ESTUDIO DEL EFECTO DE TACROLIMUS EN LA RESISTENCIA

Profesor Patrocinante Dra. Claudia Quezada Monras Instituto de Bioquímica y Microbiología Facultad de Ciencias

ESTUDIO DEL EFECTO DE TACROLIMUS EN LA RESISTENCIA

MÚLTIPLE A DROGAS DE LAS STEM LIKE CELLS DE GLIOBLASTOMA MULTIFORME HUMANO

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico

VALENTINA ANDREA ARRIAGADA NOACK

VALDIVIA – CHILE

2016

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero agradecer al proyecto Fondecyt 1121121, el cual hizo posible

el siguiente estudio y a la Dra. Claudia Quezada por recibirme en su laboratorio y por

todo su apoyo. A Wallys, por tener la paciencia y amabilidad de enseñarme cuando

recién comencé en el laboratorio y a Angelo por estar siempre dispuesto a ayudarme.

A mis compañeros de laboratorio, ya que sin ellos el día a día no sería tan ameno y

agradable. Además, no puedo dejar de agradecer a mis compañeros de carrera y

amigos, Cony, Gaby, Nivia, Sergio, Esteban y Lucho, los cuales hacían más

agradables todas las tardes y noches de estudio. A mi familia, por su apoyo y

paciencia, y por sobre todo por darme las herramientas necesarias para poder

completar esta etapa. Finalmente, quiero agradecer a Nicolás, por estar conmigo

desde antes que comenzara mi etapa universitaria, por estar ahí cada vez que lo

necesitaba, y sobre todo por entenderme y apoyarme. Gracias.

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ÍNDICE GENERAL

1. RESUMEN ............................................................................................................... 1

1.1 Summary ......................................................................................................... 2

2. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 3

2.1 Introducción al problema: cáncer y tumores cerebrales ...................................... 3

2.2 Resistencia a Múltiple Drogas (MDR) ................................................................. 5

2.3 Cancer Stem Cells en Glioblastoma Multiforme ................................................ 11

2.4 Inmunosupresores y cáncer .............................................................................. 15

2.5 Modelo tumoral in vivo ...................................................................................... 18

2.6 Hipótesis y objetivos ......................................................................................... 21

2.6.1 Hipótesis ..................................................................................................... 21

2.6.2 Objetivo general .......................................................................................... 21

2.6.3 Objetivos específicos .................................................................................. 21

3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 22

3.1 Materiales ......................................................................................................... 22

3.1.1 Material biológico ........................................................................................ 22

3.1.2 Reactivos .................................................................................................... 22

3.1.3 Equipos ....................................................................................................... 24

3.2 Métodos ............................................................................................................ 24

3.2.1 Cultivo de líneas celulares de GBM ............................................................ 24

3.2.2 Drogas y tiempo de incubación ................................................................... 25

3.2.3 Extracción de RNA total de células de GBM y GSCs ................................. 26

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3.2.4 Síntesis de cDNA ........................................................................................ 27

3.2.5 PCR en tiempo real ..................................................................................... 27

3.2.6 Fijación y marcaje de células para citometría de flujo................................. 29

3.2.7 Ensayo de transporte por acumulación de 5-carboxifluoresceína diacetato

(CFDA) en células de GBM ................................................................................. 30


(CFDA) en GSCs ................................................................................................. 31

3.2.9 Determinación de la concentración de proteínas totales ............................ 31

3.2.10 Ensayos de viabilidad celular por reducción de sales de Tetrazolio

(MTT) ................................................................................................................... 32

3.2.11 Medición de apoptosis celular mediante el marcaje con Anexina V y Yoduro

de Propidio ........................................................................................................... 33

3.2.12 Obtención y conteo celular para generación del modelo in vivo ............... 33

3.2.13 Inducción de tumores subcutáneos en ratas Sprague-Dawley ................. 34

3.2.14 Tratamientos con drogas antitumorales in vivo ......................................... 34

3.2.15 Extracción y fijación de tejidos tumorales ................................................. 35

3.2.16 Inmunohistoquímica .................................................................................. 35

3.2.17 Análisis estadístico ................................................................................... 38

4. RESULTADOS ....................................................................................................... 39

4.1 Efecto de FK506 sobre los niveles de transcrito del transportador MRP1 en

células adherentes y GSCs derivadas de las líneas celulares U87MG y C6 .......... 39

4.2 Efecto de FK506 sobre los niveles proteicos del transportador MRP1 en células

adherentes y GSCs derivadas de las líneas celulares U87MG y C6 ...................... 42

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4.3 Efecto de FK506 sobre la actividad del transportador MRP1 en células

adherentes y GSCs derivadas de las líneas celulares U87MG y C6 ...................... 47

4.4 Efecto de FK506 en combinación con vincristinca sobre la viabilidad de las

células U87MG ....................................................................................................... 50

4.5 Apoptosis celular bajo el tratamiento de FK506 combinado con vincristina en

células C6 ............................................................................................................... 52

4.6 Efecto de FK506 en combinación a vincristina sobre el crecimiento tumoral en un

modelo alogénico subcutáneo in vivo de glioblastoma ........................................... 54

4.7 Evaluación de la expresión de MRP1 en muestras de tumores subcutáneos

generados mediante la inoculación de GSCs ......................................................... 57

4.8 Evaluación de la expresión de Ki-67 en muestras de tumores subcutáneos


4.9 Evaluación de la expresión de GFAP en muestras de tumores subcutáneos


4.10 Evaluación de la expresión de Nestina en muestras de tumores subcutáneos


5. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 69

6. REFERENCIAS ...................................................................................................... 82

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Modelo de transportadores de resistencia a múltiple drogas. …...……………8

Figura 2. Modelo de resistencia a drogas en el tumor…………………………………...13

Figura 3. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles del transcrito de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular U87MG …………………………………………40

Figura 4. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles del transcrito de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular C6…….…………………………………………..41

Figura 5. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles de expresión de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular U87MG …………………………………………43

Figura 6. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles de expresión de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular C6…….…………………………………………..45

Figura 7. Efecto de la droga FK506 sobre la actividad de MRP1 en células adherentes

y GSCs de la línea celular U87MG…………………………………………………………48

Figura 8. Efecto de la droga FK506 sobre la actividad de MRP1 en células adherentes

y GSCs de la línea celular C6………………………………………………………………49

Figura 9. Efecto del tratamiento combinado FK506/vincristina sobre la viabilidad de

células adherentes y GSCs de la línea celular U87MG .…………………………………51

Figura 10. Efecto del tratamiento combinado FK506/vincristina sobre la apoptosis

celular en células C6………………………………………………………………………..53

Figura 11. Efecto del tratamiento combinado FK506/vincristina sobre el crecimiento

tumoral in vivo………………………………………………………………………………..55

Figura 12. Análisis por inmunohistoquímica de MRP1 en muestras de tumores bajo

distintas condiciones de tratamiento………………………………………………………58

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Figura 13. Análisis por inmunohistoquímica de Ki-67 en muestras de tumores bajo


Figura 14. Análisis por inmunohistoquímica de GFAP en muestras de tumores bajo


Figura 15. Análisis por inmunohistoquímica de Nestina en muestras de tumores bajo


Figura 16. Modelo del tratamiento de FK506 en combinación con vincristina………80

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Secuencia de los partidores utilizados………………………………………….28

Tabla II. Anticuerpos utilizados en la evaluación de los cortes tumorales……………37

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LISTA DE ABREVIATURAS

5FU : 5-Fluorouracilo

ABC : ATP binding cassette

B-27 : Suplemento de medio de cultivo libre de suero

BCA : Ácido becinconinico

BHE : Barrera hematoencefálica

BSA : Albúmina de suero de bovino

C6 : Línea celular de glioma de rata

CFDA : 5-carboxifluoresceína diacetato

CSCs : Células madre cancerígenas

CT : Tomografía computacional

CYP : Ciclofosfamida

D-MEM/F-12 : Medio de cultivo “Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture

F-12”

DMSO : Dimetil sulfóxido

DTT : Dithiothreitol

ECM : Matriz extracelular

EDTA : Ácido etilendiaminotetraacético

EGF : Factor de crecimiento epidermal

FGF : Factor de crecimiento fibroblastico

FK506 : Droga inmunosupresora tacrolimus

GBM : Glioblastoma multiforme

GSC : Glioma Stem-like Cells (Células tipo-madre de glioma)

GSH : Glutatión

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HBMEC : Células endoteliales humanas de la microvasculatura cerebral

IHQ : Inmunohistoquímica

MDR : Multiresistencia a drogas

MGMT : O6-alquilguanina-DNA alquiltransferasa

MK571 : Antagonista del receptor de leucotrienos D4

MRI : Imagen de resonancia magnética

MRP1 : Multidrug resistance-associated protein 1

NMU : N-nitrosometilurea

NSC : Células madre normales

OMS : Organización Mundial de la Salud

PBS : Tampón fostato salino

PI : Yoduro de propidio

qPCR : Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

SCLC : Carcinoma de pulmón de células pequeñas

T98 : Línea celular de glioblastoma humano

U87MG : Línea celular de glioblastoma humano

UV : Utravioleta

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1. RESUMEN

El Glioblastoma Multiforme (GBM) es la forma más común y agresiva de tumor

cerebral y pese a los avances terapéuticos su índice de mortalidad sigue siendo elevado

reflejándose en una escasa sobrevida que no supera el año post tratamiento. Estos

tumores presentan una pobre respuesta a la quimioterapia, la cual estaría mediada por

la sobreexpresión de transportadores de la superfamilia ABC, siendo MRP1 el más

expresado en GBM. Se ha descrito la presencia de una subpoblación celular llamada

Glioma Stem-like Cells (GSCs), las que cumplirían un papel importante en el proceso de

tumorigénesis y quimioresistencia, asociandose además con altos niveles de expresión

de transportadores ABC. Se ha descrito que el uso de tacrolimus (FK506) modularía la

expresión y actividad del transportador MRP1 en líneas celulares de GBM, sin embargo

esto no ha sido estudiado en GSCs. Es por ello, que en este trabajo se propone el uso

de FK506 como agente quimiosensibilizador en GCSs. Por lo cual, se evaluó la expresión

del transcrito, proteína y actividad de MRP1 bajo el tratamiento con FK506; además de

la viabilidad celular bajo el tratamiento con FK506 en combinación a vincristina

(FK506/Vc), para finalmente determinar su efecto en un modelo tumoral in vivo. Nuestros

resultados indican que FK506 no altera los niveles de transcrito ni de la proteína de

MRP1, pero si disminuye la actividad de este transportador, lo que se relacionó además

con una menor viabilidad celular al tratar con FK506/Vc. Finalmente, el volumen de los

tumores disminuyó con el tratamiento combinado de FK506/Vc, al igual que los niveles

de expresión de ciertos marcadores tumorales (Ki-67, GFAP y Nestina). En base a estos

resultados, se concluye que FK506 actuaría como modulador de MRP1 en las GSCs,

proponiéndose como un nuevo agente quimiosensibilizador para el GBM.

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1.1 Summary

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most aggressive and common type of brain

cancer and despite of the therapeutic progress its mortality index remain high, which is

reflected in the poor survival that does not exceed the year post treatment. These tumors

have a poor response to chemotherapy, which could be mediated by ABC transporters

superfamily, being the MRP1 transporter expressed the most in GBM. It has been

described the presence of a cellular population called Glioma Stem-like Cells (GSCs), that

would play a role on the tumorigenesis and chemoresistance of GBM and has been linked

to high levels of ABC transporters. It has been described that the used of tacrolimus

(FK506) modulates the expression and activity of MRP1 in GBM cell lines, however this

has not been studied in GSCs. Therefore, this study proposes the use of FK506 as a

chemosensitizer agent in GSCs. For this purpose, we assessed the levels of mRNA,

protein and the activity of MRP1 under the treatment with FK506; furthermore, the cell

viability under the treatment with FK506 in combination with vincristine (FK506/Vc), to

finally assess the treatment in an in vivo tumor model. Our results denote that FK506 does

not disrupt the mRNA and the protein levels of MRP1, but it diminishes the transporter’s

activity, which has been related also with a lower cell viability when the cells was treated

with FK506/Vc. Finally, the tumors diminished its volume under the combined treatment

with FK506/vincristine, as the expression levels of several tumor markers (Ki-67, GFAP

and Nestin). Base on these results, it is concluded that FK506 would act as a modulator

of MRP1 in GSCs, being proposed as a new chemosensitizer agent for GBM.

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2. INTRODUCCIÓN

2.1 Introducción al problema: cáncer y tumores cerebrales

En la actualidad el cáncer es el mayor problema de salud pública, siendo el

responsable de una de cada cuatro muertes en el mundo (Siegel et al., 2013). En Chile,

el cáncer es la segunda causa de muerte, significando el 21,8% de las muertes y solo

superado por las enfermedades cardiovasculares que representan el 27,5% del total de

muertes. Entre las neoplasias más importantes y con mayor probabilidad de riesgo en

Chile, podemos encontrar el cáncer de estómago, próstata, pulmón y glándula mamaria

(Medina y Kaempffer, 2001).

Por otro lado, los tumores cerebrales si bien no representan una alta incidencia,

poseen una alta tasa de mortalidad, siendo la segunda causa de muerte en niños después

de las neoplasias hematopoyéticas (Peigñan et al., 2011; Siegel et al., 2013). Los gliomas

son los tumores cerebrales más comunes derivados de células gliales (Lu y Shervington,

2008) y se pueden clasificar histológicamente en astrocitomas, oligodendrogliomas y

oligoastrocitomas (Louis et al., 2001; Theeler et al., 2012). La Organización Mundial de

la Salud (OMS) clasifica estos tumores en cuatro grados según su histomorfología,

proliferación y la presencia de proliferación microvascular o necrosis, en donde los

tumores de grado I y II (astrocitoma pilocítico y difuso, respectivamente) corresponden a

tumores de bajo grado y los de grado III y IV (astrocitoma anaplásico y glioblastoma

multiforme, respectivamente) a tumores de alto grado (Theeler et al., 2012; Kyun Lim et

al., 2011; Ohgaki y Kleihues, 2005). Los tumores de alto grado corresponden al 60 – 75%

de los gliomas, siendo el Glioblastoma Multiforme (GBM) la forma más común, agresiva

y fatal. A pesar de los recientes avances y esfuerzos esta neoplasia sigue siendo el tumor

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de peor pronóstico, permaneciendo incurable (Huang et al., 2010; Clarke, Butowski, y

Chang, 2010).

El GBM se caracteriza, principalmente, por presentar astrocitos neoplásicos poco

diferenciados, gran heterogeneidad celular, regiones necróticas y hemorrágicas, alta

actividad mitótica y proliferación vascular (Holland, 2000; Rahman et al., 2010); y respecto

al origen de estos tumores, lo más frecuente es que se generen de novo, sin presentar

evidencia clínica alguna de un astrocitoma de menor grado, llamándose en este caso

GBM primario. Por otro lado, en aproximadamente el 10% de los casos, el GBM se

origina a partir de un astrocitoma de menor grado, por lo cual recibe el nombre de GBM

secundario (Tortosa et al., 2000; Van Meir et al., 2010).

El tratamiento actual para esta neoplasia consiste en la resección quirúrgica

seguida de radio y quimioterapia, en donde el fármaco de elección utilizado corresponde

a temozolomida, el cual es un alquilante del DNA (Clarke, Butowski, y Chang, 2010). Aun

así, la sobrevida de los pacientes, después de su diagnóstico no supera los 14,6 meses,

lo que se debe principalmente a la baja eficiencia de la resección quirúrgica, ya que las

células del GBM se infiltran en el parénquima cerebral sano limitando este procedimiento

(Clarke, Butowski, y Chang, 2010; Wainwright et al., 2012; Rath et al., 2013; Kim y Kumar,

2014). Otro motivo del fracaso terapéutico guarda relación con el hecho de que la

quimioterapia con temozolamida no resulta efectiva debido a un mecanismo de

resistencia mediado por la enzima O6-alquilguanina-DNA alquiltransferasa o MGMT, la

cual remueve el grupo alquilo del oxígeno en posición 6 de la guanina, revirtiendo el

efecto producido por la droga (Jacinto y Esteller, 2007; Clarke, Butowski, y Chang, 2010;

Zhang, Stevens and Bradshaw, 2012).

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Por estas razones, se debe comprender a fondo los mecanismos responsables de

la resistencia en esta neoplasia y debido a la escasa efectividad de los fármacos

antitumorales, es de suma importancia encontrar nuevas alternativas terapéuticas y

blancos farmacológicos para así finalmente otorgarles a los pacientes una mayor

sobrevida post quirúrgica.

2.2 Resistencia a Múltiple Drogas (MDR)

La resistencia que presentan los tumores a drogas antineoplásicas es una

de las razones más importantes por la cual la quimioterapia no es efectiva y uno de los

mecanismos involucrados es la resistencia a múltiples drogas o MDR (por el término

Multidrug resistance en inglés), fenómeno que permanece siendo el mayor obstáculo en

el tratamiento de una gran variedad de neoplasias (Munoz et al., 2007; Peigñan et al.,

2011). Este concepto describe un fenómeno caracterizado por la habilidad del tumor de

exhibir resistencia a una gran variedad de agentes quimioterapéuticos, cuyas estructuras

y mecanismos de acción pueden ser completamente diferentes (Krishna y Mayer, 2000;

Munoz et al., 2007; Baguley, 2010). Se han descrito un número de mecanismos que

explicarían este fenómeno, los cuales se han clasificado en mecanismos no celulares y

celulares. El mecanismo no celular se refiere a que independientemente de la vía de

administración de la droga (vía venosa, arterial u oral), ésta debe difundir a través del

torrente sanguíneo hacia el tumor y la resistencia se explica debido a una reducida

vascularización del tumor y por lo tanto, una reducida entrada de las drogas al mismo

(Krishna y Mayer, 2000; Baguley, 2010). En cambio, los mecanismos de resistencia

celular se pueden agrupar en distintas categorías: a) regulación alterada de la apoptosis,

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lo que lleva a la activación de mecanismos anti-apoptóticos como la sobreexpresión de

la familia de proteínas BCL2 y mutaciones en el gen supresor de tumores p53; b)

modificación metabólica de los fármacos, que puede llevarse a cabo por acción de la

enzima Glutatión S-transferasa; c) activación de mecanismos de reparación del DNA

como la ya mencionada MGMT que remueve el grupo alquilo de la guanina; d) alteración

de la diana molecular del fármaco, como lo es la alteración de la topoisomerasa II (blanco

de la droga etoposido); y e) la resistencia mediada por los transportadores ABC (ATP

Binding Cassette) (Krishna y Mayer, 2000; Paredes, Blanco y Echenique-Elizondo, 2006;

Shapira et al., 2011).

Los transportadores ABC son proteínas de membrana que funcionan como

bombas dependientes de ATP que previenen y protegen a la célula de la acumulación

intracelular de xenobioticos y compuestos tóxicos, incluyendo además a drogas

antitumorales, translocándolas al medio extracelular a través de la membrana plasmática

(Sharom, 2008; Cárcamo, Quezada y González-Oyarzún, 2009). En humanos, la familia

de transportadores ABC incluye 49 proteínas, las que se dividen en 7 subfamilias

(clasificadas de la letra A a la G), describiéndose a los transportadores ABCB1 (P-gp),

ABCC1 (MRP1) y ABCG2 (BCRP) como las principales proteínas identificadas en células

tumorales (Dean, Fojo y Bates, 2005; Sharom, 2008). Estas proteínas poseen 4 dominios,

correspondientes a 2 dominios transmembrana que consisten en 6 a 12 α-helices que le

confieren su especificidad por el sustrato; y 2 dominios de unión a nucleótido, los cuales

hidrolizan ATP, encargados de proporcionale la energía al transportador (Munoz et al.,

2007; Sharom, 2008; Lu y Shervington, 2008; Moitra, Lou y Dean, 2011).

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A la fecha, el transportador ABCB1 es uno de los más estudiados, siendo además

el primero en ser descubierto (Paredes, Blanco y Echenique-Elizondo, 2006). La

expresión de esta proteína se ha encontrado usualmente elevada en una gran variedad

de tumores, relacionandose con un fenotipo de extrema quimioresistencia en neoplasias

hematológicas y sólidas (Ozben, 2006; Paredes, Blanco y Echenique-Elizondo, 2006).

Por mucho tiempo, se creyó que esta proteína era la única que confería la

quimioresistencia a los tumores, sin embargo, Cole y colaboradores el año 1992

caracterizaron por primera vez al transportador MRP1, identificándolo como el

responsable del fenotipo MDR en la línea celular de cáncer pulmonar SCLC (Small Cell

Lung Carcinoma) (Cole et al., 1992; Paredes, Blanco y Echenique-Elizondo, 2006; Munoz

et al., 2007). Se ha demostrado que MRP1 se encuentra sobreexpresado en líneas

celulares y muestras de tejido de gliomas de alto grado en comparación a tejidos de

cerebros normales, en donde la expresión de MRP1 es casi ausente (Aronica et al., 2003;

Calatozzolo et al., 2005; Declèves et al., 2006; Ak et al., 2007). Además, MRP1 es

expresado en la membrana plasmática de células del endotelio vascular, sugiriéndose un

papel importante en la permeabilidad selectiva a las drogas, limitando su paso al cerebro

a través de la barrera hematoencefálica (BHE) (Benyahia et al., 2004).

Se han descrito una variedad de drogas antineoplásicas sustrato de MRP1

(alcaloides de la vinca, doxorrubicina, etopósido, paclitaxel, entre otros), las cuales, como

se indica en la figura 1, ingresan a la célula a través de un sistema de transportadores

específicos o inespecíficos. Una vez que estas drogas alcanzan el citoplasma son

conjugadas con Glutatión por acción de la enzima Glutatión S-transferasa y de esta forma

la droga puede ser extruida por el transportador MRP1 desde el citosol al medio

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Figura 1. Modelo de transportadores de resistencia a múltiple drogas. El modelo

explica la acción de un transportador tipo MRP1. En círculos rojos se indica el sustrato,

el cual entra a la célula mediado por un transportador especifico o inespecífico (cilindro

de líneas rojas, B), posteriormente es conjugado con Glutatión por la enzima Glutatión S-

transferasa y, de este modo, es transportado al medio extracelular por el transportador

ABC en un mecanismo dependiente de ATP (Modificado de Cárcamo, Quezada y

González-Oyarzún, 2009).

9

extracelular en un proceso dependiente de ATP (Renes et al., 1999; Declèves et al., 2006;

Cárcamo, Quezada y González-Oyarzún, 2009).

Estudios previos en nuestro laboratorio, confirman esta sobreexpresión del

transportador MRP1 en las líneas celulares (T98G y G44) y cultivos primarios de GBM

mediante ensayos de western blot e inmunohistoquimica, y además se logró demostrar

que este transportador poseía una alta actividad (Peigñan et al., 2011); por lo tanto, una

buena aproximación para combatir la multiresistenca y mejorar la respuesta a los

tratamientos en los pacientes con GBM, sería utilizar como blanco terapéutico al

transportador MRP1. De hecho, se ha demostrado en ensayos in vitro e in vivo, que al

down-regular MRP1, en líneas celulares y en modelos de xenoinjertos, se logra

quimiosensibilizar las células de GBM a las drogas anti-tumorales, y además en ratas

knock out para MRP1 se ha observado una mayor sensibilidad al tratamiento con

vincristina y etoposido (Munoz et al., 2007; Cárcamo, Quezada y González-Oyarzún,

2009).

Se han descrito estrategias para sobrellevar el fenómeno de MDR entre las cuales

destacan el uso de drogas que no son sustrato de estos transportadores ABC como

drogas alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas modificadas, entre otros; y el uso de

drogas que no son anticancerígenas y que modulan a estos transportadores (Choi, 2005;

Ozben, 2006). Hace ya 25 años que se describen moduladores para estas proteínas,

siendo los inhibidores de P-gp los más estudiados. El mayor desafío en este ámbito es el

desarrollo de moduladores que sean efectivos contra el fenómeno de MDR, pero que a

su vez no generen efectos secundarios ni toxicidad en el organismo, debido a que los

inhibidores inicialmente descritos como ciclosporina A o verapamil no fueron diseñados

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para inhibir la MDR, y por lo tanto poseían una baja afinidad por el transportador, lo que

se traducía que en ensayos clínicos se requirieran altas dosis provocándose efectos

secundarios (Ozben, 2006; Sharom, 2008). Es por ello, que se desarrollaron los

inhibidores de segunda generación, los cuales se crearon con el fin de disminuir los

efectos secundarios, pero éstos al ser administrados junto a una droga antineoplásica

terminaban interfiriendo con el metabolismo y aclaramiento del fármaco, ya que

competían por el complejo citocromo p450, lo que provocaba un aumento en la

concentración plasmática del fármaco y la toxicidad de éste (Choi, 2005; Ozben 2006;

Hubensack et al., 2007). Por lo tanto, se debieron desarrollar nuevos moduladores que

no fueran metabolizados por el complejo p450 y que no interfirieran con la

farmacocinética de la droga anticancerígena. Estos moduladores se denominaron de

tercera generación, y entre ellos podemos describir a tariquidar, cuyos ensayos han

exhibido buenos resultados en modelos de xenoinjertos, aumentando considerablemente

la actividad antitumoral de doxorrubicina y paclitaxel (Mistry et al., 2001; Choi, 2005;

Ozben 2006; Hubensack et al., 2007; Sharom, 2008; Patel et al., 2011).

En comparación con P-gp, para el transportador MRP1, solo se han descrito unos

pocos quimiosensibilizadores, en donde podemos destacar a MK571, análogo sintético

del Leucotrieno C4, el cual es exportado fisiológicamente por MRP1 (Munoz et al., 2007;

Sharom, 2008). Esta droga actúa revirtiendo el eflujo de los fármacos anticancerígenos,

lo cual ha sido corroborado por nuestro grupo de investigación mediante ensayos in vitro,

en los cuales se ha observado que al tratar cultivos primarios y líneas celulares de GBM

con MK571, en conjunto con las drogas antineoplásicas tales como vincristina, etoposido

y taxol (todas drogas sustrato de MRP1), se produce un aumento en la citotoxicidad y

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una disminución en la tasa proliferativa (Munoz et al., 2007; Cárcamo, Quezada y

González-Oyarzún, 2009; Peigñan et al., 2011). También, se ha descrito en nuestro

laboratorio que el inmunosupresor tacrolimus (FK506) es capaz de quimiosensibilizar la

línea celular T98G y cultivos primarios de GBM a drogas antineoplásicas, mediante la

disminución de la expresión y actividad de MRP1 (Garrido et al, 2011).

Por lo tanto, inhibir la actividad de este transportador, y por consiguiente aumentar

la retención de las drogas antineoplásicas mediante el uso de antagonistas, sería una

buena aproximación para revertir la baja eficacia de los tratamientos quimioterapéuticos.

2.3 Cancer Stem Cells en Glioblastoma Multiforme

Una característica importante de varios tipos de tumores es la gran

heterogenicidad celular que poseen, concepto que hace referencia a que dentro de un

mismo tumor existen diferentes subpoblaciones celulares con distintos perfiles

moleculares, las cuales se han generado por un gran número de mutaciones y cambios

epigenéticos (Gupta, Chaffer y Weinberg, 2009; Baguley, 2010; Navin et al., 2010). Hoy

en día, esta característica se considera la clave en la tumorigenicidad celular,

asociándose con la progresión, resistencia, potencial metastásico y recurrencia (Inda,

Bonavia y Seoane, 2014; Boonzaier et al., 2015). Una subpoblación celular llamada

“Cancer Stem Cells” (CSCs), que constituye una minoría dentro de las células

neoplásicas en el tumor, ha tomado gran relevancia en el último tiempo. Este tipo celular

comparte ciertas características con las Stem Cells normales (NSC), pudiéndose

encontrar en una gran variedad de neoplasias incluyendo el GBM humano (Visvader y

Lindeman, 2008; Huang et al., 2010). Esta subpoblación posee las habilidades de

12

autorenovación, multipotencialidad de diferenciación y, además, se les atribuye ser las

responsables del crecimiento y mantención del tumor (Lobo et al., 2007; Gupta, Chaffer

y Weinberg, 2009; Brescia et al., 2013). También, se han asociado estas células a la

capacidad de iniciación tumoral, debido a que al ser inoculadas en modelos animales

logran generar, mantener y propagar el tumor (Singh et al., 2004; Baiocchi et al., 2010;

Liu et al., 2010; Brescia et al., 2013; Han et al., 2015). Existe la teoría, de que las CSCs

provendrían de las NSC, lo que se podría explicar debido a que estas células poseen la

capacidad de reparar su DNA a medida que se autorenuevan y, por lo tanto, son más

susceptibles a acumular mutaciones cuando son expuestas a agentes carcinógenos, lo

que causaría una desregulación en las vías de autorenovación y proliferación celular

(Dean, Fojo y Bates, 2005; Burkert, Wright y Alison, 2006). Además, las células madre

neuronales son capaces de escapar de los mecanismos que controlan su proliferación y

diferenciación, lo que conlleva a una transformación de estas células a CSCs, pudiendo

dar lugar a un glioma (Wen y Kesari, 2008).

Esta subpoblación celular, en comparación con las células diferenciadas del tumor,

son relativamente quiescentes y poseen una baja tasa de división celular, características

que le confieren protección a la quimioterapia (Moitra, Lou, Dean, 2011). Una

característica de gran importancia, en lo que respecta a la quimioterapia, son los altos

niveles de expresión de transportadores ABC presentes en las CSCs, pudiéndose

explicar la recurrencia del tumor mediante el modelo de resistencia a drogas (Figura 2).

Este modelo describe que dentro del tumor encontramos células en diferentes grados de

diferenciación y una pequeña subpoblación de CSCs, las cuales una vez realizada la

13

Figura 2. Modelo de resistencia a drogas en el tumor. El modelo indica que la

resistencia a drogas puede ser mediada por las Cancer Stem Cells (CSCs). El tumor

contiene una pequeña subpoblación de CSCs (círculos rojos) además de su contraparte

diferenciada (círculos azules). Una vez realizada la quimioterapia, las células

diferenciadas no sobreviven, mientras que las CSCs, las cuales expresan altos niveles

de transportadores ABC, permanecen y tienen la capacidad de repoblar el tumor

(Modificado de Dean, Fojo y Bates, 2005).

14

quimioterapia sobreviven para luego repoblar el tumor, generando su reincidencia (Dean,

Fojo y Bates, 2005; Moitra, Lou, Dean, 2011).

En el caso del GBM esta subpoblación recibe el nombre de Glioma Stem-like Cells

(GSCs), las que cuando son cultivadas in vitro en medio libre de suero bovino fetal y en

presencia de factores de crecimiento (EGF y FGF) crecen formando conglomerados

celulares llamados neuroesferas (Bao et al., 2006; Hong, Chedid y Kalkanis, 2012;

Ladiwala, Basu y Mathur, 2012).

Las GSCs pueden ser identificadas y aisladas en base a la expresión de ciertos

marcadores de superficie de células madre tales como CD44, CD133 y Nestina, entre

otros; y se ha relacionado el nivel de expresión de éstos con un pronóstico desfavorable

de la enfermedad (Khoshnevisan, 2012; Pietras et al., 2014; Zizza et al., 2015). CD44 es

una glicoproteína, que actúa como receptor de membrana para componentes de la matriz

extracelular (ECM) como lo son el ácido hialurónico y osteopontina (Pietras et al., 2014;

Kim and Kumar, 2014; Multhaupt et al., 2015, Zizza et al., 2015). Este receptor es un

marcador ampliamente utilizado para caracterizar CSCs, relacionándose con la

tumorigénesis en una gran variedad de neoplasias, actuando además como regulador de

la proliferación y migración celular (Jijiwa et al., 2011). Además, CD44 se ha asociado

con la mantención y crecimiento del tumor, favoreciendo el proceso de metástasis, siendo

uno de los factores que condicionan la capacidad de estas células de invadir el tejido

adyacente (Dimov et al., 2011; Jijiwa et al., 2011; Gao et al., 2015). Otro marcador

ampliamente utilizado es CD133, glicoproteína utilizada como marcador de células madre

hematopoyéticas; además, se ha reportado como regulador en procesos de proliferación,

15

angiogénesis y formación de colonias, siendo esencial para la autorenovación de las

CSCs (Brescia et al., 2013; Yiming et al., 2015). En ensayos in vivo, se ha determinado

que la subpoblación de GSCs CD133+ posee un mayor potencial tumorigénico que

aquella GSCs CD133-. Esto se demostró mediante la inoculación de ambas

subpoblaciones celulares en ratones NOD-SCID, en donde la subpoblación CD133+ tuvo

la capacidad de formar un tumor a diferencia de la subpoblación negativa para este

marcador (Singh et al., 2004; Beier et al., 2007). Finalmente, Nestina es un filamento

intermedio, cuya sobreexpresión se ha correlacionado con el fenotipo de células madre

y con el desarrollo de gliomas (Dimov, et al., 2011; Wu, et al., 2015). Nestina es utilizada

normalmente como marcador de células madre neuronales, pero en los últimos años su

expresión se ha asociado con la proliferación de células progenitoras neoplásicas (Lu et

al., 2011).

Según estos antecedentes, nuevas estrategias terapéuticas son necesarias para

erradicar este tipo de tumor y, un buen enfoque terapéutico seria utilizar como diana a

esta subpoblación de GSCs con el fin de vencer la resistencia a los tratamientos

quimioterapéuticos y evitar la recurrencia de este tipo de tumor (Wen y Kesari, 2008;

Tabatabai y Weller, 2011).

2.4 Inmunosupresores y cáncer

Como ya fue mencionado anteriormente, en nuestro laboratorio se ha descrito que

FK506 disminuye la expresión y actividad del transportador MPR1. Esta droga, aislada

de Streptomyces tsukubaensis, es un potente inmunosupresor, clasificado como un

macrólido de estructura cíclica, el cual es 10 a 100 veces más potente que ciclosporina

16

A (Arceci, Stieglitz y Bierer, 1992; Naito et al., 1992 Hauser et al., 1998; Reichenspurner,

2005). FK506 es normalmente utilizado para prevenir el rechazo agudo de órganos

trasplantados, existiendo evidencias desde los años 90 sobre su potencial uso como

agente quimiosensibilizante, revirtiendo el fenotipo de MDR (Arceci, Stieglitz y Bierer,

1992; Reichenspurner, 2005). Respecto a su mecanismo de acción, FK506 actúa como

prodroga, volviéndose activa solo cuando se une a un grupo de proteínas denominadas

inmunofilinas. Cuando tacrolimus ingresa a la célula, se une a la inmunofilina FKBP12

(FK506 binding protein 12) generando un complejo que se une e inhibe a Calcineurina

(fosfatasa dependiente de Calmodulina). Esto provoca que Calcineurina no sea capaz de

desfosforilar a NF-ATc (subunidad citoplasmática del factor activador de células T),

impidiendo su translocación nuclear; como consecuencia, se bloquea la transcripción de

Interleucina 2 (IL-2), inhibiéndose la activación y proliferación de linfocitos T,

provocándose de esta forma su acción inmunosupresora (Liu et al., 1991; Schreiber y

Crabtree, 1992; Reichenspurner, 2005; Pawarode et al., 2006).

Las inmunofilinas son una familia de proteínas peptidil-prolil cis-trans isomerasas

(poseen un dominio PPIasa o dominio FK), que catalizan la interconversión de enlaces

peptidil-prolil imida en péptidos y sustratos proteicos; cabe destacar que la actividad

isomerasa no es esencial para los efectos inmunosupresores de estas proteínas (Göthel

y Marahiel, 1998). Las FKBPs son un tipo de inmunofilinas de entre 12 a 133 kDa,

evolutivamente conservadas, encontrándose en diversos organismos como bacterias,

levaduras y mamíferos (Hemenway y Heitman, 1996; Göthel y Marahiel, 1998). Estas

proteínas son las dianas naturales de FK506 y pueden poseer desde 1 a más de 4 sitios

de unión para este ligando, el cual se une al dominio FK (Romano, D’Angelillo y Romano,

17

2015). Otro aspecto importante de estas proteínas es su posible rol en el cáncer, ya que

se han asociado con la quimioresistencia y la tumorigenicidad de ciertos tipos de tumores,

incluyendo los gliomas (Romano et al., 2010; Bo-Hwa and Ho Sup, 2011). Existen

evidencias que demuestran que al tratar células de Leucemia Linfoide Crónica con FK506

o con un siRNA para FKBP12 se promueve la apoptosis de estas células. Además, en

otros ensayos realizados con distintas líneas celulares de hepatoma, cáncer de próstata,

melanoma, leucemia linfoide aguda y glioma, en donde se silenciaron ciertas

inmunofilinas, se reportó un efecto pro-apoptótico y quimiosensibilizante (Romano et al.,

2010; Romano et al., 2013).

Por otra parte, el uso de inmunosupresores como agentes quimiosensibilizadores

para ciertos tipos de cáncer se ha investigado hace ya bastantes años, siendo las drogas

más estudiadas ciclosporina A y FK506 (Arceci, Stieglitz y Bierer, 1992; Natio et al., 1992;

Qadir et al., 2005; Gupta et al., 2006; Pawadore et al., 2007; Kawahara et al., 2015). En

ensayos in vitro, se ha descrito que FK506 es capaz de revertir la quimioresistencia

mediada por los transportadores BCRP, P-gp y MRP1 (Arceci, Stieglitz y Bierer, 1992;

Pawadore et al., 2007; Garrido et al., 2011). Además, la concentración

intracitoplasmática de fármacos antineoplásicos tales como vincristina, daunomicina,

mitxantrona o doxorrubcina incrementó cuando fueron utilizados en combinación a

FK506, disminuyendo a su vez la viabilidad celular, formación de colonias, migración e

invasión celular; y, por otro lado, aumentando la apoptosis celular (Arceci, Stieglitz y

Bierer, 1992; Naito et al., 1992; Capone et al., 2014; Kawahara et al., 2015; Garrido et al.,

2011).

18

Cabe destacar, que si bien el uso de FK506 se ha testeado en ensayos in vitro, no

existen muchas evidencias sobre su uso en modelos in vivo. Sin embargo, en el año

2015, Kawahara y colaboradores demostraron que FK506 es capaz de retardar el

crecimiento tumoral en un modelo subcutáneo de cáncer de vejiga en ratones NOD-SCID.

En base a estas evidencias es que en este estudio proponemos el uso de FK506 como

agente quimiosensibilizador en un modelo alogénico subcutáneo de GBM.

2.5 Modelo tumoral in vivo

La necesidad de encontrar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de

los gliomas, ha llevado al desarrollo de modelos in vivo, los cuales idealmente deben

cumplir con ciertas características para permitir una buena aproximación a la clínica: 1)

debe presentar un parecido histológico a gliomas humanos; 2) debe presentar similitud

genética con los gliomas humanos; 3) debe ser ortotópico y mostrar crecimiento

intraparenquimal; 4) debe ser invasivo y angiogénico; y 5) debe imitar la respuesta

terapéutica de los gliomas humanos (Miura et al., 2008; Stylli et al., 2015). Para la

generación de tumores cerebrales, destacan métodos como la utilización de radiación,

virus, y la carcinogénesis inducida por químicos que fue llevada a cabo por primera vez

en el año 1939 mediante la implantación de pellets de metilcolantreno en cerebros de

ratones (Auer, del Maestro y Anderson, 1981; Stylli et al., 2015). La utilización de este

último método dio origen a la línea celular C6, la cual se generó a partir de tumores

cerebrales de ratas Wistar mediante la recurrente inyección de N-nitrosometilurea (MNU),

compuesto altamente carcinogénico (Benda et al., 1968; Schmidek et al., 1971; Auer, del

Maestro y Anderson, 1981; San-Galli et al., 1989; Stylli et al., 2015). Cabe destacar, que

19

los métodos mencionados anteriormente no permiten la generación de un gran número

de tumores idénticos en ubicaciones intracraneales similares (Auer, del Maestro y

Anderson, 1981; Nagano et al., 1993). Es por ello que hace ya 30 años, los modelos

alogénicos han sido ampliamente utilizados, donde destaca la implantación de células C6

en el cerebro de ratas Wistar, Sprangue-Dawley y Long-Evans (Wong et al., 2012; Stylli

et al., 2015). Las células C6 comparten marcadores histopatológicos y tumorales con el

GBM, y se ha descrito que al inocular entre 105-106 células en el núcleo caudado en el

cerebro de ratas, crece un tumor que exhibe un alto índice mitótico, necrosis, proliferación

vascular y pleomorfismo nuclear, además, de una morfología, un crecimiento y un patrón

de infiltración difusa similar al del GBM humano (Nagano et al., 1993; Beutler et al., 1999;

Grobben, De Deyn y Slegers, 2002; Stylli et al., 2015). En el año 1987, Farrell y

colaboradores describieron la generación de tumores mediante la implantación de

esferoides de la línea C6 en cerebros de ratas Sprangue-Dawley, obteniéndose como

resultado un tumor altamente vascularizado con un centro necrótico, de crecimiento

rápido y con invasión de células al tejido circundante, características similares a la del

GBM humano.

Los modelos de xenoinjerto en ratones inmunosuprimidos son frecuentemente

utilizados para estudios de neoplasias cerebrales al tener la ventaja de poder generar un

tumor a partir de la implantación de un linaje celular humano (Wong et al., 2012; Stylli et

al., 2015). Existen dos tipos de modelos, siendo el más simple el modelo heterotípico,

en el cual, la implantación de las células, en este caso de glioma, se realiza de manera

subcutánea. Este modelo, si bien es más rápido y permite un mejor monitoreo del

crecimiento del tumor, no es el más idóneo, debido a que el tumor se genera en un

20

ambiente distinto al cerebral, en ausencia de la barrera hematoencefálica (BHE), la cual

afecta la entrega y el aclaramiento de los fármacos (Stylli, et al., 2015). Es por ello, que

se prefiere el uso de modelos ortotópicos (implantación de células intracranealmente), ya

que reproducen de mejor manera las condiciones ambientales del tumor, permitiendo la

aparición de una subpoblación de células tumorales con las propiedades biológicas

observadas en las neoplasias (Joseph, et al., 2005; Stylli, et al., 2015).

Finalmente, trabajos previos en nuestro laboratorio lograron estandarizar un

modelo in vivo de GBM mediante la inoculación de 2 x 106 GSCs de la línea C6 de forma

subcutánea en ratas Sprangue-Dawley, obteniéndose tumores visibles al cabo de los 10

días post-inoculación, los cuales presentaban un alto grado de atipia celular, mitosis y

necrosis (Vargas, 2015).

En base a los antecedentes presentados, planteamos en este trabajo que el

tratamiento con la droga FK506 lograría disminuir la expresión y actividad del

transportador MRP1, con lo cual podríamos utilizar una droga sustrato de MRP1

(vincristina) como tratamiento para el GBM. Por último, nosotros esperamos que el

tratamiento conjunto (FK506 con vincristina) logre disminuir el crecimiento del tumor in

vivo generado a partir de la inoculación de GSCs de la línea celular C6 en ratas Sprague-

Dawley.

21

2.6 Hipótesis y objetivos

2.6.1 Hipótesis

El tratamiento in vitro e in vivo con la droga FK506 (tacrolimus) disminuye la

expresión y actividad del transportador MRP1 en las Glioblastoma Stem-like Cells

(GSCs), disminuyendo su resistencia a la quimioterapia.

2.6.2 Objetivo general

Quimiosensibilizar las GSCs mediante la disminución de la expresión y actividad

del transportador MRP1 post tratamiento con la droga FK506.

2.6.3 Objetivos específicos

Medir la expresión del transcrito, proteína y actividad del transportador MRP1 en

las GSCs aisladas de la línea celular U87MG de GBM humano y C6 de glioma de

rata en comparación a sus respectivas células diferenciadas, bajo el tratamiento

con la droga FK506.

Evaluar la viabilidad celular bajo el tratamiento combinado de FK506/vincristina en

las lineas celulares U87MG y C6.

Evaluar el efecto de la combinación de FK506/vincristina en un modelo alogénico

in vivo de glioblastoma.

22

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Materiales

3.1.1 Material biológico

En este trabajo se utilizó la línea celular U87MG (ATCC® HTB-14™) y C6 (ATCC®

CCL-107™) las que corresponden a células humanas de astrocitoma grado IV (GBM) y

células gliales proveniente de un glioma de rata, respectivamente. Además, se utilizaron

ratas Sprague-Dawley machos de un rango de peso entre 100 – 200 gr, proporcionadas

por el bioterio del Instituto de Bioquímica y Microbiología de la Facultad de Ciencias de

la Universidad Austral de Chile.

3.1.2 Reactivos

Abcam: Mouse anti-Nestin ab18102, Anexina V-FITC.

AppliChem GmbH: N-N-dimetilformamida

ATCC: Líneas celulares U87MG y C6.

Chemie®: Ketamina clorhidrato100 (100 mg/mL).

Daco: Lápiz hidrófobo, diaminobenzidina (liquid DAB substrate cromogen system).

Gibco: Medio Neurobasal, medio D-MEM/F-12, suero fetal bovino, 0,5% Tripsina-EDTA

10X, penicilina/estreptomicina 100x (10.000 unidades de penicilina, 10.000 gr de

estreptomicina, 29.2 mg de L-glutamina por mL de solución salina), suplemento B-27 50X,

GlutaMAXTM 100X.

HyCloneTM: Agua libre de nucleasas.

23

Invitrogen: Partidores síntesis DNA específicos para los genes en estudio (Tabla 1), set

de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) 100 mM, inhibidor de ribonucleasas (RNaseOUT)

(40 U/µL), transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (200 U/µL),

tampón de reacción de la transcriptasa reversa, 0,1 M DTT.

Life Technologies: Azul de Tripán 0,4%, yoduro de propidio, anticuerpos secundarios

Alexa 488 goat anti-mouse, Alexa 488 goat anti-rabbit

Merck & Co., Inc.: Alcohol etílico absoluto, ácido clorhídrico, citrato sódico dihidrato,

bálsamo de Canadá, formaldehído, alcohol metílico, HEPES, cloruro de sodio, cloruro de

magnesio, cloruro de calcio, ácido acético glacial.

PrepoTech: Factor de crecimiento epidermal (EGF), factor básico de crecimiento de

fibroblastos (bFGF).

Richmond Vet Pharma: Xilazina clorhidrato 100 (100 mg/mL).

Santa Cruz Biotechnologies: Anticuerpos primarios monoclonales mouse anti-Mrp1 (sc-

18836), goat anti-Ki67 (M-19) (sc-7846), rabbit anti-Mrp1 (H-70) (sc-13960), mouse anti-

GFAP (2E1) (sc-33673).

Sigma Chemical Co.: 5- carboxifluoresceína diacetato (CFDA), MTT Formazán.

Solis BioDyne: 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX).

Thermo Scientific: Pierce BCA Protein Assay Kit.

Tocris Bioscience: Tacrolimus (FK506), vincristina.

Vector Laboratories: ImmPRESSTM Reagent Kit Peroxidase.

Winkler: Solución de Chomczysky - fenol, PBS 10X, alcohol isopropilico, alcohol metílico

y etílico, cloroformo, carbonato de sodio, borato de sodio 10-Hidrato, dimetilsulfóxido

24

(DMSO), glicerol, triton X-100, hidróxido de sodio, albúmina de suero de bovino (BSA),

cloruro de potasio, dodecilsulfato de sodio (SDS).

3.1.3 Equipos

Espectrofotómetro Nanodrop 2000 Thermo scientific, termociclador Eppendorff

(mastercycler personal), termociclador Stratagene MX3005P, balanza analítica Radwag

AS220/C/2 Agilent Technologies, balanza Sartorius TE4101, pHmetro Inolab WTW Series

pH 720, micropipetas Gilson, horno microondas Somela (E 70 TF-7), centrífuga

Eppendorf minispin, sonicador misonix QSonica LLC XL-2000 series, Heidolph Duomax

Rocking Orbit Platform Shaker, baño termorregulado Memmert, incubadora de cultivo

Nuaire DH autoflow, agitador termorregulado Thermo scientific, centrífuga refrigerada

Sigma 2-16PK, microcentrífuga Labnet SNop11, cámara de flujo laminar Nuair,

fluorímetro Perkin Elmer, lector de microplacas Synergy 2 BioTek, Bio Vortex Biosan,

Citometro BD FACS Jazz.

3.2 Métodos

3.2.1 Cultivo de líneas celulares de GBM

Las líneas celulares U87GM (GBM humano) y C6 (glioma de rata) fueron crecidas

a confluencia en placas de cultivo de 100 mm en medio D-MEM/F-12 suplementado con

suero bovino fetal al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% en condiciones estándares de

CO2 al 5%, 95% de humedad relativa y 37°C. Las GSCs de la línea U87MG fueron

crecidas en medio Neurobasal suplementado con B-27 1X, Glutamax 1X,

penicilina/estreptomicina al 1%, EGF (20 ng/mL) y FGF (20 ng/mL) bajo condiciones

25

estándares y las GSCs de la línea C6 fueron crecidas en medio D-MEM/F-12

suplementado con B-27 1X, Glutamax 1X, penicilina/estreptomicina al 1%, EGF (20

ng/mL) y FGF (20 ng/mL) bajo las mismas condiciones. Se realizó cambio de medio de

cultivo cada 3 a 5 días según su proliferación.

Para realizar el traspaso de células U87MG y C6 adherentes a otras placas se

retiró el medio de cultivo por aspiración, la monocapa de células se lavó con PBS 1X para

luego ser incubadas con 2 mL de tripsina 1X en PBS 1X por 3 minutos a 37°C.

Transcurrido este tiempo, se neutralizó la tripsina agregando 4 mL de medio de cultivo

suplementado con suero bovino fetal al 10%. Las células se recuperaron por

centrifugación a 500xg por 5 minutos, se descartó el sobrenadante y el sedimento de

células fue resuspendido con medio D-MEM/F-12 suplementado. Para el caso de las

GSCs de U87MG y C6, se retiraron las células por aspiración y se centrifugaron a 500xg

por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y el sedimento de células fue resuspendido

con medio Neurobasal o D-MEM/F-12 suplementado, según la línea celular. Finalmente

las células fueron traspasadas a placas de 100 mm, de 6 o 24 pocillos para realizar los

ensayos correspondientes.

3.2.2 Drogas y tiempo de incubación

Para este estudio las células fueron incubadas durante 24 horas con las drogas

tacrolimus (FK506) a concentraciones de 7, 15 y 30 ng/mL y vincristina a una

concentración de 0,1 µM.

26

3.2.3 Extracción de RNA total de células de GBM y GSCs

Las células fueron incubadas durante 24 horas en placas de 6 pocillos con FK506

y transcurrido este tiempo se extrajo el RNA total utilizando la solución de Chomczynski-

fenol. Las células adherentes se lavaron con PBS 1X, posteriormente se adicionaron 0,5

mL de la solución Chomczynski-fenol a cada pocillo y se recolectó el extracto celular en

tubos Eppendorf de 1,5 mL. Mientras que las GSCs fueron retiradas por aspiración y

centrifugaras a 500xg por 5 minutos en tubos Eppendorf de 1,5 mL. Posteriormente se

descartó el sobrenadante, se lavó con PBS 1X, centrifugando a 500xg por 5 minutos. Se

descarto el sobrenadante y a cada tubo se le adicionó 0,5 mL de la solución de

Chomczynski-fenol. A partir de este paso ambos tipos celulares se trabajaron de igual

manera. A cada tubo se le adicionó 0,1 mL de cloroformo y se agitaron vigorosamente

por 15 segundos. Se centrifugaron por 15 minutos a 12.000xg a 4ºC y el sobrenadante

(fase acuosa superior) se transfirió a un nuevo tubo. El RNA se precipitó con 0,25 mL de

isopropanol, mezclando e incubando por 10 minutos en hielo. Posteriormente, se

centrifugaron a 12.000xg por 15 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y lavó el

sedimento con 0,25 mL de etanol 75% frío. A continuación se centrifugaron los tubos por

5 minutos a 7.500xg a 4°C y el sedimento se dejó secar hasta evaporarse totalmente el

etanol. Finalmente, el sedimento se resuspendió en 20 µL de agua libre de nucleasas. El

RNA extraído fue cuantificado y se determinó su pureza mediante el espectrofotómetro

Nanodrop, para lo cual se evaluó 1 µL de cada muestra midiéndose su absorbancia a

260 nm y 280 nm. El RNA extraído se guardó a -80ºC hasta su posterior uso.

27

3.2.4 Síntesis de cDNA

La síntesis de cDNA se llevó a cabo a partir del RNA extraído previamente. Se

preincubaron 1 µg de RNA total de cada muestra con 1 µL de cada dNTP (dATP, dTTP,

dCTP, dGTP; 0,25 mM), 1 µL de oligo dT (100 pmol) y agua libre de nuecleasas (hasta

un volumende 12 µL) por 5 minutos a 65°C. Pasado este tiempo se incubaron los tubos

en hielo por 3 minutos. Posteriormente, se le agregó a cada tubo 4 µL de tampón de

reacción (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3), 2 µL DTT (10 mM), 1 µL de

inhibidor de ribonucleasa recombinante (RNAsaOUT; 20 unidades) y 1 µL de

transcriptasa reversa (M-MLV; 50 unidades), teniendo un volumen total de reacción de

20 µL, el cual se incubó por 1 hora a 42°C. Por último, la mezcla fue incubada a 72ºC por

10 minutos para así inactivar la transcriptasa reversa. El cDNA sintetizado se guardó a -

20ºC hasta su posterior utilización.

3.2.5 PCR en tiempo real

Los niveles del transcrito de MRP1 se analizaron por PCR en tiempo real,

utilizando el termiciclador Stratagene MX3005P (Agilent Technologies Inc.). La mezcla

de reacción contenía 4 µL de 5X Evagreen qPCR mix plus, 1 µL de la mezcla de

partidores (10 µM cada uno) (Tabla I), 14 µL de agua libre de nucleasas y 1 µL del cDNA

sintetizado previamente. Se utilizó agua libre de nucleasas en lugar de cDNA como

control negativo. Las etapas de la PCR consistieron en una activación inicial de la enzima

a 95ºC por 15 minutos, posteriormente 40 ciclos de denaturación (95ºC por 10 segundos),

28

Tabla I. Secuencia de los partidores utilizados.

Gen Secuencia (sentido/antisentido)

Mrp1 Humano 5' GGACTTTCGTGTGCTCCTGA 3'

5' AGGTCAAGCTTTCCGTGTACTG 3'

Mrp1 Rata 5’ TGAACCATGAGTGTGCAGAA 3’

5’ TCACACCAAGCCAGCATCCT 3’

β -actina Humano 5' GGGGTCTTGAAGGTCTCA 3'

5' TGTCACCAACTGGGACGA 3'

β -actina Rata 5’ TGTCACCAACTGGGACGATA 3’

5’ GGGGTCTTGAAGGTCTCAAA 3’

29

alineamiento (55ºC por 15 segundos) y elongación (72ºC por 20 segundos). Finalmente,

se realizó una curva de disociación para determinar amplificación de productos

inespecíficos. El análisis de los datos se realizó utilizando el software MxPro qPCR,

utilizando el método ΔΔ Ct y la expresión de β-actina como normalizador para cada

muestra.

3.2.6 Fijación y marcaje de células para citometría de flujo

Las células fueron incubadas durante 24 horas en placas de 6 pocillos con FK506

y transcurrido este tiempo las células se recolectaron. Para el caso de las GSCs, las

células se transfirieron a tubos Eppendorf, se centrifugaron a 500xg por 5 minutos para

luego trabajar con el precipitado. En el caso de las células adherentes, se lavaron con

PBS 1X y luego se tripsinizaron incubando con 200 µL de tripsina 1X en PBS 1X por 3

minutos a 37°C. Luego, se detuvo la tripsina con medio suplementado con suero bovino

fetal al 10%, las células se centrifugaron a 500xg por 5 minutos y se descartó el

sobrenadante. A partir de este momento ambos tipos celulares se trabajaron por igual.

Las células se lavaron una vez con PBS 1X y posteriormente se fijaron incubándolas por

15 minutos a temperatura ambiente con formaldehido al 3,7%. Luego, se centrifugaron

por 5 minutos a 500xg, se descartó el sobrenadante y las células se permeabilizaron con

metanol 80% por 30 minutos a 4°C. Pasado este tiempo de incubación, se centrifugaron

las células por 5 minutos a 500xg y luego se lavaron con PBS 1X. Posterior a esto, se

realizó un bloqueo de 1 hora con albúmina de suero bovino (BSA) 0,5% en PBS 1X y

luego se incubó con el anticuerpo primario mouse anti-MRP1 (para células U87MG) y

rabbit anti-MRP1 (para células C6), ambos en una dilución 1:50 en solución de bloqueo

30

por toda la noche a 4°C, procurando dejar una muestra como control negativo (sin incubar

con anticuerpo primario). Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las células se

lavaron 2 veces con solución de bloqueo, centrifugando a 500xg por 5 minutos, para luego

incubar por 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario Alexa 488 goat

anti-mouse (para células U87MG) y Alexa 488 goat anti-rabbit (para células C6) en una

dilución 1:500 en solución de bloqueo. Finalmente, se lavaron las células 2 veces con

PBS 1X, se resuspendieron en solución FACS Flow y se analizaron mediante el citómetro

de flujo BD FACS Jazz utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm y de

emisión de 530 nm.


(CFDA) en células de GBM

Para medir la actividad del transportador MRP1 se sembraron aproximadamente

1 x 105 células por pocillo en placas de 24 pocillos y con sus respectivos tratamientos con

FK506 (7, 15 y 30 ng/mL). Luego de 24 horas, se les adicionó a las células D-MEM/F-12

suplementado con CFDA a una concentración final de 500 nM y se incubaron por 15

minutos a 37°C. Posteriormente, se aspiró el medio y se lavaron las células 3 veces con

PBS 1X y nuevamente se incubaron a 37°C, pero esta vez sólo con medio base D-

MEM/F-12 por 30 minutos. Pasado este tiempo las células se lavaron con PBS 1X y

fueron lisadas con 230 µL de PBS 1X-triton X-100 al 0,4% y utilizando un rastrillo para

favorecer el desprendimiento de las células. Posteriormente se transfirieron las células a

tubos Eppendorf para ser sometidas a sonicación. De este extracto se tomaron 5 µL para

realizar la cuantificación de proteínas mediante el método del ácido bicinconínico (BCA)

31

y lo que no se utilizó se congeló a -20ºC hasta su determinación. La fluorescencia

intracelular se midió mediante un espectrofluorímetro y para ello se diluyó cada muestra

10 veces con PBS 1X y esta solución se transfirió a una cubeta de cuarzo de paso óptico

de 1 cm. Se utilizaron las longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 530

nm, respectivamente para la lectura de las muestras.


(CFDA) en GSCs

Para medir la actividad del transportador MRP1, las GSCs se dejaron crecer de 7

a 10 días en una placa de 100 mm y posteriormente se sembraron en placas de 24

pocillos con sus respectivos tratamientos con FK506 (7, 15 y 30 ng/mL). Luego de 24

horas, se les adicionó a las células D-MEM/F-12 suplementado con CFDA a una

concentración final de 500 nM y se incubaron por 15 minutos a 37°C. Pasado este tiempo,

se transfirieron a tubos Eppendorf y se lavaron 3 veces con PBS 1X, centrifugando por 5

minutos a 500xg. Se descartó el sobrenadante y se incubó por 30 minutos a 37°C con

medio D-MEM/F-12. Posteriormente, se lavaron las células 3 veces con PBS 1X como se

indicó anteriormente, se lisaron con 230 µL de PBS 1X-triton X-100 al 0,4% y se

sonicaron. El proceso de cuantificación de proteínas, de lectura y las condiciones del

equipo son idénticas a las utilizadas en células de GBM.

3.2.9 Determinación de la concentración de proteínas totales

Las proteínas se cuantificaron utilizando el método del ácido bicinconínico (BCA),

para los cual se utilizó una curva de calibración entre 0 y 2 mg/mL a partir de un estándar

32

de BSA de 2 mg/mL (proporcionado por el kit de cuantificación) diluido en agua

desionizada. Para la cuantificación se utilizó una placa de 96 pocillos, en la cual a cada

pocillo se adicionó 200 µL de reactivo de trabajo (reactivo A más reactivo B en una

relación 50:1, respectivamente, los cuales son proporcionados por BCA™ protein assay

kit) y 20 µL de cada una de las distintas diluciones del estándar de albúmina o de la

muestra. Como blanco se utilizó la solución de PBS 1X-triton X-100 al 0,4%. La placa se

incubó por 30 minutos a 37°C y finalmente se realizó la lectura en un lector de microplacas

de ELISA (Synergy HT, BioTek Instruments, Inc.) a una longitud de onda de 570 nm. Las

concentraciones de las muestras se obtuvieron por interpolación de éstas a la curva de

calibración.

3.2.10 Ensayos de viabilidad celular por reducción de sales de Tetrazolio (MTT)

Las células U87MG fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de

5 x 104 células por pocillo en un volumen de 50 µL. Posteriormente, se agrego a cada

pocillo 50 µL de cada tratamiento (FK506 15 ng/mL y vincristina 0,1 µM) y se dejo incubar

por 24 horas. Transcurrido este tiempo, se agregó a cada pocillo 50 µL de MTT (5 mg/mL)

disuelta en medio base y se dejó incubar por 4 horas a 37ºC. Pasado este tiempo de

incubación, se agregó a cada pocillo 50 µL de tampón de lisis (50% N-N-

dimetilformamida, 2,5% ácido acético glacial, 20% SDS, 2,1% HCl) y se volvió a incubar

a 37ºC, pero esta vez por un tiempo de 2 horas. Finalmente, se midió la absorbancia en

un lector de microplacas a una longitud de onda de 570 nm. Los valores de absorbancia

se expresaron en porcentajes (%) respecto al control (células sin tratamiento).

33

3.2.11 Medición de apoptosis celular mediante el marcaje con Anexina V y Yoduro

de Propidio

Las células C6 fueron incubadas por 24 horas con sus respectivos tratamientos y

pasado este tiempo de incubación, se extrajo el medio de cultivo y se lavaron las células

una vez con PBS 1X. Posteriormente se tripsinizaron las células agregando 200 µL de

tripsina 1X en PBS 1X e incubando por 3 minutos a 37°C. Pasado este tiempo se agregó

medio suplementado para detener la tripsina, y las células se centrifugaron a 500xg por

5 minutos. Se descartó el sobrenadante y las células se lavaron con PBS 1X

centrifugando por 5 minutos a 500xg. El precipitado celular fue resuspendido en 500 µL

de tampón de Binding 1X para Anexina V (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 5

mM MgCl, 1,8 mM CaCl2) y luego se adicionó 1 µL de Anexina V acoplada a FITC y 5 µL

de Yoduro de Propidio 2 mg/mL. Se incubó 20 minutos a temperatura ambiente para

luego ser analizadas por el citómetro de flujo BD FACS Jazz a una longitud de onda de

excitación de 488 nm y utilizando los filtros 530/40 y 670LP para Anexina V-FITC y Yoduro

de Propidio, respectivamente.

3.2.12 Obtención y conteo celular para generación del modelo in vivo

Las GSCs de la línea celular C6 fueron transferidas a tubos de 15 mL y se

centrifugaron a 500xg por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y las células fueron

resuspendidas en medio D-MEM/F-12 base para proceder a contarlas. Para ello, se tomó

una alícuota de 10 µL de células y se mezcló con 10 µL de azul de tripán al 0,4%. Se

aplicó la mezcla homogeneizada en un dispositivo de recuento para ser contadas por un

contador celular automático (Countess Invitrogen). El equipo entrega información sobre

34

el porcentaje (%) de viabilidad celular, número total de células, número de células

muertas y número de células vivas. Se destinaron 2 x 106 células por rata resuspendidas

en 200 µL de medio D-MEM/F-12 base para la generación de un tumor subcutáneo.

3.2.13 Inducción de tumores subcutáneos en ratas Sprague-Dawley

Todos los procedimientos en los animales de prueba fueron aprobados por el

Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad Austral de Chile. Se utilizaron

animales macho de 1 mes de edad de la cepa Sprague-Dawley (150 - 200 gr), los cuales

se mantuvieron en condiciones de laboratorio: un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad, con

comida y agua ad libitum. Las GSCs de células C6, las cuales previamente fueron

recolectadas y resuspendidas a una concentración celular de 2 x 106 células en 200 µL

de medio D-MEM/F-12 base, fueron inoculadas de forma subcutánea en el flanco

izquierdo de las ratas, previamente anestesiadas mediante administración intraperitoneal

de ketamina (100mg/kg)/xilazina (10mg/kg) y rasuradas.

3.2.14 Tratamientos con drogas antitumorales in vivo

Al día 10 post-inoculación de las células, fue posible visualizar la masa tumoral

bien formada y los animales fueron divididos en cuatro grupos: (i) PBS 1X estéril

(vehículo), (ii) FK506 (2,25 mg/kg/72 hrs; e.v.), (iii) vincristina (0,3 mg/kg/72 hrs; e.v) y (iv)

FK506/vincristina. Los tratamientos fueron diluidos en PBS 1X estéril y administrados

cada 3 días por un tiempo de 7 días antes que los tumores desaparezcan completamente.

35

3.2.15 Extracción y fijación de tejidos tumorales

Luego de 7 días post-tratamiento los animales fueron eutanasiados y los tumores

fueron rápidamente extraídos y fijados en formalina al 10% para luego ser analizados

histológicamente.

3.2.16 Inmunohistoquímica

Se evaluó la expresión de marcadores tumorales en los tumores subcutáneos.

Para ello, se desparafinaron e hidrataron los cortes de tejido tal como se describe a

continuación. Para desparafinar el tejido, los cortes fueron embebidos por 15 minutos en

soluciones de xilol I y xilol II, y luego hidratados mediante una batería de alcoholes en

porcentaje decreciente (etanol 100%, metanol 100%, etanol 90%, etanol 70% y agua

destilada). Para desenmascarar el antígeno se utilizó tampón citrato de sodio (10 mM,

pH 6), calentando el tampón en el microondas hasta una temperatura de 90°C cada 5

minutos por 30 minutos. Se dejó enfriar el tampón a temperatura ambiente por 30 minutos

y luego se agregó agua destilada para enfriar por 3 minutos. Se delimitó el tejido mediante

un lápiz hidrófobo y se agregó peróxido de hidrógeno al 3% por 20 minutos. Pasado este

tiempo se volvió a incubar por otros 20 minutos con peróxido de hidrogeno al 3%. Luego

se lavaron los cortes con agua destilada por 2 minutos y PBS 1X por otros 2 minutos. Los

cortes de tejido se bloquearon por 1 hora mediante la solución de bloqueo ImmPRESS

Normal Horse Serum 2,5% y luego por 30 minutos con BSA 1% en PBS 1X-tween 20

0,05%. Se realizaron 2 lavados con PBS 1X por 5 minutos y las muestras se dejaron

incubando con el anticuerpo primario correspondiente (diluido en BSA 1% en PBS 1X-

tween 20 0,05%) durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda (Tabla 2). Pasado este

36

tiempo, se lavaron 3 veces los cortes con PBS 1X por 5 minutos y se incubaron con el

anticuerpo secundario ImmPRESS por 1 hora. Se volvieron a lavar 3 veces los cortes con

PBS 1X por 5 minutos y se reveló agregando el sustrato DAB ImmPACT (1 mL de tampón

+ 30 µL de DAB) por el tiempo requerido por cada anticuerpo. Luego del revelado, los

cortes fueron lavados 2 veces con PBS 1X y se realizó una contra tinción con

hematoxilina por 1 minuto. Se lavaron los cortes con agua destilada, se agregó borato de

sodio (0,1 M, pH 8,5) por 30 segundos y nuevamente se lavaron las muestras con agua

destilada. Los cortes se pasaron por la batería de alcoholes, pero esta vez en orden

ascendente de concentración (etanol 70%, etanol 96%, metanol 100%, etanol 100%, xilol

II y xilol I). Finalmente, se montaron las muestras con Bálsamo de Canadá y fueron

visualizadas con un microscopio óptico con aumento 10X y 20X, para ser analizadas

mediante el programa ImageJ 1.50.

37

Tabla II. Anticuerpos utilizados en la evaluación de los cortes tumorales

Anticuerpo Dilución

Anti-Nestin ab18102 (Abcam) 1:100

Anti-Ki67 (M-19) sc-7846 (Sta Cruz Biotechnology) 1:50

Anti-Mrp1 (H-70) sc-13960 (Sta Cruz Biotechnology) 1:50

Anti-GFAP (2E1) sc-33673 (Sta Cruz Biotechnology) 1:50

38

3.2.17 Análisis estadístico

Los resultados obtenidos fueron graficados, procesados y presentados según

media ± desviación estándar (S.D.) mediante el programa GraphPad prism 6.01. La

significancia estadística entre los tratamientos tanto in vitro como in vivo se evaluó

mediante el análisis de varianza (ANOVA) seguido por el test de Tukey. Las diferencias

significativas entre los grupos se calcularon con un p valor ≤ 0,05.

39

4. RESULTADOS

4.1 Efecto de FK506 sobre los niveles de transcrito del transportador MRP1 en

células adherentes y GSCs derivadas de las líneas celulares U87MG y C6

El efecto del inmunosupresor tacrolimus (FK506) sobre los niveles de transcrito del

transportador MRP1 fue evaluado en células adherentes y GSCs de las líneas celulares

U87MG (glioblastoma humano) y C6 (glioma de rata). Para ello, las células fueron

tratadas por 24 horas con FK506 a concentraciones de 7, 15 y 30 ng/mL, posteriormente

se extrajo el RNA, se realizó la síntesis de cDNA y finalmente un ensayo de qPCR en

donde se utilizó el método ΔΔ Ct. Los resultados obtenidos indican que no existe

diferencia en los niveles de transcrito de MRP1 bajo el tratamiento con FK506 a ninguna

de las concentraciones evaluadas. Esto se observó tanto en las células adherentes y

GSCs de las líneas celulares U87MG (Figura 3) y C6 (Figura 4).

40

A

B

Figura 3. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles del transcrito de MRP1 en

células adherentes y GSCs de la línea celular U87MG. Las células U87MG adherentes

(A) y sus respectivas GSCs (B) fueron tratadas por 24 horas con FK506 (7, 15 y 30 ng/mL)

y los niveles de transcrito fueron cuantificados mediante RT-qPCR. Los gráficos

representan la media ± S.D. entre los valores de Ct del transcrito de MRP1 normalizado

con el transcrito de β-actina. n=4.

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

mR

NA

MR

P1

Ex

pre

sió

n r

ela

tiv

a

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

mR

NA

MR

P1

Ex

pre

sió

n r

ela

tiv

a

41

A

B

Figura 4. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles del transcrito de MRP1 en

células adherentes y GSCs de la línea celular C6. Las células C6 adherentes (A) y sus

respectivas GSCs (B) fueron tratadas por 24 horas con FK506 (7, 15 y 30 ng/mL) y los

niveles de transcrito fueron cuantificados mediante RT-qPCR. Los gráficos representan

la media ± S.D. entre los valores de Ct del transcrito de MRP1 normalizado con el

transcrito de β-actina. n=4.

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

mR

NA

Mrp

1E

xp

res

ión

re

lati

va

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

mR

NA

Mrp

1E

xp

res

ión

re

lati

va

42

4.2 Efecto de FK506 sobre los niveles proteicos del transportador MRP1 en células

adherentes y GSCs derivadas de las líneas celulares U87MG y C6

Se evaluó el efecto de FK506 sobre lo niveles proteicos del transportador MRP1.

Para ello, las células adherentes y GSCs de las líneas celulares U87MG y C6 fueron

tratadas por 24 horas con FK506 a concentraciones de 7, 15 y 30 ng/mL, y

posteriormente se realizó un ensayo de citometría de flujo, en el cual las células fueron

fijadas para su posterior marcaje. Se utilizó el anticuerpo primario anti-MRP1 y

posteriormente el anticuerpo secundario acoplado al fluoróforo Alexa 488. En las figuras

5 y 6 se muestran los resultados obtenidos, los cuales indican que los niveles proteicos

de MRP1 no se ven afectados bajo ninguna de las concentraciones de FK506. Esto

ocurrió tanto en las células adherentes y GSCs de las líneas celulares U87MG (Figura 5)

y C6 (Figura 6).

43

A

B

MR

P1

(%)

C t r l

7n g /m

L

1 5n g /m

L

3 0n g /m

L0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

44

C

D

Figura 5. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles proteicos de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular U87MG. Las células U87MG adherentes (A y B)

y sus respectivas GSCs (C y D) fueron tratadas por 24 horas con FK506 (7, 15 y 30

ng/mL) y los niveles de expresión fueron medidos mediante citometría de flujo. A y C,

gráficos de dispersión; B y D respectivos gráficos de barra de A y C. n=5.

MR

P1

(%)

C t r l

7n g /m

L

1 5n g /m

L

3 0n g /m

L0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

45

A

B

MR

P1

(%)

C t r l

7n g /m

L

1 5n g /m

L

3 0n g /m

L0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

46

C

D

Figura 6. Efecto de la droga FK506 sobre los niveles proteicos de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular C6. Las células C6 adherentes (A y B) y sus

respectivas GSCs (C y D) fueron tratadas por 24 horas con FK506 (7, 15 y 30 ng/mL) y

los niveles de expresión fueron medidos mediante citometría de flujo. A y C, gráficos de

dispersión; B y D respectivos gráficos de barra de A y C. n=5.

MR

P1

(%)

C t r l

7n g /m

L

1 5n g /m

L

3 0n g /m

L0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

47

4.3 Efecto de FK506 sobre la actividad del transportador MRP1 en células

adherentes y GSCs derivadas de las líneas celulares U87MG y C6

Para evaluar el efecto de FK506 sobre la actividad del transportador MRP1 en las

células adherentes y GSCs de U87MG y C6 se utilizó el ensayo de acumulación del

sustrato fluorescente CFDA. El CFDA ingresa a la célula y al ser sustrato del

transportador MRP1 es efluido hacia el extracelular, por lo cual a mayor actividad del

transportador, menor será la acumulación intracelular de CFDA; y a menor actividad de

MRP1, mayor será la acumulación de CFDA dentro de la célula. Las células fueron

tratadas por 24 horas con FK506 a distintas concentraciones (7, 15 y 30 ng/mL) y

posteriormente se evaluó la actividad de MRP1 mediante ensayos de fluorimetría.

Nuestros resultados indican que FK506 disminuye de forma significativa la actividad de

MRP1, aumentando la concentración intracelular del sustrato fluorescente en ambas

líneas celulares. En las células U87MG adherentes (Figura 7A) la actividad disminuyó al

tratar con FK506, siendo significativo a las concentración de 7 y 15 ng/mL, donde

aumentó la concentración intracelular de CFDA en un 34% y 27%, respectivamente. En

cambio, en las GSCs de U87MG (Figura 7B) la actividad disminuyó significativamente

solo a la concentración de 15 ng/mL de FK506, aumentando la acumulación de CFDA en

un 55%. En la línea celular C6 adherente (Figura 8A) la actividad disminuyó bajo el

tratamiento con FK506, sólo siendo significativo con concentraciones de 7 y 15 ng/mL,

incrementando la acumulación de CFDA en un 50% y 85%, respectivamente; y en las

GSCs de la misma línea celular (Figura 8B) sólo los tratamientos con 15 y 30 ng/mL de

FK506 lograron disminuir significativamente la actividad del transportador, aumentando

la acumulación de CFDA en un 24% y 33%, respectivamente.

48

A

B

Figura 7. Efecto de la droga FK506 sobre la actividad de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular U87MG. La actividad en las células U87MG

adherentes (A) y sus respectivas GSCs (B) fue medida a través del ensayo de

acumulación del sustrato fluorescente CFDA luego de 24 horas de incubación con la

droga FK506 (7, 15 y 30 ng/mL). Los gráficos describen la media ± S.D. entre unidades

de fluorescencia y la concentración de proteínas en μg/µl. *, p≤ 0,05; **, p≤ 0,01; ***, p≤

0,001. n=4.

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

* * *

Un

ida

de

s d

e f

luo

res

ce

nc

ia/

co

nc

. p

rote

ína

s (

µg

/µl)

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0

5 0

1 0 0

1 5 0

* * *

Un

ida

de

s d

e f

luo

res

ce

nc

ia/

co

nc

. p

rote

ína

s (

µg

/µl)

49

A

B

Figura 8. Efecto de la droga FK506 sobre la actividad de MRP1 en células

adherentes y GSCs de la línea celular C6. La actividad en las células C6 adherentes

(A) y sus respectivas GSCs (B) fue medida a través del ensayo de acumulación del

sustrato fluorescente CFDA luego de 24 horas de incubación con la droga FK506 (7, 15

y 30 ng/mL). Los gráficos describen la media ± S.D. entre unidades de fluorescencia y la

concentración de proteínas en μg/µl. *, p≤ 0,05; **, p≤ 0,01; ***, p≤ 0,001. n=4.

Un

ida

de

s d

e f

luo

res

ce

nc

ia/

co

nc

. p

rote

ína

s (

µg

/µl)

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

** *

C tr l

7 ng /m

L

1 5 ng /m

L

3 0 ng /m

L0

5 0

1 0 0

1 5 0

* * * * *

Un

ida

de

s d

e f

luo

res

ce

nc

ia/

co

nc

. p

rote

ína

s (

µg

/µl)

50

4.4 Efecto de FK506 en combinación con vincristinca sobre la viabilidad de las

células U87MG

Para evaluar la viabilidad celular se llevó a cabo el ensayo de MTT, el cual se basa

en la formación de cristales de formazan por la reducción de la sal de tetrazolio (MTT).

Esta reacción se lleva a cabo por la acción de la enzima succinato deshidrogenasa, por

lo cual la reacción solo es llevada a cabo en células viables. Las células fueron incubadas

por 24 horas con FK506 15 ng/mL, vincristina 0,1 µM o la combinación de ambas drogas

y pasado este tiempo se llevó a cabo el ensayo de viabilidad celular. Como se observa

en la figura 9, el tratamiento con FK506 por si solo no afecta la viabilidad celular, mientras

que bajo el tratamiento con vincristina, sólo la viabilidad de las células adherentes

disminuye significativamente (disminución de un 23%). En contraste, el tratamiento

combinado de FK506 y vincristina disminuye significativamente la viabilidad en ambos

tipos celulares (U87MG adherentes y GSCs), observándose una disminución de hasta un

40% para el caso de las células adherentes (Figura 9A).

51

A

B

Figura 9. Efecto del tratamiento combinado FK506/vincristina sobre la viabilidad de

células adherentes y GSCs de la línea celular U87MG. Las células U87MG (A) y sus

respectivas GSCs (B) fueron tratadas por 24 horas con FK506 (15 ng/mL), vincristina (0,1

µM) y FK506 en combinación con vincristina, y posteriormente la viabilidad celular fue

evaluada por el ensayo de MTT. Los gráficos representan el promedio ± S.D. ****, p≤

0,0001 versus el control de células no tratadas; ####, p≤ 0,0001 versus las células

tratadas con vincristina. n=6.

52

4.5 Apoptosis celular bajo el tratamiento de FK506 combinado con vincristina en

células C6

La apoptosis celular fue evaluada en las células C6 adherentes y bajo los

tratamientos con FK506 (15 ng/mL), vincristina (0,1 µM) y ambas drogas combinadas.

Luego las células se marcaron con Yoduro de Propidio y Anexina V acoplado a FITC para

ser analizadas mediante citometría de flujo. En la figura 10 se indican los resultados

obtenidos, en donde se puede apreciar que al tratar las células sólo con FK506 no hay

diferencias en la apoptosis respecto al control. En contraste, al tratar con vincristina, en

los gráficos de dispersión se observa una mayor cantidad de células en apoptosis tardía

(Figura 10A). Este incremento en la apoptosis fue de hasta un 18% en las células tratadas

con vincristina; y en el caso de la combinación de FK506/vincristina, se observó un leve

aumento de la apoptosis hasta un 21%, aunque no significativo respecto al tratamiento

con vincristina (Figura 10B).

53

A

B

Figura 10. Efecto del tratamiento combinado FK506/vincristina sobre la apoptosis

celular en células C6. Las células C6 fueron tratadas por 24 horas con FK506 (15

ng/mL), vincristina (0,1 µM) y FK506 en combinación con vincristina. Pasadas las 24

horas se evaluó la apoptosis incubando las células con Anexina V y Yoduro de propidio

por 30 minutos. A, gráficos de dispersión; B, respectivos gráficos de barra de A. ****, p≤

0,0001. n=4.

Ap

po

pto

sis

ce

lula

r(%

)

C t r l

1 5n g /m

L

V inc r is

t ina

1 5n g /m

L /

v inc r is

t ina

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

* * * ** * * *

54

4.6 Efecto de FK506 en combinación a vincristina sobre el crecimiento tumoral en

un modelo alogénico subcutáneo in vivo de glioblastoma

Mediante la inoculación de células GSCs de la línea celular C6, se generó un tumor

subcutáneo en el flanco izquierdo de ratas Sprague-Dawley. El tumor se controló durante

17 días, midiéndose su volumen cada 3 días. El día 10 se inició el tratamiento con PBS

1X estéril (vehículo), vincristina (0,3 mg/kg/72 hrs), FK506 (2,25 mg/kg/72 hrs) y FK506

en combinación con vincristina (FK506/vincristina). Luego de 7 días de tratamiento, el

tumor fue removido y fijado para realizar el análisis histológico. En la figura 11 se indican

los resultados obtenidos, en donde se puede apreciar que el tumor tratado con la

combinación FK506/vincristina posee menor tamaño comparado con los tumores tratados

con las drogas por si solas o con el vehículo (Figura 11A). El tratamiento combinado de

FK506/vincristina redujo en un 22% el crecimiento del tumor, en cambio al tratar los

tumores con el vehículo o vincristina, estos continuaron creciendo alcanzado hasta 4

veces más su tamaño (Figura 11B).

55

A

Día 10 Día 17

Vehículo

FK506/

Vincristina

FK506

vincristina

56

B

Figura 11. Efecto del tratamiento combinado FK506/vincristina sobre el crecimiento

tumoral in vivo. Los tumores fueron generados mediante la inoculación subcutánea de

GSCs de la línea C6 en ratas Sprague-Dawley. Al día 10 post-inoculación se iniciaron los

respectivos tratamientos con PBS 1X estéril (vehículo), vincristina (0,3 mg/kg/72 hrs),

FK506 (2,25 mg/kg/72 hrs) y FK506/vincristina por 6 días. Al día 7 post-inicio del

tratamiento se extirparon los tumores para su posterior análisis histológico. (A)

Comparación de cada tratamiento: vehículo, vincristina, FK506 y FK506/vincristina. Las

fotos fueron capturadas al día 10 post-inoculación (inicio de tratamiento) y al día 7 post-

inicio del tratamiento. (B) Comparación del crecimiento del tumor bajo el tratamiento con

el vehículo (negro), vincristina (azul), FK506 (verde) y FK506/vincristina (rojo). *, p≤ 0,05;

**, p≤ 0,01; ****, p≤ 0,0001. n=2.

57

4.7 Evaluación de la expresión de MRP1 en muestras de tumores subcutáneos

generados mediante la inoculación de GSCs

Los resultados obtenidos al evaluar los niveles de MRP1 en los cortes de tumores

indicaron un aumento de este transportador en las muestras tratadas con las diferentes

drogas. Se observó una mayor expresión de MRP1 al tratar con vincristina (incremento

de un 73%), mientras que si bien al tratar con FK506 y FK506/vincristina existió un

incremento de la expresión de MRP1, éste fue menor (aumento de un 23% y 36%,

respectivamente) (Figura 12).

58

A

B

MR

P1

(%)

V e h ícu lo

V inc r is

t ina

F K 5 0 6

F K 5 0 6 /

v inc r is

t ina

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

* * *

*

59

Figura 12. Análisis por inmunohistoquímica de MRP1 en muestras de tumores bajo

distintas condiciones de tratamiento. (A) Inmunomarcaje con el anticuerpo anti-MRP1

(dilución 1:50). Objetivo 20X. (B) El gráfico representan la expresión de MRP1 por

inmunohistoquímica de los tumores tratados con PBS 1X (vehículo), vincristina (0,3

mg/kg/72 hrs), FK506 (2,25 mg/kg/72 hrs) y FK506/vincristina. Las imágenes fueron

cuantificadas utilizando el programa ImageJ 1.50. El gráfico se expresa como porcentaje

(%) relativo al control tratado con PBS 1X (vehículo). *, p≤ 0,05; ***, p≤ 0,001. n=2.

60

4.8 Evaluación de la expresión de Ki-67 en muestras de tumores subcutáneos


Se evaluó los niveles de Ki-67 (marcador tumoral de ubicación nuclear) en las

muestras tratadas con las diferentes drogas, y como resultado se observó una

disminución significativa de esta proteína al tratar los tumores con FK506 por si solo y

con FK506/vincristina (disminución de un 33% y 35%, respectivamente). En cambio, con

el tratamiento con vincristina no existió una disminución de Ki-67, manteniéndose

prácticamente igual al control (vehículo) (Figura 13).

61

A

B

Ki-

67

(%)

V e h ícu lo

V inc r is

t ina

F K 5 0 6

F K 5 0 6 /

v inc r is

t ina

0

5 0

1 0 0

1 5 0

* * ** *

62

Figura 13. Análisis por inmunohistoquímica de Ki-67 en muestras de tumores bajo

distintas condiciones de tratamiento. (A) Inmunomarcaje con el anticuerpo anti-Ki-67

(dilución 1:50). Objetivo 20X. (B) El gráfico representan la expresión de Ki-67 por




(%) relativo al control tratado con PBS 1X (vehículo). **, p≤ 0,01; ***, p≤ 0,001. n=2.

63

4.9 Evaluación de la expresión de GFAP en muestras de tumores subcutáneos


Los niveles de expresión de GFAP (marcador de células astrogliales) fueron

evaluados en las muestras de tumores de las ratas tratadas con las diferentes drogas.

Se pudo apreciar que bajo el tratamiento con vincristina, GFAP no varió su expresión,

mientras que bajo el tratamiento con FK506 por si sólo y FK506/vincristina los niveles de

GFAP disminuyeron significativamente respecto al vehículo (disminución de un 26% y

47%, respectivamente) (Figura 14).

64

A

B

GF

AP

(%)

V e h ícu lo

V inc r is

t ina

F K 5 0 6

F K 5 0 6 /

v inc r is

t ina

0

5 0

1 0 0

1 5 0

* * * ** * *

65

Figura 14. Análisis por inmunohistoquímica de GFAP en muestras de tumores bajo

distintas condiciones de tratamiento. (A) Inmunomarcaje con el anticuerpo anti-GFAP

(dilución 1:50). Objetivo 20X. (B) El gráfico representan la expresión de GFAP por




(%) relativo al control tratado con PBS 1X (vehículo). ***, p≤ 0,001; ****, p≤ 0,0001. n=2.

66

4.10 Evaluación de la expresión de Nestina en muestras de tumores subcutáneos


Por último, se evaluaron los niveles de expresión de la proteína Nestina (proteína

utilizada como marcador de células madre neurales) en las muestras tratadas con las

diferentes drogas. No se observó una disminución significativa de esta proteína bajo los

tratamientos con vincristina y FK506. Únicamente, existió una disminución significativa

respecto al vehículo, la cual fue de un 25%, al tratar los tumores con FK506 en

combinación con vincristina (Figura 15).

67

A

B

Ne

sti

na

(%)

V e h ícu lo

V inc r is

t ina

F K 5 0 6

F K 5 0 6 /

v inc r is

t ina

0

5 0

1 0 0

1 5 0

*

68

Figura 15. Análisis por inmunohistoquímica de Nestina en muestras de tumores

bajo distintas condiciones de tratamiento. (A) Inmunomarcaje con el anticuerpo anti-

Nestina (dilución 1:100). Objetivo 20X. (B) El gráfico representan la expresión de Nestina

por inmunohistoquímica de los tumores tratados con PBS 1X (vehículo), vincristina (0,3



(%) relativo al control tratado con PBS 1X (vehículo). *, p≤ 0,05. n=2.

69

5. DISCUSIÓN

Cáncer o neplasia, se define como un grupo de enfermedades que se caracterizan

por un crecimiento y propagación descontrolada de células anormales, siendo el mayor

problema de salud pública en el mundo (American Cancer Society, 2015; Siegel, Miller y

Jemal, 2015). Entre las neoplasias cerebrales más mortales y comunes encontramos a

los gliomas malignos, de los cuales aproximadamente el 60 - 70% corresponden a

astrocitomas de grado IV o Glioblastoma multiforme (GBM) (Wen y Kesari, 2008; Clarke,

Butowski y Chang, 2010; Van Meir et al., 2010). Este tipo de tumor cerebral, caracterizado

por ser el más agresivo, altamente invasivo e infiltrativo, presenta una alta tasa de

mortalidad, la cual promedia los 14 meses de vida post diagnóstico (Parsons et al., 2008;

Van Meir et al., 2010). Las características mencionadas anteriormente son una de las

causas de la baja sobrevida de los pacientes, ya que a causa de su invasividad la

resección quirúrgica del tumor se dificulta y éste no se logra erradicar completamente.

Además de esto, el fracaso terapéutico es otro aspecto importante, y este se debe

principalmente a la sobreexpresión de transportadores de multiresistencia a drogas

(transportadores ABC) ubicados en la membrana plasmática de la célula. Una vez que la

droga antineoplásica ingresa a las células, estas proteínas la transportan desde el

espacio intracelular al medio extracelular en un proceso dependiente de ATP y, por lo

tanto, la droga no permanece dentro de la celula y no logra ejercer su efecto (Declèves

et al., 2006; Lu y Shervington, 2008; Garrido et al., 2011).

Por otro lado, se ha observado que en este tipo de tumores, la barrera

hematoencefálica (BHE) se encuentra dañada, lo que se ha demostrado mediante

estudios de neuroimagenología con CT (tomografía computacional) y MRI (resonancia

70

magnética), en donde se observa una extravasación de un colorante, previamente

inyectado, a través de la BHE (Grossman y Batara, 2004). Si bien, esto facilitaría el

transporte por vía paracelular de las drogas, el cual normalmente se previene por las

uniones estrechas entre las células endoteliales, se sabe que el transporte permanece

limitado aún cuando la BHE se encuentra dañada (Van Rooy et al., 2010). Además,

existen evidencias de la presencia de transportadores ABC en la BHE, lo que genera una

pobre absorción de los fármacos, impidiéndose que alcancen la zona del tumor a las

concentraciones terapéuticas requeridas (Begley, 2004; Declèves et al., 2006; Miller,

2013). En nuestro laboratorio, se ha descrito la presencia de los transportadores ABCA2,

ABCA5, MDR1, MDR3 y MRP1 en la línea celular HBMEC (células endoteliales de

microvasculatura cerebral), y además, se ha caracterizado al transportador MRP1 como

el mayormente expresado en líneas celulares, cultivos primarios y muestras de tejido de

GBM (Quezada et al., 2008; Peigñan et al., 2011; Quezada et al., 2011).

Por otra parte, el GBM contiene células que expresan marcadores de células

gliales y marcadores de stem cells, indicando la presencia de más de una población

celular en el tumor, las células ‘‘bulk’’ (células diferenciadas) del tumor y una subpoblación

celular denominada ‘‘Cancer Stem Cells’’ (CSCs), la cual juega un rol importante en los

procesos de tumorigénesis (Yuan et al., 2004; Lathia et al., 2015). Este tipo celular, a

diferencia de las Stem Cells normales (NSC), funcionan de manera desregulada, siendo

capaces de repoblar el tumor y generar la recurrencia del GBM (Gürsel et al., 2011). Si

bien, las CSCs comparten ciertas características con las NSC como la capacidad de

autorenovarse y diferenciarse a distintas estirpes celulares, no necesariamente son

generadas a partir de éstas, debido a que existen evidencias que sustentan que múltiples

71

tipos celulares, desde NSC hasta células diferenciadas, pueden estar sujetas a

transformaciones oncogénicas y transformarse en CSCs (Lathia et al., 2015).

En este estudio, se trabajó con ambos tipos celulares de las líneas U87MG y C6,

evaluándose los niveles de transcrito, proteína y la actividad del transportador de

resistencia a múltiples drogas MRP1; todo esto bajo distintas concentraciones de la droga

inmunosupresora tacrolimus (FK506), de la cual existe una gran variedad de

antecedentes que indican que es capaz de revertir el fenotipo de MDR,

quimiosensibilizando la neoplasia a fármacos anticancerígenos (Arceci, Stieglitz y Bierer,

1992; Naito et al., 1992; Gupta et al., 2006; Pawadore et al., 2006).

Los inmunosupresores como agentes anticancerígenos se han estudiado ya desde

los años 80, en donde se identificó que rapamicina en combinación con 5-fluorouracilo

(5FU) y ciclofosfamida (CYP) presentaba mejores resultados que cualquiera de las

drogas administradas por si solas, inhibiéndo el crecimiento tumoral en un modelo de

adenocarcinoma colorectal generado en ratones BDF1 (Eng, Sehgal y Vézina, 1984).

Respecto al efecto sobre los transportadores de MDR, se ha descrito que algunos

inmunosupresores como ciclosporina A, rapamicina, sirolimus y FK506 aumentan la

acumulación intracelular de ciertas drogas anticancerígenas sustrato del transportador P-

gp y BCRP (Arceci, Stieglitz y Bierer, 1992; Naito et al., 1992; Pawadore et al., 2006). Si

bien existe una gran variedad de evidencias respecto al efecto de los inmunosupresores

sobre el transportador P-gp, no son muchos los trabajos que han estudiado el efecto

sobre el transportador MRP1, aunque se ha descrito que al tratar con ciclosporina A y

FK506 aumenta la concentración intracelular de mitoxantrona en células que

sobreexpresan MRP1, concluyendose que la actividad de este transportador estaría

72

disminuida en estas células (Qadir et al., 2005; Pawadore et al., 2006). Cabe destacar,

que sólo se había descrito el efecto de los inmunosupresores sobre la actividad de los

transportadores de MDR, pero en el año 2011, en nuestro laboratorio se demostró que

FK506 es capaz de disminuir los niveles de transcrito y proteína del transportador MRP1,

además de su actividad, utilizando la línea celular T98G de GBM humano (Garrido et al.,

2011). Sorprendentemente, en el presente estudio, al evaluar los niveles de transcrito y

de proteína de MRP1 bajo distintas concentraciones de FK506 (7, 15 y 30 ng/mL), no se

observaron diferencias significativas. Este resultado se obtuvo en células diferenciadas y

GSCs de ambas líneas celulares (U87MG y C6). Respecto a esto, se sabe que los

moduladores MDR usualmente son inhibidores competitivos de los transportadores ABC,

ocupando los sitios de unión a sustrato o bien, interfiriendo con el sitio de unión a ATP

(Pawadore et al., 2007). Hace algunos años se descubrió que FK506, al igual que

ciclosporina A y verapamil, es sustrato de P-gp y, por lo tanto, disminuyen sólo su

actividad interactuando directamente con éste (Naito et al., 1992; Yokogawa et al., 1998).

También se evidenció que FK506 inhibe competitivamente a BCRP en la línea celular

MCF-7 de adenocarcinoma mamario, desplazando la unión del sustrato radiactivo [125I]-

iodoarylazidoprazosin ([125I]-IAAP) (Pawadore et al., 2007).

Por otra parte, se ha sugerido que las inmunofilinas (FKBPs, blancos intracelulares

de FK506) funcionarían como reguladores de los transportadores ABC, lo que se ha

demostrado en modelos de Saccharomyces cerevisiae y Arabidopsis (Hemenway y

Heitman, 1996; Geisler et al., 2003). Estas proteínas, son conservadas evolutivamente

desde levaduras hasta el ser humano, siendo practicamente idéntico el mecanismo de

acción que ejerce FK506 sobre las FKBPs. Sobre el mecanismo de acción de FK506, una

73

vez que éste ingresa a la célula, se une a la proteína FKBP12 y en levadura, ese complejo

además de inhibir a calmodulina, inhibiría además la interacción de FKBP12 con P-gp,

interfiriendo en la función de este último (Hemenway y Heitman, 1996). Por otro lado, en

Arabidopsis, se ha demostrado la presencia de una proteína tipo inmunofilina, llamada

TWD1 (TWISTED DWARF1) o AtFKBP42, la cual posee un dominio FKBP de 42 kDa y

además, se ha descrito que posee similitudes con las proteínas FKBP51 y FKBP52 de

mamíferos (Kamphausen et al., 2002). TWD1 interactúa con AtPGP1 (transportador

homólogo a P-gp en Arabidopsis) mediante su dominio N-terminal (dominio PPIasa) y

además, se une a AtMPR1 (transportador homólogo a MRP1 en Arabidopsis) mediante

su dominio C-terminal (dominio TRP de unión a calmodulina) modulando la actividad de

este último (Geisler, et al., 2003; Geisler, et al., 2004). Si bien no existen evidencias si

FKBP12 interactúa directamente con MRP1 en mamiferos, los antecedentes

mencionados anteriormente hacen referencia a los resultados obtenidos en este trabajo,

en donde únicamente la actividad del transportador MRP1, y no su expresión, se ve

alterada bajo el tratamiento con FK506, sugiriéndonos que esta droga estaría inhibiendo

al transportador ya sea directamente o a través de su unión a FKPB12. Es importante

destacar que la actividad del transportador MRP1 en las GSCs de ambas líneas celulares

disminuyó significativamente al ser tratadas con FK506 a una concentración de 15 ng/mL,

mientras que en las células diferenciadas la actividad del transportador disminuyó bajo el

tratamiento con FK506 desde una concentración de 7 ng/mL, sugiriéndonos una mayor

resistencia por parte de las GSCs en comparación a la población diferenciada.

Para determinar el efecto de FK506 sobre la viabilidad celular in vitro se realizó el

ensayo de MTT, para ello las células fueron sometidas a una incubación con FK506 a

74

una concentración de 15 ng/mL, concentración a la cual se observó una mayor

disminución de la actividad del transportador MRP1. Como resultado se obtuvo una

disminución de la viabilidad celular de hasta un 40%, aunque es importante destacar que

en las células U87MG existió una disminución de la viabilidad no solo bajo el tratamiento

combinado (FK506 con vincristina), si no que también bajo el tratamiento con vincristina

por si sola, lo que no ocurrio en el caso de las GSCs de la misma línea celular. Estos

resultados nos muestran una mayor resistencia al tratamiento por parte de las GSCs.

Además, al evaluar apoptosis celular en las células C6, se obtuvo un incremento de la

apoptosis al tratar las células con vincristina, en comparación con el control sin

tratamiento. Adicionalmente, el uso combinado de FK506 y vincristina, logró un

incremento mayor de la apoptosis, aunque no significativo respecto al tratamiento con

vincristina. Los resultados obtenidos de viabilidad celular y apoptosis concuerdan con

otros estudios en donde se ha descrito que FK506 tendría un efecto quimiosensibilizante

en distintas lineas celulares de cáncer, aumentando la concentración intracelular de las

drogas anticancerígenas, disminuyendo la viabilidad celular y, además, induciendo

apoptosis celular (Arceci, Stieglitz y Bierer, 1992; Garrido et al., 2011; Kawahara et al.,

2015). Si bien el ensayo de viabilidad solo se realizó en la línea celular U87MG y el

ensayo de apoptosis en las células C6, estos resultados nos sugieren un posible efecto

quimiosensibilizador de la droga FK506 para su posterior uso en modelos in vivo de GBM.

En relación al modelo in vivo, desde ya hace algunos años se han utilizado ratones

inmunosuprimidos para la generación de tumores subcutáneos y cerebrales, destacando

su uso en estudios preclínicos con drogas citotóxicas y antiproliferativas. El uso de este

modelo otorga la ventaja de poder generar tumores humanos en ratones, tan solo

75

mediante la inoculación de una línea de cultivo celular humana (Baiocchi et al., 2010;

Stylli et al., 2015). Otra aproximación es el uso de la línea celular C6 de glioma de rata,

las cuales al ser inoculadas en ratas permiten la generación de un tumor que presenta

características equivalentes al GBM humano, destacando un patrón de infiltración difuso

y crecimiento similar (Grobben, De Deyn, y Slegers, 2002; Miura et al., 2008; Stylli et al.,

2015). En este trabajo se logró generar un tumor subcutáneo en ratas Sprague-Dawley

mediante la inoculación de la subpoblación GSCs de la línea celular C6 en el flanco

izquierdo de las ratas, demostrándose el potencial tumorigénico de esta subpoblación

(Singh et al., 2004; Bao et al., 2006; Li et al., 2008). Este tipo de tumor presentó una serie

de ventajas, siendo un procedimiento poco invasivo para el animal, y además,

permitiendonos realizar un fácil monitoreo del volumen tumoral.

Las drogas FK506 (2,25 mg/kg/72 hrs, e.v.) y vincristina (0,3 mg/kg/72 hrs, e.v.),

fueron administradas de forma conjunta logrando revertir el crecimiento del tumor en un

22% al día 7 de tratamiento. Respecto a FK506, no existen muchas evidencias sobre su

poder como agente quimiosensibilizador en ratas, aunque se ha descrito que en dosis

inmunosupresoras subterapéuticas de menos de 1 mg/kg/día (no se observa supresión

de la respuesta inmune de los linfocitos T CD8+) (Iwata et al., 1993), FK506 es capaz de

reducir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de cáncer de vejiga (Kawahara

et al., 2015). Por otro lado, se han descrito una serie de efectos secundarios en humanos

tras la utilización de FK506 post-transplante, entre los que destacan nefrotoxicidad,

diabetogénesis, neuropatía, anemia, entre otros (Asante-Korang et al., 1996; Rauch et

al., 2009); además en el año 1988 se describió que FK506 en altas dosis (1, 3 y 10

mg/kg/día) ejercía un efecto tóxico en ratas, provocando pérdida de peso en los animales

76

tratados (Kawashima, Fujino y Mochizuki, 1988). Es por ello que en este estudio se utilizó

una concentración de 0,75 mg/kg/día, conocida como una concentración subterapéutica

de FK506, la cual puede ser administrada de forma endovenosa (e.v.) o intraperitoneal

(i.p.) (Iwata et al., 1993; Harada et al., 2004; Kawahara et al., 2015).

Vincristina por su parte, es un alcaloide de la vinca utilizado ampliamente como

agente quimioterapéutico en el tratamiento de algunas neoplasias, incluyendo el cáncer

de mama, leucemia, linfomas y algunos tumores cerebrales primarios (American Cancer

Society, 1997; Bhalla, Singh, Jaggi, 2015). Esta droga ejerce su efecto antineoplásico

inhibiendo la dinámica de los microtúbulos, evitando la división celular (Tanner, Levine y

Topp, 1998; Jordan, 2002); además, se ha demostrado que vincristina en dosis

superiores a 0,1 mg/kg/día administrándose durante 2 semanas, genera un efecto de

hiperalgesia y dolor neuropático en ratas (Tanner, Levine y Topp, 1998; Bhalla, Singh,

Jaggi, 2015).

Cabe destacar que si bien el modelo de tumor subcutáneo es utilizado

ampliamente en estudios preclínicos, presenta algunas desventajas, como la ausencia

de un microambiente cerebral y la ausencia de la BHE, la cual es importante en la entrega

y aclaramiento de las drogas (Stylli et al., 2015). Con respecto a vincristina, se ha descrito

que tiene una pobre penetración al tejido cerebral debido a la presencia de la BHE, aún

cuando la BHE se encuentra dañada (Boyle, Eller, Grossman, 2004). Esto se debe a que

en el endotelio vascular existen elevados niveles del transportador P-gp (Boyle, Eller,

Grossman, 2004). Además, se ha evidenciado que la concentración de vincristina,

administrada por vía endovenosa, es el doble a nivel subcutáneo comparado con el

cerebro (Boyle, Eller, Grossman, 2004). Por otro lado, Iwasaki y colaboradores realizaron

77

un estudio sobre la farmacocinética de FK506, administrándolo por vía endovenosa

(Iwasaki et al., 1998). A las 2 horas post administración, FK506 alcanzó niveles 5 veces

superiores en la piel en comparación al tejido cerebral, y 3 veces mayores a las 24 horas

post administración (Iwasaki et al., 1998). Estos antecedentes sugieren que, si bien el

tratamiento combinado con ambas drogas posee efectos positivos en el modelo de tumor

subcutáneo, podríamos obtener resultados diferentes si evaluamos estas drogas en el

modelo de tumor cerebral debido a la presencia de la BHE.

Referente a los resultados obtenidos en las inmunohistoquímicas (IHQ) de las

muestras tumorales, el transportador MRP1 aumentó significativamente al administrar

vincristina por si sola y en conjunto con FK506. Este resultado no es del todo inesperado,

ya que se ha descrito que el tratamiento con una droga, sustrato de un transportador,

induce una sobreexpresión del transportador como resultado de un mecanismo de

resistencia (Nieth y Lage, 2005). Además, las líneas celulares resistentes a fármacos,

comúnmente se establecen por la repetida administración de un fármaco, lo que provoca

una sobreexpresión de los transportadores ABC (Nieth y Lage, 2005). Es así como la

consecutiva administración de vinblastina, adriamicina y mitoxantrona, provoca la

sobreexpresión de los transportadores P-gp, MRP1 y BCRP en las lineas celulares

CEM/VBL, HL60/ADR, DON-MX, respectivamente (Arceci, Stieglitz y Bierer, 1992; Nieth

y Lage, 2005; Pawadore et al., 2007). Por otro lado, Ki-67 es una proteína nuclear

presente en todas las células en proliferación activa, encontrándose sus máximos niveles

de expresión en la fase M del ciclo celular (Urruticoechea, Smith y Dowsett, 2005; De

Azambuja et al., 2007). Este marcador se ha correlacionado también con los distintos

grados histológicos de gliomas y cáncer de mama, presentando mayores niveles de

78

expresión los tumores de alto grado (Schröder et al., 2002; Urruticoechea, Smith y

Dowsett, 2005; Hu et al., 2013). Los resultados de este trabajo nos indican que existe una

relación entre los niveles de Ki-67 con el volumen del tumor, disminuyendo su expresión

significativamente en aquellos tumores que presentaron una disminución en su tamaño

(tratamiento con FK506 y FK506 en conjunto con vincristina). Estos resultados

concuerdan con los obtenidos por Detre y colaboradores en el año 1999, en donde se

indujo un tumor mamario mediante la inoculación de celulas MCF-7 a ratones nude, y

luego del tratamiento anticancerígeno por 14 días los niveles de Ki-67 disminuyeron hasta

4 veces (Detre et al., 1999). También se ha demostrado que una disminución de los

niveles de Ki-67 se acompaña de un aumento en la apoptosis celular (Detre et al., 1999;

Johnston et al., 1999; Urruticoechea, Smith y Dowsett, 2005). Además, se evaluaron los

niveles de la Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP), la cual es utilizada como marcador de

células astrogliales, células madre neurales, y además, se ha descrito que se encuentra

altamente expresada en astrocitomas de bajo y alto grado (GBM) (Jung et al., 2007;

Wakimoto et al., 2012). En el presente estudio se obtuvo una disminución de un 26% y

47 % de este marcador en los tumores tratatados con FK506 y FK506 en combinación

de vincristina, respectivamente. Por último, se evaluaron los niveles de Nestina, una

proteína de filamentos intermedios utilizada como marcador de células madre neurales

(Wakimoto et al., 2012; Neradil y Veselska, 2015). Además, esta proteína se encuentra

expresada en altos niveles en las GSCs, asociándose a las características de

autorenovación y proliferación celular (Neradil y Veselska, 2015). Se ha descrito que en

el GBM existen elevados niveles de Nestina (Lu et al., 2010; Wakimoto et al., 2012),

corroborándose el resultado obtenido en los ensayos in vivo, en donde se observa un alta

79

expresión de Nestina en la condición control (vehículo). A diferencia de esta situación,

únicamente se obtuvieron menores niveles de Nestina bajo el tratamiento con FK506 en

combinación con vincristina, en donde existió una disminución de un 25% de la expresión

de este marcador, indicándonos un efecto favorable en el tratamiento de este tipo de

tumor.

En base a lo discutido, se expone un modelo, en el cual se observa que al tratar

únicamente con vincristina, ésta entra a la célula y es expulsada por el transportador

MRP1 (Figura 16A). Posteriormente, tras la repetida administración de vincristina, los

niveles de expresión de MRP1 aumentan, pero al administrarse conjuntamente con

FK506, vincristina permanece en el medio intracelular (Figura 16B). Cabe destacar que

debido a que se desconoce el mecanismo de acción por el cual FK506 inhibe la actividad

de MRP1, hemos propuesto que puede ser mediante la unión directa al transportador,

funcionando como un inhibidor competitivo; o a través de la unión a FKBP, impidiendo

que esta proteina module positivamente la actividad de MRP1 (Figura 16B).

En términos generales, podemos concluir que la droga FK506 no posee un efecto

significativo sobre los niveles expresión del transcrito de MRP1 ni en los niveles de

expresión proteicos de este transportador. En contraste, la actividad del transportador

MRP1 disminuye significativamente bajo el tratamiento con FK506. Además, FK506 en

combinación con vincristina disminuye la viabilidad celular y el volumen tumoral en un

modelo in vivo alogénico subcutáneo de GBM. Asimismo, los niveles de expresión de

ciertos marcadores como Ki-67, GFAP y Nestina disminuyeron.

80

Figura 16. Modelo del tratamiento de FK506 en combinación con vincristina. (A) La

droga vincristina ingresa a la célula y una vez dentro de ella es conjugada a Glutatión

(GSH), lo que conlleva a su eflujo a través del transportador MRP1, el cual estaría siendo

modulado positivamente por la intercción con la proteína FKBP. (B) La administración de

FK506 inhibe la actividad del transportador MRP1, ya sea inhibiéndolo competitivamente

o uniéndose a FKBP, provocando que ésta no module al transportador. Esta inhibición

permite que vincristina permanezca intracelularmente, aún cuando los niveles de

expresión de MRP1 en la membrana plasmática se encuentren aumentados por la

administración repetitiva de vincristina.

81

Finalmente, como proyección a futuro, proponemos evaluar el efecto de la

combinación FK506/vincristina en un modelo animal xenogénico, inoculando células de

GBM de origen humano vía intracerebral, con el fin de obtener una aproximación más

cercana a la enfermedad, incorporando variables como el microambiente tumoral y la

presencia de la BHE. En base a esto consideramos el uso de FK506 como un potente

agente quimiosensibilizador en este tipo de neoplasias, permitiendo otorgar a los

pacientes un mejor pronóstico para esta enfermedad.

82

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ESTUDIO DEL EFECTO DE TACROLIMUS EN LA RESISTENCIA