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EVALUACIÓN A NIVEL IN VITRO DEL EFECTO DE LA VARIACIÓN NUTRICIONAL SOBRE
LA ACTIVIDAD PROMOTORA DE CRECIMIENTO VEGETAL EN MICROORGANISMOS
ASOCIADOS A PLANTAS DE SACHA INCHI (Plukenetia volubilis Linneo)
DANIELA STEFAN ROJAS COPETE
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
2
EVALUACIÓN A NIVEL IN VITRO DEL EFECTO DE LA VARIACIÓN NUTRICIONAL
SOBRE LA ACTIVIDAD PROMOTORA DE CRECIMIENTO VEGETAL EN
MICROORGANISMOS ASOCIADOS A PLANTAS DE SACHA INCHI (Plukenetia volubilis
Linneo)
DANIELA STEFAN ROJAS COPETE
Trabajo de grado
Presentado como requisito
Para optar por el título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
Director
Bayron Enrique Agualimpia Valderrama
M.Sc Química Ambiental
Codirector
Carlos Augusto Acevedo Isidro
M.Sc Fitoprotección
Asesor
Giampaolo Orlandoni Merli
PhD. Estadística
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
3
4
AGRADECIMIENTOS
A mi director por su paciencia, tiempo prestado y conocimiento durante el
desarrollo de esta investigación y en las distintas etapas de mi formación académica.
A mi co-director y asesor, por su conocimiento, apoyo y aportes en el
desarrollo de este trabajo.
A mis padres por el apoyo constante, paciencia, lucha y entrega durante todo
el curso de mi carrera universitaria.
A mi tía y mi prima por su colaboración y apoyo en este proceso de formación.
A todos los docentes que hicieron parte de mi formación profesional en cada
semestre cursado.
A mis compañeros y amigos Jahir Vargas, Nathalia Hernández y Ricardo
García por ser un equipo, apoyo, acompañamiento durante cada semestre cursado.
Al personal de laboratorio UDES por la paciencia y colaboración prestad
5
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN 9
INTRODUCCIÓN 13
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 15
JUSTIFICACIÓN 17
1. MARCO TEÓRICO 18
1.1 El cultivo de la oleaginosa promisoria (Sacha inchi) 18
1.1.1 Fertilización y manejo en el cultivo de Sacha inchi 19
1.2 Inoculantes microbianos como alternativa a la agricultura sostenible 20
1.3 Microorganismos promotoras de crecimiento vegetal (PGPM) 22
1.3.1 Microorganismos fijadores de nitrógeno 23
1.3.2 Microorganismos solubilizadores de fosfatos 24
1.3.3 Microorganismos productores de sustancias indólicas 25
1.4 Evaluación y selección de microorganismos PGPM 27
2 MARCO CONTEXTUAL 29
3 OBJETIVOS 32
3.1 General 32
3.2 Específicos 32
4 METODOLOGÍA 33
6
4.1 Ubicación 33
4.2 Microorganismos 33
4.3 Establecimiento de requerimientos nutriciones 34
4.4 Respuesta fisiológica de la producción de sustancias indólicas y solubilización de fosfatos
bajo variados requerimientos nutricionales 34
4.4.1 Producción de ácido indol acético 34
4.4.2 Solubilización de fosfatos 35
4.5 Diseño experimental 36
4.6 Análisis estadístico 38
4.7 HIPÓTESIS 39
4.7.1 Hipótesis nula 39
4.7.2 Hipótesis alternativa 39
4.8 Métodos cuantitativos utilizados 39
4.8.1 Determinación de sustancias indólicas reactivo de Salkowsky 39
4.8.2 Determinación de fosfato soluble por el método de molibdovanadato fosfórico 40
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 41
5.1 Establecimiento de requerimientos nutricionales 41
5.2 Respuesta de la producción de sustancias indólicas bajo diferentes concentraciones y
fuentes de carbono 46 5.3
Respuesta fisiológica de la solubilización de fosfatos bajo diferentes concentraciones y fuentes de
carbono 43
7
5.4 Relación de las actividades con los requerimientos nutricionales dadas 55
6 CONCLUSIONES 59
7 RECOMENDACIONES 60
8 LISTA DE REFERENCIAS 61
TABLAS
Tabla 1. Sustancias indólicas producidas por géneros microbianos. 26
Tabla 2. Relación de los tratamientos y concentraciones a evaluar para actividad producción de
indoles. 37
Tabla 3. Relación de los tratamientos y concentraciones a evaluar para actividad solubilización de
fosfatos. 37
Tabla 4. Requerimientos nutricionales establecidos 41
Tabla 5. Estadística descriptiva para producción de sustancias indólicas por TSEBT01-01 55
FIGURAS
Figura 1. Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 y TSPBT06-01 bajo requerimientos
nutricionales establecidos 42
Figura 2. Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de
(5g/L) 47
Figura 3 . Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de
(2.5g/L) 49
8
Figura 4. Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de
(1.25g/L) 50
Figura 5. Respuesta del microorganismo TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de
(10g/L) 52
Figura 6. Respuesta de TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de (5g/L) 53
Figura 7. Respuesta del microorganismo TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de
(2.5g/L) 54
Figura 8. Estudio de medias de la producción de sustancias indólicas 57
9
RESUMEN
Título: EVALUACIÓN A NIVEL IN VITRO DEL EFECTO DE LA VARIACIÓN NUTRICIONAL
SOBRE LA ACTIVIDAD PROMOTORA DE CRECIMIENTO VEGETAL EN
MICROORGANISMOS ASOCIADOS A PLANTAS DE SACHA INCHI (Plukenetia volubilis Linneo)
Autor: Rojas Copete, Daniela Stefan
Palabras clave: PGPM, Sacha inchi, requerimientos nutricionales, solubilización de fosfatos,
producción de sustancias indólicas
Descripcción:
En el presente trabajo se buscó ampliar los criterios para la evaluación nivel
in vitro de los microorganismos con actividad promotora de crecimiento (PGPM) aislados de
órganos de sacha inchi, con el fin de seleccionar los que se van a ser llevados a campo y que
tengan un mayor efecto benéfico para el cultivo en cuanto a su desarrollo. Para ello se evaluó
el comportamiento de la respuesta de producción de sustancias indólicas y solubilización de
fosfatos en dos cepas definidas en anteriores trabajos como PGPM, bajo distintas
concentraciones y fuentes de carbono.
Inicialmente se definieron los requerimientos nutricionales y operacionales
que permitieran la expresión estable de las actividades en cada una de los microorganismos, a
través de formulación y ajuste de tipo de medio, fuente de carbono, nitrógeno, fósforo,
temperatura y comportamiento de crecimiento. Luego se determinó la respuesta de las
actividades producción de sustancias indólicas y solubilización de fosfatos bajo las diferentes
fuentes de carbono.
10
Como resultado se logró evidenciar que para producción de indoles la mayor
respuesta se obtuvo con triptófano 99.97mg/L a una concentración de 5g/L mientras en las otras
fuentes de carbono sólo se obtuvo respuesta cuando la concentración fue de 1.25g/L en las
fuentes de carbono manitol, xilosa y glucosa con valores de 13.35mg/L, 10.22mg/L y
10.22mg/L de sustancias indólicas respectivamente, por otro lado, la solubilización de fosfatos
sólo se obtuvo respuesta para concentración de 10g/L con glucosa como fuente de carbono
36.30mg/L de fosfato soluble. Finalmente, mediante un análisis de medias; se determinó que la
producción de sustancias indólicas depende del triptófano y su concentración, mientras, que la
solubilización de fosfatos depende totalmente de la glucosa y su concentración en el medio para
la expresión de la actividad.
11
ABSTRACT
Title: IN VITRO LEVEL EVALUATION OF THE EFFECT OF NUTRITIONAL VARIATION ON THE
PROMOTING ACTIVITY OF VEGETABLE GROWTH IN MICROORGANISMS ASSOCIATED
WITH SACHA INCHI PLANTS (Plukenetia volubilis Linneo)
Author: Rojas Copete, Daniela Stefan
Key words: PGPM, Sacha inchi, Nutritional requirements, Solubilization of phosphates,
Production of indole substances
Description:
In the present work we sought to expand the criteria for the evaluation in vitro
level of microorganisms with growth promoter activity (PGPM) isolated from sacha inchi
organs, in order to select those that are going to be taken to the field and that have a greater
beneficial effect for the crop in terms of its development. To this end, the performance response
of indolic substances and solubilization of phosphates was evaluated in two strains defined in
previous studies as PGPM, under different concentrations and carbon sources.
Initially, the nutritional and operational requirements that allowed the stable
expression of the activities in each of the microorganisms were defined, through the formulation
and adjustment of the type of medium, carbon source, nitrogen, phosphorus, temperature and
growth behavior. Then the response of the activities indolic substances production and
solubilization of phosphates under the different carbon sources was determined.
12
As a result, it was possible to demonstrate that for the production of indoles
the highest response was obtained with tryptophan 99.97mg / L at a concentration of 5g / L
while in the other carbon sources only response was obtained when the concentration was 1.25g
/ L in the carbon sources mannitol, xylose and glucose with values of 13.35mg / L, 10.22mg /
L and 10.22mg / L of indole substances respectively, on the other hand, solubilization of
phosphates was only obtained response for concentration of 10g / L with glucose as carbon
source 36.30mg / L of soluble phosphate. Finally through an analysis of means; it was
determined that the production of indole substances depends on the tryptophan and its
concentration, while, that the solubilization of phosphates depends entirely on the glucose and
its concentration in the medium for the expression of the activity.
13
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos promotores de crecimiento vegetal conocidos como
(PGPM) y sus actividades benéficas, vienen siendo estudiados para desarrollar alternativa de
manejo y fertilización que permitan el establecimiento sostenible en la región, de la oleaginosa
conocida como Sacha inchi, reconocida en el mundo por tener cualidades nutricionales y
terapéuticas, aprovechable en industriales de alimentos y suplementos para humanos y
animales, debido al alto contenido en sus aceite de omegas: 3, 6 y 9, y contenido de proteínas
y aminoácidos (Perúbiodiverso, 2009).
Los PGPM son reconocidos por ser microorganismos que promueven el
crecimiento y desarrollo de las plantas, estos se encuentran en el suelo teniendo una interacción
benéfica planta-microorganismo, ya que muestran actividades como solubilización de fosfatos,
producción e sustancias indólicas y fijación de nitrógeno entre otras. Gracias a esta actividades
se han desarrollado inoculantes microbianos que al ser aplicados en campo mejoran
considerablemente la calidad y riqueza de los cultivos. Sin embargo, para el desarrollo de dichos
inoculantes, necesariamente se deben aislar, evaluar y seleccionar en el laboratorio los
microorganismos que presenten las mejores actividades (farmacéuticas, 2018).
Por lo anterior, el problema que se presenta a menudo durante la evaluación y
selección de éstos microorganismos en el laboratorio, es que cuando se llevan a campo muchas
veces no expresan las mismas actividades. Esto se debe, a que no se tienen en cuenta los
14
factores nutricionales presenten en el suelos los cuales pueden afectar la respuesta fisiológica
de los microorganismos, entre los requerimientos nutricionales se encuentran: fuente de
carbono, nitrógeno, fósforo y otros micronutrientes, tipo de medio, temperatura, tiempo, pH,
humedad y luz esenciales en el proceso metabólico microbiano, y además, otro factor
importante para tener en cuenta es la concentración de estos elementos ya que pueden afectar
los procesos celulares inhibiendo otros factores (Cueto, M; Jimenez, A; Sotelo, L. y Tarsicio,
A., 2012).
En este contexto, este trabajo se enmarca en la búsqueda de nuevos criterios
de evaluación y selección de microorganismos previamente aislados que presenten dicha
actividad y de esta manera ampliar, fortalecer, determinar y establecer bases para la formulación
de inoculantes microbianos, de esta manera, aprovechar para el establecimiento de cultivos
agrosostenibles. Los resultados obtenidos en esta investigación van a permitir evaluar la
respuesta comportamiento fisiológico y como el tipo de sustrato puede influir en la expresión
de actividades PGPM de tal manera que faciliten seleccionar de mejor manera los
microorganismos que se van a utilizar en el cultivo de Sacha inchi.
15
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la actualidad la universidad de Santander viene adelantado investigaciones
que apuntan a desarrollar alternativas para la fertilización y manejo agrosostenibles de la
oleaginosa promisoria Sacha inchi (Plukenetia volubilis), reconocida por la características
nutricionales y terapéuticas de su aceite, rico en omega 3, 6 y 9 (Gómez, 2005). Dichas
alternativas se han fundamentado en el uso de microorganismos con actividades promotoras de
crecimiento vegetal. Para lo cual, ya se cuenta con una colección de bacterias hongos y
levaduras aislados de los distintos órganos de Sacha inchi, con capacidad para la producción de
Sustancias indólicas y solubilización de fosfatos. Éstos microorganismos, con los que se espera
formular inoculantes para la fertilización del cultivo de sacha inchi, han sido evaluados y
seleccionados, a nivel in vitro, tenido en cuenta únicamente las actividades expresadas bajo
requerimientos nutricionales controladas y sobre-enriquecidas en el laboratorio.
Por lo que hace imperativo seleccionar a aquellos que realmente al ser
llevados a campo presente efectos benéficos sobre la planta. Sin embargo, tal como lo reportan
otros estudios, generalmente los microorganismos seleccionados con la mejores actividades a
nivel in vitro, al ser llevados a campo, disminuyen dichas actividades y no generan los efectos
benéficos esperados sobre la planta. Situación que puede explicarse en algunos casos, al hecho
de que en los ensayos de laboratorio no se tiene en cuenta la complejidad de la fisiología del
microorganismos evaluados, ni cómo estos pueden responder a diferentes requerimientos
nutricionales nutricionales, entre ellas la fuente de carbono, cuando son llevados a campo, ya
que los componentes de los medios formulados en el laboratorio donde se evalúan las respuesta
16
de los microorganismos, no son los mismos que se encuentran naturalmente en el suelo y las
concentraciones de los mismos son totalmente diferentes a las de campo donde van a ser
aplicados.
Es sabido que las actividades ya mencionadas, se asocian a factores físico-
químicos y algunos factores nutricionales como fuentes de carbono que se ubican en el suelo y
en la planta donde se va a estimular o establecer el microorganismo, es decir en los ambientes
naturales de interacción (microorganismo-suelo-planta), la expresión de las actividades
microbianas benéficas mencionadas se pueden ver afectadas específicamente por el tipo y
concentración de las sustancias o elementos presentes en el suelo y los exudados de la planta,
debido a que pueden llegar a incidir en el crecimiento o reproducción de la población
microbiana funcional (Cano, 2011).
Debido a lo anterior y a que en la actualidad los microorganismos con
actividades que promueven el desarrollo de la planta se están teniendo en cuenta para la creación
de paquetes tecnológicos de fertilización sostenible, es que se hace indispensable tener en
cuenta otros factores a la hora de evaluar los microorganismos PGPM en el laboratorio, que
pueden afectar su fisiología y por lo tanto sus respuesta benéfica en campo.
17
JUSTIFICACIÓN
Los resultados de esta investigación van a contribuir y ampliar criterios que
permitan una mejor selección de micoorganismos con actividad promotora de crecimiento
(pgpm) y garantizar que estos cuando se lleven a campo tengan el mismo funcionamiento o
que no se vean disminuidas las actividades por otras condiciones nutricionales y ambientales.
Por otro lado, se extiende el área de conocimiento en procesos de evaluación de
microorganismos PGPM a nivel de laboratorio, ajustando factores que se encuentran en las
condiciones in vivo a las del in vitro.
También contribuye al desarrollo de la líneas de investigación que permitan
establecer el tipo de cultivo con el uso de microorganismos, es decir, generando paquetes
tecnológicos que puedan contribuir al desarrollo sostenible de este cultivo.
Otro aporte de este trabajo, es enriquecer la línea de investigación del
programa y del grupo de investigación CIBAS donde se ha venido desarrollando estudios,
porque no solo valora la riqueza microbiológica funcional si no que le da aparte criterios de
sostenibilidad en la medida que se seleccionan los microorganismos con las mejores actividades
demostradas para la mejora de la agricultura colombiana.
18
1. MARCO TEÓRICO
1.1 El cultivo de la oleaginosa promisoria (Sacha inchi)
Sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) es una planta nativa del sur de América,
también conocida comúnmente como maní inca o maní estrella. En cuanto a su taxonomía,
pertenece al reino vegetal, división Spermatophyta, Sub división Angiospermae, orden
Dicotiledónea, familia Euphorbiaceae, género Plukenetia, especie volúbilis (Mcbride, 1951).
Esta oleaginosa se encuentra distribuida por la selva peruana, Amazonía boliviana, brasilera y
se ha extendido hasta Colombia en los departamentos de Caquetá, Putumayo, Valle del Cauca,
Antioquia y Santander, de las cuales se ha registrado 17 especies en América, 3 en áfrica y una
en Asia (Cervantes, A; Cruz, Ramiro, et. al., 2002). En cuanto a su morfología es una planta
silvestre trepadora, crece entre los 100 y 2000 m.s.n.m (Ayala, 2016); Se caracteriza por tener
un fruto de valor nutricional y comercial es rico nutricionalmente por su alto contenido de
ácidos grasos poliinsaturados como ácido alfa linoleico (Omega 3) con un 48.6%, ácido
linoleico (Omega 6) con 36.8% y ácido oleico (Omega 9) con 8.28%, lipovitaminas que oscila
entre 25-30%, vitaminas, antioxidantes y aminoácidos entre los cuales están isoleucina, leucina,
lisina, tirosina, treonina, valina, metionina, cisteína y fenilalanina, son conocidos por favorecer
las funciones cerebrales, el funcionamiento en la parte de sistema digestivo, transporte y
oxigenación de la sangre, contribuye al equilibrio del metabolismo y potencia otras actividades
motoras del cuerpo (Perúbiodiverso, 2009).
19
1.1.1 Fertilización y manejo en el cultivo de Sacha inchi
Los requerimientos del suelo para el desarrollo de las plantas de Sacha inchi
son relativamente simples, esta tiene una amplia adaptación a variados tipos de terreno (franco
arcilloso arenoso, franco arcilloso y franco arenoso), pero hay condiciones ideales en las cuales
el crecimiento es óptimo, por ejemplo, se recomienda que el suelo tenga textura franco-arcilloso
o ligeramente suelto que posibilite la humedad, lo ideal es que no sean suelos tan ácidos, dentro
de un rango entre 5.5-7.5 de pH, el contenido de materia orgánica se aconseja sea alto y el modo
de siembra en cuanto a distanciamiento de tres metros entre plantas y calles para que la siembra
del cultivo sea provechoso (Ayala, 2016).
Pero, pese a la buena adaptación del cultivo en diferentes condiciones físicas
y químicas del suelo son necesarios componentes nutricionales como lo son Fósforo (P),
Carbono (C), y Nitrógeno (N) principalmente que se suplementan mediante fertilizantes
químicos o convencionales; según (Manco, 2008) afirma que en vivero se requiere realizar de
2 a 3 aplicaciones de Glow More 32-10-10 (3Kg/Ha), en campo un abono a base de nitrógeno
en una dosis de (1.0-1.5L/Ha) y también aplicaciones de Grow More 10–55- 10 (2-4 Kg/ha.) o
Quimifol PK 970 Plus (1.0-2.0 Kg./ha.) al inicio de floración e inicio de formación de fruto,
además de recomienda aplicar al suelo de NPK (30 g. urea + 45 g. superfosfato triple + 30 g.
cloruro de potasio) y de humus de lombriz de tierra (15 t/ha/año.
20
Arévalo (1995) propone que se han evidenciado buenos resultados aplicando
2Kg de humus de lombriz por planta y fertilizantes a base de hormonas, también hay estudios
en donde utilizan 57g de urea, 45g de cloruro de potasio y 45g de fosfato triple de calcio por
planta para el mantenimiento nutricional del cultivo, cabe destacar, que en épocas de intenso
calor se sugiere suministrar vitamina B (0.5-1.0 l/ha) y calcio (0.5 l/ha) ya que el exceso de
sustancias carbonatadas puede ser perjudicial para el cultivo, por esto se recomienda controlar
con sulfato de amonio con una dosificación de 9g/planta; (Perúbiodiverso, 2009) sugieren
aplicar 1Kg de compost y 100g de roca fosfórica si los suelos presentan un pH ácido o menos
a 4.5, para la suplementación del suelo 0.5Kg de humus por planta dos veces al año y para
fertilización foliar se recomienda la utilización de extractos de algas, ácidos húmicas y
desestresantes cada 90 días con el fin de mantener el balance de suelo y disminuir
enfermedades; Pero la fertilización química del cultivo incrementa los costos de producción del
10-12% de la inversión monetaria se consume en fertilizantes cada año, además, generan efectos
no sólo en sacha inchi, sino también en otras plantaciones afectando el equilibrio biológico de
suelo, predisponen al cultivo a problemas disminuyendo la estructura y la composición del
mismo, aumentan la erosión, desajustan la temperatura, la humedad, el pH y dificulta la
comercialización en Europa como producto agroecológico.
1.2 Inoculantes microbianos como alternativa a la agricultura sostenible
Los diferentes inconvenientes que se han presentado en el campo de la
fertilización agrícola, han llevado a la búsqueda de alternativas que contribuyan a proteger el
ecosistema para incrementar de manera significativa la fertilidad además que minimicen los
21
impactos del método convencional de producción y aseguren la permanencia de la agricultura
sostenible entre éstos métodos (Creus, 2017) afirma que para el crecimiento de las plantas se
sugieren el uso de bioles u otros productos aprobados por agricultura orgánica como guano de
vacuno, ovino, de gallinaza, compost de estiércol y/o vegetal, humus de lombriz, roca fosfórica,
extracto de algas marinas, bioestimulantes, microorganismos eficientes y micorrizas
(Perúbiodiverso, 2009).
A partir de los microorganismos como alternativa para un suelo sustentable,
se han desarrollado una serie de productos denominados inoculantes microbianos los cuales
frenan el uso de sustancias químicas y que se consideran la sustitución parcial o total de los
productos sintéticos (Apodaca, M; Armenta, A; Camacho, R; García, C; Montoya, Gerardo y
Nava, E, 2010); (Pineda, Eliana; Restrepo, Sara; y Ríos, Eduardo, 2017). Este uso de
inoculantes se les conoce con el nombre de biofertilizantes los cuales pueden promover el
crecimiento vegetal, prevenir o disminuir el efecto de microorganismos patógenos en las plantas
(Apodaca, M, et. al, 2017). El empleo de biofertilizantes es una de las mayores contribuciones
entre la asociación de disciplinas como la biotecnología y agroecología para la agricultura
moderna, dado que llegan a ser parte de una nueva era de la agricultura renovable.
El uso de los biofertilizantes va desde el suelo hasta distintas partes de la
planta como lo son raíz y la semilla, debido que su principal objetivo es hacer que los nutrientes
en el suelo están disponible para las plantas exhibiendo diferentes actividades entre las cuales
están: promover el crecimiento, fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos, hierro, fósforo
22
y potasio y finalmente la producción sustancias indólicas homólogas a las producidas
normalmente por las plantas como los son ácido indol acético y las auxinas (Afanador, 2017).
Por lo anterior, dado que éstos productos son a base de microorganismos
cuyos productos metabólicos directamente con la protección contra patógenos por medio de
antiobióticos o enzimas líticas como quitinasas y son usados para mejorar el desarrollo de las
plantas, se ha mostrado el potencial como recurso amigable con el medio ambientes y como
fuente importante de nutrientes. Estos microorganismos se pueden encontrar en diferentes áreas
del suelo y están directamente influenciados colonizando la raíz de la planta o dentro del tejido.
Actualmente, muchos de los países han ido incorporando esta alternativa para el cuidado de sus
cultivos, se reporta el uso de biofertilizantes en México e India a menor escala, y por otra parte,
Estado Unidos, Japón, Corea del sur y el Reino Unido a escalas más grandes; Colombia es líder
en Latinoamérica por el uso de estos productos en el manejo de su agricultura (Mishra, P. y
Dash, D., 2014).
1.3 Microorganismos promotoras de crecimiento vegetal (PGPM)
Existe una concesión de microorganismos denominados PGPM (Plant Growth
Promoting Microorganism) que tiene la cualidad de inducir el crecimiento de las plantas. Existe
un sin número de diferentes especies de microorganismos en su mayoría bacterias de vida libre
e importancia agrícola que pueden estar de manera externa e interna en las plantas situándose
en la parte de la rizosfera o suelo superficial y las intrínsecas dentro de la raíz u otras estructuras
de la planta por lo general de manera nodular. Los microorganismos PGPM están estrechamente
23
relacionados o su manera de promover el crecimiento es a partir de actividades de solubilización
de elementos esenciales y otros metabolitos secundarios (Abhilash, P; Dubey, R; Gupta, V;
Singh, . y Tripathi, V, 2016).
1.3.1 Microorganismos fijadores de nitrógeno
Los microorganismos fijadores de nitrógeno se caracterizan ser capaces de
suministrar este elemento a las plantas, existen dos grupos: los fijadores de nitrógeno
simbióticos y los de vida libre. Rhizobium es el género más conocido capaz de realizar esta
actividad, forma un tipo de simbiosis con las raíces especialmente de las leguminosas
nodulando las raíces de las plantas y aportando el N2 asimilable; la enzima encargado de esta
reacción se llama nitrogenasa la cual cambia el N2 a amoniaco (NH3) y se ioniza a (NH4).
Otros géneros que exhiben esta actividad son Azotobacter sp, Azospirillum
sp, Pseudomonas sp, Enterobacter sp y Klebsiella sp. Para la selección y evaluación de estos
microorganismos normalmente se realiza en medios carentes de nitrógeno como Ashby, para la
cuantificación de la actividad se realiza por medio de la evalución producción del ión amonio
empleando la técnica colorimétrica Berthelot (fenol-hipoclorito) y finalmente cuantificar por
medio de espectrofotometría (Lara, C; Oviedo, L. y Villalba, M., 2007).
24
1.3.2 Microorganismos solubilizadores de fosfatos
Existe un grupo de microorganismos capaz de solubilizar el fósforo no soluble
presente en el suelo por medio de reacciones de precipitación poniéndolo disponible a la planta
y brindándole una ventaja frente a las que no tiene la relación con microorganismos
(Benjumeda, 2017). Esta actividad fue reconocida hace más de un siglo, y muchos
micoorganismos de diferentes grupos y especies filogenéticos se han evidenciado que poseen
tal capacidad: Pseudomonas, Klebsiella, Flavobacterium, Enterobacter, Erwinia, Rhodobacter,
Agrobacterium, Aerobacter, Microoccus, Rhizobium, Bacillus y hongos como Aspergillus,
Penicillium, fusarium y Trichoderma (Dipika, A. y Pralhad, K., 2017) y (Gobi, T; Sayyed, R;
Sharma, S. y Trivedi, M., 2013).
Los mecanismos utilizados para la solubilización de fosfatos varían según el
complejo metabólicos de los microorganismos, como primera parte se reporta la secreción de
ácidos desechados durante el metabolismo de diferentes fuentes de Carbono, en su mayoría
azúcares, básicamente es una relación de mutua ayuda ya que los microorganismos metabolizan
los azúcares secretados por las raíces de las plantas y liberar ácidos orgánicos (oxálicos,
butílico, acético, cítrico entre otros) que tienen como función quelar el Ca2+ que está presente
en la liberación de fosfato soluble. Y el último método es a través de fosfatasas que son capaces
de hidrolizar el fósforo presente en la materia orgánica del suelo; éste mecanismo es utilizados
por bacterias como Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia, Flavobacterium,
Microbacterium y Serratia (Alexander, 1977) y (Lazarovitz,G. y Mahnaz, S., 2006).
25
Para la obtención de especies con esta característica se debe hacer un
aislamiento a partir de rizosfera u órganos de la planta en medios nutricionalmente enriquecidos
como: NBY (Yeast Broth Nutrient) y selectivos para su actividad como medio Pikovskaya,
pero, para la evaluación de su actividad como tal existen dos grandes categorías según
(Bobadilla, C. Ricón, S, 2008): cuantificación de iones ortofosfatos por medio de métodos
colorimétricos simples, rápidos y económicos como ácido vanadomolibdato fosfato, Mo-Blue
y método verde malaquita, por otro lado, existen otro métodos que miden la actividad
enzimática de la fosfatasa para esto se utiliza el p-nitrofenilfosfato y por último, (Arévalo, Z;
Corrales, L. y Moreno,V, 2014) determinaron por medio de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) la presencia de ácidos orgánicos como láctico, cítrico y propiónico los
cuales indican dicha actividad.
1.3.3 Microorganismos productores de sustancias indólicas
Otro grupo de éstos micoorganismos tienen la capacidad de producir
sustancias homólogas a las fitohormonas o también conocidas por excitar el crecimiento
vegetal; éstos microorganismos realizan esta actividad mediante su metabolismo de hormonas
importantes de tipo auxinas, giberelinas y citoquinas, la producción de hormonas son
fundamentos que inciden de manera significativa sobre el crecimiento de la planta
influenciando la tasa de respiración, proliferación de órganos arbusculares, incremento de
absorción de líquidos (agua) y elementos esenciales o minerales en el cultivo. La cualidad que
tiene algunos microorganismos de producir este tipo de sustancias se expone en la siguiente
tabla:
26
Tabla 1. Sustancias indólicas producidas por géneros bacterianos.
Sustancias indólicas Microorganismos productores
AIA
Azospirillum brasilense, Azospirillum
lipoferum, Azospirillum brasilense,
Azospirillum mutants, Rhizobium,
Xanthomonas, Pseudomonas
Giberelinas
Agrobacterium sp., Micrococcus spp.,
Pseudomonas spp., Azospirillum
lipoferum, Bacillus subtilis, Bacillus
cereus. Azospirillum brasilense
Giberelinas y Citoquina Azospirillum brasilense, Arthrobacter
giacomelloi, Azospirillum chrococcum
AIA, Giberelinas y Citoquina
Azospirillum paspali, Azotobacter spp,
Acinetobacter spp., Agrobacterium sp.,
Bacillus spp., Pseudomonas spp,
Xanthomonas, Flavobacterium spp.
(Mantilla, 2006); (Rodriguez, 2013).
En su mayoría, el género representativo en la producción de sustancias
indólicas es Azospirillum, se ha reportado que tiene sintetizar cantidades de hasta 16ug/ml a
nivel in vitro. Se ha demostrado que las hormonas se sintetizan metabólicamente teniendo
sustratos del suelo o exudados producidos por las plantas por medio de sus diferentes órganos.
Para el aislamiento de estos grupos de microorganismos en medios selectivos como NFB con
rojo Congo o azul de bromotimol como indicadores, la evaluación de su actividad se puede
realizar mediante la cuantificación química del ácido indol acético (AIA) utilizando el método
colorimétrico con el reactivo de Salkowsky y utilizando técnicas espectofotométricas
(Betancurt, C; Mantilla,C. y Oviedo, L, 2011).
27
1.4 Evaluación y selección de microorganismos PGPM
La evaluación y selección de microorganismos es un proceso complejo y es la
base para la producción de biofertilizantes, aunque para ello existen diferentes etapas previas
como: recolección de muestras, aislamiento, selección, bioaumentación y por último evaluación
teniendo en cuenta cada una de las actividades anteriormente mencionadas presente los
parámetros como: que sea estable metabólicamente y tenga una tasa de crecimiento rápida,
concentración celular superior a 108 UFC/g, no produzca efectos adversos en el hombre ni en
las comunidades microbianas nativas del suelo y presenten capacidad de colonización efectiva
en la raíz de la planta (Rondón, 2012).
Sin embargo, este proceso es dispendioso debido a que requiere el desarrollo
de métodos y experimentos de ensayo y error, y esta actividad de tener un producto tangible es
llamada bioprospección influenciada desde el proceso hasta el producto final por obstáculos
como: Un proceso de búsqueda de los microorganismos largo debido a que debe presentar las
siguientes características: competitivo, tolerante a condiciones medioambientales y activo
metabólicamente, además los costos de producción y requiere de atención de cada una de las
etapas del proceso y por último hace parte del producto la vida útil del mismo, viabilidad,
excelente desempeño en campo (Camelo, 2010) y también es necesario considerar una serie de
factores y aspectos que van a influir en su efectividad, entre ellos se tienen: los estándares de
calidad, su adaptabilidad al suelo, el vehículo que se utiliza para ser aplicado a la planta o el
suelo, la facilidad de aplicación y por último los costos de producción (Xavier, I; Holloway, G.
Y Leggett, M, 2004).
28
Un punto muy importante para destacar es que muchas veces estos
microorganismos a nivel in vitro muestran excelente respuesta en sus actividades, pero cuando
se ensayan en campo no es así, esto puede ocurrir porque usualmente la concentración
establecida no alcanza para competir con la microbiota autóctona del suelo, la efectividad de
los biofertilizantes permitirá superar las barreras que disminuyen su eficacia y que, finalmente,
imponen la percepción que tienen de ellos quienes los aplican, los productores.
Estos factores se agrupan en diferentes variables: a) el cultivo; b) el suelo; c)
el proceso de producción del inoculante, y d) las prácticas de manejo que realiza el productor
(Prabha, R; Singh D. y Singh H., 2016). Pero una de las características a las que mas se les
atribuye es que los componentes nutricionales con los que se realizan los ensayos en el
laboratorio no son los mismos en campo, por lo tanto la expresión de las actividades decae o se
vuelve totalmente nula al no tener las mismas condiciones dadas en el laboratorio, por esto, se
han realizados estudios en los cuales se varían las fuentes de Carbono a sustancias que estén
naturalmente en el suelo y de esta manera crear un ambiente similar así mismo, cuando los
inoculantes se evalúen en campo presenten las mismas características a nivel in vitro.
29
2 MARCO CONTEXTUAL
La evaluación de las actividades de microorganismos PGPR ha sido
reportado diferentes autores; (Cueto, M; Jimenez, A; Sotelo, L. y Tarsicio, A., 2012), evaluaron
el efecto de la inoculación de microorganismos en rábano en campo, la obtención de los aislados
se realizó a partir de diferentes muestras en las etapas mesófila, termófila y de enfriamiento de
proceso de compostaje, la selección de los microorganismos fue a partir de asilamiento en
medios de cultivo selectivos (Burk libre de nitrógeno y Pikovskaya) teniendo en cuenta las
actividades fijación de nitrógeno y solubilización de fosfatos, finalmente identificación
molecular en los que encontraron Azotobacter sp, Bacillus pumilus y Bacillus Licheniformis,
éste último microorganismo demostró tener mayor eficiencia en cuanto a longitud de las
plantas, número de hojas y peso seco del sistema radicular, aunque sugieren un nuevo estudio
desarrollando consorcios con los tres microorganismos para mayor efectividad.
(Cruz, S. y Murcia, A., 2017), evaluaron la capacidad de producir sustancias
indólicas mediante la prueba cuantitativa con el reactivo de Salkowsky como el ácido indol
acético (AIA) de aislados en suelos de café, yuca y palma. En donde las aislados P8 identificada
como Pseudomonas sp. Y Y16 (Bacillus sp.) tuvieron la capacidad de producir 8.22ug/mL
7.92ug/mL de AIA siendo las más efectivas.
Hay que mencionar (Patiño, C; Sanclemente, O. y Yacumal, V., 2017),
evaluaron solubilización de fosfatos de Escherichia vulneris, Pseudomonas oleivorans,
30
Acinetobacter calcoaceticus y Pseudomonas entomophila aislados de caña de azúcar y guadual,
evidenciaron que tuvo un halo en medio Pikovskaya >10mm, siendo esta aislados nunca
reportada con esta actividad. De la misma manera (Penín, 2017), reporta la determinación de
AIA mediante la misma técnica con resultados de 54ug/mL para Mesorhizium ciceri.
(Serna, 2015) Evaluó la solubilización de fosfatos por medio del método
cuantitativo molibdovanadato con tres diferentes fuentes de fósforo (Fosfato de Aluminio,
Fosfato Tricálcico y Fosfato de Hierro), Penicillum ochrochloron solubilizó 76.7mg/mL con
fuente de fosfato tricálcico, en general fue el microorganimo con mejor rendimiento
solubilizador con las tres fuentes de fosfato analizadas.
(Nautiyal, 1999), realizó una variación en la concentración de fuente de
Carbono y cloruro de magnesio, medio NBRIP (National Botanical Research Institute
Phosphate growth médium) y medio Pikovskaya en la evaluación de la solubilización de
fosfatos, dando mejores resultados en solubilización de fosfatos 121.6% el tratamiento con
(glucose, 20; MgCl2, 10) y en medio Pikovskaya +yeast extract (0.1) 144.0% en comparación
con el control.
(Barrera, A., Canchignia, H., Morante, J., Peñafiel, M., Prieto, H. y Torres, E,
2015) evaluaron las producción de ácido indol 3-acético y la formación de raíces en hojas de
vid por Pseudomonas veronii R4 durante 72 horas empleando concentraciones de 5 y 10mM de
triptófano y finalmente analizaron el producto final por cromatografía líquida en alta definición
31
(HPLC); obtuvieron mayores cantidades de AIA de 0.0231 a 0.0245mM con 5mM de triptófano
que 0.0174mM con 10mM de triptófano, esto demuestra que la fuente de carbono y otras
variables u elementos esenciales que necesita el microorganismo para crecer metabólicamente
influencia de manera directa en la expresión de estas actividades, por lo tanto, en nuevos
estudios se están haciendo variaciones con diferentes fuentes de los macro y micronutrientes
según los elementos que se encuentren naturalmente en el suelo creando un ambiente similar in
vitro a que el microorganismo se va a enfrentar en campo para así asegurar la expresión de las
actividades.
32
3 OBJETIVOS
3.1 General
Evaluar a nivel in vitro el efecto de diferentes fuentes y concentraciones de carbono sobre la
solubilización de fosfato y producción de sustancias indólicas en microorganismos asociados a
plantas de Sacha inchi (Plukenetia volubilis) de la colección promotores de crecimiento vegetal de
la Universidad de Santander.
3.2 Específicos
Determinar los requerimientos nutricionales y fisiológicas para la expresión estable de las
actividades promotoras de crecimiento vegetal en los microorganismos seleccionados.
Comparar las actividades de solubilización de fosfatos y producción de sustancias indólicas de
los microorganismos seleccionados en diferentes concentraciones y fuentes de carbono.
Establecer el nivel de correlación existente entre las actividades obtenidas y las variaciones
nutricionales implementadas.
33
4 METODOLOGÍA
4.1 Ubicación
El presente trabajo se desarrolló en la Universidad de Santander (UDES) sede
Bucaramanga; el establecimiento de condiciones, evaluación de las actividades promotoras de
crecimiento vegetal (Solubilización de fosfatos y producción de sustancias indólicas) y demás
actividades en los microorganismos se llevaron a cabo en el laboratorio de agroecología,
bioquímica, biología molecular y genética de la misma Universidad.
4.2 Microorganismos
Para la investigación de seleccionaron dos cepas de bacterias pertenecientes a
la colección de aislados del programa de Microbiología industrial con el código interno
TSEBT01-01 con capacidad para producir sustancias indólicas con reporte de 36.683mg/L y
TSPBT06-01 con habilidad de solubilizar fosfatos con niveles de 45.100mg/L en estudios
anteriormente realizados, que son parte del proyecto “Evaluación de la actividad promotora de
crecimiento en microorganismos asociados a plantas de Sacha inchi (Plukenetia volúbilis
Linneo)”.
34
4.3 Establecimiento de requerimientos nutriciones
Con el fin de garantizar los requerimientos nutricionales para las expresión
estable de las actividades por parte de los microorganismos, se establecieron crecimiento y
adaptación de los aislados, dichos requerimientos se fijaron bajo los siguientes criterios: Tipo
de medio, Tipo de fuente de carbono, nitrógeno y fósforo, temperatura, pH y comportamiento
de crecimiento mediante medición de biomasa en 0, 2, 5, 8, 11 y 24 horas por medio de
espectrofotometría y conteo de unidades formadoras de colonia (UFC), posteriormente para la
verificación de la producción de las actividades se siguió el protocolo para la determinación
cuantitativa de ácido indol acético y solubilización de fosfatos según HACH Company, 2007 y
Salkowski, 1885.
4.4 Respuesta fisiológica de la producción de sustancias indólicas y solubilización de
fosfatos bajo variados requerimientos nutricionales
4.4.1 Producción de ácido indol acético
Se prepararon los medios variando la fuente de carbono, estas, seleccionaron
bajo el criterio que sea exudado radicular, componente del suelo y se ajustaron a las tres
concentraciones diferentes, las cuales se definieron según las concentraciones normales de
carbono (Tabla 2).
35
El inóculo se adicionó al medio 10% v/v de a una concentración de 1x108
UFC/mL ajustada según la curva patrón realizada correlacionando absorbancia con UFC a
través de cinéticas de crecimiento se ajustó el pH a 7. Se llevó a cabo en viales de inyección
por duplicado para cada fuente y concentración de carbono con un volumen de 10Ml. La
evaluación se desarrolló durante 96 horas con mediciones en los tiempos 0, 24, 48, 72 y 96
horas a 30°C y 100rpm siguiendo la colorimétrica de Salkowsky; de cada muestra se tomaron
5mL posteriormente se centrifugó a 5000rpm durante 15 minutos y se añadieron 2mL de
reactivo de Salkowsky se dejó incubando a 30°C durante 30min mientras se daba la reacción
color rojo indica producción de AIA, seguidamente se llevó la cuantificación en
espectrofotómetro HACH DR 2800 a 530nm. Las muestras se tomaron por duplicado, se tomó
registro de temperatura, pH y humedad relativa.
4.4.2 Solubilización de fosfatos
Se prepararon los medios variando la fuente de carbono, estas, seleccionaron
bajo el criterio que sea exudado radicular, componente del suelo y se ajustaron a las tres
concentraciones diferentes, las cuales se definieron según las concentraciones normales de
carbono (Tabla 3). el inóculo se adicionó al medio 10% v/v a una concentración de 1x108
UFC/mL ajustada según la curva patrón realizada correlacionando absorbancia con UFC a
través de cinéticas de crecimiento a cada medio se ajustó el pH a 6. Se llevó a cabo en viales de
inyección por duplicado para cada fuente y concentración de carbono con un volumen de 10mL
36
La evaluación se desarrolló durante 96 horas con mediciones en los tiempos
0, 24, 48, 72 y 96 horas a 30°C y 100rpm siguiendo la metodología con (Molybdovanadate
Rapid Liquid Method); de cada muestra se tomaron 3mL posteriormente se centrifugó a
5000rpm durante 15min y se añadieron 2mL de reactivo de molibdovanadato fosfato se dejó a
temperatura ambiente durante siete (7) minutos mientras se daba la reacción color amarillo
indica fosfato soluble, seguidamente se llevó la cuantificación en espectrofotómetro HACH DR
2800 a 430nm. Las muestras se tomaron por duplicado, se tomó registro de temperatura, pH, y
humedad relativa.
4.5 Diseño experimental
Se empleó un diseño factorial de una variable (fuente de carbono) y tres
niveles de concentraciones (3) con dos replicas en cada punto de tiempo y en cinco (5) periodos
distintos, 0, 24, 48, 72 y 96 horas.
37
Tabla 2. Relación de los tratamientos y concentraciones a evaluar para actividad producción de
indoles.
PRODUCCIÓN DE INDÓLES
TRATAMIENTO CONCENTRACIÓN
Glucosa 5g/L 2.5g/L 1.25g/L
Xilosa 5g/L 2.5g/L 1.25g/L
Arabinosa 5g/L 2.5g/L 1.25g/L
Ácido ascórbico 5g/L 2.5g/L 1.25g/L
Triptófano 5g/L 2.5g/L 1.25g/L
Tabla 3. Relación de los tratamientos evaluar para actividad solubilización de fosfatos.
SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS
TRATAMIENTO CONCENTRACIÓN
Glucosa 10g/L 5g/L 2.5g/L
Xilosa 10g/L 5g/L 2.5g/L
Arabinosa 10g/L 5g/L 2.5g/L
Ácido ascórbico 10g/L 5g/L 2.5g/L
Triptófano 10g/L 5g/L 2.5g/L
38
4.6 Análisis estadístico
Se realizó un análisis de medias a través de la comparación de los valores de
la actividades: solubilización de fosfatos y producción de sustancias indólicas, con las distintas
fuentes y concentraciones establecidas. A partir de esto, se estableció la condición nutricional
(fuente o concentración) determinante en la variación de la actividad PGPR estudiada en cada
microorganismo evaluado por medio de una análisis de regresión.
39
4.7 HIPÓTESIS
4.7.1 Hipótesis nula
Diferentes tipos y concentración de fuente de carbono, tiene efectos sobre
expresión de las actividades PGPM (solubilización de fosfatos y producción de sustancias
indólicas) en microorganismos aislados de sacha inchi.
4.7.2 Hipótesis alternativa
Diferentes tipos y concentración de fuente de carbono no tienen efectos en la
expresión de las actividades PGPM (solubilización de fosfatos y producción de sustancias
indólicas), en microorganismos aislados de Sacha inchi.
4.8 Métodos utilizados
4.8.1 Determinación de sustancias indólicas reactivo de Salkowsky
El reactivo de Salkowsky es un método cualitativo-cuantitativo descrito por
Salkowsky en 1958, está compuesto por 2% cloruro férrico FeCl3 en una solución de HClO4el
35%, este reactivo oxida el ácido indol acético formando hierro a pH ácido, cuando hay
presencia de compuestos indólicos se observa una coloración rosa dependiendo de la
40
concentración de AIA es más intensa, para su cuantificación de utiliza un espectrofotómetro
HACH DR 2800 a una longitud de onda de 530nm (Betancurt, C., Lara, C. y Oviedo, L, 2011).
4.8.2 Determinación de fosfato soluble por el método de molibdovanadato fosfórico
El método de molibdovanadato fosfórico es utilizado para la determinación
de fosfato soluble a través de la reacción del molibdato formando complejo de fosfomolibdato
en presencia de vanadio produciendo ácido vanadomolibdofosfórico amarillo en medio ácido,
la intensidad de la coloración depende de la concentración de fosfato soluble, para la
cuantificación se realiza en espectrofotómetro HACH DR 2800 a 430nm (HACH Company,
2007).
41
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Establecimiento de requerimientos nutricionales
Los requerimientos nutricionales establecidos permitieron el crecimiento de
los microorganismos seleccionadas garantizando la expresión de las actividades (Tabla 1),
dicho crecimiento se encontró dentro de los rangos óptimos establecidos por Santos, 2016. Se
alcanzó de 2.54*109 ufc/mL una concentración microbiana para el cultivo de TSEBT01-01 y de
2.61*1012 ufc/mL para el cultivo de TSPBT06-01 durante 24 horas.
Tabla 4. Requerimientos nutricionales establecidos
Requerimientos
nutricionales
Producción de sustancias
indólicas
Solubilización de fosfatos
Fuente de carbono Peptona de soya Glucosa
Fuente de nitrógeno Extracto de levadura Sales de amonio
Sales Cloruro de sodio Fosfato dipotásico
Temperatura 30±2°C 30±2°C
pH 7 6
Fuente: Rojas, (2019)
42
Figura 1. Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 y TSPBT06-01 bajo requerimientos
nutricionales establecidos
Fuente: (Rojas, 2019)
En el figura 1, Se muestra la respuesta de la producción de indoles y
solubilización de fosfatos de los microorganismos bajo los requerimientos nutricionales
establecidas; se evidencia, que estos parámetros definidos para cada microorganismos
garantizaron que las actividades PGPM de cada uno no se vieran afectadas esto quiere decir que
su comportamiento fisiológico es estable.
Durante el tiempo de estudio hubo una producción total de 79.18mg/L de
sustancias indólicas, estos resultados se contrastan con lo obtenido en trabajos anteriores en los
que se ha evaluado este microorganismo (Santos, 2016) quién en su investigación evalúo la
0102030405060708090
05
1015202530354045
1 2 3 4 5
mg/
L su
stan
cias
ind
ólic
as
mg/
L so
lub
iliza
ció
n d
e fo
sfat
os
Tiempo (H)
Respuesta de los microorganismos TSEBT01-01 Y TSPBT06-01
mg/L PO soluble TSPBT06-01 mg/L AIA TSEBT01-01
y = 21,792x - 20,214R² = 0,9115
y = 9,777x - 10,717R² = 0,9503
0 24 48 72 96
43
producción de indol la cuál cuantificó 36,683mg/L utilizando como fuente de carbono glucosa,
de igual manera, (Mantilla, 2006), a partir de la aislados B. aisladoscia fue capaz de producir
14.823mg/L de indoles.
La mayoría de los estudios realizados reportan producción de AIA entre 3-
40mg/L, pero (Angula, V., Sanfuentes, E., Rodriguez, F. y Sossa, K., 2014) utilizando como
fuente de carbono peptona de caseína evaluando la producción de la fitohormona obtuvieron
cuantificaciones finales de 80-100mg/L, el promedió de producción de sustancias indólicas de
los 78 microorganismos aislados fue de 97.5 ± 2.87mg/L en presencia del inductor (triptófano)
el cual confirma resultados obtenidos en esta investigación ya que se encuentra dentro del
rangos anteriormente cuantificados, estos resultados se justan a lo encontrado en el trabajo
debido a que se utilizan fuentes de carbono similares, y de la misma manera, se obtiene una
producción de indoles con valores cercanos 97.00mg/L y 76.30mg/L.
(Alemán, A., Lara, C. y Oviedo, L, 2011) aislaron bacterias pertenecientes a
los géneros Azotobacter y Azospirillum de la rizosfera de suelos cultivados de maíz, yuca,
algodón y plátano y evaluaron la capacidad de producción de AIA de las aislados en presencia
del inductor (triptófano), mediante su cuantificación con reactivo de Salkowsky determinaron
la producción de la auxina en un rango de 3 a 45 ppm o mg/L; se ha demostrado que incluso a
bajas concentraciones de ácido indol acético se es capaz de estimular el crecimiento de las
plantas, hay que destacar de AIA es una de las auxinas más encontradas en el campo rizosférico
y en la relación planta-microorganismo. Hay que destacar que la alta producción de la hormona
en los ensayos realizados pueda ser debido a la buena adaptación nutricional por parte del
44
microorganimo utilizando los requerimientos nutricionales proporcionados, por ello, el
microorganismo ha tenido la capacidad de metabolizar de manera más rápida y ambientarse
metabólicamente para la producción de la hormona.
En cuanto a la solubilización de fosfatos, también es evidente que las
requerimientos óptimas y las concentraciones para desarrollar los procesos metabólicos están
asociados con la fisiología del microorganismo y por lo tanto los requerimientos nutricionales
como lo son fuente de carbono, nitrógeno y fósforo, esto se correlaciona debido a que se
evidencia el crecimiento del microorganismo, no solo, en la expresión de la actividad si no
también en su biomasa y velocidad de crecimiento 0.018 y 0.026 ufc/h.
A las 96 horas, el microorganismo liberó una totalidad de 42.30mg/L de
fosfato soluble, esto se contrasta en lo reportando en la literatura por (Caballero, A., Hernández,
A., Hernández, N. y Narvois, R, 2004) en donde evaluaron bacterias solubilizadores de fosfato
utilizando como fuente de carbono glucosa con resultados de 15.8 a 440mg/L de fosfato soluble,
esto se ajusta a lo encontrado, debido a que se utiliza la misma fuente de carbono y se obtiene
un expresión de la actividad con valores similares.
Otros autores como (Barrera, A., Canchignia, H., Morante, J., Peñafiel, M.,
Prieto, H. y Torres, E, 2015) reportan requerimientos nutricionales como fuente de carbono
(glucosa y otros azúcares), fuentes de nitrógeno como extracto de levadura, tripticasa de soya
y sales tales sulfato de magnesio, cloruro de calcio y fosfato dipotásico requerimientos similares
45
a las halladas para el crecimiento de los microorganismos, además, otros factores físicos como
la temperatura, pH y el número de revoluciones también se contrastan con lo encontrado
utilizando requerimientos que se contrastan a los establecidos en este trabajo . De igual manera
(Almaraz, J., Hernandez, E., Hernandez, I., Lopez, A., Morales, F. y Torres, M, 2018),
utilizaron el medio Luria-Bertani compuesto por extracto de levadura, peptona de caseína y
cloruro de sodio nutrientes también encontrados que son óptimos para el crecimiento y la
expresión de las actividades PGPM.
Finalmente hay que resaltar que bajo los requerimientos nutricionales y
operacionales dadas se exhibe crecimiento del microorganismo en los diferentes momentos de
réplicas y además una expresión estable de las actividades de importancia en estudio, esto quiere
decir que los aislados en estudio se adaptaron a los parámetros nutricionales proporcionados,
también hay que añadir que es posible observar estabilidad crecimiento y de la misma manera
una buena respuesta fisiológica de los microorganismos por lo tanto, se evidencia que existen
una relación importante y dependiente entre los requerimientos nutricionales y el
comportamiento fisiológico microbiano (Geeraerd, A; Valdramidis, V; Devlieghere, F;
Bernaert, H; Debevere, j. y Van Impe, J., 2014).
La importancia de estas actividades radica en que es de gran aplicación el uso
de microorganismos como inoculantes microbiológicos en el desarrollo vegetal, se ha
demostrado que el uso de productos agrícolas con microorganismos que tengan esta capacidad
proporciona mejoras en la calidad de las cosechas y el rendimiento de las mismas, por esto, se
46
sigue estudiando de manera importante este tipo de aislados a nivel in vitro para poderlos llevar
a campo y aprovechar su potencial agrícola.
5.2 Respuesta de la producción de sustancias indólicas bajo diferentes concentraciones y
fuentes de carbono
En la producción sustancias indólicas durante 96 horas con las diferentes
fuentes de carbono (glucosa, xilosa, manitol, ácido ascórbico y triptófano) a un concentración
de 5g/L (figura 2), la mayor respuesta se presentó cuando se proporcionó triptófano obteniendo
99,9mg/L como producción total de sustancias indólicas, por otro lado, manitol sólo en las
últimas 72 horas se alcanzó 13.35mg/L, mientras en las otras fuentes de carbono no se presentó
producción de la hormona.
47
Figura 2. Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de
(5g/L)
Fuente: (Rojas, 2019)
Estos resultados se contrastan con los reportado según (Canchignia, H.,
Celedón, P., Gonzalez, M. y Seeger, M, 2016) que afirman el triptófano como principal inductor
de la mayoría de las vías metabólicas utilizadas para la síntesis de sustancias indólicas en
bacterias y aumentan de manera significativa la producción de la hormona. Éste aminoácido se
encuentra en el suelo debido a que es un exudado de la raíz de las plantas presente en el
meristemo radicular, de esta manera, las bacterias de la rizosfera lo metabolizan para llevar a
cabo la biosíntesis de sustancias indólicas y así interfiere en el desarrollo de las plantas.
(Barrera, A., Canchignia, H., Morante, J., Peñafiel, M., Prieto, H. y Torres, E., 2016) realizaron
un estudio en el cual utilizaron dos concentraciones de triptófano 5mM y 10mM y se evidenció
que el aumento del percusor genera niveles significativos de sustancias indólicas.
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
0 24 48 72 96
Co
nce
ntr
ació
n s
ust
anci
as in
dó
licas
mg/
L
Tiempo (H)
Respuesta de TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de (5g/L)
Glucosa Xilosa Manitol Triptófano Ácido ascórbico
y = 29,003x - 45,605R² = 0,7862
48
(Bartel, 1997) evidenció por ejemplo que la aplicación de triptamina con lleva
al aumento de AIA y llegaron a la conclusión de que la triptamina y el triptofol hacen parte de
vías para la síntesis de AIA dependiente de triptófano, al proporcionarle al microorganismo un
estrés nutricional con las distintas fuentes de carbono que son de naturaleza variada, entre
azúcares más simples, aminoácidos y ácidos la respuesta fisiológica se ve totalmente afectada,
el metabolismo del mismo asimila cada una de las fuentes nutricionales produciendo una
variedad de compuestos que se ven evidenciados primero que todo en el cambio de pH.
De otra manera, es posible observar que bajo ese estímulo fisiológico juega
un papel importante el cambio de fuente de carbono en la respuesta a el metabolismo
caracterizado como promoción del crecimiento vegetal en este caso sustancias indólicas; no hay
literatura antecedente que explique concretamente que pasa con el metabolismo del
microorganismo al variar nutricionalmente el medio en cuanto a la respuesta de la producción
de sustancias indólicas, pero se puede deducir con esta investigación que posiblemente al
cambio nutricional el microorganismo opte por otras rutas con el fin de mantener la población,
entre esas otras vías metabólicas puede producir metabolitos que muy probablemente sean de
naturaleza ácida y por esta razón también alteren el pH de medio.
Es importante decir que los compuestos indólicos producidos pueden ser de
naturaleza de ácido indol acético debido a que el método de Salkowsky es específicamente para
cuantificar la producción de esta hormona por medio de reacciones químicas y se obtuvieron
cualitativamente indicios del mismo por la coloración rosa del medio y además la cuantificación
a partir del espectrofotómetro, pero, para saber con certeza la naturaleza de los compuestos
49
producidos es necesario utilizar métodos más sensibles, precisos y exactos como los son la
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) (Delgado, W. y Cuca, L, 2016).
La respuesta fisiológica del microorganismo en el medio proporcionando una
concentración de 2.5g/L de fuente de carbono se observa que sólo con el triptófano se obtiene
una respuesta positiva. Durante las 96 horas de evaluación se evidencia respuesta fisiológica
alta porque se mantiene los compuestos indólicas teniendo como producto final 88.59mg/L,
para xilosa también hubo producción 13.35mg/L pero sólo se vio reflejada en las últimas 72
horas (ver gráfica 3).
Figura 3. Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de
(2.5g/L)Fuente: (Rojas, 2019)
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
0 24 48 72 96
Co
nce
ntr
ació
n s
ust
anci
as in
dó
licas
mg/
L
Tiempo (H)
. Respuesta de TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de (2.5g/L)
Glucosa Xilosa Manitol Triptófano Ácido ascórbico
y
= 26,182x -
40,903
R² = 0,79
50
Figura 4. Respuesta del microorganismo TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de
(1.25g/L)
Fuente: (Rojas, 2019)
Al suministrar una concentración de fuente de carbono muy baja, se pudo
evidenciar que hubo una respuesta por parte del microorganismos con las fuentes de carbono
triptófano, manitol, xilosa y glucosa con una producción final de 85.45mg/L, 13.3585.45mg/L,
10.2285.45mg/L y 13.35 mg/L respectivamente, hay que destacar que se genera un aumento en
la síntesis de los compuestos indólicos progresivamente pero se destaca desde las 72 horas en
adelante (figura 4).
Es importante destacar que en efecto se evidenció que al variar las fuentes de
carbono tenemos una alteración de la actividad tanto de manera positiva (induciéndola) como
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
0 24 48 72 96
Co
ncr
ntr
ació
n s
ust
anci
as in
dó
licas
mg/
L
Tiempo (H)
. Respuesta de TSEBT01-01 concentración de fuente de carbono de (1.25g/L)
Glucosa Xilosa Manitol Triptófano Ácido ascórbico
y
= 23,674x -
27,737
R² = 0,9314
51
de manera negativa (disminuyendo), lo más importante es que es totalmente evidente que
cuando la concentración de triptófano aumenta, de igual manera, incrementa la producción de
sustancias promotoras de crecimiento vegetal, por otro lado que diferentes fuentes de carbono
que se encuentra naturalmente en el suelo estando disponible para los microorganismos son
asimiladas también para la síntesis de la hormona pero en cantidades menores, sin embargo, lo
más fundamental que se pudo observar es que cuando la concentración de carbono es menor se
presenta una síntesis por parte de las demás fuentes de carbono desde las 24 horas y se genera
un aumento significativo a las 96 horas de evaluación.
Las concentraciones de carbono en el suelo normalmente son muy bajas,
oscilan entre 30.0 y 50.0mg/ha para suelos agrícolas (Rodriguez, M., López, J. y Vela, G.,
2012), estos resultado son promisorios en la medida que amplían el conocimiento sobre los
factores que influir sobre la expresión de actividades PGPM. Con dicho conocimiento se pueden
generar inductores en los inoculantes que garantizarían estas actividades en campo.
5.3 Respuesta fisiológica de la solubilización de fosfatos bajo diferentes concentraciones y
fuentes de carbono
La solubilización de fosfatos con diferentes fuentes nutricionales y a una
concentración de 10g/L sólo se evidenció cuando en el medio el estímulo proporcionado fue
glucosa teniendo a las 96 horas 32.0mg/L, para las otras fuentes (xilosa, manitol, triptófano y
52
ácido ascórbico) no se presentó registro de actividad en ningún tiempo de evaluación. (Ver
gráfica 5).
Figura 5. Respuesta del microorganismo TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de
(10g/L)
Fuente: (Rojas, 2019)
La concentración de fosfato solubilizado en respuesta fisiológica bajo el
estímulo de glucosa se ajusta a lo reportado por Santos, 2016, en donde se evaluó el mismo
microorganismo y se obtuvieron valores similares 35.0mg/L, de igual manera, la actividad se
mantuvo en aumento durante las 96 horas de evaluación, al mismo tiempo, el pH disminuyó de
6 a 4 lo cual es un indicio de que se está llevando a cabo la actividad. Desde varios años atrás
se reporta que la solubilización de fosfatos se debe a la producción de ácidos orgánicos como
ácido butírico, succínico, acético, láctico entre otros en forma extracelular los cuales
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
0 24 48 72 96
Fost
ato
so
lub
le m
g/L
Tiempo (H)
Respuesta de TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de (10g/L)
Glucosa Xilosa Manitol Triptófano Ácido ascórbico
y = 7,519x - 6,539R² = 0,9918
53
transforman compuestos insolubles de fosfato y proveen la fácil absorción del elemento por
parte de la planta volviéndolo soluble (Árevalo, Z., Corrales, L. y Moreno, V, 2014).
Nautiyal, 1999, realizó un estudio en donde evaluaba la eficiencia de
microorganismos promotores de crecimiento en la solubilización de fosfatos en medio NBRIP
variando condiciones como lo fueron tipos de fuentes de carbono y concentraciones de cloruro
de magnesio (MgCl2), de los cuales la solubilización de fosfatos fue superior en cuanto al
control cuando se utilizaron glucosa a 20g/L y cloruro de magnesio 10g/L teniendo como
cuantificación final 121% comparado con el control; lo importante a destacar es que los mejores
resultados se obtuvieron cuando la concentración de glucosa y de cloruro de magnesio fue la
más alta suministrada, 20g/L y 10g/L respectivamente lo que supone que posiblemente sean
factores dependientes de la actividad.
Figura 6. Respuesta de TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de (5g/L)
Fuente: (Rojas, 2019)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 24 48 72 96
Fosf
ato
so
lub
le m
g/L
Tiempo (H)
Respuesta de TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de (5g/L)
Glucosa Xilosa Manitol Triptófano Ácido ascórbico
y = 0,0996ln(x) + 0,0046 R² = 0,8017
54
Al variar disminuir la concentración de carbono la actividad se ve casi
totalmente disminuida entre valores de 0-0.5mg/L (Ver figura 5 y 6), se exhibe un
comportamiento totalmente diferentes, debido a que estos metabolitos dependen totalmente del
crecimiento del microorganismo, por lo tanto, si es capaz de crecer de igual manera produce la
expresión de la actividad, es por esto, que cuando la concentración de glucosa disminuye el
proceso metabólico se ve totalmente afectado. La solubilización de fosfatos es el resultado de
la acidez que se produce por la vía de oxidación directa de la glucosa u otras fuentes de carbono
aldosa reductasa por acción de una enzima deshidrogenasa, por esta razón en ninguna de las
otras fuentes proporcionadas se evidenció la actividad sólo de manera mínima en xilosa debido
a la semejanza en su estructura molecular.
Figura 7. Respuesta del microorganismo TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de
(2.5g/L)
Fuente: (Rojas, 2019)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 24 48 72 96
Fosf
ato
so
lub
le m
g/L
Tiempo (H)
Respuesta de TSPBT06-01 concentración de fuente de carbono de (2.5g/L)
Glucosa Xilosa Manitol Triptófano Ácido ascórbico
y
= 0,116ln(x) -
0,0311
R² = 0,7762
55
Finalmente, hay que destacar que fisiológicamente el microorganismo se ve
afectado bajo diferentes requerimientos nutricionales, estos resultados corresponden con el
trabajo realizado por Nautiyal, 1999 en donde la respuesta fisiológica disminuye en la
solubilización de fosfatos cuando se varía la fuente de carbono al combinar otros azúcares como
lo son fructosa, manitol, sorbitol y xilosa; es evidente que se producen otros metabolitos a partir
de los diferentes compuestos del medio líquido debido a que el pH en todos los casos vario
acidificando el caldo.
5.4 Relación de las actividades con los requerimientos nutricionales dadas
En la tabla 5 y gráfica 8, se muestran la relación de las fuentes de Carbono y
la producción de sustancias indólicas se evidencia sólo desde la hora 72 a la 96 debido a que
en todas las fuente nutricionales fue donde se produjo algún registro de actividad y solamente
cuando la concentración es la más baja proporcionada (1.25g/L).
Tabla 5. Estadística descriptiva para producción de sustancias indólicas por TSEBT01-01
Tiempo(h) Variable n Media mg/L D.E.
72,00 (Glucosa) 1 10,22 0,00
72,00 (Xilosa) 1 0,00 0,00
72,00 (Manitol) 1 3,95 0,00
72,00 (Ácido ascórbico).. 1 0,00 0,00
72,00 (Triptófano) 1 82,32 0,00
96,00 (Glucosa) 1 13,35 0,00
96,00 (Xilosa) 1 13,35 0,00
96,00 (Manitol) 1 13,35 0,00
96,00 (Ácido ascórbico).. 1 0,00 0,00
96,00 (Triptófano) 1 85,45 0,00
Fuente: (Rojas, 2019)
56
Es importante aclarar la diferencia que existe entre en triptófano en relación
con las otras fuentes de Carbono en cuanto a la respuesta de expresión de la actividad, los
valores con respecto a esta fuente nutricional son significativamente diferentes, a las 72 horas
existe una variación en la respuesta desde un 88.00 y 95.00%, mientras que a las 96 horas 85 a
100% en relación a las otras fuentes de carbono.
Otro punto importante para destacar es que en cuando se presentó más
producción de la actividad el pH disminuyó de neutro a ácido alcanzando valores inferiores a
4, mientras que en el momento que la producción de sustancias indólicas fue más baja, el pH
alcanzó valores de hasta, lo que significa, que muy posiblemente se producen otros compuestos
en mayor proporción como ácidos débiles propios del metabolismo fermentativo.
57
Figura 8. Estudio de medias de la producción de sustancias indólicas
con las fuentes de carbono (Concentración 1.25g/L)
Fuente: (Rojas, 2019)
Para la actividad de solubilización de fosfatos el ambiente cambia totalmente
debido a que como la producción de la actividad fue nula durante todo el período de evaluación
en comparación con glucosa fuente de carbono que normalmente se encuentra en el medio
entonces es posible decir que está actividad depende totalmente de la variable fuente de carbono
para poderse expresar.7
Los diferentes resultados halladas durante el desarrollo de este estudio
investigativo permiten darse cuenta de que éstos microorganismos tiene la capacidad de utilizar
0102030405060708090
MG
/L S
UST
AN
CIA
S IN
DÓ
LIC
AS
FUENTE DE CARBONO
Relación de fuente de carbono con producción sustancias indólicas
Glucosa
Glucosa
72 HORAS
96 HORAS
58
fuentes de carbono que están naturalmente en un ambiente u ecosistema y de igual manera
seguir presentado la actividad de interés aunque en menores cantidades y que por otro lado, el
metabolismo pueda verse totalmente afectado tomando camino a la producción de otros
compuestos; de esta manera, siguiendo el rumbo de esta investigación quedan planteados
diferentes conceptos metodológicos que nos conllevan a un acercamiento y conocimiento sobre
la expresión de estas actividades y de está manera tener una premisa de como el
microoorganismo va a responder en campo, siendo así un aporte esencial para contribuir en las
bases formativas de productos agroecológicos para la agricultura sostenible.
59
6 CONCLUSIONES
Se logró establecer los requerimientos nutricionales adecuadas para la producción
estable de sustancias indólicas y solubilización de fosfatos; dichas requerimientos
están determinadas por los nutrientes como carbono entre 0.25 y 1%, nitrógeno 0.2-
0.5%, sales 0.01-0.5% y temperatura de 30 ±2°C.
Se determinó que la mayor producción de sustancias indólicas y solubilización de
fosfatos en los microorganismos estudiados, están determinadas por los estímulos
nutricionales con triptófano en concentración de 5g/L y de glucosa en concentración
de 10g/L respectivamente, pero estas concentración no se encuentran naturalmente en
el suelo.
Se estableció que existe una relación entre la fuente y la concentración de carbono para
la expresión de producción de sustancias indólicas como para solubilización de
fosfatos. En correspondencia con un comportamiento directamente proporcional, dado
que, a medida que aumenta la concentración de triptófano y glucosa respectivamente
de igual manera la respuesta de estas actividades se incrementa.
Se encontró que el triptófano puede ser utilizado por el microorganismo tanto como
inductor y fuente de carbono para la expresión de la actividad producción de sustancias
indólicas sin que se vea afectada su fisiología.
60
7 RECOMENDACIONES
● Se recomienda evaluar a los microorganismos incluyendo periodos con largo tiempo de
fermentación, que permitan definir o evidenciar la posible expresión de valores de la
actividad y de otro tipo de metabolitos.
● Se recomienda complementar el análisis cuantitativo espectofotométrico con otras técnicas
como HPLC que permitan la identificación de las sustancias indólicas que se están
produciendo y el resto de elementos secundarios generados durante el proceso de
evaluación.
● Se recomienda continuar el estudio variando otras fuentes nutricionales como lo es de
nitrógeno, fósforo, diferentes pH, y/o el seguimiento con una sola fuente de carbono pero
utilizando un rango de concentraciones más amplio.
61
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