Estudio estructural de los factores de transcripción EhHSTF y EhYY1 de Entamoeba histolytica como posibles blancos terapéuticos. Clave CGPI: 20080309 RESUMEN Entamoeba histolytica el agente causal de la amibiasis es un parásito que está expuesto durante su ciclo de vida a diferentes presiones ambientales, no obstante es capaz de invadir y establecerse en su huésped. Esto lo logra gracias a los cambios en los patrones de expresión de diferentes genes involucrados en patogenicidad y virulencia entre otros. Poco se conoce a cerca del control transcripcional en este parásito. Sin embargo en nuestro grupo de trabajo hemos identificado dos factores de transcripción, los cuales podrían tener una gran relevancia en la expresión génica de E. histolytica. Estos factores son el EhHSTF y el EhYY1. Ambos factores presentan regiones muy conservadas con sus homólogos identificados y estudiados en otros organismos como son el dominio de unión al DNA. No obstante también presentan algunas diferencias que los hacen candidatos a blancos terapeúticos frente a esta parasitosis. INTRODUCCION La amibiasis, es una enfermedad ubicua que afecta a grandes poblaciones en el mundo, y es causada por el protozoario E. histolytica, De 500 millones de personas que están infectadas en todo el mundo con Entamoeba, la mayoría está infectada con E. dispar y 10% (50 millones) con E. histolytica; una forma invasiva, lo que constituye cinco millones de casos, con mortalidad de 100 000 personas por año (Goldsmith, 2005; WHO, http://www.who.int/). La transcripción de E. histolytica es un evento génico poco estudiado. Factores de transcripción En la actualidad solo han sido descritos seis factores de transcripción en E. histolytica el primero y segundo factores decubiertos corresponden a las proteínas EhEBP1 y EhEBP2 de 28 y 18 kDa respectivamente. Estos presentan regiones homólogas con los motivos de reconocimiento de RNA (RRM) (Shaenman y col., 1998). El tercero es el factor C/EBP, el cual presenta un dominio bZIP altamente conservado (Orozco, 2000). El cuarto es el factor URE3-BP de 22.6 kDa que presenta dos motivos de uniòn a calcio EF-hand. El quinto es la proteína de unión a la caja TATA (TBP). Y mas recientemente se identificó a una familia de tres factores de transcripción de choque térmico (HSTF) (Gomez y col., 2007). Recientemente Nieto y col., 2005 mostraron que en la región de –111 a –170 pb del promotor del gen EhPgp5 se encuentran los elementos de respuesta a la emetina (ERE). En esta región se identificaron secuencias consenso de unión para los factores CdxA, YY1 y un elemento de respuesta a choque térmico (HSE). En donde al analizar la funcionalidad de estas secuencias se encontró que la responsable de activar la expresión del gen EhPgp5 es el elemento HSE. No obstante, cuando se deletó y mutó la secuencia YY1 se observaron cambios en la actividad transcripcional del promotor del gen EhPgp5, ya que se disminuyó la expresión del gen reportero CAT. Por lo que probablemente la secuencia YY1 este involucrada en la activación del gen EhPgp5 aunque no con la misma intensidad que la secuencia HSE (Nieto, 2007 Tesis). La proteína que potencialmente podría reconocer a ésta secuencia es el factor transcripcional YY1, el cual ha sido blanco de muchos investigadores por sus múltiples funciones en procesos biológicos y se han encontrado diversas características

estructurales en éste factor. Una de ellas es la presencia de dominios de dedos de zinc que se encuentran presentes en un amplio grupo de proteínas denominadas ZFP (del inglés zinc fingers proteins). Estructura Ying Yang 1 (YY1) es un factor de transcripción con una gran versatilidad funcional, ya que como su nombre lo indica es tanto activador como represor transcripcional de diversos genes. El factor YY1 de mamífero es una proteína altamente conservada de 414 aminoácidos con un peso molecular de 44 kDa (Bushmeyer et al., 1995). Sin embargo, YY1 migra en geles SDS a un peso molecular de 65-68 kDa probablemente debido a la estructura de la proteína. A lo largo de la secuencia protéica del factor YY1 de mamífero se han identificado diversos sitios funcionales. Dos regiones acídicas del residuo 1 al 50 y del 81 al 153, las cuales se han identificado como un sitio de activación de éste factor. En los residuos 70 al 80 se ha identificado un cluster de histidinas y hacia el residuo 154-198 se ha encontrado un alto porcentaje de glicinas y alaninas (aproximadamente el 55%) el cual es un dominio importante de transactivación (Austen et al. 1996). OBJETIVOS Objetivo general

Caracterizar estructuralmente a los factores de transcripción EhHSTF y EhYY1 de Entamoeba histolytica.

Objetivos particulares

1. Realizar un análisis “In silico” de la proteína EhYY1 2. Analizar filogenéticamente a la proteína EhYY1 3. Identificar secuencias consenso de unión para el factor YY1 en regiones 5´-flanqueantes de genes amibianos 4. Determinar la expresión del gen EhYY1 en trofozoítos crecidos bajo diferentes condiciones de estrés térmico y químico

METODOS Y MATERIALES Analisis “In silico” Obtención de secuencias de proteínas de dedos de zinc y de factores de transcripción YY1. Las secuencias de las ocho diferentes proteínas de dedos de zinc seleccionadas por su mayor homología con nuestra proteína y de los siete factores de transcripción YY1 que ya han sido identificados en diversos organismos se obtuvieron usando la herramienta BLAST dentro del servidor EXPASY (www.expasy.org), utilizando la secuencia de la proteína que denominamos EhYY1. Se realizaron una serie de alineamientos utilizando el programa CLUSTALW dentro del servidor European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/index.html) para determinar los porcentajes de similitud entre

las diferentes secuencias. Los alineamientos obtenidos se exportaron al programa BIOEDIT versión 7.0.0 (www.iubio.bio.indiana.edu/molbio/seqpup). Identificación de dominios funcionales Se utilizó el programa SCANPROSITE del servidor EXPASY (www.expasy.org) para identificar los sitios potencialmente funcionales de las proteínas EhYY1 y HYY1 (YY1 de H. sapiens) con la finalidad de hacer un análisis estructural comparativo. Predicciones tridimensionales de estructuras terciarias Se realizaron predicciones de estructura terciaria de la proteína EhYY1 utilizando el programa SWISS-MODEL del servidor EXPASY. Para estas predicciones estructurales se utilizaron dos diferentes templados (en formato PDB) los cuales fueron visualizados y analizados estructuralmente con el programa PyMol (versión 0.97 www.pymol.org/funding.html,). Así mismo fueron analizados estereoquímicamente con el programa WinCoot (versión 0.3.3), al igual que los modelos prediseñados, con la finalidad de identificar la probable estructura terciaria de la proteína EhYY1. Análisis filogenético. Las secuencias obtenidas se manejaron en formato FASTA y se realizaron una serie de alineamientos utilizando el programa CLUSTALW dentro del servidor European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/index.html) con la finalidad de hacer un estudio filogenético de las secuencias. Utilizando el programa MEGA4 (www.megasoftware.net) se realizó un estudio filogenético de las diferentes proteínas de dedos de zinc y de los factores de transcripción YY1 que han sido identificados en diferentes organismos y se construyeron diferentes árboles filogenéticos. Búsqueda de secuencias consenso de unión para el Factor YY1 en regiones 5´ flanqueantes de otros genes amibianos 5.2.1. Obtención de las secuencias de diversos genes de E. histolytica. Se realizó una selección de 14 genes involucrados en los procesos de invasión, adhesión y lisis celular (Tabla 3), es decir, en general en el evento de virulencia. La secuencia de cada gen se obtuvo a partir del servidor PATHEMA (www.pathema.tigr.org) el cual utiliza como base de datos el sitio TIGR (de sus siglas en inglés The Institute of Genomic Research) (www.tigr.org). Obtención de las secuencias 5´-flanqueantes y búsqueda de secuencias consenso de union para el factor YY1 Una vez obtenida la secuencia completa de los genes antes mencionados, se realizó la búsqueda de los contigs correspondientes para identificar y seleccionar una secuencia de aproximadamente 1000 pb río arriba de las regiones 5´-flanqueantes de cada uno. En estas regiones se realizó la búsqueda de secuencias consenso de unión para el factor YY1 utilizando el programa TESS (Transcription Element Search System) (http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess). Cultivo de trofozoítos de E. histolytica.

Los trofozoítos de la Clona A fueron cultivados axénicamente a 37º C en medio TYI-S-33 (Diamond y col., 1978) suplementado con suero bovino al 16.6% (Biofluids). Los trofozoítos de la Clona A también se cultivaron bajo dos diferentes condiciones: estrés térmico; dando un choque térmico de 42ºC a las células en tiempos de 30 min, 1, 2 y 3 h; y con estrés químico añadiendo 220 μg de Emetina (8 μM) por cada 50ml de medio de cultivo. Obtención de RNA de los trofozoítos de E. histolytica. A partir de un cultivo de trofozoítos de la Clona A, (5x106 células/caja de cultivo) se cosecharon las amibas en tubos falcon estériles de 50 ml. Se realizaron dos lavados con PBS a un pH 6.8. En el segundo lavado se agregó un volumen de 15 ml de PBS y se realizó el conteo de trofozoítos utilizando una cámara de Neubauer, posteriormente, el paquete celular obtenido se resuspendió en 800 μl de Trizol (Invitrogen) por cada 5 x 106 células. Los pellets se resuspendieron en 30 μl de agua DEPC y finalmente se almacenaron a -70°C. Cuantificación del RNA Para la cuantificación del RNA se realizó una dilución 1:500 de las muestras previamente resuspendidas y se cuantificó por espectrofotometría, se determinó su pureza y se almacenó a -70°C. Ensayos de RT-PCR Para determinar la presencia del transcrito del gen EhYY1 en los trofozítos cultivados bajo las diferentes condiciones a estudiar se realizaron ensayos de RT-PCR con cada uno de los RNAs extraídos de los trofozoítos de la clona A crecidos en ausencia y en presencia de emetina; sin exposición y con exposición a un choque térmico por 30 min, 1, 2 y 3 h. Se prepararon las siguientes mezclas de reacción utilizando el Kit Access RT-PCR System (Promega) que contiene: 10 μl de Buffer Amv-Tf1, 1 μl de dNTP´s, 2 μl de MgSO4, 1.5 μl oligonucleótido antisentido (YY1As) a 40 μM (CGGGATCCATTACAATGATACATT), RNA equivalente a 10 μg, 1 μl de enzima RT y H2O DEPC cbp 100 μl; esta reacción se realizó en el Termociclador (Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400) a 48°C durante 45 min, posteriormente se adicionó 1.5 μl de oligonucleótido en sentido (YY1S) (5´CGGGATCCATGGAAAGCCAAATAG3´) y 1 μl de enzima Taq Polimerasa. RESULTADOS Análisis de las secuencias de proteínas de dedos de zinc y de factores de transcripción YY1 identificados en otros organismos. Una vía de identificación de las características de proteínas es el análisis In silico comparativo de éstas con proteínas previamente reportadas y analizadas, mediante la búsqueda de dominios y sitios que potencialmente resulten ser funcionales. Por tal motivo realizamos la búsqueda de las secuencias de proteínas ZFP y de factores de transcripción YY1 identificados en otros organismos. Llevamos a cabo un estudio comparativo de las secuencias de las proteínas de dedos de zinc y de la proteína EhYY1, y posteriormente entre los factores YY1 y nuestra proteína

en estudio. Para realizar estos análisis primero se obtuvieron las secuencias de dichas proteínas haciendo un BLAST en el servidor EXPASY. Para lo cual obtuvimos las secuencias de las proteínas ZFP de D. rerio comúnmente llamado “pez cebra” (A7MBW5); C. quinquefasciatus, un mosquito casero (B0XJ63); C. albicans, un hongo (Q5A696); R. norvegicus, rata (Q8CGQ6); M. musculus, ratón (Q497V9); C. intestinales, un urocordado marino (Q1RLG5); H. sapiens, humano (Q5MCW4) y A. aegypti, un mosquito que es el principal vector del virus de la fiebre amarilla (Q17IF0). Posteriormente, se obtuvieron las secuencias completas de los factores de transcripción YY1 que han sido reportados para los siguientes organismos: B. taurus, el toro (A5D7T6); I. punctatus conocido como “pez gato” (Q4JHY9); D. rerio comúnmente llamado “pez cebra” (Q7T1S3); M. musculus, ratón (Q00899); H. sapiens, humano (P25490); R. norvegicus, rata (Q8CHJ4) y X. laevis, una rana africana (Q6DDI1). Estas secuencias se compararon con la secuencia de la proteína que denominamos EhYY1 utilizando el programa ClustalW para hacer un alineamiento múltiple. Los alineamientos múltiples mostraron un porcentaje de homología del 51 al 56% y de identidad del 33 al 40% entre las proteínas ZFP y la proteína EhYY1. Por otro lado, observamos un porcentaje del 54 al 56% de homología y del 34 al 35% de identidad entre los factores de transcripción YY1 y la proteína YY1 de E. histolytica. Uno de los dominios más conservados en las ZFP son los dominios de dedos de zinc (Klug et al., 1995). En las siete proteínas utilizadas en este estudio se identificaron de 4 a 18 dominios de dedos de zinc, los cuales se encuentran hacía el extremo carboxilo terminal al igual que en la secuencia de la proteína en estudio EhYY1. Con estos datos podemos señalar que hay un alto porcentaje de homología e identidad entre las proteínas de dedos de zinc, los factores de transcripción YY1 y la proteína en estudio EhYY1, ya que estos tres tipos de proteínas comparten la presencia precisamente de un número variable de dedos de zinc.

Identificación de los dominios de la proteína EhYY1. Debido a que los factores YY1 presentan, además de los dominios de unión al DNA, otros sitios conservados que son importantes para su actividad como sitios de fosforilación, amidación y miristilación. Nosotros decidimos buscar estos dominios en la proteína EhYY1 y hacer un análisis estructural comparativo con la proteína YY1 de humano. Utilizamos el programa SCANPROSITE del servidor EXPASY he identificamos, en la proteína EhYY1, diez diferentes sitios de fosforilación dependientes de diferentes cinasas, dos sitios de miristilación, y uno de glicosilación. Asimismo identificamos la presencia de cuatro dedos de zinc que potencialmente conformarían el dominio de unión al DNA. Todos son en un principio sitios que potencialmente pueden ser funcionales (Tabla 2).

Los resultados muestran que ambas secuencias presentan sitios semejantes, que al estar

presentes en ellas y a pesar de que no se encuentran exactamente en la misma posición, probablemente puedan tener la misma función tales como los dedos de zinc y los sitios de fosforilación.

Tabla 2. Sitios identificados y su localización específica. En esta tabla se muestran los sitios y su localización en las secuencias de las proteínas YY1 de H. sapiens y de E. histolytica.

SITIO H. sapiens (No. de residuos)

E. histolytica (No. de residuos)

N- glicosilación 149 a 152

Sitio de fosforilación dependiente de AMPc-GMPc

362 a 365 21 a 24

Sitio de fosforilación dependiente de Proteincinasa C

180 a 182 256 a 258 337 a 339

20 a 22 56 a 58 25 a 27 51 a 53 126 a 128

Fosforilación dependiente de Caseincinasa II

108 a 11 236 a 239 225 a 228 247 a 250

5 a 8 73 a 76 56 a 59

Fosforilación dependiente de Tirosincinasa

104 a 111

Sitio de N-miristilación. 56 a 67 160 a 167 114 a 119 176 a 181 188 a 202 263 a 272

34 a 39 177 a 182

Sitio de Amidación 176 a 183 256 a 259 360 a 363

Dedos de zinc 296 a 320 353 a 377 325 a 347 383 a 407

28 a 54 88 a 112 60 a 82 118 a 142

De igual manera, los sitios de fosforilación son relevantes en la activación de este factor ya que estudios de defosforilación demostraron que ésta proteína al no estar fosforilada, ya no puede interaccionar con su secuencia consenso en el promotor perdiendo su función activadora o represora. Interesantemente, se identificó un dominio hacia el extremo C terminal de la proteína EhYY1 conformado por cuatro dedos de zinc en similitud con la proteína YY1 de humano el cual corresponde al dominio de unión al DNA. Con este análisis se identificaron, en la secuencia de la proteína que denominamos EhYY1, de una longitud de 185 aminoácidos, cuatro dominios de dedos de zinc del tipo C2H2. El primer dominio corresponde del residuo 30 al 54 (24 aminoácidos); el segundo dominio corresponde del residuo 62 al 84 (22 aminoácidos); el tercer dominio corresponde del residuo 89 al 112 (23 aminoácidos); y el cuarto dominio corresponde del residuo 120 al 142 (22 aminoácidos) de la secuencia aminoacídica del EhYY1 (Figura 1). Con los datos anteriormente descritos, podemos concluir que la proteína EhYY1 al presentar estos dominios de dedos de zinc tendría la capacidad de interaccionar con el

DNA. Más aún, debido a que son muy semejantes a los dominios de la proteína HYY1 tanto en estructura como en número, podría tratarse de un factor YY1-like. Figura 1. Dominios de dedos de zinc identificados en la secuencia aminoacídica de la proteína EhYY1.

6.3. Predicción de estructura terciaria Con la finalidad de tener una mejor caracterización estructural de la proteína EhYY1 de E. histolytica realizamos un análisis de predicción de su estructura tridimensional, para lo cual hicimos un análisis comparativo con el cocristal ya reportado de la proteína YY1 de humano, haciendo una sobreposición de los modelos y estableciendo una semejanza estructural de las proteínas. Para la realización del modelo utilizamos el programa Swiss Model del servidor EXPASY, éste se obtuvo en formato PDB y se visualizó con el programa PyMol. Como templado para la realización de la primera predicción utilizamos el cocristal de la proteína YY1 de humano, denominado en formato PDB 1Ubd (Houbaviy et al. 1996). Está proteína esta constituida también por cuatro dedos de zinc (Figura 2). El resultado de ésta primera predicción nos mostró a la proteína EhYY1 del residuo 30 al 141, ubicándonos de manera particular en los cuatro dedos de zinc. Observamos que la EhYY1 está constituida en su mayoría por los dedos de zinc (Figura 2A). Algo similar se puede observar con el cocristal HYY1, ya que en éste modelo se observan los residuos del 285 al 408, que son justamente en donde se encuentran los dedos de zinc conformando el dominio de unión al DNA (Figura 2B). Como se puede observar ambas proteínas presentan una estructura muy semejante sugiriendo su posible similitud en sus funciones.

A B

COOH

COOH

NH3 NH3

Figura 2. Predicción de la estructura terciaria de la proteína EhYY1. A. Modelo predicho EhYY1a. B. Templado utilizado HYY1 (1Ubd). En ambos modelos se muestran las cuatro estructuras α hélices correspondientes a cada uno de los dedos de zinc. Sin embargo, debido a que nuestra proteína también presenta cierto grado de similitud con las ZFP, entonces realizamos una nueva predicción de estructura pero utilizando como templado una ZFP de humano, la cual se encuentra cocristalizada y se denomina en formato PDB como 2Gli. Esta es una proteína codificada por el oncogene Gli humano y

esta constituida por cinco dedos de zinc (Pavletich et al., 1993). El resultado obtenido fue visualizado también con el programa PyMol (Figura 3), en donde se observa nuevamente que la EhYY1 está constituida en su mayoría por los dedos de zinc, el modelaje se realizó del residuo 34 al 142 en donde se encuentran ubicados justamente los dedos de zinc (Figura 3A) apoyando el resultado de que la proteína en estudio parece ser un factor YY1-like. Mientras que si bien el modelo del co-cristal de la ZFP también se realizó en la región donde se ubican los dedos de zinc (residuo 103 al 202) (Figura 3B), el parecido entre ambas estructuras terciarias no es muy elevado.

COO

A

NH3

NH3

COOB

Figura 3. Predicción de estructura terciaria de la proteína EhYY1. A) Segundo modelo predicho EhYY1B. B) Templado utilizado proteína ZFP de humano 2Gli. Posteriormente, con los modelos mostrados en las figuras 2 y 3 se realizó un análisis estereoquímico de las estructuras para determinar cual de los modelos predichos presentaba mayor calidad estereoquímica de sus enlaces peptídicos. 6.3.1. Evaluación de la calidad de los modelos Con la finalidad de determinar cual de las predicciones de los modelos tridimensionales presentaba una mejor calidad estereoquímica se evaluaron los ángulos de torsión phi (φ), psi (ψ) y omega (Ω) y los choques en las cadenas laterales que pudieran presentarse para cada estructura. Este análisis se llevó a cabo utilizando el programa WinCoot (versión 0.3.3). Los resultados de los porcentajes de los residuos en posiciones preferentes, residuos en posiciones permitidas y residuos en posiciones estrictamente no permitidas del gráfico

de Ramachandran se muestran en la tabla 3, en donde podemos observar que EhYY1a (utilizando de templado a la proteína YY1 de humano, 1Ubd) presenta un 83.64% de residuos en regiones preferentes, un 11.82% de residuos en regiones permitidas y un 4.55% de residuos en regiones no permitidas. Estos resultados nos indican que el modelo EhYY1a presenta un porcentaje significativo de conformaciones energéticamente favorecidas, lo que nos indica que éste modelo presenta una buena calidad estereoquímica.

Tabla 3. Resultados de los gráficos de Ramachandran EhYY1 y 1Ubd.

PDB Residuos en regiones preferentes

Residuos en regiones permitidas

Residuos en regiones no permitidas

EhYY1 (a) 83.64% 11.82% 4.55%

1Ubd 87.50% 8.93% 3.57%

Sin embargo, debido a que nuestra proteína también presentó porcentajes del 51 al 56% de homología y del 33 al 40% de identidad con las ZFP, entonces realizamos una predicción de estructura, pero utilizando como templado una ZFP de humano, la 2Gli. Los resultados de los porcentajes de los residuos en regiones preferentes, residuos en regiones permitidas y residuos en posiciones estrictamente no permitidas del gráfico se muestran en la tabla 4. Los resultados nos muestran que EhYY1b (segunda predicción) presenta un 71.03% de residuos con ángulos preferentes, un 13.08% de residuos con ángulos permitidos y un 15.89% de residuos con ángulos no permitidos. Con estos porcentajes podemos determinar que el modelo EhYY1b presenta un mayor número de conformaciones energéticamente no favorecidas y por lo tanto una menor calidad estructural en comparación con el primer modelo (EhYY1a).

Tabla 4. Resultados de los gráficos de Ramachandran EhYY1 y 2Gli

PDB Residuos en regionespreferentes

Residuos en regionespermitidas

Residuos en regiones no permitidas

EhYY1 (b) 71.03% 13.08% 15.89%

2Gli 67.97% 17.65% 14.38%

Por otro lado, con la finalidad de describir cual de los modelos obtenidos es de mejor calidad en estructura terciaria realizamos el estudio del enlace omega y un análisis de la geometría de los modelos con base al estudio de la planaridad de los enlaces peptídicos de la cadena principal. Para el primer estudio, el análisis de los datos obtenidos por el programa WinCoot en donde se señala el número de residuos con enlaces omega correctos tanto de los templados, como de los modelos predichos se muestra en la tabla 5. Para ambos templados (1Ubd y 2Gli) pudimos observar un 100% de residuos con enlaces Ω correctos. Sin embargo, conforme los resultados observados en el programa WinCoot, el modelo 1Ubd presenta una mejor planaridad en sus enlaces péptidicos. Ahora bien, al realizar el estudio del enlace Ω con el modelo EhYY1a obtuvimos una predicción de estructura con un 99% de residuos con enlaces Ω correctos y un 1% con enlaces Ω incorrectos, indicando que el modelo EhYY1a es estereoquímicamente de mejor calidad que el obtenido al utilizar como templado a la proteína ZFP, esto debido a que contiene un mayor número de residuos con valores ideales en comparación con el modelo EhYY1b (Tabla 5).

Tabla 5. Resultado del análisis del enlace omega de los modelos

EhYY1 (a) 1Ubd EhYY1 (b) 2Gli

Residuos con enlaces Ω correctos 99% 100% 92% 100%

Residuos con enlaces Ω incorrectos 1% 8%

Por otro lado, realizamos un análisis de la geometría de los modelos con base al estudio de la planaridad de los enlaces peptídicos de la cadena principal debido a que en casi todos los enlaces peptídicos es de 180° considerándose éste ángulo como un valor ideal del enlace.En la tabla 6 se muestran los datos obtenidos del programa WinCoot, en donde se muestran los porcentajes de los residuos con valores ideales y no ideales tanto de los modelos predichos, como de los templados. En el modelo EhYY1a se obtuvo un 99.5% de residuos con valores ideales y un 0.5% de residuos con valores no ideales. Así mismo, en el templado 1Ubd podemos observar un 100% de residuos con valores ideales, ya que todos sus residuos conservan la planaridad adecuada de acuerdo con los parámetros del programa WinCoot. Al realizar éste mismo análisis con el modelo EhYY1b se obtuvo un 93% de residuos con valores ideales y un 7% de residuos con valores no ideales. Sin embargo el templado 2Gli también presentó un 100% de residuos con valores ideales pero la calidad en sus residuos planares es menor en comparación con el templado 1Ubd.

Comparando estos porcentajes con el primer modelo observamos que EhYY1a presenta un mayor número de residuos con valores ideales en su planaridad indicando que modelo es de mejor calidad. Con todos estos datos podemos determinar que el modelo EhYY1a presenta mayor calidad estereoquímica en comparación con el modelo EhYY1b. Tabla 6. Resultado del análisis de la geometría de la cadena principal de los modelos

EhYY1 (a) 1Ubd EhYY1 (b) 2Gli

Residuos con valores de ángulo≈ 180° 99.5% 100% 93% 100%

Residuos con valores de ángulo ≠ 180° 0.5% 7%

6.4. Análisis filogenético del factor EhYY1 Debido a que la EhYY1 presentó características similares tanto con las ZFP, como con los factores YY1 realizamos un estudio evolutivo del factor EhYY1 para poder denotar su origen y ubicación genética. Seleccionamos, por un lado, las secuencias de las proteínas ZFP de organismos representativos en la escala evolutiva y, por otro lado, las secuencias de los TFYY1 que ya han sido identificados.

Figura 4. Árbol Filogenético de las ZFP con los Factores de Transcripción YY1 de diferentes organismos y con EhYY1. En la imagen podemos observar que ambos grupos de proteínas (ZFP y YY1) derivan de un mismo ancestro común, sugiriendo así que nuestra proteína en estudio puede pertenecer a ambos grupos de proteínas, lo cual se sustenta con la presencia de los dominios de dedos de zinc. Sin embargo, podemos observar que en el árbol se agrupan en las ramas inferiores las ZFP y en una rama superior todos los TFYY1, lo que nos indica la separación evolutiva de ambos grupos protéicos aunque comparten algún ancestro. No obstante, EhYY1 se ubica en una posición intermedia entre los dos grupos protéicos, lo que sugiere que nuestra proteína probablemente se encuentra en una etapa de transición entre ambos grupos, esto debido tal vez al grado evolutivo que tiene E. histolytica. Además de que al realizar un análisis estructural comparativo del EhYY1 con las ZFP, nuestra proteína no presenta algunos de los dominios conservados entre diferentes ZFP como el dominio KRAB y BTB (Bellefroid et al. 1991). Datos que la clasificarían dentro de otro grupo. Así mismo, algo similar podemos observar en el análisis con los factores YY1 ya que el EhYY1 no presenta no presenta ninguna de éstas regiones, pero si presenta un alto grado de conservación en el dominio de unión al DNA conformado por los cuatro dedos de zinc, tanto en posición como en tamaño. 6.5. Búsqueda de secuencias consenso de unión para el factor YY1 en regiones 5´ flanqueantes en diferentes genes amibianos.

Con el antecedente de que E. histolytica presenta un encendido y apagado de diversos genes durante su ciclo de vida, debido a que desde que entra en contacto con su huésped esta sometida a diversos tipos de estrés, estuvimos interesados en identificar posibles secuencias consenso de unión para el factor de transcripción YY1 en regiones 5´ flanqueantes de diversos genes amibianos implicados tanto en la patogenicidad, como en la virulencia de este parásito. Para lo cual, realizamos una lista de 14 genes amibianos (Tabla 7) implicados en la patogenicidad y virulencia del parásito, posteriormente bajamos las secuencias de éstos del proyecto genoma de la amiba utilizando el programa Pathema, el cual utiliza como base de datos el TIGR (del inglés, The Institute of Genomic Research). Una vez obtenidas las secuencias fueron identificados los “contigs” correspondientes para cada gen. Por lo que tomando en cuenta que los promotores identificados tienen un tamaño aproximado de 300 a 1000 pb, se utilizaron las primeras 1000 pb rio arriba del sitio de inicio de la traducción de cada gen para llevar a cabo la búsqueda de posibles secuencias consenso de unión para el TFYY1 utilizando el programa TESS (del inglés, Transcription Element Search System).

Tabla 7. Lista de genes amibianos implicados en patogenicidad y virulencia.

GENES 1. Actina 2. Ameboporo A 3. Ameboporo C 4. Cistein proteinasa 1 5. Cistein proteinasa 8 6. Cistein proteinasa 13 7. Cistein proteinasa 18 8. Hsp20 9. Unidad pesada de la lectina10. Lectina Igl1 11. Lectina Igl2 12. Peroxirredoxina 13. Piruvatoferredoxina 14. Superóxido dismutasa

Los resultados obtenidos por el programa TESS se muestran en la tabla 8 donde se indican, para cada gen, las posiciones de posibles secuencias consenso de unión para el factor YY1. Tabla 8. Tabla de posiciones de las posibles secuencias consenso de unión para el YY1 en diferentes regiones 5´-flanqueantes de genes amibianos. Actina

-227 -221 Cistein proteinasa 1 -21 -16

Hsp20 -31 -26

-237 -232 -30 -25 -50 -45 -267 -262 -55 -50 -123 -118 -412 -407 -83 -77 -196 -191 -449 -444 -90 -85 -292 -286 -501 -496 -106 -101 -314 -309

-518 -513 -160 -155 -536 -531 -588 -582 -192 -187 -656 -651 -775 -770 -214 -209 -727 -721 -886 -881 -248 -243 -797 -792 -256 -251 -805 -800Ameboporo A -17 -12 -261 -256 -845 -840 -154 -149 -282 -277 -906 -901 -210 -205 -510 -505 -978 -973 -298 -293 -563 -558

-570 -565

-573 -568Cistein proteinasa 18 -19 -14

-603 -598 -816 -811 -302 -297 -656 -651 -972 -967 -307 -302 -693 -688 -316 -311

-718 -712 Cistein proteinasa 8 -62 -57

-443 -438

-737 -732 -300 -295 -835 -830 -886 -881 -400 -395 -846 -840 -928 -923 -459 -454 -887 -882 -948 -943 -843 -838

-887 -882Unidad pesada lectina -179 -174

Ameboporo C -44 -39 -915 -910 -230 -225 -52 -47 -933 -928 -458 -453 -340 -335 -515 -510

-517 -512

Cistein proteinasa 13 -48 -43

-527 -522 -518 -512 -171 -166 -536 -531 -651 -645 -402 -397 -674 -669 -795 -790 -557 -551 -724 -719 -810 -805 -634 -629 -790 -785 -870 -865 -677 -671 -879 -874 Lectina Igl1 -110 -105 Lectina Igl2 -118 -112 Peroxirredoxina -44 -39 -136 -131 -236 -231 -196 -191 -236 -231 -346 -341 -274 -269 -346 -341 -426 -421 -351 -346 -426 -421 -597 -592 -427 -421 -562 -557 -610 -605 -603 -598 -810 -805 -959 -954Piruvato ferredoxina -40 -35

Superóxido dismutasa -83 -78

-66 -61 -135 -130 -361 -356 -147 -142 -373 -368 -170 -165 -384 -378 -241 -236

-415 -410 -271 -266 -478 -473 -291 -286 -513 -508 -301 -296 Con estos datos podemos concluir que al encontrar estos posibles sitios de unión para el factor transcripcional YY1, y tomando en cuenta su característica tan peculiar que puede funcionar como un activador y/o un represor de genes, entonces es probable que el EhYY1 esté participando en la regulación de la expresión de genes implicados en la patogenicidad y virulencia del parásito, jugando un papel fundamental en la sobrevivencia del parásito. 6.6. Expresión del gen EhYY1. Debido a que E. histolytica lleva a cabo un encendido y apagado de genes durante su ciclo de vida por ser sometida a diferentes tipos de estrés y dadas las características particulares de los factores YY1, pudiera ser que EhYY1 tenga un papel relevante en el control de diferentes genes amibianos. Por tal motivo, con la finalidad de determinar la expresión de la proteína EhYY1 bajo diferentes tipos de estrés, se cultivaron y cosecharon trofozoítos de la CA crecidos en condiciones basales y bajo dos diferentes condiciones: estrés térmico a cuatro diferentes tiempos y con estrés químico usando 8 μM. Una vez cosechados estos trofozoítos se obtuvieron los RNAm correspondientes, los cuales fueron cuantificados por espectrofotometría. Asimismo su integridad fue verificada a través de un gel desnaturalizante de formaldehído. Posteriormente se procedió a realizar la estandarización de los ensayos de RT-PCR, utilizando el Kit Access RT-PCR System (Promega) y los oligonucleótidos YY1SB y YY1ASB los cuales flanquean en las regiones 5´ y 3´ del gen completo respectivamente. Los resultados muestran la amplificación de una banda la cual corresponde al tamaño esperado (525 pb) en los trofozoítos crecidos sin estrés térmico. Sin embargo se observó una disminución en la expresión del gen conforme se incrementaron los tiempos de estrés térmico, hasta desaparecer completamente la expresión a las 3 h (Figura 5). De igual manera se realizaron las RT-PCRs para el gen de actina (control positivo) de los trofozoítos crecidos a diferentes tiempos de estrés térmico. En la figura 6 se observa la banda esperada de 210 pb correspondiente al fragmento de gen de actina amplificado a los diferentes tiempos de estrés térmico. Observamos una disminución del 70% de la expresión del gen EhYY1 a los 30 min de choque térmico, en comparación con la basal, un 84% y un 88.7% menos de expresión a las 1 y 2 h de choque térmico, mientras que a las 3 h no se observó expresión del gen EhYY1. Estos resultados sugieren que el estrés térmico modifica la cantidad del transcrito del gen EhYY1 en los trofozoítos (Figuras 5 y 6). Por otro lado también analizamos la expresión del gen EhYY1 en los trofozoítos de la clona A crecidos bajo un estrés químico con emetina (CAE). Como en los ensayos de RT-PCR anteriores observamos la expresión de éste gen en los trofozoítos crecidos en ausencia de la droga (100%), sin embargo, su expresión cambio cuando las amibas se cultivaron en presencia de emetina, ya que disminuyó 74%, lo que sugiere que el estrés químico también altera la expresión de éste gen (Figura 7). El control positivo correspondiente al gen de actina para la CA fue detectada, no obstante en la CAE su expresión también se vió alterada ante la condición probada. Los datos obtenidos muestran que, en la clona A, el gen EhYY1 se expresa a nivel de RNAm en condiciones normales de crecimiento, sin embargo, su expresión se ve alterada cuando los trofozoítos se someten algún tipo de estrés como térmico o químico.

pb

622

527

307

pb

525

1 2 3 4 5 6

1 2

Figura 5. Detección de la expresión del gen EhYY1, en trofozoítos de la CA de E. histolytica crecidos bajo un estrés térmico, mediante ensayos RT-PCR. Gel de acrilamida al 12%. Carril 1, marcador de tamaño molecular pBR 322/Msp1; carril 2, RT-PCR del gen EhYY1 en condiciones basales de crecimiento; carriles 3, 4, 5 y 6, RT-PCR del gen EhYY1 a los tiempos de 30 min, 1, 2 y 3 h de estrés térmico.

1 2 3 4 5 6

pb

307

217

pb

210

Figura 6. Amplificación del fragmento del gen de actina mediante RT-PCR (control positivo). Gel de acrilamida al 12%. Carril 1, marcador de tamaño molecular pBR 322/Msp1; carril 2, RT-PCR del gen actina en trofozoítos sin estrés térmico; carriles 3, 4, 5 y 6, RT-PCR del gen actina a los tiempos de 30 min, 1, 2 y 3 h de estrés térmico.

pb

525

1 2 3

pb

622

527

307

Figura 7. Detección de la expresión del gen EhYY1, en trofozoítos de la CA de E. histolytica crecidos bajo un estrés químico, mediante ensayos RT-PCR. Gel de acrilamida

al 12%. Carril 1, marcador de tamaño molecular pBR 322/Msp1; carril 2, RT-PCR del gen EhYY1 en condiciones basales de crecimiento; carril 3, RT-PCR del gen EhYY1 de trofozoítos

crecidos con 8 μM de emetina.

IMPACTO El presente proyecto permitió que se realizara y concluyera la formación de dos estudiantes de posgrado, una de maestría y otra de doctorado. Un estudiante más de maestría aún está en formación y recientemente se ha incorporado un estudiante de doctorado. Asimismo, permitió el acercamiento de estudiantes de licenciatura al área de la investigación biomédica. El trabajo se presentó en el Congreso Nacional de Bioquímica a través del cual se difundió parte del conocimiento generado del presente proyecto. Además se generó conocimiento en el área de factores de transcripción en E. histolytica. Finalmente, con los resultados obtenidos y unos más que estamos realizando pretendemos escribir un artículo para una revista internacional. Asímismo se escribió un capítulo en un libro sobre el tema a nivel internacional.