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VII Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniería Habana 2007
EVALUACIÓN DE CÁPSULAS SARTOBRAN P EN LA FILTRACIÓN ESTERILIZANTE DEL IFA HBsAg
Y. Robainas, A. Beldarraín, N. Pentón,, F. Hernández, J. M. Hernández, L. Melo, Y. Díaz, S. Piloto, C. Quintero, Y.
Mendoza, M. Rodríguez, D. Pérez, B. Menéndez
Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. P.O. Box. 6162, e.mail: [email protected]
RESUMEN Se estudió el desempeño para la filtración esterilizante del Ingrediente Farmacéutico Activo de la vacuna antihepatitis B recombinante (IFA HBsAg), utilizando como medio filtrante cápsulas Sartobran P (Sartorius, Alemania). El proceso de esterilización con vapor saturado para las cargas definidas en el proceso de filtración, demostraron que todos los puntos medidos alcanzan un F0 mayor de 15 minutos, garantizando así una correcta “esterilización” de los materiales. La comprobación de la integridad física de las membranas por determinación del punto de burbuja, demostró que esta se mantiene antes y después del proceso de filtración, lo cual garantiza en principio una operación exitosa. La prueba de retención bacteriana realizada a escala de proceso, simulando las operaciones con tampón e IFA HBsAg, demostraron la capacidad real de las cápsulas de retener una elevada carga microbiológica de Brevundimonas diminuta ATCC 19146, a una concentración de 107 ufc/cm2 de área filtrante efectiva, garantizando así la esterilidad del material filtrado en correspondencia con las exigencias reguladoras. Todos estos resultados demuestran garantía y seguridad de esterilidad del IFA HBsAg. Palabras claves: Filtración esterilizante, esterilización por calor húmedo, integridad de membranas, reto microbiológico
1. INTRODUCCIÓN En correspondencia a las Buenas Prácticas de
Fabricación vigentes, los productos farmacéuticos deben tener exactamente establecidos los estándares y especificaciones que definan su calidad. Para un producto final o Ingrediente Farmacéutico Activo (IFA), uno de los puntos críticos ampliamente regulado y controlado es la seguridad, es decir, la no existencia de contaminación microbiológica que comprometa su acción específica, lo que se logra con tecnologías que garanticen un índice de letalidad, eliminación o retención máxima, en aquellos puntos críticos donde los microorganismos puedan “potencialmente” contaminar el producto [6]. La operación final en el proceso de producción de un IFA acuoso es, generalmente, una filtración esterilizante por membrana de 0,2 µm que aporta “en principio” seguridad al producto, lo cual en la práctica tiene que
demostrarse para cada caso en particular [6]. Para demostrar el desempeño de sistemas de filtración esterilizante utilizando cápsulas filtrantes están definidas pruebas típicas como la prueba de retención bacteriana, retando el sistema con Brevundimonas diminuta ATCC 19146, a una concentración de 107 ufc/cm2 en correspondencia con las normas internacionales vigentes, además de las pruebas de integridad no destructivas antes y después del proceso de filtración y el análisis de extractables [6]. Sin embargo, la operación de filtración está compuesta por varios pasos que comienzan desde la preparación de los materiales y su esterilización, y la filtración per se, así como todas las pruebas asociadas a la misma. Por la complejidad de estas operaciones y su impacto sobre la calidad del producto final, este trabajo tiene como objetivo evaluar el proceso de filtración final esterilizante del Ingrediente Farmacéutico Activo de la vacuna antihepatitis B recombinante que utiliza como medio filtrante cápsulas Sartobran P con membranas de acetato de celulosa (Sartorius, Alemania) [7].
2. METODOLOGÍA. Los procesos de esterilización por calor húmedo para la
carga de materiales utilizados en la filtración, fueron realizados en una autoclave horizontal DLOV (De Lama, Italia) con una capacidad de 1280 L [4]. Para determinar la efectividad de este esquema de carga, se estudió la penetración de calor en la cámara de la autoclave utilizando un sistema de validación térmica, tipo Validator 2000 (Kaye Instruments Inc, USA). Para ello, fueron distribuidos 10 sensores de temperatura de alta precisión, termopares, por toda la geometría de la cámara. Los valores de F0 fueron calculados según la siguiente ecuación [1], [2]:
dtFf
i
.reft
t
ZTT
∫−
= 100 (1)
donde: ti: tiempo inicial, tf: tiempo final, T: Temperatura Tref: Temperatura de referencia Z: efecto producido por un cambio de temperatura en la resistencia microbiana.
Para la determinación del punto de burbuja después de la filtración, cuando la cápsula está humedecida con IFA se
1ISBN 978-959-212-236-9 (c) Sociedad Cubana de Bioingeniería, artículo T046
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donínimo para el
ón,
ja mínimo para la
iciente de correlación según la guiente ecuación [7].
realizó en correspondencia a las recomendaciones del fabricante utilizando la siguiente relación [7]:
agua.minB.Pkproductodel.minB.P = (2)
de: P.B min. del producto: Punto de burbuja mproducto después de la filtracik, coeficiente de correlación, P.B min. del agua: Punto de burbucápsula humedecida con agua.
Para ello, se mide el punto de burbuja a las cápsulas humedecidas con agua y con el producto en específico para determinar el coefsi
)promedio(aguadel.minB.P
)promedio(productodel.minB.Pk = (3)
don
rminado para el producto después de
cuando la cápsula fue
l valor mínimo y 1000 mBar por enc
el tampón del IFA, PBS, e IFA er se según [4], [8].
r calor húm
ceso de este
terilización con vapor saturado ig. 1 ab
. El proceso de esterilización por vapor saturado se realizó gún [4].
de: P.B min. del producto (promedio): Punto de burbuja mínimo promedio detela filtración, P.B min. del agua (promedio): Punto de burbuja mínimo promedio determinadohumedecida con agua.
El rango de trabajo para el punto de burbuja debe establecerse entre e
ima de este [7]. Todos los experimentos de reto microbiológico se
realizaron en cabina de flujo laminar horizontal tipo ICEM BIO72. Se inoculó el material a retar, PBS o IFA HBsAg, con Brevundimonas diminuta ATCC 19146 hasta alcanzar una concentración mínima en la superficie de la membrana de 107 ufc/cm2. Inmediatamente se procedió a filtrar dicho material, tomándose del filtrado las muestras para determinar esterilidad en días diferentes a tres lotes de cápsulas, retando en ambos casosp
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Preparados los materiales para la filtración
esterilizante, estos pasan a ser esterilizados poedo en la autoclave horizontal DLOV [4].
En la Fig. 1 arriba, se presentan los resultados obtenidos en la esterilización de la carga de materiales auxiliares para la filtración esterilizante del IFA HBsAg. El perfil característico para “cargas porosas”, se observa en la Fig. 1A arriba, donde el calentamiento inicial combina con varios ciclos de prevacío para hacer más efectiva la penetración del vapor saturado en el interior de los materiales a esterilizar. Este ciclo se caracteriza por una primera etapa de precalentamiento de la cámara por inyección de vapor saturado a razón de 200 kg/h, otra de esterilización hasta completar el tiempo definido en aproximadamente 25 minutos, terminando luego con una etapa de enfriamiento hasta
que se puedan retirar los materiales esterilizados y preparar el siguiente ciclo. Los valores de F0 medidos por 10 sensores de temperatura distribuidos en el interior de la cámara, sobrepasan en todos los casos los 15 minutos a 121.1°C considerados como satisfactorios para un pro
rilización con vapor saturado, Fig. 1, abajo. Para este ciclo, los valores de tiempo en los cuales se
alcanza el Fo, están muy por encima de lo considerado necesario para un ciclo de es(F ajo). Fig. 1. Estudio de penetración de calor para la carga de materiales auxiliares utilizados en la filtración esterilizante del IFA HBsAg. Arriba, perfiles de temperatura obtenido para los 10 termopares distribuidos en la cámara del autoclave; abajo valores de Fo calculados según la ecuación 1. Los colores indican la posición de los termopares: en A, (----) termopar 1; (----) termopar 2; (----) termopar 3; (----) termopar 4 y (----) termopar 5. En B, (----) termopar 6; (----) termopar 7; (----) termopar 8; (----) termopar 9 y (----) termopar 10se
Para esterilizadores de vapor saturado como las autoclaves, los parámetros físicos que gobiernan la eficiencia del ciclo de esterilización son el tiempo, la temperatura y la presión. Los dos últimos parámetros varían uno con el otro en una relación proporcional directa. Por ello, es aceptado un rango de temperatura para la esterilización de 118 - 134 °C. La USP Pharmacopeia (USP) declara “un ciclo de autoclave, donde se especifiquen los materiales, medios o reactivos, es por un periodo de 15 minutos a 121 °C” [8]. Sin embargo las Pharmacopeias
0 10 20 30 40Tiempo (minutos)
0
10
20
30
40
50 A
10
20
30
40
50
60
Valo
r Fo
B
0 2 4 620
40
60
80
100
120
20 22 24 26 28 30
.
20
40
60
80
100
120
Tem
pera
tura
(°C
)
B
A
Tiempo (minutos)
2ISBN 978-959-212-236-9 (c) Sociedad Cubana de Bioingeniería, artículo T046
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os a un equivalente de letalidad a 121
omprometer la esterilidad del pro
edecidas con agua y espués de filtrar el IFA.
Sartobran ués de la filtración es de
P
Europea (EP) y Británica (BP) recomiendan un proceso de calentamiento como mínimo a 121°C durante 15 minutos como una condición de referencia para preparaciones acuosas [3], [5]. Ambas Pharmacopeias dejan claro que “otras condiciones de tiempo y temperatura pueden ser utilizadas, aunque el índice de letalidad debe ser demostrado de forma adecuada y reproducible”. El procedimiento matemático, también conocido como Anglo-Saxon, para el cálculo del índice de letalidad, usa el valor de F0 como unidad de referencia. El valor de F0 puede ser calculado por la ecuación 1, produciendo datos de temperatura que se acumulan a lo largo del proceso de esterilización los cuales son convertid
.1 °C [1] , [2]. En la práctica, se ha demostrado que valores de F0
de al menos 8 minutos equivalentes a diferentes temperaturas de esterilización alcanzan un índice de letalidad máximo [1], [2]. En nuestro caso particular, los valores de F0 son superiores a los 20 minutos, alcanzándose en algunos sitios específicos de la cámara, en dependencia de la carga y la colocación del termopar, valores que superan hasta tres veces lo considerado como ideal. Estos resultados indican la eficiencia de nuestros ciclos de esterilización, que si bien dan potencialidad, no garantizan certeza de esterilidad, pues la manipulación posterior de estos materiales, puede c
ceso de filtración. Se determinaron los puntos de burbuja, como
prueba de integridad, para las cápsulas, para establecer un criterio de aceptación de una prueba que rutinariamente se realiza lote a lote. En la Tabla I se dan valores de punto de burbuja para las cápsulas Sartobran P antes de filtrar, humd
Tabla I Determinación del Punto de Burbuja para cápsulas
P, humedecidas con agua y despterilizante l IFA.
.B agua P.B IFA Cápsula
mBar mBar
1 3610±229 3267±6
2 3590±115 3250±17
3 3630±167 3293±21
Promedio 3610±154 3270±23 P. Bagua, IFA, Punto de burbuja medidos para agua e IFA en tres lotes de cápsulas. El promedio es para las nueve determinaciones
alizadas.
de filtrar el IFA
n de carga
cápsulas Sartobran P antes y spués de un proceso de filtración simulado.
pruebas de retención bacteriana se
uestran en la Tabla II.
R P utilizadas en el proceso de obtención del IFA HBsAg.
contaminado
Concentración
/10-10 ufc/mL
Concentración
/ 10-7 ufc/cm2Esterilidad
re
El valor promedio del punto de burbuja para la cápsula humedecida con agua, 3610±154 mBar, está en el rango establecido por el fabricante, es decir, 3200-4200 mBar. Para la cápsula después de filtrar el IFA y determinados los valores de presión en la membrana, se calculó el punto de burbuja utilizando la ecuación 3. Sustituyendo los valores promedios de la Tabla I en la ecuación 3, se obtiene un k =0,906, el cual introducido
en la ecuación 2 da un punto de burbuja promedio de 2899 mBar para las cápsulas Sartobran P después de filtrar el IFA HBsAg. Con estos resultados, fue establecido un rango de trabajo entre 2800 y 3800 mBar como criterio de aceptación del punto de burbuja para las cápsulas después
HBsAg. Se realizaron varias mediciones para corroborar el valor
determinado anteriormente utilizando los mismos tres lotes de cápsula, los cuales se humedecen con agua para inyección e IFA HBsAg, simulando las condiciones de proceso. En la Fig. 2, se representa el comportamiento de la integridad de las cápsulas Sartobran P antes y después de la filtración simulada. El punto de burbuja de las cápsulas Sartobran P, determinado después de la filtración esterilizante del IFA HBsAg se encuentra dentro de los límites establecidos anteriormente, indicando que mecánicamente, estas cápsulas mantienen sus propiedades durante todo el proceso de filtración dando una seguridad suficiente de eliminació
microbiológica en correspondencia a lo esperado.
Fig. 2. Comportamiento de la integridad de lasde
Los resultados de las m
Tabla II esultados del reto microbiológico a las cápsulas Sartobran
Material del inóculo en la membrana
Ensayo de
PBS 4,0±2,0 32,1±16,1 Pasa el ensayo
IFA 4,0±0,3 32,3±2,6 ensaPasa el
yo ufc, unidades formadoras de colonia; IFA, Ingrediente Farmacéutico Activo. Los resultados para el tampón PBS son
ra una n = 6 y para IFA n = 3 pa
Como se observa, el material filtrado cumple exitosamente el ensayo de esterilidad lo cual demuestra la
Cápsula1 2 3 4 5 6 7 8 9
P. B
ante
s (mBa
r)
3000
3200
3400
3600
3800
4000
4200
2800
3000
3200
3400
3600
3800
4000P
. B de
spué
s (mB
ar)
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roceso de filtración del IFA HBsAg utilizando capsulas Sartobran P (Sartorius, A
dicando esto que la operación de filtración ciones del procedimiento vi
[1]
Heat
[2]
eat
[3] Pharmacopeia. Volume II. The
[4] na
2006.
[6] er Inc,
[7] [8] United States Pharmacopeia
Convention, Rockville, MD, pp. 1813, 1819, 2143-2145, 2000.
efectividad de las cápsulas para retener carga microbiológica y esterilizar efluentes en las condiciones de operación utilizadas en el proceso de obtención del IFA HBsAg. Estos resultados demuestran la garantía de esterilidad del p
lemania).
5. CONCLUSIONES Los procesos de esterilización por calor húmedo,
para la carga utilizada en la preparación de los materiales para la filtración esterilizante del IFA HBsAg alcanzan, en todos los casos, valores de F0 superiores a los 15 minutos, indicando una correcta esterilización de los mismos. La determinación del punto de burbuja después de la filtración utilizando cápsulas alcanzó un valor promedio fue 2899 mBar, estableciéndose un rango de 2800 a 3800 mBar, el cual se comprobó en 9 mediciones diferentes sin desviación alguna. La prueba de retención bacteriana realizada a escala real de proceso, para las cápsulas Sartobran P, simulando las operaciones con tampón e IFA, contaminándose con 107 ufc/cm2 de Brevundimonas Diminuta, demostró ser satisfactoria por prueba de esterilidad según USP XXIV, in
en las condigente es segura.
REFERENCIAS
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[5] European Pharmacopeia. Council of Europe, Strasbourg, 3d ed., pp. 283-285, 1997. Meltzer, T. H. y Jornitz, M. W. Filtration in the pharmaceutical Industry. Marcel DekkNew York, ISBN 0-8247-9896-1, 933 pp, 1998. Sartorius A. G. http//www.sartorius.com USP 24-NF 19.
4ISBN 978-959-212-236-9 (c) Sociedad Cubana de Bioingeniería, artículo T046
