ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE LA ESPECIE CHLORELLA VULGARIS EN RESIDUOS DE UNA FERMENTACIN ALCOHLICA A PARTIR DE CAA DE AZUCARJuan David Garca MahechaFacultad de Ingeniera y Arquitectura, Universidad Nacional de Colombia

ResumenEn el presente trabajo se mostrara la metodologa experimental para la preparacin y adecuacin de un inoculo de Chlorella vulgaris para el crecimiento en un medio formulado hecho de vinazas provenientes de una fermentacin alcohlica. Tambin se realiza el estudio cintico y el ajuste a alguno de los modelos usados en la literatura, validando cada modelo con los datos experimentales obtenidos. Se plantean diferentes metodologas experimentales para la preparacin del inoculo, seguimiento cintico, medicin de azucares reductores, cuantificacin de lpidos y protenas. Por ltimo se realiza un anlisis de contenido celular de lpidos y protenas seguido de la comparacin de los resultados obtenidos en funcin del porcentaje de vinaza en cada medio.

1 Introduccin:Las microalgas tienen una amplia diversidad y son usadas desde dcadas atrs ya que proporcionan metabolitos especficos de gran importancia, pigmentos, antioxidantes y polisacridos. Algunas de las aplicaciones actuales son la produccin de biomasa, suplementos alimenticios, desarrollo en el tratamiento de aguas, fijacin del CO2 producido a nivel industrial y un alto potencial en el sector energtico. El cultivo de micro algas se ha llevado a cabo en diversas formas dependiendo de su aplicacin industrial, algunas de ellas son el cultivo en fotobioreactores cerrados, tanques abiertos y piscinas de algas [1]. El crecimiento heterotrfico y mixotrofico de la C. vulgaris viene siendo objeto de estudio para la produccin industrial de las mismas, esto se debe al alto contenido de aceite en las clulas y el rpido crecimiento al realizar el cultivo por estas dos vas. El mayor inconveniente que se presenta en estos medios de cultivo es el costo que se genera al usar la glucosa o el acetato como fuentes de carbono para las micro algas, adems de diversos nutrientes adicionales que corresponden en total al 80% del costo total del cultivo [2]. Es por este motivo que se propone realizar el crecimiento de la C. vulgaris en los residuos generados en una fermentacin alcohlica, en este caso se propone el uso de residuos de la fermentacin de caa de azcar; en estos residuos es posible encontrar una concentracin adecuada de glucosa, fosfatos y nitratos necesarios para realizar el crecimiento de las micro algas.1.2 Rutas metablicasLa C. vulgaris es una micro alga color verde y unicelular del filo Chlorophyta, tiene una forma esfrica midiendo de 2 a 10 um de dimetro, dependiendo de la especie se pueden lograr diferentes tolerancias a la temperatura y tasas de crecimiento.En la C. vulgaris se presentan las siguientes rutas metablicas [2,3]: Fotosntesis Ciclo de Calvin-Benson Glucolisis/glucognesis Ciclo de Krebs Fosforilacin oxidativa Biosntesis de cidos grasos Biosntesis de triglicridos Ruta pentosa fosfato Formacin de biomasaLa variacin de las rutas metablicas en el crecimiento de la C. vulgaris radica en las diferentes formas de crecimiento, estas formas son las siguientes:1.2.1 AuttrofaLa ruta metablica en el crecimiento auttrofo de la C. vulgaris tiene como caracterstica principal la fotosntesis, donde gracias a la luz solar es posible llevar a cabo la reaccin de descomposicin del agua , y gracias a esto es posible iniciar el ciclo de Calvin y producir glucosa a partir del dixido de carbono [2,4]1.2.2 HetertrofaLa ruta metablica en el crecimiento hetertrofo de la C. Vulgaris es caracterizada por la omisin de la fotosntesis, por lo cual es necesario proporcionar una fuente de carbono en forma de azcares para que se pueda llevar a cabo la gluclisis y todos los ciclos consecuentes [2,4].1.2.3 MixotrficaDurante esta ruta metablica ocurren todos los ciclos metablicos nombrados pero adicional a esto es necesario suministrar carbono en forma de azucares [4,5].Durante los tres tipos de crecimiento se puede evidenciar una diferencia entre el color de las micro algas, puesto que en un crecimiento heterotrfico es posible realizarlo en ausencia de luz por lo cual no se genera una cantidad considerable de clorofila y las algas pierden la tonalidad verde caracterstica [4,5].En figura 1 se puede observar la ruta metablica de la C. vulgaris en un crecimiento hetertrofo y en la figura 2 la diferencia de coloracin que se presentan con los diferentes crecimientos (auttrofo, hetertrofo y mixotrofico).

Figura 1. Metabolismo de C. vulgarisen crecimiento heterotrfico [2].En este esquema metablico se evidencia la falta de la etapa de fotosntesis y se muestra a gran rasgo todas las rutas metablicas nombradas anteriormente y las relaciones existentes entra cada una de ellas.

Figura 2. Diferencias de tonalidad en un crecimiento auttrofo, hetertrofo y mixotrofico [5].

1.3 Medios de cultivo y condiciones de cultivoA continuacin en la tabla 1 se muestran algunos medios de cultivo utilizados en experimentos previos, los dos primeros corresponden a medios preparados en el laboratorio de Microbiologa de la Universidad Nacional de Colombia para trabajos previos, el ultimo medio de cultivo corresponde a un medio utilizado en el crecimiento de la C. vulgaris en un trabajo realizado para la comparacin del crecimiento con bajos niveles de nitrgeno en el medio [6], adems en la tabla 2 se muestra una caracterizacin de una vinaza que aparece en la literatura, con esta caracterizacin es posible hacer un panorama de los compuestos que puedan hacer falta en la vinaza y que posibles inhibidores se tengan en la misma para la C. vulgaris.

Tabla 1. Comparacin de medios formulados [2,4,6]

CompuestoMedio formulado 1 (g/l)Medio formulado 2 (g/l)Medio formulado 3 (g/l)

Macronutrientes

NaNO22.5x10-1-2.5x10-1

CaCl2.2H2O2.5x10-22.5x10-22.5x10-2

MgSO4.7H2O7.5x10-37.5x10-27.5x10-2

K2HPO47.5x10-3-2.25x10-2

KH2PO47.5x10-31.75x10-11.76x10-1

NaCl7.5x10-32.5x10-32.5x10-2

Proteose peptone1.002.17-

(NH4)2SO4-2.5x10-1-

Glucosa15.015.0-

Solucin EDTA

EDTA--5.0x10-2

KOH--3.1x10-2

Solucin cida de hierro

FeSO4.7H2O--4.97x10-3

Solucin de Boro

H2BO22.86-1.14x10-2

Solucin de metales traza

MnCl2.4H2O1.81-1.44x10-3

ZnSO4.7H2O2.22x10-1-8.82x10-3

NaMoO4.5H2O3.9x10-1--

CuSO4.5H2O7.90x10-2-1.57x10-3

Ca(NO3)2.6H2O4.94x10-1-4.89x10-4

Tabla 2. Caracterizacin de una vinaza y propiedades qumicas [7]

CompuestoConcentracin (%p/p)

Solidos totales60

Materia Orgnica46

Carbono no oxidable18

Nitrgeno0.95

Fosforo (P2O5)0.04

Potasio (K2O)4.88

Calcio (CaO)1.31

Magnesio (MgO)0.67

Sulfatos (SO4)2.59

Elementos menoresmg/kg

Manganeso (Mn)43

Cobre (Cu)10

Zinc (Zn)19

Boro (B)6

Caractersticas adicionales

Densidad (kg/m3)1300

pH4.5 a 5

Conductividad Elctrica (dS/m)17

Viscosidad (cPs)450

La diferencia ms notoria entre los tres medios de cultivo es el uso de la glucosa, esto se debe a que en el tercer medio de cultivo la C. vulgaris crece de forma auttrofa.1.3.1Condiciones de cultivo auttrofasLas condiciones de cultivo de manera auttrofa que se han reportado en la literatura son una intensidad lumnica de 60 umol de fotones m-2s-1 a una temperatura de 27C, una agitacin de 140 rpm y un tiempo de crecimiento de 144 horas, el pH recomendado es de 7 [4]. La cantidad de dixido de carbono recomendado es el 2% v/v y con un flujo de aire de 0.400 vvm [6], la cintica de crecimiento de la C. vulgaris que se muestra en la figura 3 se realiz con las condiciones anteriormente nombradas.El intervalo de tiempo en que se realiza el conteo de clulas es cada 24 horas.

Figura 3. Crecimiento de C. vulgarisde forma auttrofa [6].1.3.2 Condiciones de cultivo hetertrofasEl crecimiento heterotrfico se realiza en ausencia de luz, pero es necesario suministrar oxigeno ya que este es un factor primordial en el crecimiento hetertrofo. Esto se debe a la respiracin celular y si se suministra poco oxigeno la tasa de crecimiento disminuye. Se debe considerar que en la especie C. vulgaris el crecimiento auttrofo es 5.5 veces menos rpido que el crecimiento hetertrofo ya que se produce 16 veces ms ATP [3]. Algunas condiciones reportadas para el crecimiento heterotrfico son una temperatura de 28C, una velocidad de agitacin de 150 a 180 rpm y ausencia de luz, se realiza un crecimiento de 4 a 6 das, el inocuo inicial debe ser del 10% v/v [8,9,10].Tambin se tienen unas caractersticas fsicas del residuo donde se realiz un cultivo de la C. vulgaris en la tabla 3, esto es importante tenerlo en cuenta puesto que gracias a esto existe una variacin en la concentracin de azucares y sales en el medio.Tabla 3. Composicin y propiedades de una vinaza caracterizada para un crecimiento heterotrofico [8]

ParametroSin centrifugarCentrifugada

pH4.24.1

Total solidos suspendidos (g/L)190.1

Total solidos disueltos (g/L)4140

Total COD (g/L)8045

Total COD disueltos (g/L)4845

Total azucar (g/L)2712

Total Nitrogeno (g/L)5.51.5

La siguiente cintica de crecimiento presentada en la figura 4 corresponde a una cintica de crecimiento de la C. vulgaris en un medio heterotrfico a base de agua de lavado proveniente del lavado de la soya:

Figura 4. Cintica de crecimiento de la C. vulgaris en un medio heterotrfico a base de agua de lavado [9].1.3.3 Condiciones de cultivo mixotroficaSe ha realizado el crecimiento de la C. vulgaris de manera mixotrofica [10], donde las condiciones de cultivo fueron las siguientes: se realiz en cultivo en un medio Bristol, con nitrato como fuente de nitrgeno a un pH de 7.0, con luz continua a 110.35 uE m-2s-1, sin un suministro directo de dixido de carbono, el cultivo se mantuvo en aireacin constante a un flujo de 0.45 Lmin-1, el aire fue filtrado. El cultivo tambin se realiza en el residual de ablandamiento de soya a una concentracin inicial de 20x106 celmL-1. El tiempo de cultivo es de 72 horas, algunas condiciones lumnicas recomendadas se encuentran entre 300 y 880 lx [8,10].A continuacin en la figura 5 se presenta la cintica de crecimiento de la C. vulgaris en diferentes medios de cultivo a base de manera mixotrofica:

Figura 5. Crecimiento de C.vulgaris en diferentes medios de soya [11].Dependiendo del tipo de cultivo que se aplique, se tendrn diferentes concentraciones de carbohidratos, lpidos y protenas en la C. vulgaris, en la tabla 4 se muestra la concentracin de estos componentes en un medio heterotrfico y en la figura 6 se muestra la concentracin de los componentes celulares en un cultivo mixotrofico:Tabla 4. Composicin celular de C. Vulgaris cultivada heterotroficamente [12]

CompuestoComposicin de la biomasa (%)

Clorofila10.01

Lpidos8.62

Protenas40.04

Azucares28.96

Cenizas9.89

Figura 6. Concentracin de lpidos, carbohidratos y protenas en la C. Vulgaris creciendo mixotroficamente[11].

Por ltimo se presenta un anlisis del contenido celular comparativo entre un crecimiento heterotrfico y mixotrofico en la figura 7, y los tres crecimientos auttrofo, hetertrofo y mixotrofico en la tabla 5:

Figura 7. Composicin qumica de la C. vulgarisen un medio heterotrfico y mixotrofico [10] donde los medios de cultivo son uno preparado, .Tabla 5. Comparacin del contenido de lpidos de C. Vulgaris por medio de las tres diferentes formas de cultivo [3].

Tipo de crecimientoLipid/PhoLipid/O2Lipid/CO2Lipido/GLC

Auttrofo0.00500.05010.0578-

Auttrofo0.00470.05010.0578-

Auttrofo0.00410.03780.0598-

Auttrofo0.00100.02110.0598-

Hetertrofo0.00930.08702.43590.3552

Mixotrofico0.00820.07640.27970.4371

Mixotrofico0.00500.05030.058110.513

Mixotrofico0.00100.00910.059863.828

Donde los rendimientos estn presentados en mg de lpidos/ mmol de sustrato, el crecimiento hetertrofo y mixotrofico se realiza con glucosa, el auttrofo con dixido de carbono al igual que el mixotrofico.

2 Metodologa experimental

2.1 Seguimiento cinticoEl seguimiento de la cintica de crecimiento se puede realizar por tres formas, la primera es conteo en cmara de Neubauer [11], la segunda es peso seco y relacionarla con la medida de la absorbancia [8] o simplemente usar la medida del peso seco [10]. La metodologa experimental utilizada es la presentada en la figura 8, en la figura 9 se muestra la medicin de peso seco y en la figura 10 la medicin de absorbancia:

Figura 8. Procedimiento experimental para conteo en cmara de Neubauer.*Las diluciones requeridas varan dependiendo del tiempo que tenga el cultivo, 1 en 3 para un rango de 1 a 2 das, 1 en 10 para un rango de 3 a 5 das y 1 en 15 para un rango de 5 das en adelante.

Figura 9. Procedimiento experimental para medir peso seco.

Figura 10. Procedimiento experimental para medir absorbancia.Para las pruebas de absorbancia y peso seco es necesario realizar un lavado de la biomasa, las clulas que se encuentran especialmente cultivadas en las vinazas contienen un alto grado de sales e impurezas que generan un error experimental si no son retiradas, por esto es necesario lavarlas con agua y centrifugarlas 4 veces como se indica en los pasos 2 a 7 de la Figura 8.La curva de calibracin entre absorbancia y peso seco se construye realizando los procedimientos de medicin de peso seco y medicin de absorbancia en paralelo para cada muestra, utilizando como blanco agua y midiendo la absorbancia a 540nm.2.2 Medicin de lpidosLa medicin de la cantidad de lpidos presentes en la biomasa se realiza mediante el siguiente procedimiento citado en [13] y presentado en la figura 11.

Figura 11. Procedimiento experimental para determinar la cantidad de lpidos.

2.3 Medicin de azucaresLa medicin de azucares reductores se realiza con el mtodo del DNS (cido dinitrosaliclico), el DNS es preparado para reaccionar con una concentracin mxima de 4 g/l de azcar; el procedimiento es el siguiente presentado en la figura 12:

Figura 12. Metodologa para la medicin de azucares reductores.Para este DNS se realiz un posterior curva de calibracin que relaciona la absorbancia con la concentracin de azucares reductores.2.4 Medicin de protenasPara la cuantificacin de protenas se utiliz el mtodo del Bradford, pero para poder aplicar este mtodo es necesario desdoblar y desnaturalizar las protenas con beta-mercaptoetanol y SDS. El reactivo de Bradford solo es capaz de medir una concentracin mxima de 20g/mL de protena, por lo cual es necesario realizar diluciones para poder cuantificar la cantidad; el procedimiento es el siguiente [14] presentado en la figura 13:

Figura 13. Cuantificacin de protenas por el mtodo de reactivo de Bradford.

3 Resultados y anlisis

3.1 Preparacin del inoculo y adaptacin de la C. vulgaris a las vinazasComo se nombr anteriormente en las condiciones necesarias para el cultivo de algas de forma heterotrfica es necesario realizar un inoculo del 10% en volumen. El medio formulado que se utiliz fue el nmero uno de la tabla 1. En la experimentacin se prepararon 3 muestras de vinaza cada una con porcentajes diferentes, las proporciones fueron 50% 80% y 95% de vinaza y se prepar un blanco de crecimiento positivo que contena el medio formulado. En un principio el disolvente en las vinazas era agua pero transcurridas dos corridas del experimento las microalgas no presentaron un crecimiento considerable en los medios, en cambio en el medio formulado que siempre fue usado como un blanco de crecimiento positivo si se present crecimiento en las dos corridas. Al observar este patrn de no crecimiento se pudo concluir que las vinazas no contenan algn componente necesario para el crecimiento de la C. vulgaris, por lo cual fue necesario cambiar el disolvente de las vinazas y usar medio formulado sin glucosa en lugar de agua. A pesar de aumentar la concentracin de algunos compuestos como los fosfatos y los nitratos que ya se encuentran presentes en las vinazas las microalgas son capaces de soportar los excesos de estos compuestos ms que las deficiencias de algunos otros. No fue posible determinar experimentalmente los compuestos ausentes en la vinaza por lo cual se recomienda usar en todos los casos un porcentaje de medio formulado sin glucosa. La adaptacin de la microalga se realiz de la siguiente manera: en la primera semana se realiz una siembra desde una colonia en agar a un medio formulado lquido para preparar un pre-inoculo, este se dej en crecimiento por 2 das, luego se realiz el inoculo 10% volumen a volumen directamente en los medios formulados de vinaza. Al realizar esto el experimento fracas puesto que los medios formulados son muy hostiles y adems se encontraba diluido en agua, la ausencia de compuestos necesarios para el crecimiento provoco la inhibicin de la mayora de las clulas.Para el inoculo de la segunda corrida se centrifugaron todas las muestras, se concentr la biomasa y se combinaron todas las muestras creando as un inoculo con clulas viables que se encontraban en el blanco de crecimiento positivo, las pocas clulas viables presentes en las vinazas y una gran cantidad de microorganismo muerto. En la segunda corrida el resultado no fue el esperado en las vinazas, la concentracin de la biomasa fue muy baja pero se logr observar un cambio de tonalidad en el blanco de crecimiento positivo, este cambio de tonalidad se debe a la prdida parcial de cloroplastos en la clula a causa de la ausencia de luz, el cambio de tonalidad se puede observar en la Figura 14.En la tercera corrida se realizaron los mismos pasos de la segunda corrida, la nica diferencia fue la preparacin de los medios con vinaza ya que se us medio formulado sin glucosa como disolvente en lugar de agua, esto produjo un resultado positivo y esperado en todas las muestras.La metodologa a seguir para la adaptacin de la C. Vulgaris a un medio tan hostil como lo es la vinaza es preparar un blanco crecimiento positivo con medio formulado, a los dos das centrifugar y realizar una siembra en un medio formulado con el 5% de vinaza, cada dos das repetir el procedimiento aumentando la concentracin de vinaza a 20% posteriormente a 50%, luego a 80% y por ultimo a 95%, recordando que como diluyente se debe usar el medio formulado. A medida que la microalga se va adaptando a las vinazas y debido a la turbidez del medio de cultivo se van a ir perdiendo los cloroplastos por lo cual la C. Vulgaris va a crecer color blanco, sin embargo al observarla al microscopio se puede observar una tonalidad verde claro, en la Figura 15 se muestra la C. Vulgaris vista al microscopio.AB

CFIgura14. Diferencias de tonalidad en las dos primeras corridas realizadas. A) Primera corrida, B) Segunda corrida, C) Diferencia de tonalidad en la biomasa concentrada y lavada, de izquierda a derecha los medio son: Blanco de crecimiento positivo, 5% de vinazas, 20% de vinazas, 50% de vinazas, 80% de vinazas y 100% de vinazas.

Figura 15. C. vulgaris vista a travs del microscopio a 10X, adaptada al medio con vinaza.Los volmenes experimentales usados son 120mL y el inoculo se prepar con el procedimiento anteriormente explicado, para la siembra se us el 10% volumen a volumen.3.2 Seguimiento y ajuste de la cintica de crecimientoA la cintica de crecimiento se le realizo un seguimiento por los tres mtodos nombrados en el numeral 4.1; el mtodo ms confiable es la medicin de peso seco, esto se debe a que no es necesario realizar diluciones.Al realizar el conteo con cmara de Neubauer el error experimental poda tomar valores de hasta un 30%, esto se debe al factor de dilucin que se maneja, en primera instancia tenemos el factor de dilucin que utiliza la cmara que corresponde a 1x10-4 el cual se ve multiplicado por el factor de dilucin que como mnimo es 3, al ver estas relaciones solo es necesario contar una clula de ms o una clula menos y nuestro resultado se ve afectado con +3x104 clulas cada litro, lo cual es un error bastante considerable. Solo se realiz una prueba con la cmara de Neubauer y fue para la primera corrida, los resultados se pueden observar en la Figura 16.

Figura 16. Medicin de la cintica de crecimiento para la primera corrida por el mtodo de conteo en cmara de Neubauer, las lneas negras nos indica la diferencia medida con la desviacin estndar entre la cantidad de clulas del medio ms concentrado en vinazas con respecto al menos concentrado; la lnea azul corresponde al blanco de crecimiento positivo.En esta grafica se puede observar que no existe una diferencia considerable en el nmero de clulas de los medios formulados que contienen vinaza y agua como disolvente; adicional a esto es posible evidenciar el error experimental que ocurre en este mtodo de seguimiento cintico, los datos se encuentran en un rango muy bajo de desviacin estndar lo cual considera estas tendencias prcticamente iguales, dando como resultado una inhibicin del microorganismo en el medio con vinaza. Por ltimo se puede observar otro inconveniente con este mtodo, si la mezcla se deja en reposo las clulas tienden a precipitarse y si se realiza el muestreo sin re-suspender se obtiene un error como el que se observa en el tiempo 240 horas, en todas las muestras se encontr un decrecimiento que en un principio estaba asociado a la muerte celular, pero al observar los datos del siguiente tiempo es posible descartar esta posibilidad ya que se conserva una tendencia. Con base a este experimento es posible descartar el mtodo de conteo con cmara de Neubauer debido al error que fluctuar entre el 30% y 40% dependiendo de las diluciones que sea necesario realizar.El segundo mtodo de seguimiento que se le realizo a la cintica fue medir absorbancia y relacionarla por medio de una curva de calibracin con el peso seco, este mtodo tampoco fue adecuado para el seguimiento cintico, esto se debe a que la C. Vulgaris pasado el tiempo y debido al estrs que le causa el medio con vinaza comenz a aglomerarse y a sedimentarse, formando as una solucin con partculas suspendidas de manera no uniforme lo cual imposibilita obtener un dato correcto de la absorbancia, el mtodo es confiable para bajas concentraciones del microorganismo caso en el cual no forma aglomeraciones. A causa de esto es necesario descartar este mtodo de seguimiento puesto que arroja datos poco confiables.Por ltimo se utiliz el mtodo de medicin del peso seco, es de esperar que debido a la temperatura se puedan evaporar compuestos voltiles presentes en la clula, pero como se mostr en la tabla 4 ms del 60% del contenido celular son lpidos, protenas y azucares los cuales a 70oC no se evaporan. Los resultados obtenidos con esta metodologa son los mostrados en la figura 17 y en la tabla 6 se muestra la diferencia de peso seco entre la biomasa sin lavar y lavada.Tabla 6. Diferencia en el peso seco de la biomasa lavada y sin lavar siguiente el procedimiento de la figura 9.

MuestraPeso Biomasa lavada (g)Peso Biomasa sin lavar (g)Porcentaje de diferencia (%)

0% vinaza0.51500.51512%

50% vinaza0.55040.55807%

80% vinaza0.56970.570311%

95% vinaza0.53750.538824%

Figura 17. Seguimiento cintico de la C. Vulgaris con la metodologa de medicin de peso seco para la tercera corrida experimental, con el microorganismo adaptado a la vinaza y usando como disolvente de la vinaza medio formulado sin glucosa.En esta corrida se muestra claramente el crecimiento de la C. Vulgaris en el medio preparado con vinaza y usando como diluyente medio formulado, se puede descartar el error producido por las sales presentes en las vinazas ya que se realiz un lavado de la biomasa antes de secarla, esto con el fin de retirar cualquier impureza y sal que se encontrar adherida a la pared celular del microorganismo. Teniendo estos datos experimentales y la medicin de consumo de sustrato la cual se realiz con medicin por DNS cuyos resultados se muestran en la Figura 18 fue posible realizar el ajuste a un modelo cintico de Monod, el modelo consta de los siguientes parmetros [15]:(1)(2)(3)(4)Donde el parmetro corresponde a la tasa de crecimiento y sus unidades son tiempo-1, este a su vez es funcin de la concentracin de sustrato S y de dos parmetros cinticos que son la tasa mxima de crecimiento y la afinidad del microorganismo al sustrato , la velocidad de produccin de biomasa es la tasa de crecimiento por la concentracin de biomasa X y la velocidad de consumo de sustrato es la velocidad de produccin de biomasa dividida entre el rendimiento global de la produccin de biomasa con respecto al consumo de sustrato , los resultados obtenidos para estos parmetros se muestran en la tabla 7.

Figura 18. Consumo de sustrato contra el tiempo en la tercera corrida experimental para la C. Vulgaris en diferentes concentraciones de vinaza usando como disolvente medio formulado sin glucosa.

Tabla 7. Parmetros cinticos obtenidos para la C.vulgaris en diferentes concentraciones de vinaza usando como disolvente medio formulado sin glucosa.

Concentracin de vinazamax (1/h)ks (g/L)Yxs (adimensional)

Blanco de crecimiento positivo0.0455.50.090

50% vinaza0.0452.00.280

80% vinaza0.0453.50.220

95% vinaza0.04540.170

En la figura 19 se muestra la validacin del modelo cintico, esto se realiza mostrando los resultados experimentales obtenidos para la tasa de crecimiento calculada con los tiempos de generacin usando la ecuacin 4 contra la velocidad de consumo de sustrato rs y en la misma grafica los mismos parmetros calculados con los parmetros cinticos de la tabla 7.

AB

CDFigura 19. Validacin de los parmetros cinticos y de la tabla 6 con los datos experimentales para el ajuste al modelo tipo Monod, A) blanco de crecimiento positivo, B) 50% medio formulado sin glucosa-50% vinazas, C) 20% medio formulado sin glucosa-80% vinazas, D) 5% medio formulado sin glucosa-95% vinazas.Como se puede apreciar en la figura 18 el ajuste no parece ser muy adecuado, esto se debe a que el modelo cintico tipo Monod no es el ms adecuado, aun as los parmetros obtenidos funcionan como comparativo de cada medio formulado, en la figura 20 se muestran las cinticas tanto experimentales como ajustadas al modelo de Monod.

AB

CDFigura 20. Seguimiento cintico de la C. vulgaris para los diferentes medios formulados, se muestran los datos experimentales de concentracin de biomasa (g/L) y tiempo (h) y el modelo cintico tipo Monod al cual fue ajustada cada cintica con los parmetros de la tabla 6. A) Blanco de crecimiento positivo, B) 50% medio formulado sin glucosa-50% vinazas, C) 20% medio formulado sin glucosa-80% vinazas, D) 5% medio formulado sin glucosa-95% vinazas.El rendimiento ms alto de biomasa consumo de sustrato observado es en los medio preparados con 50% vinazas y 50% medio formulado sin glucosa como disolvente y el 80% vinazas y 20% medio formulado sin glucosa como disolvente, esto quiere decir que hubo un alto crecimiento de la C. Vulgaris con una cantidad reducida de sustrato si se compara la cantidad presente en los dems medios. Los dos valores son muy cercanos y la diferencia que se evidencia entre ellos se puede deber a error experimental. Sin embargo se puede ver que este rendimiento se ve reducido en el medio 95% vinaza 5% medio formulado sin glucosa como disolvente, esto se puede deber a una inhibicin ocasionada por algn compuesto en exceso presente en la vinaza. Es posible establecer experimentalmente un punto ptimo de rendimiento construyendo una curva que relacione el rendimiento biomasa-consumo de sustrato con el porcentaje de vinazas en el medio. Con respecto al parmetro de crecimiento, al ser calculado con la ecuacin 4, en todos los medios se evidencian de cuatro a cinco tiempos de generacin, agregando a esto que la cintica de los 4 medios fue seguida al mismo tiempo y al tratarse de la misma cepa de C. vulgaris era de esperar que las tasas de crecimiento especificas fueran similares, en este caso son iguales, puesto que cercanas las 200 horas en todos los medios la micro alga entra a fase estacionaria. La tasa de crecimiento especifica mxima es de 0.045 h-1.Analizando los valores obtenidos para la constante de afinidad del sustrato se puede observar que la C. vulgaris presenta mayor afinidad en el medio preparado al 50% vinazas, seguido del medio preparado al 80% de vinazas, este efecto se evidencia en la figura 18 que nos muestra el consumo de sustrato con respecto al tiempo, el sustrato es consumido rpidamente en el medio al 50% de vinazas y se consume de forma muy lenta en el medio formulado sin vinaza. Esto se debe a la adaptacin de la C. vulgaris al medio hostil que contiene vinaza. Sin embargo se observa que a mayor concentracin de vinaza la afinidad por el sustrato se reduce, esto se debe a un clara inhibicin de la microalga a causa de una alta concentracin de algn componente presente en la vinaza, es posible mediante experimentos ms rigurosos encontrar el componente inhibidor y realizar un ajuste cintico donde se tenga en cuenta la misma constante de afinidad del sustrato y se considere un trmino adicional de inhibicin a altas o bajas concentraciones de uno de los compuestos en el medio de crecimiento.3.3 Contenido celularAl realizar las pruebas de extraccin de lpidos y medicin de protenas se obtuvieron los resultados reportados en la figura 21.

Figura 21. Porcentaje de protenas y lpidos presentes en la C. Vulgaris para los diferentes medios formulados con vinaza.

Como se observa que en casi todos los casos la cantidad de protenas es ms alta que la cantidad de lpidos, la cuantificacin de lpidos tiene un cierto parecido a los presentados en la figura 6, pero los datos correspondientes a la cantidad de protenas se encuentran desfasados ya que es de esperar que este porcentaje ocupe cerca del 50% del contenido celular. Los datos obtenidos posiblemente no tienen mucha validez y es necesario aplicar un mtodo ms certero de cuantificacin de protenas, el problema principal en la medicin de protenas es ocasionado por la complejidad de la extraccin de las mismas y la desnaturalizacin, es posible que durante el experimento no se hayan extrado totalmente las protenas y peor an las protenas extradas no fueron totalmente desnaturalizadas. La extraccin de las protenas se realiz con la biomasa seca, pero la recomendacin es realizarla con la biomasa concentrada y hmeda, puesto que as la lisis y la extraccin es mucho ms fcil de realizar, al igual que la desnaturalizacin de las protenas.Con los lpidos ocurre algo muy similar, la diferencia es que durante el experimento hubo una cantidad de biomasa a la cual es recomendable realizarle una extraccin adicional con cloroformo.Al tener estas consideraciones presentes se puede ver que los resultados no presentan mucha confiabilidad por lo cual es necesario buscar otra metodologa o complementar esta metodologa con tcnicas ms certeras de lisis celular y extraccin de protenas y lpidos.La cantidad de lpidos tiene un aumento a medida que la concentracin de vinaza es mayor, esto se puede deber a la hostilidad del medio y que posiblemente la presin osmtica es mayor que en agua con sales, posiblemente la respuesta a este estrs sea generar una pared celular ms gruesa por lo cual la cantidad de lpidos aumenta.

4 Conclusiones Las vinazas son un medio de cultivo hostil pero la C. vulgaris es capaz de crecer en ellas. Las vinazas deben ser reforzadas con el medio formulado para completar los nutrientes que hacen falta y son requeridos en el crecimiento de la C. vulgaris. La adaptacin de la C. vulgaris a las vinazas puede tomar cerca de 2 semanas con la metodologa propuesta para la preparacin del inoculo. El mtodo ms adecuado para el seguimiento cintico es la medicin de peso seco ya que no genera un error muy grande gracias a que no se necesita realizar diluciones. La medicin de los azucares reductores se puede realizar con la prueba de DNS presentando resultados bastante confiables. Se puede obtener un rendimiento mximo de concentracin de biomasa con respecto a la cantidad de sustrato consumido, este rendimiento se reduce a medida que aumenta la concentracin de vinaza, pero en el caso del medio formulado el rendimiento es bajo, lo cual indica que existe un mximo rendimiento en una concentracin de vinaza especifica. La concentracin de biomasa al igual que el rendimiento de consumo de sustrato tambin presenta un mximo, a medida que aumenta la concentracin de vinaza aumenta la concentracin de biomasa, pero llega hasta un punto mximo donde a altas concentraciones de vinaza se inhibe el crecimiento, la velocidad mxima de crecimiento se reduce y la concentracin de biomasa tambin se reduce. A medida que aumenta la concentracin de vinaza la concentracin de lpidos tambin aumenta. La metodologa usada para extraer y cuantificar las protenas y los lpidos no parece ser la ms adecuada ya que al parecer no se puede cuantificar la cantidad total de estos compuestos presentes en la C. vulgaris.

5 Bibliografa[1] F. Hadj-Romdhanea, P. Jaouena, J. Pruvosta, D. Grizeaua, G. Van Voorena, P. Bourseaua. Development and validation of a minimal growth medium for recycling Chlorella vulgaris culture. Bioresource Technology 123 (2012) 366374.[2] Octavio Perez-Garcia, Froylan M.E. Escalante, Luz E. de-Bashana,b, YoavBashan. Heterotrophic cultures of microalgae: Metabolism and potential product. Water research 45 (2011) 11-36.[3] Javier Bernache, Orfil Gonzles, Csar M. Gmez, Francisco J. Parra, Rubn Gonzles, Yolanda Gonzles, Jorge R. Robledo. Construccin de un modelo metablico para simular la distribucin de flujos de carbono y formacin de cidos grasos en Chlorella Vulgaris. XIV Congreso nacional de biotecnologa y bioingeniera. Junio 2011.[4] Juan Jacobo Jaramillo Obando. Evaluacin tecno-econmica de la produccin de biocombustibles a partir de microalgas. Tesis de maestra. Universidad Nacional de Colombia. Ao 2011.[5] Tamarys Heredia-Arroyo, Wei Wei, Roger Ruan, Bo H. Mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris and its potential application for the oil accumulation from non-sugar materials. biomass and bioenergy 35 (2011) 2245-2253.[6] Lina Maria Gonzlez Gonzles. Influencia de la deficiencia de nitrgeno y fsforo en las interacciones competitivas entre C. vulgaris y Scenedesmus Acutus. Tesis de maestra. Universidad Nacional de Colombia. Ao 2010.[7] Alvaro Garca O. y Carlos A. Rojas C. Posibilidades de Uso de la Vinaza en la Agricultura de Acuerdo con su Modo de Accin en los Suelos. Nota tcnica. Tecnicaa 2006.[8] Debjani Mitra, J. (Hans) van Leeuwen, BuddhiLamsal. Heterotrophic/mixotrophic cultivation of oleaginous Chlorella vulgaris on industrial co-products. Algal Research 1 (2012) 40-48.[9] Yalei Zhang, Hongyang Su, YunnaZhong, Chunmin Zhang, ZhengShen, WenjingSang, GangYan, XuefeiZhou. The effect of bacterial contamination on the heterotrophic cultivation of Chlorella Pyrenoidosa in wastewater from the production of soy bean products. Water research 46 (2012) 5509-5516.[10] Xingmei Han, Yuanguang Li, XinzhiSun, XiaodongWei, YongruSun, Yiqin Wang. Studies on the heterotrophic cultivation of transgenic Chlorella containing the rabbit defense in gene. Bioprocess Biochemistry 40 (2005) 3055-3060.[11] Liliana Gmez Luna, Inaudis lvarez, Roger Rivero. Cultivo de Chlorella Vulgaris sobre residual de soja con la aplicacin de un campo magntico. XXIII MIXING Junio de 2012.[12] E. B. Sydney, T. E. da Silva, A. Tokarski, A. C. Novak, J. C. de Carvalho, A. L. Woiciecohwski, C. Larroche, C. R. Soccol. Screening of microalgae with potential for biodiesel production and nutrient removal from treated domestic sewage. Applied Energy 88 (2011) 32913294.[13] Yujie Feng, Chao Li, Dawei Zhang. Lipid production of Chlorella vulgaris cultured in artificial wastewater medium. Bioresource Technology 102 (2011) 101105.[14] www.bio-rad.com. Produc list and Technical tips. Visitado Mayo de 2013.[15] Bioprocess Engineering Principles. Pauline M. Doran. Elsevier Science & Technology Books, Tercera edicin.

Anexo ACurva de calibracin correspondiente a la prueba de peso seco relacionada con la absorbancia mostrada en la figura 22.

Figura 22. Curva de calibracin absorbancia contra peso seco.

Anexo BCurva de calibracin correspondiente a la medin de azucares reductores con DNS mostrada en la figura 23.

Figura 23. Curva de calibracin absorbancia contra concentracin de azucares reductores.

Anexo CCurva de calibracin correspondiente a la medin de protenas con el reactive de Bradford mostrada en la figura 24.

Figura 24. Curva de calibracin absorbancia contra concentracin protenas.