre y doméstico. (Rodríguez
et al, 2004)
4. Trypanosoma rangeli (Tejera, 1920)
En América latina este es el segundo tripanosoma de importancia por su infección en
humanos. Este parásito hemoflagelado perteneciente a la familia Stercoria, se caracteriza
por poder ser transmitido tanto mediante las heces como por las glándulas salivales.
Posee un kinetoplasto subterminal redondo que es más pequeño que en T. cruzi, el núcleo
esta cerca de la mitad del cuerpo y la membrana ondulante está bien desarrollada.
T. rangeli puede infectar a humanos y a una amplia variedad de animales selváticos y
domésticos, sin embargo no es patogénico para el hospedero (D’Alessandro, 1992). En
algunos casos se pueden presentar infecciones mixtas de T. cruzi con T. rangeli lo que
dificulta el diagnóstico de la enfermedad de Chagas ya que se han encontrado reacciones
serológicas cruzadas (Guhl & Marinkelle, 1982). Se ha observado que los triatominos,
particularmente los des género Rhodnius, son susceptibles a cepas de T. rangeli que
poseen el mismo origen geográfico (Machado et al. 2001).
5. Análisis de Minicírculo: Diferenciación de T. cruzi y T. rangeli.
Se han desarrollado varias pruebas para la detección específica de T. cruzi y T.
rangeli, algunas están basadas en ADN nuclear o del kinetoplástido. Los métodos que
usan el ADN del kinetoplástido como blanco parecen ser más sensibles en la detección de
la infección por T. cruzi: 0.015fg de ADNk minicírculo, aproximadamente 10 moléculas
(Sturm et al, 1989). De modo que es posible detectar la presencia de una sola célula de T.
cruzi en 20mL de sangre humana (Avila et al, 1991).
Las moléculas de minicírculo de T. cruzi, poseen una extensión de 1.4 kb y están
organizadas en cuatro segmentos, cada uno consiste en una región corta de ADN
18
altamente conservado entre T. cruzi, además posee una región más larga que exhibe alta
variabilidad en la secuencia (Degrave et al, 1988). Los cebadores para amplificar la
región variable se encuentran en la parte conservada alrededor de la misma y generan un
producto de 330 pares de bases (Avila et al, 1990; Sturm et al, 1989). En algunos casos
se detecta una banda a 660 o 990 pb que corresponde a múltiplos de la región variable del
minicírculo (Avila et al, 1993). La presencia de T. rangeli es determinada mediante la
detección de un fragmento de 760 pb y un juego de bandas entre 300–450 pb,
especialmente la banda a 450 (Vallejo et al, 1999).
6. Diversidad genética de T. cruzi
El parásito T. cruzi es considerado como una especie heterogénea que consiste en
varias subpoblaciones que circulan entre los vectores y sus reservorios (Review by
Devera et al, 2003). La diversidad genética puede ser el resultado de la propagación de
los clones con poco o ausente intercambio genético (Souto et al, 1996). En este contexto,
el mismo hospedero podría estar simultáneamente infectado por cepas diferentes, estas
cepas también corresponden a clones que se distribuyen en áreas geográficas específicas.
Entre las formas de clasificación de las cepas de T. cruzi se encuentra la realizada por
Souto et al, 1996. Basándose en los genes del ADNr y el miniexón se indicó un claro
dimorfismo del taxón que definió el grupo T. cruzi I y T. cruzi II; esta será la
nomenclatura que se usará en este trabajo.
a. Características biológicas
La diversidad genética ha sido apoyada por estudios de comportamiento biológico.
Se demostró que las cepas aisladas de reservorios humanos y de vectores en áreas
geográficas diferentes muestran un comportamiento distinto en los animales de
laboratorio (Review by Devera et al, 2003). El uso de parámetros biológicos acerca de la
interacción parásito-ratón dio lugar a tres subgrupos llamados biodemos. Estos
caracterizan por diferentes parasitemias, morfologías, tropismo por tejidos y lesiones
histopatológicas (Andrade, 1974). La teoría del modelo clonal histotrópico apoya que los
diferentes genotipos presentan una distribución favoritaria en tejidos sugiriendo que la
variabilidad genética influye en la forma clínica (Vago et al. 2000).
19
b. Análisis evolutivo
Kawashita et al, 2001, realizó un análisis filogenético (“maximun likelihood”) de 20
cepas representatives de T. cruzi basándose en comparaciones directas de las secuencias
de 18S y D7-24Sa ADNr, con lo cual se confirmó una subdivisión primaria en dos
linajes, hacer referencia a figura 3 (Souto et al. 1996; Stothard et al. 1998; Fernandes et
al. 1998a). El riboclado 1 corresponde a T. cruzi II y se encontró principalmente en el
ciclo doméstico y en pacientes. Por su lado, T. cruzi I (riboclado 2) y Z3 (riboclado 4) se
ha asociado con el ciclo selvático aislándose de zarigueyas, roedores salvajes y
triatominos (Miles & Cibulskis 1986; Zingales et al. 1998; Fernandes et al. 2001).
Posiblemente la variabilidad encontrada entre los riboclados 2, 3 y 4 se explica con la
evolución y la distribución específica de sus hospederos y vectores que evolucionaron en
Sur América durante el Cenozóico (Marcilla et al. 2001).
El ancestro hipotético de los riboclados 1, 2, 3 y 4 se esparció en todo sur y norte
América hace 84.4 millones de años atrás cuando Sur América y África aún estaba
unidos. Cuando estos continentes se separaron, en el período Cenozoico, la fauna de Sur
América estaba compuesta por marsupiales, edentates y ungulates. Se propone que los
riboclados 2, 3 y 4 evolucionaron de los marsupiales sur americanos que estaban aislados
de los placentales de Norte América infectados con el riboclado 1, esto posiblemente
ocurrió en el período cenozoico. De acuerdo con esta hipótesis, el riboclado 1 puede
haber llegado a Sur América durante el oligoceno junto con los roedores y los primates
que migraban de isla en isla, o durante el gran intercambio de fauna que ocurrió durante
el plioceno-pleistoceno cuando Sur y Norte América se conectaron mediante el istmo de
Panamá (Kawashita et al, 2001). En Norte América la asociación entre riboclado 1 y
mamíferos placentales y por otro lado riboclado 2 y marsupiales es fuerte y puede ser
evidencia de la evolución independiente de estos clados por un largo período de tiempo
(Clark et al, 1994). De modo que la divergencia entre T. cruzi I y II posiblemente ocurrió
en el período cretácico (144-65 millones de años atrás) y los subclados divergieron en el
20
período terciario de la era cenozoica (65 a 1.8 millones de años atrás) (Kawashita et al,
2001).
Figura 3: Tiempos estimados de divergencia para los riboclados de Trypanosoma cruzi y
su correlación con grupos definidos mediante otros métodos.
(Adaptado de Kawashita et al, 2001)
Otra alternativa….
Al asumir una razón de evolución más alta (4% de divergencia por 100 millones de
años) para la secuencia de ADNr 18S en T. cruzi. Esto sugeriría que la divergencia de las
cepas ocurrió recientemente, menos de 18 millones de años y que puede ser el resultado
de la coevolución con los vectores o las barreras geográficas en Sur América que aislaron
a los marsupiales de los mamíferos placentales (Kawashita et al, 2001).
Virtualmente, todas las especies de Rhodnius están asociadas principalmente con
árboles de palma, (Miles 1979, Carcavallo et al. 1998), lo que podría deberse a una
historia evolutiva común (Gaunt & Miles, 2000). La adaptación de Rhodnius a las palmas
puede evidenciarse por la coloración, los órganos escaladores y en que la distribución de
estos dos grupos coincide notablemente. Además muchas especies de este género se
alimentan de pájaros que comúnmente viven en estas plantas. Una investigación que
21
asocia a las especies de Triatoma con su hábitat (Miles 1979), revela que al menos 20
especies están asociadas con cavernas o madrigueras de roedores. La preferencia de un
género por su hábitat influencia la distribución dentro de las casas, por ejemplo, R.
prolixus se encuentra en techos de palma.
Se ha observado que T. cruzi I y T. rangeli han sido consistentemente aislado a partir
de zarigüeyas (marsupiales del género Didelphis), que se encuentran infectando especies
de Rhodnius (Povoa et al. 1984, Carrasco et al. 1996) y que la distribución geográfica de
parásitos, reservorios e insectos coincide. La diferencia principal es que T. cruzi I se
transmite por contaminación fecal mientras que T. rangeli por saliva. Por su lado, T.
cruzi II predomina en el ciclo de transmisión doméstica en países de Sur América (Miles
et al. 1984, Chapman et al. 1984), mientras que T. cruzi I en los ciclos de transmisión del
norte del amazonas. Esto lleva a hipotetizar que hay una asociación entre T. cruzi II,
Triatoma y roedores (Gaunt & Miles, 2000). Además, en el sur de Brazil se le ha
asociado con primates (Fernandes et al. 1999). En el cuadro 3 se sintetizan estas
asociaciones las cuales se sugieren un patrón de evolución (Gaunt & Miles, 2000), no
obstante pueden existir excepciones.
Basado en estas observaciones se propone que T. cruzi 1 evolucionó en palmas con
especies Rhodniini y en asociación con zarigüeyas (Didelphis). Mientras que, T. cruzi II
y Z3 evolucionaron de hábitats y madrigueras terrestres en lugares rocosos con los
insectos Triatomini y en asociación con edentates y posiblemente marsupiales. Así, los
edentates son el hospedero primario de T. cruzi II y Z3 y las subdivisiones pudieron ser
contemporáneas en Sur América desde hace 65 millones de años. (Gaunt & Miles, 2000).
Cuadro 3: Diferencias entre el género Rhdonius y Triatoma
Rhodnius Triatoma
Ecotopo silvestre Arboreal: palmas Terrestre: rocas
Tripanosomas asociados T. cruzi I y T. rangeli T. cruzi II
Hospederos asociados Marsupiales Roedores y primates
(Adaptado de Gaunt & Miles, 2000)
22
c. Características bioquímicas
La electroforesis enzimática evaluando las enzimas ALAT, ASAT, isomerasa
glucofosfato (GPI), glucosa 6 fosfato dehidrogenasa (G6PDH), enzima málica (ME) y
fosfofoglucomutasa (PGM) se obtuvieron los zimodemos 1 y 2 (Miles et al.1981). El
zimodemo 1 agrupa a los marsupiales y los triatominos salvajes, el Z2 son domésticos y
se derivan de humanos y mamíferos domiciliares. Estudios adicionales mostraron un
tercer zimodemo asociado a ambientes selváticos (Review by Devera et al, 2003).
d. Características moleculares
Mediante análisis de Esquizodemos, amplicación random de ADN polímórfico
(RAPD) y fragmentos de restricción de ARN ribosomal se ha confirmado la
heterogenicidad de T. cruzi y su subdividión en dos grupos pricipales.
• El análisis del miniexón, que es tema de esta propuesta, será a continuación
explicado. El gen del miniexón está presente en el genoma nuclear de los organismos del
orden Kinetoplástida en casi 200 copias repetidas en tandem, las cuales consisten en tres
diferentes regiones: exón, intrón y región intergénica. El exón es una secuencia de 39
pares de bases, altamente conservada dentro del orden y que es agregada post
transcripcionalmente en todos los ARNm. El intrón, por su parte, es moderadamente
conservado entre el género o subgénero mientras que la región intergénica, también
llamado espaciador no transcrito (NTS-ME) es particularmente diferente entre especies
(Devera et al., 2003). El espacio intergénico puede ser amplificado con PCR haciendo
posible la clasificación de T. cruzi en dos grupos taxonómicos principales I y II
(Fernández, 1996; Souto et al, 1996; Fernandes et al, 1998). Hacer referencia a figura 4
en donde se muestra la estrategia de amplificación y la localización de sondas específicas,
los cebadores ME-L y ME-R reconocen secuencias del exón (cuadro gris), el intrón se
localiza en el cuadro negro y finalmente la línea que conecta representa el espaciador no
transcrito y variable. T. cruzi I se observa principalmente en animales y triatominos
salvajes, mientras que T. cruzi II está en humanos (Fernandes et al. 1998, Zingales et al.
1998).
23
Figura 4: Esquema de la estrategia de amplificación del gen miniexón y localización de
sondas específicas para determinar el grupo al que pertenece.
(Adaptado de Fernandes et al, 1998)
Estos subgrupos también pueden relacionarse con los zimodemos propuestos
mediante electroforesis enzimática, T. cruzi I corresponde al zimodemo 1 y T. cruzi II al
zimodemo 2, sin embargo, la posición del zimodemo 3 no esta clara. (Fernandes, 2001).
Este proyecto usa el multiplex PCR basado en el espaciador no transcrito del gen
miniexón para determinar la presencia de T. cruzi I, II, Z3 o T. rangeli. Esta técnica se
ve favorecida ya que el gen está repetido en tandem. El procedimiento se hace usando un
pool de 5 cebadores, 4 de ellos “foward” y un “reverse”. Los “foward consisten en tres
oligonucleótidos que se derivan de la región hipervariable y repetida del miniexón (TC1:
5’ACA C T TTC TGT GGC GCT GAT CG 3´; TC2: 5’ TTG CTC GCA CAC TCG GCT
GCA T 3´ y TC3: 5’ CCG CGW ACA ACC CCT MAT AAA AAT G 3´) y un
oligonucleótido de la región específica del espaciador no transcrito de T. rangeli (TR: 5’
CCT ATT GTG ATC CCC ATC TTC G 3´). Como cebador “reverse” se usa un
oligonucleótido que corresponde a una secuencia presente en casi toda la región
conservada de los genes del miniexón (ME: 5’ TAC CAA TAT AGT ACA GAA ACT G
3´) (Fernandes, 2001).
• Análisis con microsatélites: Este tipo de ADN consiste en unidades de
nucleótidos que se repiten en tandem, se usan como marcadores genéticos puesto que el
número de repeticiones en un locus dado puede variar de un individuo a otro. Según el
tamaño de la unidad y la cantidad de veces en que se repite, este ADN se ha divido en
tres clases conocidas como satélites, minisatélites y microsatélites (Bennett 2000).
24
Los microsatélites se pueden organizar en una forma simple que consiste en varias
repeticiones de dos o más nucleótidos, o pueden posee una estructura más compleja: dos
o mas motivos repetidos, (CA)n(GT)n, o (dC-dA)n(dG-dT)n. Se les denominan
imperfectos o complejos cuando tienen espaciadores entre motivos repetidos varias
veces, (GA)n (N)n (CT)n. El número de copias de la unidad de repetición en un loci
específico es extremadamente polimórfico y la variación del número de repeticiones
puede ocurrir entre alelos. La razón de mutación varia entre 10-6 a 10-2 . Esta razón
cambia de acuerdo al número de repeticiones en el arreglo (Harr et al, 2000).
Gracias a su tamaño son versátiles en su manipulación en el laboratorio; se pueden
elaborar cebadores de las regiones flanqueantes conservadas, ser amplificados por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) y luego separados en
medio de alta resolución, como lo es la acrilamida, en donde la diferencia de una
repetición puede ser resuelta sin ambigüedad. Se han desarrollado tecnologías que ayudan
en el análisis electroforético de los alelos de cada muestra. Actualmente el PCR se lleva a
cabo con cebadores marcados covalentemente con fluorescencia. La separación se hace
bajo el principio de la electroforesis haciendo migrar los amplicones a través de capilares.
Estas moléculas absorben la luz proveída por un láser y la emiten a una longitud de onda
específica para cada fluorocromo. Al final del capilar, se encuentra un detector que
analiza las emisiones y las traduce a un patrón de diferentes colores que corresponden a
una longitud de onda particular. La computadora registra, como en el caso de un
cromatógrafo, el tiempo de elusión, el tamaño en pares de bases, el área y la altura de
cada pico. Este sistema permite trabajar varios microsatélites siempre y cuando posean
tamaño y fluorocromos diferentes.
7. Trabajos realizados en Guatemala
En Guatemala Rivera (2003) identificó locus correspondientes a microsatélites
polimórficos en el genoma del T. cruzi. A partir de estas secuencias se diseñaron
cebadores específicos para amplificar 11 locus, de estos únicamente tres (MS3, MS5 y
MS6) mostraron polimorfismo. Luego estos tres se amplificaron usado aislados de T.
cruzi localizados en seis departamentos endémicos de Guatemala, en una región cercana
25
al canal de Panamá en Panamá, en la provincia de Manabi de Ecuador y en dos estados
del Brasil. Las muestra provienen de vectores: Triatoma dimidiata, Rhodnius prolixus y
Rhodnius pallescens; reservorios y humanos. (Rivera, 2003).
El locus MS3 se caracteriza por presentar una serie de alelos no esperados espaciados
del alelo más cercano por 23 pares de bases. Cuando se incluyó este alelo espaciado y los
tres microsatélites descritos, el análisis filogenético reveló una segregación marcada en
dos grupos denominados I y II. A estas muestras se les hizo un análisis mediante los
marcadores TC1 y TC2, según esto, el grupo II corresponde principalmente a TC2 y ellos
circulan en un ambiente silvestre pero tienen la capacidad de colonizar asentamientos
humanos. Mientras que en el tipo I se observa una mezcla de linajes, que sugieren que
hay una subdivisión basada en el hospedero del cual fueron aislados. Cabe mencionar
que estos subgrupos presentan una fuerte distancia genética entre ellos. Por su parte, al
analizar las muestras eliminando los alelos espaciados de MS3 se observó también la
presencia de dos grandes grupos, sin embargo la división no parece estar basado en los
linajes sino que en los genotipos. Además, el menor valor de la distancia genética de Nei
obtenida podría suponer una estructuración poco real (Rivera, 2003).
En este proyecto a tipificación genética de T. cruzi en contenidos fecales de R.
prolixus y T. dimidiata, se basa en los locus MS3 y MS5 desarrollados por Rivera, 2003.
El locus MS3 corresponde a un dinucleótido (TG)20, su alelo predominante es 190pb, sin
embargo también puede presentarse como 231pb, para el análisis, el cebador “Foward”
esta marcado con el fluorocromo 6FAM (azul). Por otro lado, el locus MS5 es un
trinucleótido (CAA)7, con alelo predominante 230pb, su cebador “Foward” esta marcado
con HEX (verde).
26
PARTE III
III. RESULTADOS Y DISCUSION
1. Análisis de minicírculo para muestras (n=57) de Jalapa y Zacapa
Se recolectaron insectos de Jalapa y Zacapa, 57 de estos presentaron heces
positivos por microscopía para tripanosomas. A estas muestras se les extrajo el ADN y a
continuación se sometieron a un análisis basado en la secuencia del minicírculo que es
capaz de discriminar entre aquellas infectadas por T. cruzi o T.rangeli. En el cuadro 4 y
en la figura 5 puede verse que R. prolixus esta infectado similarmente por T. cruzi (9/38,
23.7%) y por T.rangeli (8/38, 21.1%) mientras que T. dimidiata se encuentra únicamente
infectado con T.cruzi (9/19, 47.4%). Los resultados de infección para R. prolixus no son
los esperados según ensayos previos, hacer referencia a Marco Teórico. Anteriormente en
aislados de Chiquimula, se había registrado infección principal por T. rangeli (59/72,
81.9%) y secundaria por T. cruzi (5/72, 6.9%).
Cuadro 4: Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa y
Zacapa mediante el ensayo del minicírculo
Vector Parásito Frecuencia %
T. cruzi 9 23.7
T. rangeli 8 21.1
No amp 21 55.3
R. prolixus Total 38 100.0
T. cruzi 9 47.4
T. rangeli 0 0.0
No amp 10 52.6
T. dimidiata Total 19 100.0
27
Figura 5: Detección de T. cruzi y T.rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa y Zacapa mediante el ensayo de
Minicírculo
9 9
80
21
10
05
10152025303540
R. prolixus T. dimidiataVectores
Mue
stra
sNo ampT. rangeliT. cruzi
No obstante, a diferencia del ensayo con aislados de Chiquimula, la mitad de estas
muestras, R. prolixus (21/38, 55.3%); T. dimidiata (10/19, 52.6%) no amplificaron. La no
amplificación no descarta una infección positiva porque existe la posibilidad de que se
haya errado en alguno de los pasos previos a este ensayo. Sería necesario evaluar, el
método de preservación de las heces, la eficiencia de la extracción, los inhibidores de
PCR, la preparación del master mix, la sensibilidad en la detección de las bandas, entre
otros. Se recomienda desarrollar un control interno positivo que descarte la presencia de
inhibidores o errores en la reacción para el futuro.
Con el fin de tener un mejor entendimiento de la distribución de T. cruzi y T.
rangeli en las heces de los vectores, se procedió a realizar este análisis usando el
marcador basado en la secuencia del mini-exón en lugar de usar el minicírculo. En el
cuadro 5 y figura 6 se presenta la comparación de las frecuencias encontradas en los
aislados de los diferentes departamentos. Se debe hacer la aclaración que esta
comparación da una idea de lo que ocurre pero no puede tomarse como absoluta porque
los ensayos son diferentes. Sería necesario hacer un análisis de sensibilidad y
especificidad de cada uno antes de compararlos. Sin embargo, se observa que las
frecuencias de infección son similares. En ambos casos R. prolixus se encuentra
principalmente infectado con T.rangeli, mientras que T. dimidiata con T. cruzi.
28
Cuadro 5: Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores de Jalapa/Zacapa
(n= 57) y Chiquimula (n= 103)
Jalapa/Zacapa
Ensayo Miniexón
Chiquimula
Ensayo Minicírculo
Vector Parásito Frecuencia % Frecuencia %
T. cruzi 9 23.7 5 6.9
T.cruzi/T.rangeli 4 10.5 0 0.0
T. rangeli 18 47.4 59 81.9
No amp 7 18.4 8 11.1
R. prolixus
Total 38 100 72 100.0
T. cruzi 8 42.1 31 100.0
T.cruzi/T.rangeli 0 0.0 0 0.0
T. rangeli 0 0.0 0 0.0
No amp 11 57.9 0 0.0
T. dimidiata
Total 19 100 31 100.0
Figura 6: Detección de T. cruzi y T. rangeli en heces de vectores colectados en Jalapa y Zacapa mediante el ensayo del Miniexón
9 8
40
18
0
7
11
05
10152025303540
R. prolixus T. dimidiata
Vectores
Mue
stra
s No ampT. rangeliT.cruzi/T.rangeliT. cruzi
Los resultados descritos concuerdan con la teoría de Gaunt y Miles 2000 que
sugiere una alta asociación evolutiva entre el género Rhodnius y T. rangeli. A su vez
29
estos resultados destacan la importancia de estudiar la influencia de T. rangeli en el ciclo
de transmisión de T.cruzi. T. rangeli es una especie no patógenica para humanos que
puede ser fácilmente mal diagnosticada con T.cruzi. Por esa razón se recomienda que se
revisen las técnicas de diagnóstico y los índices de prevalencia de la enfermedad de
Chagas en regiones en donde Rhodnius esta presente.
A su vez, es necesario estudiar la competencia entre ambos tripanosomas a través
de todo el ciclo de transmisión, en reservorios, en hospederos y en vectores. Este estudio
incluiría la interrelación entre T.rangeli y cada uno de los linajes de T.cruzi.
2. Análisis de miniexón para muestras (n=160) de Chiquimula, Jalapa y
Zacapa.
Utilizando el gen del mini-exón, en Guatemala y México se ha encontrado TCI
tanto en vectores como en hemocultivos de muestras humanas (ciclo doméstico y
selvático), y se cree que juega un papel importante en infecciones humanas (Ruíz-
Sánchez, et. al. 2005; Higo, et. al. 1997), así también en Panamá el TCI se ha encontrado
en hemocultivos de muestras humanas y en el vector R. pallescens, siendo éste el
principal genotipo en el ciclo doméstico/peridoméstico y selvático y el responsable de la
enfermedad en éste país (Sousa, et.al. 2006, Samudio, et.al., 2007). Mientras que en
Brazil TCII es preferencialmente asociado con infecciones humanas y TCI es asociado a
ambos ciclos. (Fernandes, et. al. 1998,1998a, 1999, 2001, Miles, et. al 1977, O´Connor,
et. al. 2007).
Existen varias hipótesis que explican que la evolución de de los linajes de T. cruzi
se encuentra relacionado con la evolución sus hospederos. Una de las hipótesis sugiere
que el TCII evolucionó en América del Sur junto con los placentales, mientras que el TCI
evolucionó en América del Norte junto con marsupiales y edentados, cuando ambos
continentes se encontraban separados. Se propone que no importando el origen de los
30
linajes, el gran intercambio de fauna durante la conexión de las Américas a través del
istmo de Panamá debió permitir el movimiento del TCII y el TCI en Centro América.
En las muestras analizadas, recolectadas en ambientes domésticos se encontró que
un 13%(3/24) de muestras provenientes de T. dimidiata y un 2%(2/89) de R. prolixus se
encontraban infectadas con ambos linajes, TCI y TCII; mientras que un 33%(8/24) de T.
dimidiata y 8%(7/89) de R. prolixus se encontraban infectados sólo con TCI. Un
39%(35/89) de las muestras de R. prolixus se encontraban infectadas únicamente con T.
rangeli, mientras que un 4%(4/89) se encontraban infectadas simultáneamente con TCI y
T. rangeli (Cuadro 6, Figura 7). No se encontró el TCII sólo en ninguno de los vectores.
Estos resultados señalan la presencia de cepas TCII en el ámbito doméstico en la
región. Estudios anteriores que han analizado muestras de T. cruzi de Guatemala han
demostrado la presencia de TCI pero no se ha comprobado la presencia de TCII en
humanos o vectores. (Ruíz-Sánchez, et. al. 2005). Nuestros resultados sugieren que en
Guatemala existen tanto el TCI como el TCII circulando en el ciclo doméstico de
transmisión.
Una adecuada caracterización de T. cruzi es esencial para determinar el rol que los
diferentes linajes puedan jugar en la patogénesis, manifestaciones clínicas y diferencia en
la respuesta a la quimioterapia. Se conoce que T. cruzi I son más resistentes a las drogas
(benznidazol e itraconazol) que T. cruzi II; así también que una mezcla en linajes de T.
cruzi presenta una respuesta distinta al tratamiento con benznidazol que una infección
con un solo linaje. Así también se conoce que el TCII es más patogénico, siendo asociado
a los mega síndromes; mientras que el TCI es menos patogénico y es asociado a las
manifestaciones cardíacas.
La presencia de ambos linajes de T. cruzi en las heces de los vectores puede
generar una epidemiología más compleja ya que tanto vectores como hospederos podrían
estar infectados con ambos linajes, y en éstos últimos, darse un tropismo diferencial a
tejidos ocasionando así manifestaciones clínicas diversas. Por esto es importante conocer
31
el genotipo de T. cruzi causante de la enfermedad de Chagas en Guatemala ya que el
tratamiento adecuado para pacientes depende de dicho genotipo; por lo mismo se
recomienda utilizar esta metodología modificada para analizar muestras de humanos
(hemocultivos, tejidos) con casos de enfermedad Chagas.
Cuadro 6: Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de
heces de triatominos colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula.
T. dimidiata R. prolixus
Frecuencia % Frecuencia %
TCI 8 33 7 8
TCII 0 0 0 0
TCI y II 3 13 2 2
TCI y T. rangeli 0 0 4 4
T. rangeli 0 0 35 39
no amplificó 13 54 41 46
Total 24 100 89 100
*Los números indican el total de muestras positivas para cada linaje de T. cruzi: TCI
(T. cruzi I), TCII (T. cruzi II) así también para T. rangeli.
Figura 7: Resultados obtenidos mediante el marcador del miniexón para muestras de heces de triatominos
colectadas en Jalapa, Zacapa y Chiquimula
0
10
20
30
40
50
60
TCI TCII TCI y II TCI y T.rangeli
T. rangeli noamplificó
Frec
uenc
ia
R. prolixus (n=69)T. dimidiata (n=24)
32
Para determinar si existe diferencia significativa en los linajes de T. cruzi entre T.
dimidiata y R. prolixus se realizó una prueba exacta de Fisher, cuadro 7.
Cuadro 7: Distribución de TCI y TCI/TCII en T. dimidiata y R. prolixus (Fisher exacto)
T. dimidiata R. prolixus
TCI 8 11
TCI/TCII 3 2
P=0.6299
Se determinó que no existe diferencia significativa entre los linajes de T. cruzi
encontrados entre T. dimidiata y R. prolixus. En este estudio no se observó la relación
descrita por Gaunt & Miles, en el cual proponen que las especies de Rhodnius están
asociadas con TCI y Triatoma con TCII. La presencia de ambos linajes se puede deber
al traslape que existe entre el ciclo doméstico y selvático, ya que los vectores selváticos
como T. dimidiata acarrean el parásito de ecótopos silvestres (cuevas, selvas,
madrigueras, palmeras, chultunes, cúmulos de piedra, troncos secos) a las viviendas
humanas atraídos por la luz. Así también con la migración de asentamientos humanos se
han invadido zonas silvestres y las viviendas se han construido cercanas a estos ecótopos
en los que se encuentran las chinches, las cuales pueden ser atraídas por la luz de las
viviendas y llegar a estas (Menes et.al. 2007). Los reservorios selváticos como Didelphis
spp. y roedores pueden invadir temporalmente ecótopos peridomésticos y domésticos en
búsqueda de alimento o refugio (Cordón-Rosales, Pennington, 2007).
Las muestras se deben analizar mediante otros métodos para descartar que las
mezclas de TCI y TCII encontradas sean híbridos, lo cual indicaría que en algún
momento hubo eventos de reproducción sexual en T. cruzi (Higo, et. al. 2000) y que
posteriormente estos híbridos se propagaron clonalmente (Freitas et. al., 2006). Esto es
de mucha importancia ya que aunque haya un bajo nivel de intercambio genético, esto
permitiría la recombinación de cualquier atributo biológico o de marcadores genéticos
como la sensibilidad hacia drogas (Higo, et. al. 2000).
33
3. Análisis de microsatélites para muestras (57) de Jalapa y Zacapa.
Se analizaron las muestras de ADN extraído de heces de 57 triatominos, 17 de T.
dimidiata y 40 de R. prolixus de Jalapa y Zacapa mediante un PCR que amplifica
microsatélites. Los amplicones se enviaron a la Universidad de Arizona para su análisis
mediante electroforesis capilar y a continuación se visualizaron con el software Peak
Scanner 1.0 de Applied Biosystems. Según este software el 26.3% (15/57) de las
muestras, 7% (4/57) de T. dimidiata y 19.3% (11/57) de R. prolixus no se pudieron
analizar porque estaban fuera de escala (“offscale”) o la señal es de mala calidad. De
modo que el número de muestras se redujo a 13 de T. dimidiata y 29 de R. prolixus.
La selección de picos verdaderos se hizo aplicando a las muestras una serie de
criterios: (1) Eliminación de la señal menor a 100 pares de bases producida por
tetrámeros o dímeros de cebadores, figura 8; (2) la intensidad mínima fue de 50unidades
de fluorescencia para no confundir picos verdaderos con ruido, figura 9; (3) el múltiplo
de repetición del nucleótido, figura 10; (4) el límite inferior del tamaño del amplicón por
la ausencia total del microsatélite; (5) la adición de adeninas por la polimerasa; (6) la
formación de productos que poseen el múltiplo de repetición pero que son artefactos del
PCR creados por la polimerasa al amplificar el fragmento (stturers), figura 11.
Figura 8: Electroferograma que muestra tetrámeros o dímeros de cebadores en la región
menor a 100 pares de bases (51.89 y 92.11 pb). Estos no son picos producidos por el
microsatélite.
34
Figura 9: Electroferograma que muestra la señal debida a ruido, menor a 50
unidades de fluorescencia y tres picos verdaderos (254.4, 257.95, 263.47 pb).
Figura 10: Electroferograma que muestra un microsatélite con un múltiplo de repetición
de 3 bases (225.32, 232.22 pb).
Se encontraron tres alelos que no cumplen con los criterios anunciados
anteriormente, sin embargo por la frecuencia en que se observaron se discuten en este
apartado. Para MS5 se encontró un alelo alredor de 161 (157-163) pares en todos los
casos el pico aparece partido de la punta (pick-split). Esta señal está presente en 10
muestras, 3 de T. dimidiata (23%(3/13)) y 7 de R. prolixus (24%(7/29)), hacer referencia
a cuadro 7.
35
Figura 11: Electroferograma que muestra artefactos de la amplificación (236.84, 264.23,
268.67 pb) pero que no son picos verdaderos (238.73 y 266.09 pb). Estos se reconocen
por su proporción respecto al pico principal y por su comportamiento en que la
fluorescencia va aumentando conforme se acerca al pico principal y luego disminuye.
Así mismo, se encontró un posible alelo de 114 pares de bases para MS3 presente
en 7 muestras, 4 de T. dimidiata (30.8% (4/13)) y 3 de R. prolixus (10.3% (3/29)). En este
caso la señal tiene un área muy grande comparado con la altura del pico. Además se
encontró un posible alelo alrededor de 156 (154-157) pares de bases para MS3 presente
en 14 muestras, 8 de T. dimidiata (61.5% (8/13)) y 6 de R. prolixus (20.7% (6/29)). Este
pico tampoco se consideró verdadero por ser pick-split, hacer referencia a cuadro 8.
Todas las señales que no cumplieron con los criterios para considerarse
verdaderos, no se incluyeron en los análisis posteriores.
Cuadro 8: Frecuencia de alelos que no se consideraron picos verdaderos.
MS Alelo T. dimidiata
(n=13)
R. prolixus
(n=29) Total (n=42)
5 161 23%(3/13) 24%(7/29) 23.8% (10/42)
3 114 30.8% (4/13) 10.3% (3/29) 16.7% (7/42)
3 156 61.5% (8/13) 20.7% (6/29) 33.3% (14/42)
36
Se investigó si hay diferencia en la frecuencia con que estos alelos aparecen en los
vectores de la enfermedad de Chagas. Para esto se hizo un análisis de Fisher exacto con
dos colas y se consideró diferente los valores P menores a 0.05. Hacer referencia a cuadro
9. Según esto no hay diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de dos de
los alelos, sin embargo en el alelo 156 de MS3 sí se observó diferencia. Este dato
contribuye a fortalecer la hipótesis planteada en este estudio, de que las cepas de T. cruzi
que transmiten ambos vectores son diferentes. Se debe considerar que se usó una prueba
no paramétrica y que por lo tanto se necesitan 5 o más datos para cada categoría en la
tabla de contingencia.
Cuadro 9: Diferencia estadística entre la frecuencia de alelos no verdaderos entre los
vectores
MS AleloValor P para
dos colas
5 161 1.000
3 114 0.176
3 156 0.015
Fisher Exacto p<0.05.
Una vez seleccionados los picos principales, estos fueron sometidos a una
normalización estadística. Las muestras fueron analizadas en diferentes equipos y esto se
ve afectado por el límite de detección de cada aparato particular. Además la cantidad de
ADN en la muestra no fue previamente cuantificada y por lo tanto no fue estándar para
cada ensayo. Las muestras con mayor concentración de ADN tienen mayor ventaja de
amplificar los alelos que se encuentran en menor proporción. Es decir que en cualquiera
de los dos casos hay alelos que se podrían ver favorecidos según el equipo y la
concentración de ADN inicial. Hacer referencia a Grajeda 2006 para procedimiento de
normalización.
La siguiente prueba estadística hizo uso del programa Allelogram, (Idury y
Cardon 2007) el objetivo fue aproximar el alelo obtenido por Peak Scanner al entero más
37
apropiado basándose en una aproximación por mínimos cuadrados. Con esto se
obtuvieron números discretos y fue posible graficarlos en un distribución de frecuencias.
Hacer referencia a figuras 12 y 13. En el locus MS3 hay una mayor frecuencia de los
alelos 190 y 192 para T. dimidiata mientras que 190 y 256 para R. prolixus. En cambio en
el locus MS5 hay una prevalencia de 230 y 236 para T. dimidiata y 230 y 239 para R.
prolixus. La diferencia en la distribución fue evaluada estadísticamente mediante el
programa Genepop proporcionado por la Escuela de Ciencias Biomédicas, Universidad
de Tecnología Curtin, Australia y disponible en línea en
http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/.
Figura 12: Distribución de alelos para el locus MS3
05
10152025303540
146 154 174 180 190 192 220 226 228 230 234 246 248 254 256
Alelos
Frec
uenc
ia
T. dimidiata (n=26)R. prolixus (n=11)
Los resultados de GenePop se resumieron los cuadros 9 y 10. La diferencia génica
se refiere a la distribución de alelos en varias poblaciones, es decir compara la
probabilidad de que un alelos por si solo puede encontrarse en otro individuo. La
diferencia genotípica se refiere a la distribución de genotipos en varias poblaciones, es
decir compara la probabilidad de que una pareja de alelos específicos se encuentren en
dos individuos. Este análisis se hizo tanto para los locus por individual, (cuadro 10) como
para los dos loci como un conjunto, cuadro 11. Las diferencias significativas se marcan
en negrita.
38
Figura 13: Distribución de alelos para el locus MS5
02468
1012141618
206 221 227 230 233 236 239 242 245
Alelos
Frec
uenc
ia
T. dimidiata (n=22)R. prolixus (n=17)
Cuadro 10: Diferenciación génica y genotípica (Fisher exacto) de la distribución de alelos
según locus.
3 5 Génica <0.000 0.02228
Genotípica 0.00253 0.26187Valor p < 0.05.
Cuadro 11: Diferenciación génica y genotípica (Chi2) evaluando ambos loci.
Chi2 df p Génica Infinito 4 Altamente significativo
Genotípica 14.639 4 0.00551
Según estos resultados se observa que si hay diferencia génica y genotípica entre
las frecuencia de alelos de T. cruzi que se encuentran en las heces de R. prolixus y las que
se encuentran en T. dimidiata. Este resultado parece contradecir lo encontrado mediante
el análisis del miniexón, sin embargo se debe de considerar la tasa de mutación de ambos
de marcadores. Los microsatélites se caracterizan por tener una tasa de mutación muy
alta la cual varía de 10-6 a 10-2 (Harr et al, 2000). Esto significa que puede encontrarse
hasta 1 mutación cada 100 generaciones, lo que se traduce a que se mide una diferencia
más sutil que con el uso de miniexón.
39
La diferencia en la frecuencia genética de las cepas mediante los microsatélites,
demuestra que los ciclos de transmisión entre los vectores de Guatemala son diferentes.
Este es un resultado esperado debido a las diferentes ecologías del las tribus tritominii y
rhodninii; Triatoma tiene un ciclo peridomestico-selvático mientras que Rhodnius es
doméstico y de distribución focalizada en Guatemala. Esto es una evidencia a favor de la
teoría de coespeciación vector-parásito que ocurrió a través del tiempo, indicando que las
cepas tienen un alto grado de adaptación con su vector correspondiente. Estos datos son
determinantes porque las relaciones específicas de los vectores con sus parásitos influyen
en las diferencias en los ciclos de transmisión de la enfermedad, especialmente cuando un
vector reemplaza a otro después del tratamiento con insecticidas.
Sería interesante evaluar la competencia vectorial de T. dimidiata para las cepas
encontradas en R. prolixus y evaluar si la colonización de esta especie en regiones
previamente infestadas por R. prolixus tendrá un efecto importante la transmisión de la
cepa de T. cruzi asociada a R. prolixus. Las estrategias de control, prevención y
tratamiento deben considerar estas diferencias ser efectivas.
Finalmente, se elaboró un análisis filogenético de las muestras de heces
amplificadas con microsatélites. Para esto se utilizó el programa Phylip 3.67, con un
boostrap de 1,000 reiteraciones, la distancia genética se midió mediante el método de
Cavali Sforza y el árbol se construyó mediante un Neighbor Joining. El outgroup es una
muestra de T. cruzi aislada de un marsupial, Didelphis marsupialis de Ecuador. Hacer
referencia a figura 14. En este árbol filogenético no se encontró una relación entre las
cepas de T. cruzi aisladas de los vectores.
40
Figura 14: Árbol filogenético que relaciona aislados de T. cruzi de heces de R. prolixus
(Rp) y T. dimidiata (Td). Las muestras de Jalapa y Zacapa están diferenciadas por JZ.
Outgroup PR6456. 1000 reiteraciones. En negrita se señalan los bootstrap significativos.
41
754
La ausencia de amplificación pudo deberse a una muy baja cantidad de ADN del
parásito para ser detectada por PCR ó que el ADN de las muestras sin amplificación
contenían algún compuesto que inhibió el PCR o que degradó el ADN; ésto debido a que
dichas chinches fueron disectadas en diferentes períodos antes o después de alimentadas,
por lo tanto el proceso de digestión pudo haber liberado diferentes productos del
metabolismo para cada insecto. También se pudo deber al proceso de disección de dichas
chinches, lo cual pudo causar que las heces tuvieran contacto con otros compuestos
inhibidores, como el grupo hemo (Comunicación personal, Pamela Pennington). Para
evaluar la inhibición se podrían realizar diluciones de las muestras, ya que en éste
proceso se diluyen los inhibidores hasta cierto punto donde ya no perjudique la
amplificación del PCR. Sin embargo, no se puede descartar infección de tripanosoma en
estas muestras fecales que no amplificaron.
42
PARTE IV. IV.1 CONCLUSIONES
• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del minicírculo se
detectó que el 47.4% (9/19) de las muestras de heces con microscopia
positiva para tripanosoma obtenidas de T. dimidiata estaban infectadas
con T. cruzi y 52.6% (10/19) no amplificaron.
• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del minicírculo se
detectó que el 23.7% (9/38) de las muestras de heces con microscopia
positiva para tripanosoma obtenidas de R. prolixus estaban infectadas con
T. cruzi, 21.1% (8/38) con T. rangeli y 55.3% (21/38) no amplificaron.
• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del miniexón se
detectó que el 33.3% (8/24) de las muestras de heces obtenidas de T.
dimidiata estaban infectadas con TCI, 12.5% (3/24) con infección mixta
TCI/TCII y 54.2% (13/24) no amplificaron.
• Mediante el marcador molecular basado en la secuencia del miniexón se
detectó que el 7.9% (7/89) de las muestras de heces obtenidas de R.
prolixus estaban infectadas con TCI, 2.2% (2/89) con infección mixta
TCI/TCII, 4.5% (4/89) con infección mixta TCI/T. rangeli, 39.3% (35/89)
con T. rangeli y 46.1% (41/89) no amplificaron.
• La distribución de linajes I y II de T. cruzi encontrados en R. prolixus y T.
dimidiata son iguales (p=0.6299).
• Existe diferencia entre la frecuencia alélica, génica (p = altamente
significativo) y genotípica (p = 0.00551) entre las cepas de T. cruzi
aisladas de contenidos fecales de R. prolixus y T. dimidiata simpátricos en
Guatemala.
43
IV.2 RECOMENDACIONES
• Aumentar el número de muestras de T. dimidiata para aumentar la
significancia estadística.
• Realizar análisis de loci para verificar que las mezclas de TCI y TCII no
sean híbridos, como realizar el equilibrio de Hardy-Weinberg y diferencias
entre heterozigocidad observada y esperadas
• Realizar el mismo estudio con muestras provenientes de casos humanos y
vectores/reservorios del ciclo selvático de transmisión.
• Utilizar un control interno para control de amplificación.
44
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Andrade SG. 1974. “Caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas do
Recôncavo Baiano: contribuição ao estudo da patologia geral da doença de
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45
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trypanosomiasis in Brazil based on dimorphisms of rRNA and mini-exon
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50
IV.4 ANEXOS
IV.4.1 Anexo 1: Diagrama de Flujo de la Estrategia Metodológica
51
IV.4.2. Anexo 2: Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de triatominos recolectadas en Chiquimula.
IV.4.2.1 Locus MS5
52
53
54
55
56
57
IV.4.2.2 Locus MS3
58
59
60
61
62
63
64
65
66
IV.4.3 Electroferogramas de muestras de T. cruzi aisladas de heces de triatominos recolectadas en Jalapa y Zacapa.
IV.4.3.1 Locus Ms3
67
68
69
70
IV4.3.2 Locus MS5
71
72
73
74
75
76
77
PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA OFICINA ADMINISTRATIVA DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES
Registros correspondientes 31 de Octubre del 2007
Nombre del Proyecto: Estudio del ciclo de transmision de Trypansoma cruzi mediante la tipificación genetica de este parasito
Código del Proyecto: FODECYT 085-2006 Investigador Principal : Licda. Laura María Grajeda Díaz Fecha: 01 de Noviembre del 2006 al 31 de Octubre del 2007 Duración: 12 meses
FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA DEL PROYECTO
RENGLÓN DESCRIPCIÓN AUTORIZADO
TRANSFERENCIAS
AJUSTADO EJECUTADO SALDO
GRUPO 1
121 Publicidad y propaganda 1,400.00 (1,400.00) - - - -
122 Impresión, encuadernación y reproducción - -
300.00
300.00 300.00 -
79
142 Fletes 400.00 (400.00) - - - -
163
Mantenimiento y reparación de equipo médico sanitario y de laboratorio 4,000.00 (3,995.28)
4.72 -
4.72
181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad 24,000.00 -
-
24,000.00 24,000.00 -
181
Estudios, investigaciones: Evaluación externa de resultados e impacto 8,000.00 -
-
8,000.00 8,000.00 -
182 Servicios médicos sanitarios 1,250.00 (300.00) 1,690.00
2,640.00 2,640.00 -
GRUPO 2
243 Productos de papel o cartón - (300.00) 300.00 - -
261 Elementos y compuestos químicos 5,400.00 -
7,435.28
12,835.28 12,830.48
4.80
291 Útiles de oficina - - 180.00
180.00 - 180.00
295 útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio 6,177.50 (1,230.00)
-
4,947.50 4,942.20
5.30
GRUPO 3
323 Equipo médico-quirurgicos y de laboratorio 12,280.00 (3,230.00)
950.00
10,000.00 10,000.00 -
Gastos Administrativos 6,290.75 - -
6,290.75 -
6,290.75
TOTALES Q 69,198.25 Q (10,855.28) Q 10,855.28
Q 69,198.25 Q 62,712.68
Q 6,485.57
80