Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores

Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores

inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de

Porphyromonas gingivalis en macrófagos humanos

Yormaris Castillo Romero

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias

Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN) Bogotá. D.C, Colombia; noviembre de 2017

Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores

inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de

Porphyromonas gingivalis en macrófagos humanos

Yormaris Castillo Romero

Trabajo de investigación para optar al título de: Magister en ciencias-Microbiología.

Directora: Diana Marcela Castillo Perdomo

BcL, MSc, cPhD. Facultad de Odontología, Universidad El Bosque

Co-director: Jaime Eduardo Castellanos Parra

OD, MSc, PhD Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Colombia

Línea de Investigación:

Biología Molecular de agentes infecciosos

Grupo de Investigación:

Instituto UIBO (Unidad de Investigación Básica Oral) Universidad El Bosque

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias

Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN)

Bogotá. D.C, Colombia; noviembre de 2017

Dedicatoria

Dedico este trabajo a Dios, por darme la

oportunidad de levantarme cada día, la

perseverancia para cumplir con mis sueños y

la luz para iluminar mí camino de vida.

A mi familia, especialmente mi madre Yolis M

Romero, mi hermano Diego, mi papá Ernesto

y a mi novio Javier porque ustedes son mi gran

apoyo y la razón para dar lo mejor de mí como

persona, como profesional, estudiante y

amiga.

A mi amiga Alexandra Cáceres.

“Aquel que tiene un porqué para vivir, se puede enfrentar a todos los cómos” Friedrich Nietzsche

Agradecimientos

A mis directores Diana Marcela Castillo Perdomo, Jaime Eduardo Castellanos, Gloria Inés

Lafaurie. Por todo su apoyo, enseñanza, guía y dedicación en este proceso, por darme la

oportunidad de aprender un poquito de todo su conocimiento y experiencia, por permitirme

crecer como persona y profesional.

A la Universidad El Bosque, especialmente al instituto UIBO porque es mi casa, es mi

presente y ha sido mi escuela, a todos mis compañeros de UIBO, porque se han convertido

en mi familia y de quienes aprendo cada día. Especialmente agradezco a Nathaly

Delgadillo, Yineth Neuta y Andrés Cardona, por su colaboración, apoyo y ayuda en este

proceso.

Al Instituto de Virología, por abrirme las puertas de su laboratorio y a sus integrantes por

siempre tener la mejor disposición para ayudarme en todo este proceso, especialmente

agradezco a la doctora Myriam Velandia, Arturo Balbas y Giovanny Delgado.

Agradezco al posgrado de Microbiología, por su apoyo en el desarrollo de este trabajo. A

mis profesores, especialmente a la profesora Martha Raquel Fontanilla y Daniel Uribe

Vélez, por toda su enseñanza y dedicación. A socorro Prieto, por su carisma, su dedicación

y amor a lo que hace. Por ser nuestra guía en el posgrado, por su valioso e impecable

trabajo.

Agradezco a la Fundación para la promoción de la investigación y la tecnología, entidad

que apoyó económicamente para el desarrollo de este trabajo. Contrato No 3955

Al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias).

Contrato No 6422017 Código. 13874455642

Resumen y Abstract IX

Resumen

Porphyromonas gingivalis es un patógeno periodontal, que secreta vesículas de

membrana externa (OMV) como vehículo de factores de virulencia e incluso se ha

reportado que estas pueden ser más virulentas que la propia bacteria y podrían modular

la respuesta inmune. Objetivo: Determinar las variaciones en la expresión de mediadores

inflamatorios en macrófagos humanos estimulados con vesículas de membrana externa

de P. gingivalis. Métodos: Monocitos U937 fueron diferenciados a macrófagos y

estimulados a diferentes tiempos con OMV, lisado bacteriano y bacteria viva. En

experimentos independientes cada estímulo fue pre-tratado con los inhibidores KYT-1,

KYT-36 y Polimixina-B para bloquear la acción de las gingipaínas R y K y además del LPS

respectivamente. Se determinaron los niveles solubles de citocinas y quimiocinas y

también del ARNm. Se usó ANOVA factorial para el análisis estadístico. Resultados: Las

vesículas estimularon la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas. Sin

embargo, cuando se bloquean las gingipaínas R y K presentes en OMV, los niveles de IL-

1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α e IL-8 aumentaron significativamente comparado con

células sin estímulo y las estimuladas sin el bloqueo (p<0,05). De manera contraria, se

encontró una disminución en los niveles de TNF-α después de bloquear las proteasas o

LPS. Conclusión: Las vesículas de membrana externa de P. gingivalis más que las

bacterias vivas inducen cambios en la secreción de mediadores inflamatorios en

macrófagos humanos por eventos de proteólisis dependientes de gingipaínas lo cual

podría estar involucrado en el establecimiento de un estado crónico característico de la

enfermedad periodontal.

Palabras clave: Vesículas de membrana externa, P. gingivalis, citocinas, macrófago,

gingipaínas.

X Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en

macrófagos humanos

Abstract

Porphyromonas gingivalis is a periodontal pathogen, which secretes outer membrane

vesicles (OMV) as a vehicle for virulence factors and it has even been reported that these

can be more virulent than the bacterium itself and could modulate the immune response.

Objective: To determine the variations in the expression of inflammatory mediators in

human macrophages stimulated with outer membrane vesicles of P. gingivalis. Methods:

U937 monocytes were differentiated into macrophages and stimulated at different times

with OMV, bacterial lysate and live bacteria. In independent experiments each stimulus

was pre-treated with inhibitors KYT-1, KYT-36 and Polymyxin-B to block the action of the

R and K gingipains and in addition to the LPS respectively. The soluble levels of cytokines

and chemokines and also of the mRNA were determined. Factorial ANOVA was used for

the statistical analysis. Results: The vesicles stimulated the production of proinflammatory

cytokines and chemokines. However, when the R and K gingipains present in OMV are

blocked, the levels of IL-1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α and IL-8 increased significantly

compared with cells without stimulus and those stimulated without the blockade (p <0.05).

Conversely, a decrease in TNF-α levels was found after blocking proteases or LPS.

Conclusion: The outer membrane vesicles of P. gingivalis, more than live bacteria, induce

changes in the secretion of inflammatory mediators in human macrophages due to

gingipains-dependent proteolysis events, which could be involved in the establishment of

a chronic state characteristic of periodontal disease.

Key words: External membrane vesicles, P. gingivalis, cytokines, macrophage,

gingipains.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ……………………………………………………………………………………… IX

Lista de figuras………………………………………………………………………………. XIII

Lista de tablas………………………………………………………………………………... XVI

Lista de Símbolos y abreviaturas………………………………………………………… XVII

1 Marco teórico ............................................................................................................ 5 1.1 Periodontitis ....................................................................................................... 5 1.2 Etiología de la periodontitis ................................................................................ 6 1.3 Porphyromonas gingivalis .................................................................................. 7

1.3.1 Factores de virulencia de P. gingivalis ............................................................. 8 1.3.1.1 Fimbrias ............................................................................................... 8 1.3.1.2 Hemaglutininas .................................................................................... 8 1.3.1.3 Lipopolisacárido (LPS) ......................................................................... 9 1.3.1.4 Gingipaínas .......................................................................................... 9

1.3.1.4.1 Funciones de las gingipaínas .............................................................. 11 1.3.2 Vesículas de membrana externa (OMV) ........................................................ 12 1.3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis ........................................... 12

1.3.3.1 Composición de las OMV de P. gingivalis .......................................... 14 1.3.3.2 Función de las OMV de P. gingivalis .................................................. 16 1.3.3.3 Cambios de respuesta inmune por OMV de P. gingivalis ................... 17

2 Metodología ............................................................................................................ 19 2.1 Cultivo bacteriano de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 y obtención de pre-inóculos ........................................................................................................... 19

2.1.1 Inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 ................................................ 20 2.1.2 Viabilidad bacteriana de inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 .......... 20 2.1.3 Límite de detección de actividad de la proteasa (Rgp) en los pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis ........................................................................................... 20

2.2 Obtención y purificación de OMV P. gingivalis ................................................. 21 2.2.1 Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) para OMV de P. gingivalis ... 22 2.2.2 Límite de detección de actividad proteasa de las OMV de P. gingivalis ......... 22

2.3 Cultivo celular de monocitos U937 ATCC® CRL1593.2™ ................................ 22 2.3.1 Diferenciación de monocito U937 a macrófago .............................................. 23

2.4 Evaluación de la viabilidad de macrófagos-U937 estimulados con P. gingivalis 23 2.5 Modelo de infección de macrófagos - U937 con OMV de P. gingivalis ............. 24

2.5.1 Evaluación de los niveles solubles de citocinas por citometría de flujo .......... 24

XII Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos

humanos

2.6 Evaluación de la expresión de citocinas proinflamatorias por macrófagos-U937 estimulados con OMV de P. gingivalis W83 y 33277 ................................................... 25 2.7 Evaluación del efecto de la inhibición de gingipaínas y LPS de OMV en los niveles y expresión de citocinas en proinflamatorias ................................................... 26 2.8 Plan de análisis ................................................................................................. 27

3 Resultados ............................................................................................................. 29 3.1 Recuentos bacterianos del pre-inóculo e inóculos P. gingivalis ATCC 33277 y W83 29 3.2 Actividad de la Arg-gingipaína Rgp en los Pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis ..................................................................................................................... 31 3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y ATCC 33277 .............. 32

3.3.1 Microscopia Electrónica de Transmisión de vesículas de membrana externa de P. gingivalis ......................................................................................................... 33 3.3.2 Actividad Arg-gingipaína de vesículas de P. gingivalis .................................. 33

3.4 Diferenciación celular de Monocitos U937 a Macrófagos-U937 ........................ 34 3.5 Viabilidad celular de macrófagos U937 estimulados ......................................... 35 3.6 Niveles solubles de citocinas proinflamatorias producidas por macrófagos-U937 estimulados ................................................................................................................. 35 3.7 Evaluación de la inhibición de Rgp y Kgp en OMV de P. gingivalis ................... 40 3.8 Niveles de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados .................................................................................... 50 3.9 Efecto de la inhibición de Rgp, Kgp y LPS sobre la expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados 52

4 Discusión ................................................................................................................ 57

5 Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 63 5.1 Conclusiones .................................................................................................... 63 5.2 Recomendaciones ............................................................................................ 63 5.3 Perspectivas ..................................................................................................... 64

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura 1. Productos de Transcripción y traducción de genes rgpA, rgpB y kgP de las

gingipaínas. Tomado de: Imamura. J Periodontol; 2003 (36). ......................................... 10

Figura 2. Modelo de biogénesis de vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Tres

modelos son presentados: (A) una fuerza física inducida por acumulación de proteínas de

la envoltura sobre-expresada. (B) interrupción del vínculo existente entre la membrana

externa y la capa de peptidoglicano (C) aumento de la curvatura local de la membrana

externa bacteriana potenciado por señales extracelulares como PQS: Xie H. Future

Microbiol, 2015 (47). ....................................................................................................... 14

Figura 3.SDS-PAGE de Pool OMV de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 (30 µg/pozo).

Carril MP: (Protein Ladder 260 kDa); carril 1: Sonicado Pg 33277; carril 2: Sonicado Pg

33277 1/100; carril 3: OMV Pg 33277; carril 4: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg

33277; carril 5: Sonicado PgW83; carril 6: Sonicado PgW83 1/100; carril 7: OMV W83;

carril 8: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg W83; carril 9: Caldo BHI

ultracentrifugado. ............................................................................................................ 32

Figura 4.Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de vesículas purificadas de P.

gingivalis (A) y Bacteria con vesículas de membrana externa (B).................................. 33

Figura 5. Micrografía de un cultivo de monocito U937 (A) y Monocito U937 diferenciado a

macrófago con 200ng/mL de PMA (B). ........................................................................... 34

Figura 6. Niveles de citocinas pro-inflamatorias en macrófagos estimulados con Lisado,

Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2

horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con

líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de

IL-1β; B) Niveles de TNF-α; C) Niveles de IL-6 ............................................................... 38

Figura 7.Niveles de quimiocinas en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV

de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca

punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas)

comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de IL-8; B) Niveles de

RANTES; C) Niveles de MCP-1; D) Niveles de MIP-1 α. ................................................ 39

XI

V

Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos

humanos

Figura 8.Niveles de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado,

Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-1β sin bloqueo y con inhibidor para Arg-

gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas

(KYT-36). C: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS

(PMXB). .......................................................................................................................... 42

Figura 9. Niveles de TNF-α en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con

Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor

para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor para Lys-

gingipaínas (KYT-36). C: niveles de TNF-α sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor

para LPS (PMXB). .......................................................................................................... 43

Figura 10.Niveles de IL-6 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado,

Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-

gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas

(KYT-36). C: niveles de IL-6 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).

....................................................................................................................................... 44

Figura 11.Niveles de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado,

Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-

gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas

(KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).

....................................................................................................................................... 47

Figura 12.Niveles de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con

Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para

Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-

gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para

LPS (PMXB). .................................................................................................................. 48

Figura 13. Niveles de RANTES en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con

Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor

para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor para Lys-

gingipaínas (KYT-36). C: niveles de RANTES sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor

para LPS (PMXB). .......................................................................................................... 49

Figura 14. Expresión relativa de ARNm en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria

y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 durante 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas

(barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas

transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A). IL-1β; B). MCP-

1; C) IL8. ......................................................................................................................... 51

Contenido XV

Figura 15.Expresión relativa de ARNm de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30

min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-1β

sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-1β sin

bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-1β sin

bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ................................................ 54

Figura 16. Expresión relativa de ARNm de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min

y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-8 sin

bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-8 sin

bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-8 sin

bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ................................................ 55

Figura 17. Expresión relativa de ARNm de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30

min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de MCP-

1 sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de MCP-

1 sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de MCP-

1 sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ........................................ 56

Contenido XVI

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Proteínas identificadas en las OMV de P. gingivalis de las cepas ATCC 33277 y W83. (Las proteínas resaltadas en negrilla fueron las más abundantes). Modificado de: Mantri et al., Microbiology Open 2015 (48). ..................................................................... 15 Tabla 2. Secuencias de primer y concentración utilizadas para detección de citocinas .. 26 Tabla 3.Promedios de recuentos de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en Log 10. .................................................................................................... 29 Tabla 4. Promedios de recuentos del inóculo de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en Log 10. ........................................................................................... 30 Tabla 5. Actividad Arg-gingipaína de pre-inóculo e inóculo de P. gingivalis .................... 31 Tabla 6.Límite de detección de actividad Arg-gingipaína de OMV de P. gingivalis ......... 34 Tabla 7. Viabilidad de macrófagos U937 estimulados con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis ..................................................................................................................... 35

Contenido XVII

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviaturas

Abreviatura Término

AAP Academia Americana de Periodoncia

ATCC American Type Culture Collection

BANA Benzoilarginina-2-naptilamida

CAAM NCBZ- GLY-GLY-ARG- clorohidrato de 7-amido-4-metil coumarina

CV Coeficiente de Variación

DE Desviación estándar

ECV Enfermedad cardiovascular

ENSAB Encuesta Nacional de salud Bucal

HA Hemaglutininas

HGE Células epiteliales gingivales Humana

HUVEC Células endoteliales de vena umbilical humana

ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular 1

IL-1β Interleucina 1 beta

IL-6 Interleucina 6

IL-8 Interleucina 8

iNOS Óxido nítrico sintasa inducible

LDL Lipoproteínas de baja densidad

LPS Lipopolisacárido

MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos

MCP-1 Proteína quimioatrayente de monocitos 1

MIP-1α (CCL3) Proteína Inflamatoria de macrófago

MOI Multiplicidad de Infección

NFκB Factor nuclear-kappaB

NLR Receptores similares a NOD

ON Óxido nítrico

DO Densidad óptica

OM Membrana externa

OMV Vesículas de membrana externa "Outer Membrane Vesicles"

PAMP Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

PI3K Fosfatidilinositol 3-quinasa

qPCR Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real

RANTES (CCL5) Quimiocina (C-C motif) ligand 5 también conocida como RANTES

RIPK1 Receptor que interactúa con la proteína quinasa-1

X

VII

I

Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos

humanos

Símbolos con letras latinas

RLR Receptores similares a RIG-I

TAK1 Factor de crecimiento transformante beta activado por cinasa 1

TEM Microscopia Electrónica de Transmisión

TLR Receptores Toll-like

TNFα Factor de Necrosis Tumoral alfa

UF Unidades de Fluorescencia

UFC Unidad Formadora de Colonias

VCAM-1 Molécula de adhesión celular vascular 1

Símbolo Término

µL Microlitro mL Mililitro µg Microgramos

Longitud de onda pg Picogramos

Introducción

La periodontitis es una enfermedad infecciosa, multifactorial, inflamatoria y crónica que

compromete la integridad de los tejidos de soporte del diente, que incluyen la encía, el

ligamento periodontal y el hueso alveolar, representa un reto inflamatorio sistémico, debido

a las grandes superficies epiteliales inflamadas en las bolsas periodontales. Esta

inflamación y vasodilatación ocasionan daño al tejido lo que permite que bacterias y sus

productos puedan llegar a otras partes del cuerpo (1-3). La actividad de la enfermedad

periodontal está determinada por una compleja interacción entre el sistema inmune y

patógenos periodontales, las alteraciones en la microbiota subgingival se han asociado

con el desarrollo y progresión de la periodontitis (4).

Esta enfermedad tiene gran impacto en la pérdida dental de la población adulta en

Colombia y en general en todas las poblaciones a nivel mundial (5). Además, se considera

una enfermedad de gran importancia no solo porque causa perdida de los dientes sino

también porque se ha relacionado con enfermedades sistémicas como: resultados

adversos en el embarazo (3, 6, 7) artritis reumatoide (7), enfermedad cardiovascular como

aterosclerosis y síndrome coronario agudo (8).

El componente microbiano juega un rol muy importante en esta enfermedad y un grupo de

bacterias anaerobias orales conocidas como periodontopatógenas pertenecientes al

complejo rojo conformado por Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia y

Treponema denticola que han sido asociada a la progresión de periodontitis, en función de

sus factores de virulencia y su interacción con el sistema inmune del hospedero (2,3,9).

P. gingivalis se considera como una de las bacterias con mayor importancia en el

desarrollo de la periodontitis debido a que grandes cargas de esta bacteria se relacionan

con mayor severidad de la enfermedad periodontal (10). Esta bacteria tiene diferentes

factores de virulencia que determinan su patogenicidad, dentro de los que se encuentran:

fimbrias, hemaglutininas, lipopolisacárido (LPS), gingipaínas, proteínas de membrana,

antígenos capsulares, ceramidas y vesículas de membrana externa (11). Las vesículas de

2 Introducción

membrana externa, son importantes factores de virulencia secretadas al medio externo

que sirven como sistema generalizado de secreción y transporte para otros factores de

virulencia como LPS, fimbrias y enzimas entre las que se encuentran las gingipaínas. Estas

vesículas han sido investigadas por su importante papel en la respuesta inmune del

hospedador y la destrucción del tejido periodontal durante la infección por P. gingivalis. Se

ha reportado que inducen la producción de citocinas proinflamatorias, asociadas con

osteoclastogénesis y por tanto resorción de hueso alveolar y destrucción del tejido

periodontal (12).

Las OMV pueden ser internalizadas en las células hospedadoras, donde ocurre su lisis y

la liberación de antígenos, que pueden ser procesados por las células presentadoras de

antígeno, lo que conduce a la inducción de la inmunidad adaptativa incluyendo la

producción de anticuerpos específicos contra este patógeno (12, 13, 14).

Aunque P. gingivalis y sus factores de virulencia están involucrados en la patogénesis de

la periodontitis, la naturaleza y magnitud de la respuesta del periodonto, se modula no sólo

por las bacterias presentes, sino también por la respuesta inmune del hospedador y las

interacciones hospedador–patógeno (15). Su persistencia crónica en el periodonto

depende de su habilidad para evadir la inmunidad del hospedador sin inhibir por completo

la respuesta inmune inflamatoria (16). Los macrófagos están implicados activamente en

todas las fases de la inflamación y su papel como efector y células reguladoras ahora se

reconoce ampliamente (17). Son un tipo de células fagocíticas que junto con otras células

modulan con eficacia la respuesta inmune innata y adaptativa ayudando a promover la

resolución inflamatoria y cicatrización de los tejidos (17).

En la periodontitis estas células secretan citocinas quimiotácticas como RANTES, MCP-1,

MIP-1α, MIP-3α, MIP-1β, IL-8, cuya función es la activación y migración de leucocitos; y

citocinas proinflamatorias como la IL-1β, TNF-α, IL-6, que activan procesos de

osteoclastogénesis y la degradación del tejido periodontal. Factores de virulencia como las

OMV secretadas por P. gingivalis en las bolsas periodontales, a nivel local pueden

exacerbar la enfermedad, lo cual podría estar influenciado por la capacidad de estas

vesículas de modular en las células la expresión de estas citocinas (18).

A nivel sistémico, la facilidad que tienen las vesículas para difundirse en tejidos profundos

y torrente sanguíneo favorecen su interacción con diferentes tipos de células como

plaquetas y células endoteliales que promueven la agregación plaquetaria y la

Introducción 3

coagulación, así como la interacción con moléculas de adhesión vascular favoreciendo la

disfunción endotelial típica de la ateroesclerosis, adicionalmente se ha confirmado que

bajas concentraciones de OMV inducen la conversión de macrófagos en células

espumosas favoreciendo el desarrollo del ateroma (2, 18, 19).

En este sentido las OMV de P. gingivalis cobran mayor importancia al ser uno de los

principales factores de virulencia que desencadenan respuesta inmune local y sistémica

favoreciendo adicionalmente la condición crónica de la periodontitis (20). Sin embargo, la

inducción de los cambios en la respuesta inmune relacionados con la interacción de las

OMV de P. gingivalis con la célula hospedadora han sido poco estudiados. Aún menos

evidente es el mecanismo por el cual estas vesículas pueden inducir una respuesta celular

de macrófagos humanos caracterizada por la producción de citocinas proinflamatorias

asociadas con el desencadenamiento de enfermedades locales y sistémicas, lo que podría

generar mayor patogenicidad de estas vesículas en comparación con la bacteria completa.

Por otra parte, no es claro cuál es la contribución de los factores de virulencia que se

encuentran en mayor proporción en las vesículas como las gingipaínas y el lipopolisacárido

en la inducción de la respuesta inmune importante en el desarrollo, evolución y

mantenimiento de la condición inflamatoria crónica a nivel periodontal. Por esta razón

hemos planteado en este trabajo la siguiente pregunta de investigación ¿Cuáles son las

variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos

estimulados con vesículas de membrana externa de dos cepas de Porphyromonas

gingivalis? En consecuencia, se planteó el siguiente objetivo general: Determinar las

variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos

estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis.

En este estudio se demostró que las vesículas inducen cambios en la expresión de ARNm

y los niveles de citocinas y quimiocinas en sobrenadantes de cultivo de macrófagos-U937

por eventos de proteólisis dependiente de gingipaínas y esta inducción es diferencial entre

dos cepas de P. gingivalis.

1 Marco teórico

1.1 Periodontitis

La Academia Americana de Periodoncia (AAP) en su consenso de 1999, definen la

periodontitis como una enfermedad infecciosa, multifactorial y crónica, que resulta en la

inflamación de los tejidos de soporte de los dientes y pérdida progresiva del nivel de

inserción clínico, caracterizada por la formación de bolsas periodontales y/o recesión

gingival (21). Esta enfermedad fue clasificada en 1999 como periodontitis crónica,

periodontitis agresiva y periodontitis asociada a condiciones sistémicas en función de

parámetros clínicos periodontales. Actualmente existe una nueva clasificación que

mantiene la clasificación de 1999 pero incluye la bolsa periodontal como parámetro clínico

adicional (22, 23).

La periodontitis crónica es una patología de gran prevalencia en la población mundial (2).

En Colombia, datos del ENSAB III en 1999, indican que la enfermedad periodontal afecta

en forma generalizada al 12% de la población antes de los 35 años y ésta aumenta

significativamente a los 60 años en un 42%. Según su severidad, el 14% de la población

cercana a los 35 años presenta una destrucción periodontal de moderada a severa y a los

60 años, esta aumenta al 40% (22). La prevalencia de enfermedad periodontal en

Colombia aumentó a un 61.8% de acuerdo al último estudio nacional de salud bucal

(ENSAB IV); de esta cifra el 43.46% de los casos corresponden a periodontitis moderada

y el 10.62% a periodontitis severa. De esta forma, la presencia de periodontitis a los 18

años muestra una prevalencia de 21.90%, con un 10.6% de periodontitis leve y 10.97% de

moderada y para la edad de 35 a 44 años, el 48.29% de las personas presentan

periodontitis moderada y el 7.84% evidencia periodontitis avanzada. A partir de los 45 años

la periodontitis aumenta por encima del 82.88% y a las edades de 65 a 79 años el 25.99%

presentaba periodontitis severa (24). Estos datos tienen un gran impacto en la salud de los

colombianos, no solo a nivel oral por perdida de piezas dentales, sino por todas las

6 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en

macrófagos humanos

condiciones sistémicas con las que se encuentra asociada al aumentar el riesgo de los

pacientes para sufrir aterosclerosis, resultados adversos del embarazo, artritis reumatoide,

neumonía por aspiración y cáncer de cabeza y cuello (2).

1.2 Etiología de la periodontitis

Una tríada de bacterias anaerobias orales que comprende P. gingivalis, T. denticola y T.

forsythia tradicionalmente han sido consideradas como agentes causantes de periodontitis,

en función de sus propiedades de virulencia y fuerte asociación con los sitios afectados

(2,9).

El hábitat predominante de bacterias asociadas con periodontitis es el surco gingival,

donde encuentran microambientes distintos asociados al biofilm dental, el fluido crevicular

gingival y el epitelio de revestimiento del surco. El entorno subgingival es rico en

mediadores inmunes e inflamatorios, y ofrece desafíos y oportunidades para las bacterias.

La salud periodontal requiere un estado inmuno-inflamatorio controlado que permite

mantener la homeostasis hospedador-microorganismo en el periodonto. Sin embargo,

durante la periodontitis, se desregula la respuesta inmune del hospedador y por lo tanto es

ineficaz para restringir la patogenicidad bacteriana. Este desequilibrio genera una

respuesta inflamatoria que favorece la cronicidad de la infección (2).

La disbiosis de la microbiota periodontal se caracteriza por un desequilibrio en la

abundancia relativa o la influencia de las especies microbianas que tienen funciones

distintas en el biofilm y que actúan en sinergia para dar lugar a un proceso infeccioso que

puede causar enfermedad en la cavidad oral o tejidos extra-orales de individuos

susceptibles (2).

La etiología infecciosa de esta entidad fue reconocida desde la década de los 60 (25);

posteriormente confirmada por innumerables estudios epidemiológicos alrededor del

mundo, en los cuales se reconoció que una serie de microorganismos Gram negativos

anaerobios y microaerofílicos aumentan significativamente en la placa subgingival de

pacientes con periodontitis indicando que esta entidad representa una infección con un

patrón polimicrobiano, que aunque variable en los individuos, muestra cierta especificidad

caracterizada por el aislamiento de un grupo de microorganismos que han sido

considerados periodontopágenos, entre los cuales se han identificado P. gingivalis , T.

Capítulo 1 7

forsythia, T. denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens,

Campylobacter rectus, Parvimonas micra, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens y

Dialister pneumosintes, entre otras. Siendo P. gingivalis el microorganismo aislado con

mayor frecuencia en periodontitis tanto crónica como agresiva alrededor del mundo, con

un patrón similar para la población colombiana (25 - 28).

1.3 Porphyromonas gingivalis

P. gingivalis es un cocobacilo Gram negativo, anaerobio estricto, inmóvil, no esporulado

tiene un diámetro entre 0,5 ~ 3,5 µm. Es un colonizador tardío de la placa dental, utiliza las

bacterias residentes en la cavidad oral para la colonización inicial y hace parte del complejo

rojo al que pertenecen los microorganismos periodontopatógenos (9). Esta bacteria tiene

una naturaleza hemolítica y exhibe un pigmento negro característico en medios de cultivos

que contienen los derivados metabólicos del hierro, extraído de la hemoglobina u otras

proteínas que contienen el grupo hemo. Es una especie caracterizada por ser asacarolítica

y su fuente de carbono y energía es proporcionada por la fermentación de aminoácidos

(11). Tiene diferentes factores de virulencia que determinan su alta patogenicidad, dentro

de los que se encuentran: fimbrias, hemaglutininas, LPS, vesículas de membrana,

gingipaínas, proteínas de membrana, antígenos capsulares y ceramidas (11).

P. gingivalis es uno de los principales patógenos implicados en la progresión de la

enfermedad periodontal, basado en la observación de que el aumento en el recuento de

esta bacteria se asocia con un aumento en severidad de la enfermedad periodontal.

Resultados de estudios experimentales de infección oral con P. gingivalis en primates,

apoyan firmemente esta hipótesis, y demuestran que la inoculación subgingival de la

bacteria en monos libres de enfermedad periodontal resulta en el desarrollo de

periodontitis. En este modelo es significativo, que los niveles de la bacteria en el surco

subgingival están estrechamente correlacionados con una marcada pérdida del hueso

alveolar (29).


macrófagos humanos

1.3.1 Factores de virulencia de P. gingivalis

1.3.1.1 Fimbrias

P. gingivalis posee fimbrias, las cuales están involucradas en la mayoría de las

propiedades de adherencia y de interacción con moléculas salivares, células epiteliales

orales y otras bacterias, así como en la inducción de la secreción de citoquinas de las

células infectadas (30). Esta bacteria tiene dos tipos de proteínas fimbriales, FimA

denominadas fimbrias mayores y Mfa1 fimbrias menores, expresadas en la superficie de

la bacteria y compuesta por polímeros de proteínas FimA y Mfa1, respectivamente (31).

Las fimbrias están constituidas en su mayoría por la proteína fimbrilina que actúa como

puente entre P. gingivalis y la superficie a colonizar e infectar (fibroblastos, células

epiteliales y células endoteliales). Estas juegan un papel muy importante en la adhesión a

células y facilita la formación del biofilm en el surco gingival. Las fimbrias mayores son de

gran importancia en la invasión, pero no son suficientes para que este proceso se lleve a

cabo (30). Las fimbrias menores están implicadas en la activación del sistema inmune, que

se encuentra estrechamente relacionado con la resorción ósea y la pérdida del ligamento

periodontal, adicionalmente se encuentran involucradas con la formación de biofilm oral

(31).

El gen fimA existe como una única copia en el cromosoma de esta bacteria y codifica para

una fimbrilina polimórfica FimA. Análisis por PCR, han permitido identificar seis genotipos

denominados I, Ib, II, III, IV y V (25). Estudios epidemiológicos han demostrado que las

cepas que poseen FimA tipo II y tipo IV son frecuentes en los pacientes con periodontitis,

mientras que la cepa de tipo I es detectada en individuos sanos. (32). Las fimbrias Mfa1

están compuestas principalmente de polímeros de la proteína Mfa1, codificados por el gen

mfa1. La proteína Mfa2 (codificada por mfa2) se localiza en la membrana externa y

desempeña un papel en el anclaje y la regulación de longitud de Mfa1 (32).

1.3.1.2 Hemaglutininas

P. gingivalis puede utilizar hemaglutininas (HA) para adherirse a los eritrocitos y/o a otras

células y adquirir nutrientes. Múltiples HA han sido identificadas en P. gingivalis, HagB se

ha demostrado estar involucrada en la adherencia de P. gingivalis a las células endoteliales

de arteria coronaria humana. HagA y HagD son 73,8% idénticas y comparten homología

Capítulo 1 9

con el dominio hemaglutinina de las gingipaínas. Otra hemaglutinina, HagE, comparte una

región de 523 aminoácidos con un 93% de homología con HagA (33).

1.3.1.3 Lipopolisacárido (LPS)

El LPS hace parte de la envoltura externa de todas las bacterias Gram negativas. Está

constituido por una región polisacárida y una región lipídica unidas covalentemente. La

región polisacárida está constituida por dos porciones, una cadena lateral (antígeno O) y

una región central (core). El antígeno O usualmente define la especificidad inmunoquímica

de la bacteria. El polisacárido central típicamente consiste de un número de hexosas y dos

azucares únicos, heptosa y 2-keto-3-deoxioctonato (KDO) (11). El lípido A es el

responsable de diversas actividades biológicas y está compuesto de un disacárido D-

glucosamina unido por enlaces beta 1-6 y ácidos grasos. El LPS funciona como una

endotoxina potente y juega un papel muy importante en la activación de la respuesta

inflamatoria, favoreciendo la producción de citocinas por parte de neutrófilos y macrófagos,

que se asocian con activación de osteoclastogénesis y por tanto inicio y progresión de la

periodontitis (11).

P. gingivalis libera OMV que penetran en los tejidos periodontales y median una respuesta

inmuno-inflamatoria en los tejidos periodontales. La naturaleza exacta y la consecuencia

de la respuesta del hospedador al LPS de esta bacteria han sido objeto de debate, debido

a los resultados contradictorios existentes. Recientemente, se reveló que P. gingivalis es

capaz de generar LPS con estructuras heterogéneas de lípido A través de una modulación

dependiente de hemina. Este microorganismo contiene LPS con lípido A tetra-acilado

(LPS1435/1.449) o penta-acilados (LPS1690) que genera efectos opuestos sobre la respuesta

inmune innata, por lo tanto, juega un papel clave en los cambios de la respuesta inmuno-

inflamatoria del hospedador (34, 35).

1.3.1.4 Gingipaínas

Las gingipaínas constituyen un grupo de endopeptidasas cisteína C25, responsables de

más del 85% de la actividad proteolítica y el 100% de la actividad llamada “actividad tipo

tripsina”. Estas enzimas son producto de tres genes (Figura 1): rgpA, rgpB y kgp,

reconocidas como gingipaína R y gingipaína K de acuerdo con su especificidad de

hidrólisis en residuos peptídicos donde encuentran Arginina o Lisina, Arg-Xaa o Lys-Xaa

respectivamente (36).


macrófagos humanos

Figura 1. Productos de Transcripción y traducción de genes rgpA, rgpB y kgP de las gingipaínas.

Tomado de: Imamura. J Periodontol; 2003 (36).

Estos tres genes se encuentran presentes en todas las cepas de P. gingivalis y son

considerados constitutivos, dan origen a 3 proteínas, la primera RgpA presenta un dominio

catalítico y un dominio hemaglutinina adhesina, RgpB que únicamente tiene un dominio

catalítico y por ultimo Kgp que al igual que RgpA presenta dominio catalítico y dominio

hemaglutinina adhesina. Los dominios hemaglutinina adhesina de RgpA y Kgp presentan

una homología entre sí, que varía entre el 97 a 98% en la mayoría de las regiones y solo

46% de homología con la región HA1 (36, 37).

Los dominios catalíticos de RgpA y RgpB son homólogos (89%), lo que podría indicar que

estas dos proteínas cumplen funciones muy similares y que la ausencia de alguna de las

dos en cepas mutantes no generaría ningún cambio en el metabolismo de la misma ni en

su capacidad patogénica, sin embargo, diferentes estudios confirman que cepas mutantes

para el gen rgpA presentan restricción en su crecimiento y menor virulencia (36-38). La

capacidad proteolítica de las gingipaínas sobre diferentes sustratos como: benzoilarginina-

2-naptilamida (BANA), NCBZ- GLY-GLY-ARG- clorohidrato de 7-amido-4-metil coumarina

(CAAM) ha hecho que se les conozca como enzimas similares a tripsina y se ha empleado

esta característica para la confirmación de P. gingivalis en el laboratorio (38, 39).

Capítulo 1 11

1.3.1.4.1 Funciones de las gingipaínas

Las gingipaínas tienen como una de sus principales funciones la degradación de proteínas,

ya que el metabolismo de esta bacteria es dependiente de la hidrólisis de proteínas.

Además, están implicadas en el secuestro de hemoglobina, hemaglutinación,

neutralización y variaciones del sistema inmune por degradación proteolítica de citocinas

anti-inflamatorias y activación de citocinas proinflamatorias como IL-1, IL-6 IL-8 y TNF-α

activadoras de osteoclastogénesis, lo cual favorece a la destrucción del tejido periodontal.

También participan en la formación de biofilm oral, estas parecen ser fundamentales en la

comunicación entre las bacterias y la adhesión gracias a su dominio hemaglutinina-

adhesina y se ha demostrado que la expresión de estas proteasas aumenta cuando P.

gingivalis está en coagregación con otras bacterias como T. forsythia, T. denticola, F.

nucleatum y P. intermedia (39). Estas están involucradas en la adhesión de P. gingivalis a

las células endoteliales antes de la invasión. Existen estudios que plantean la posibilidad

de usar estas gingipaínas como blanco terapéutico para la bloquear la acción proteasa y

por consiguiente impedir la invasión de este microorganismo tanto en el tejido periodontal

como en placas ateromatosas (40, 41).

Así mismo, la formación de células espumosas por adición de colesterol LDL

(Lipoproteínas de baja densidad) puede ser estimulada por P. gingivalis, ya que este

microorganismo tiene la capacidad de alterar la movilidad de esta molécula, facilitando de

esta manera su agregación en los macrófagos. Cuando se evalúan cepas mutantes para

proteasas Kgp y Rgp está agregación se ve inhibida, lo cual lleva a pensar que estas

proteasas son modificadoras de la movilidad del LDL, debido a que las gingipaínas tienen

la capacidad de degradar la apo B-100, uno de los mayores componentes de las partículas

de LDL. La proteólisis de esta proteína altera la carga de las partículas afectando la

movilidad del LDL, favoreciendo su agregación en los macrófagos y posteriormente la

formación de placas ateromatosas (42). Además, las gingipaínas se han caracterizado por

estimular la respuesta inmune innata, degradar componentes del complemento, péptidos

antibacterianos, citocinas y quimiocinas evitando así la resolución de la infección y

favoreciendo la cronicidad (43).


macrófagos humanos

1.3.2 Vesículas de membrana externa (OMV)

Las OMV, son nano estructuras membranosas asimétricas, que han sido descritas en

Archaeas, bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas (44). Las bacterias Gram

negativas producen naturalmente OMV. Estas se componen de una sola membrana que

deriva de la membrana externa y contienen tanto proteínas de membrana externa como

LPS, y otros lípidos, mientras que el lumen de la vesícula contiene principalmente proteínas

del periplasma que en su mayoría son importantes factores de virulencia involucrados en

la adherencia bacteriana, defensa contra los factores del hospedador o enzimas entre otros

(45).

1.3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis

Las vesículas de este microorganismo son consistentes con vesículas de otras bacterias

Gram negativas, tienen un diámetro entre 50 y 250 nm (figura 2) y se producen a manera

de ampollas en la superficie de la membrana externa de la bacteria (46, 47). Estudios han

demostrado que las vesículas sirven como un vehículo para el transporte de toxinas,

enzimas proteolíticas, y adhesinas; esto se confirmó experimentalmente concluyendo que

pueden degradar diferentes sustratos como el colágeno, Azocoll, y N-alfa-benzoil-

DLarginine p-nitroanilida, y promueven la adhesión bacteriana entre dos especies

bacterianas no coagregantes como Capnocytophaga ochracea y Eubacterium saburreum

(47).

Actualmente son consideradas un sistema de secreción generalizado, altamente regulado

que puede proporcionar una matriz de efectores moleculares, incluidos los implicados en

las interacciones célula-célula, adquisición de nutrientes, desregulación y modulación

inmune del hospedador y formación del biofilm oral. Además, por su tamaño nanométrico

las OMV tienen la capacidad de diseminarse lejos de la célula permitiendo que las

bacterias sésiles asociadas a la biopelícula extiendan su espacio de influencia. Por lo tanto,

los OMV son importantísimos contribuyentes a la supervivencia y virulencia bacteriana y,

por lo tanto, de la patogenicidad (16).

La biogénesis de las vesículas de P. gingivalis puede ser explicada desde distintos

modelos (Figura 3). Un primer modelo apoya la idea de que la membrana externa

bacteriana es empujada hacia afuera a través de una fuerza física inducida por la

Capítulo 1 13

acumulación de proteínas de la envoltura sobre-expresadas (47). La segunda teoría

describe una interrupción en el vínculo existente entre la membrana externa y la capa de

peptidoglicano, lo que lleva a una liberación descontrolada de OMV. Esta suposición se

basó en la observación de que las deficiencias en varias proteínas implicadas en la

interconexión de la membrana externa y peptidoglicano tienen un impacto dramático en la

vesiculación; un ejemplo es la lipoproteína OPRI de 6,95 kDa descrita en P. aeruginosa y

también encontrada en P. gingivalis. OPRI es una proteína de membrana externa

abundante y parece interactuar de forma covalente con la capa de peptidoglicano. La

deleción del gen Opri mejora significativamente la vesiculación en P. aeruginosa, que

presumiblemente resulta en la pérdida de la inmovilización de la membrana externa con el

peptidoglicano (47).

Finalmente, la tercera teoría describe que la vesiculación puede resultar en un aumento de

la curvatura local de la membrana externa bacteriana. Este modelo se apoya en estudios

recientes que describen una molécula de señalización 2-heptil-3-hidroxi- 4-quinolona

(PQS) descrita por primera vez en P. aeruginosa. PQS parece ser necesaria y suficiente

para la formación de OMV a través de la interacción directa con la membrana bacteriana y

la expansión de la membrana externa, lo que aumenta la curvatura de la membrana y

conduce a la formación de vesículas (47).

Mantri et al.,2015 describieron que la vesiculación en P. gingivalis es dependiente de

fimbrias, al comparar vesículas secretadas por cepas con un alelo fimbrial tipo I (ATCC

33277), tipo III (ATCC 49417) y tipo IV (W83). Mediante microscopía electrónica de

transmisión, encontraron más OMV en las superficies de la cepa ATCC 33277 y ATCC

49417, que en la cepa W83, que se ha descrito como poco productora de fimbrias.

Curiosamente, cuando se introdujo un gen que codifica para fimbrias tipo IV en la cepa

ATCC 33277, la vesiculación fue similar entre la cepa parental y la cepa receptora, lo que

sugiere que el subtipo fimbrial está implicado en la biogénesis de vesículas (2048).

La evidencia actual indica que la biogénesis de OMV es un proceso estrictamente

controlado y regulado, que implica un gasto energético de la célula, por lo que no son

producidas al azar y son estrategias de evasión, adquisición de nutrientes y patogenicidad

importantes en la bacteria, aunque es probable que las vías específicas varíen entre filo,

géneros e incluso especies, aún hacen falta por dilucidar estas diferencias (16).


macrófagos humanos

Actualmente se cree que un aumento de la curvatura local de la membrana externa (~ 14

veces) indica que la biogénesis de OMV requiere un gasto de energía para una curvatura

significativa de la membrana. En P. gingivalis se ha propuesto que esto se puede lograr

regulando positivamente la producción de ciertos lípidos de las caras internas o externas

de la membrana, lo que provoca la curvatura localizada hacia afuera de la membrana

externa. Esto da como resultado la selección de LPS aniónicos (A-LPS) y proteínas

extracelulares de la familia CTD asociadas en la superficie. La desacilación de A-LPS

puede permitir adicionalmente una mayor curvatura que conduzca a la formación de OMV

(44).

Figura 2. Modelo de biogénesis de vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Tres modelos son presentados: (A) una fuerza física inducida por acumulación de proteínas de la envoltura sobre-expresada. (B) interrupción del vínculo existente entre la membrana externa y la capa de peptidoglicano (C) aumento de la curvatura local de la membrana externa bacteriana potenciado por señales extracelulares como PQS: Xie H. Future Microbiol, 2015 (47).

1.3.3.1 Composición de las OMV de P. gingivalis

Estudios recientes utilizando herramientas proteómicas han demostrado que las vesículas

de P. gingivalis pueden actuar como intermediarios que llevan una amplia variedad de

factores de virulencia proporcionadas por sus células parentales. En las vesículas se

encuentran los factores de virulencia presentes en la membrana externa de esta bacteria

incluyendo LPS, FimA, Mfa1, HagA, Kgp, RgpA, y RgpB. Algunos de estos factores de

virulencia fueron encontrados en mayor proporción en vesículas comparado con los niveles

encontrados en células intactas y se ha reportado una mayor cantidad (3-5 veces) de

gingipaínas en las vesículas comparadas con la cantidad observada en los extractos de la

superficie de esta bacteria (20). En la tabla 1, se describen las proteínas presentes en las

Capítulo 1 15

vesículas de P. gingivalis ATCC 33277 y W83, donde se destacan las gingipaínas como

las más abundantes (20).

Tabla 1. Proteínas identificadas en las OMV de P. gingivalis de las cepas ATCC 33277 y W83. (Las proteínas resaltadas en negrilla fueron las más abundantes). Modificado de: Mantri et al.,

Microbiology Open 2015 (20).

Rank P. gingivalis ATCC 33277 P. gingivalis W83

1 Lys-gingipaína, kgp Arg-gingipaína, RgpA

2 Arg-gingipaína, RgpA Receptor antígeno A, RagA

3 Sistema de secreción Por ( PorV) Sistema de secreción Por (PorV)

4 Arg-gingipaína, RgpA Arg-gingipaína, RgpB

5 Receptor antígeno A, RagA Receptor antígeno B, RagB

6 Peptidilarginina deiminasa Peptidilarginina deiminasa

7 Proteína Hemaglutinina, HagA Proteína Hemaglutinina, HagA

8 Proteína de subunidad fimbrial tipo-1

Fim A

Antígeno Inmunoreactivo de 61

kDa

9 Receptor antígeno B, RagB Proteína no caracterizada (PG_1823,

PGN_1744)

10 Antígeno Inmunoreactivo 61 kDa Carboxipeptidasa putativa de Zinc

11 Proteína no caracterizada (PGN_1744) Proteína no caracterizada

12 Fimbrilina, Mfa1 Proteína no caracterizada (PG_1626,

PGN_0477)

13 Lipoproteína putativa Lipoproteína putativa

14 Carboxipeptidasa putativa de Zinc Proteína de unión a hemina 35 kDa

15 Antígeno inmunoreactivo 23 kDa Proteasa extracelular putativa

16 Proteína no caracterizada (PGN_0477) Antígeno inmunoreactivo 47 kDa

17 Antígeno inmunoreactivo 47 kDa Proteína no caracterizada

18 Proteína de unión a hemina 35 kDa Proteína no caracterizada

19 Proteína putativa no caracterizada Proteína de unión a hemina FetB

20 Proteasa extracelular putativa Proteína de membrana externa 41


macrófagos humanos

1.3.3.2 Función de las OMV de P. gingivalis

Se ha sugerido que el aumento de la antigenicidad encontrado en las vesículas podría ser

a causa de una mayor concentración de factores de virulencia en las vesículas que en la

superficie de P. gingivalis. Las OMV liberadas al espacio extracelular, son capaces de

penetrar una mucosa intacta y entrar a los tejidos subyacentes del hospedador liberando

todos los componentes antigénicos que trae consigo favoreciendo la progresión de la

infección (14).

Los OMV de P. gingivalis que se enriquecen selectivamente en proteínas de la familia CTD

como las gingipaínas, favorecen la coagregación bacteriana promoviendo el desarrollo de

biopelículas. También se cree que las OMV de P. gingivalis contribuyen a la interacción y

colonización del hospedador, a la evasión de los mecanismos de defensa inmunitaria y a

la destrucción de los tejidos periodontales. Las OMV pueden ser cruciales para la captura

de micronutrientes y macronutrientes, especialmente el hemo y probablemente otros

compuestos asimilables para su propio beneficio y el de la comunidad de biofilm en general

(44). Recientemente se demostró el mecanismo de endocitosis de las OMV de P. gingivalis

en células epiteliales gingivales y se observó que este proceso es dependiente de fimbrias,

además de actina y Rac1, y que una vez internalizadas, estas son enviadas al endosoma

temprano, donde son capaces de degradar proteínas de la célula como el receptor

intracelular de transferrina, importante para el trasporte y metabolismo del hierro, lo que

induce alteraciones de la función celular como síntesis de DNA y la mayoría de actividades

dependientes de ATP (13, 20). Después de la internalización, las OMV son distribuidas en

compartimientos lisosomales, donde son degradadas por la maquinaria celular y varios

antígenos pueden ser reconocidos y procesados por las células presentadoras de

antígenos, lo que conduce a la inducción de la inmunidad adaptativa incluyendo la

producción de anticuerpos (13).

Furuta et al., 2009 evaluaron la actividad proteolítica de las OMV frente a sustratos para

gingipaínas R y gingipaínas K confirmando que en estas vesículas hay gran actividad

mediada por estas enzimas (48). Sin embargo, el papel de OMV de P. gingivalis en la

inmunopatología y la inmunogenicidad durante el desarrollo de las enfermedades

periodontales en humanos no se ha descrito y el mecanismo por el cual estas vesículas

Capítulo 1 17

son capaces de inducir cambios en la función de células de la respuesta inmune innata no

es claro.

1.3.3.3 Cambios de respuesta inmune por OMV de P. gingivalis

Si bien la inflamación es un componente importante de la defensa del hospedador, la

inflamación persistente y desregulada proporciona un entorno nutricionalmente favorable

para las bacterias en la bolsa periodontal responsables en gran medida de la destrucción

ósea y tisular que caracteriza a la periodontitis (49).

Diferentes estudios han investigado el papel potencial de los OMV en la respuesta inmune

del hospedador y la destrucción del tejido durante la infección por P. gingivalis (12,14, 50).

En primer lugar estudios en sueros de pacientes con periodontitis se reportó que tenían

una reactividad fuerte contra OMV; por otra parte, cuando se adicionan OMV a una

monocapa de una línea de células epiteliales escamosas orales, las OMV provocan

desprendimiento de células, lo cual fue corroborado al pre-incubar las OMV con antisuero

anti-gingipaína el cual bloqueo la acción de las vesículas, indicando adicionalmente que

las gingipaínas derivadas de OMV tienen un efecto proteasa fuerte en la actividad de la

vesícula y sugiriendo que pueden contribuir a la destrucción del tejido periodontal al servir

como un vehículo para los antígenos y proteasas activas. (12).

Además, las OMV de P. gingivalis han sido evaluadas en células epiteliales gingivales

humana (HGE), para determinar su efecto sobre la expresión de ARNm de COX-2, IL-6,

IL-8, MMP-1 y MMP-3 (51); en línea celular de carcinoma de células epiteliales escamosas

(HSC-2), para evaluar el efecto citotóxico y de desprendimiento de células en cultivo

cuando están expuestas a las vesículas (12); en células endoteliales de vena umbilical

humana (HUVEC), utilizadas para evaluar su habilidad para promover la inflamación y su

efecto sobre la biosíntesis de moléculas de adhesión (E-selectina, ICAM-1 y glicoproteínas

como MHC-II) (52); en línea celular de macrófago de ratón (RAW264), para evaluar su

capacidad de inducir la producción rápidamente ON por las células (53).

Duncan et al., (2004) confirmaron en la línea celular mielomonocítica humana (U937) que

las vesículas contribuyen a la pérdida del receptor CD14 para LPS y que las gingipaínas

son las responsables de esta degradación. Este fenómeno, fue confirmado con vesículas

de cepas mutantes P. gingivalis deficiente de gingipaínas (54).


macrófagos humanos

Las OMV de P. gingivalis también pueden persistir dentro de los lisosomas de las células

hospedadoras y son potentes activadores de los receptores Toll-like (TLR) (55). Un estudio

reciente reportó que la capacidad de P. gingivalis para alterar la respuesta inmune local

se debía a la hipo-respuesta que inducen las OMV en los monocitos, favoreciendo que

estos no respondan a la infección por P. gingivalis viva (56).

Se sabe que los monocitos y los macrófagos son las principales células de la respuesta

inmune del hospedador a la infección bacteriana a través de la fagocitosis, la presentación

del antígeno y la producción de citoquinas. Las biopsias de tejido gingival de pacientes con

periodontitis han mostrado un número elevado de macrófagos y concentraciones más altas

de óxido nítrico sintasa y citocinas proinflamatorias, que sirven para promover la

inflamación y reclutar células inmunitarias adicionales al sitio de la infección (49). Se sabe

que las OMV bacterianas se unen a las células de mamíferos y se internalizan

rápidamente, por lo que entregarían Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

(PAMPs) tanto a la superficie celular como a los receptores citosólicos, modulando en las

células que se internaliza la funcionalidad y respuesta de las misma a la infección por P.

gingivalis (49).

Se ha establecido que P. gingivalis tiene un mecanismo para clasificar selectivamente

proteínas en OMV, lo que resulta en el empaquetado preferencial algunos factores de

virulencia en OMV y la exclusión de muchas proteínas de membrana externa de la carga

de proteína. La existencia de un proceso para empaquetar factores de virulencia

específicos en OMV puede alterar significativamente la comprensión actual de las

interacciones hospedador-patógeno (57).

2 Metodología

Para cumplir el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos:

1. Obtener y purificar las vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y P.

gingivalis ATCC 33277.

2. Evaluar los niveles y expresión de citocinas proinflamatorias en macrófagos

cultivados y estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis.

3. Evaluar el efecto de la inhibición de gingipaínas y lipopolisacárido de vesículas

extracelulares de P. gingivalis en la expresión de citocinas en proinflamatorias en

macrófagos.

La metodología a continuación descrita permitió cumplir los objetivos propuestos.

2.1 Cultivo bacteriano de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 y obtención de pre-inóculos

Cepas de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 fueron descongeladas del cepario

del Laboratorio de Microbiología Oral del Instituto UIBO, conservadas en caldo BHI (Brain

Heart Infusion) con 10% de glicerol a -80°C y cultivadas en agar Brucella suplementado

con (0.3% de Bacto agar, 0.2% de extracto de levadura, 5% de sangre de cordero, 0.2%

de sangre hemolizada, 0.0005% de hemina y 0.00005% menadiona) y fueron incubadas a

37°C durante 4 días en condiciones anaeróbicas (Anaerogen, Oxoid, Hampshire, UK).

Pasado el tiempo de incubación se verificó pureza de los cultivos y posteriormente se

ajustaron pre-inóculos bacterianos de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 en

caldo BHI y se cuantificaron por espectrofotometría a una longitud de onda () de 620 nm

y estandarizados a una densidad óptica (DO) de 0.970 – 0.972 para P. gingivalis W83 y

DO: 1.000-1.008 para P. gingivalis ATCC: 33277 con el fin de obtener recuentos lo más

similares posibles entre las dos bacterias (>1 x 108 bacterias/mL) y de esta manera

asegurar las mismas condiciones para las dos cepas a evaluar. 100 µL de cada suspensión


macrófagos humanos

previamente ajustada (pre-inóculo), fueron utilizados para hacer diluciones seriadas en

base 10 hasta la dilución -8. Se realizó el recuento del número de bacterias por mL de P.

gingivalis ATCC 33277 y W83, adicionalmente se calculó la concentración de proteínas del

pre-inóculo con ácido Bicinconínico (Pierce® BCA Solid, Thermo Scientific) usando una

curva de calibración con concentraciones conocidas de albumina sérica bovina como

patrón. 1mL del cultivo bacteriano restante fue conservado a -20°C para posteriores

pruebas. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado.

2.1.1 Inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83

En experimentos independientes se estandarizaron los inóculos bacterianos, para los

cuales se partió del pre-inóculo ajustado previamente y 100 µL de cada suspensión

bacteriana fueron sembrados en 4 mL de caldo BHI suplementado con 5% de hemina y

5% menadiona e incubados en condiciones anaeróbicas, en agitación a 90 rpm durante 48

horas. A las 48 horas de incubación se tomó una alícuota de 100 µL de cada inóculo

bacteriano y se realizaron diluciones seriadas en base 10 para realizar el cálculo del

número de bacterias a las 48 horas de incubación (Inóculo final) y se obtuvieron alícuotas

para determinar límite de detección de actividad Arg-gingipaína.

2.1.2 Viabilidad bacteriana de inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83

Para confirmar adicionalmente el dato de los recuentos bacterianos a las 48 horas de

incubación y correlacionar con los recuentos obtenidos por plaqueo, se determinó la

viabilidad bacteriana del inóculo final con el kit comercial LIVE/DEAD™ BacLight™

Bacterial Viability Kit (Thermo Fisher), como lo hemos reportado previamente en Castillo

et al., 2015 (58).

2.1.3 Límite de detección de actividad de la proteasa (Rgp) en los pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis

De los pre-inóculos y los inóculos bacterianos con recuentos en UFC/mL previamente

estandarizados, se realizaron diluciones seriadas 1:2 hasta la dilución 1:4096. Se obtuvo

el límite de detección de la actividad Arg-gingipaína de cultivos de P. gingivalis (Pre-inóculo

e Inóculo de 48 horas) usando el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg 7-amido-4-

Capítulo 2 21

metilcoumarin hydrochloride (CAAM; Sigma) como lo describe previamente Nakagawa et

al., 2006 con modificaciones (59). El inóculo fue preparado a una concentración de 16nM

en 50mM de Buffer Tris HCl pH 8.0 y DMSO (Dimetilsulfóxido), en una relación de 10µL

de reactivo CAAM con 50 µL de muestra. Todos estos ensayos fueron realizados por

triplicado, en placas de 96 pozos oscuras de fondo claro e incubadas a 37°C durante 30

minutos, pasado el tiempo de incubación la reacción fue detenida con 40 µL de una

solución de parada que contiene 100 mM de buffer acetato de sodio pH: 5.0 y 10 mM de

ácido acético 4M. Las placas fueron leídas en un fotofluorómetro Infinite® 200 PRO Tecan,

una excitación: 380 nm y de emisión: 460 nm. Se obtuvieron las unidades de

fluorescencia, que fueron transformadas en unidades de actividad Rgp.

𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 𝑹𝒈𝒑 =𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

µ𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

2.2 Obtención y purificación de OMV P. gingivalis

La preparación y purificación de las vesículas fue realizada como lo describe previamente

Furuta et al., 2009b con modificaciones (48). 100 µL de pre-inóculos previamente ajustados

para cada una de las bacterias fueron sembrados en 4 mL de caldo BHI suplementado con

hemina y menadiona e incubados en agitación a 90 rpm durante 48 horas. Transcurrido

este tiempo a cada cultivo se le adicionaron 40 µL del coctel inhibidor de proteasas 100X

(Protease Inhibitor Cocktail for use with mammalian cell and tissue extracts-Sigma) y se

procedió a realizar dos ciclos de centrifugación a 1.600 gravedades durante 1 hora a 4°C

cada ciclo. El sobrenadante obtenido libre de bacterias fue filtrado a través de filtros de

membrana en esteres de celulosa con un tamaño de poro de 0,22 µm (Millipore), para

remover bacterias residuales.

El sobrenadante filtrado, fue utilizado para la obtención de vesículas por ultra

centrifugación a 100.000 g durante 1 hora en una Ultracentrífuga (OptimaTM MAX-TL-

Ultracentrífuga (Beckman Coulter)) a 4°C. El pellet final de la ultra centrifugación fue

resuspendido en 50 µL de Tris-HCl 20 mM pH: 8.0 con 10% de glicerol y conservadas a -

20°C hasta su uso.

La concentración de proteínas totales de las OMV fue cuantificada con ácido Bicinconínico

(Pierce® BCA Solid, Thermo Scientific) usando una curva de calibración con

concentraciones conocidas de albumina sérica bovina como patrón. El perfil proteico de


macrófagos humanos

las OMV fue evaluado mediante SDS–PAGE (Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel

electrophoresis) al 14% usando un extracto sonicado de células completas de P. gingivalis

W83 y 33277 como control positivo (59), PBS + 10% de glicerol como control negativo y

se incluyó un segundo control negativo con caldo BHI. Los geles fueron separados en un

equipo Mini Protean electrophoresis (Bio-Rad, Vienna, Austria) y las proteínas se tiñeron

con coloración de plata. Los perfiles electroforéticos fueron comparados con los reportados

previamente por Veith et al., 2014 y Mantri et al., 2015 (45,20).

2.2.1 Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) para OMV de P. gingivalis

Para evaluar la integridad de las vesículas después de su obtención por ultracentrifugación,

se realizó TEM, usando el Microscopio Electrónico Digital de Transmisión Marca: FEI;

Modelo: TECNAI 20 Twin - 200Kv. Se obtuvieron imágenes de OMV purificadas de las dos

bacterias usando un pool representativo de 4 lotes de vesículas obtenidos en diferentes

momentos y conservados durante un mes a -20°C.

2.2.2 Límite de detección de actividad proteasa de las OMV de P. gingivalis

El límite de detección de actividad Rgp de las vesículas de P. gingivalis ATCC: 33277 y P.

gingivalis W83 fue determinada de la misma manera como fue realizada con bacteria

completa usando el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg 7-amido-4-metilcoumarin

hydrochloride (CAAM; Sigma) como lo describe previamente Nakagawa et al., 2006 (59).

2.3 Cultivo celular de monocitos U937 ATCC® CRL1593.2™

Una línea celular de monocito U937 ATCC® CRL1593.2™ donada por el Instituto de

Virología de la Universidad El Bosque, fue cultivada como lo describe Sekot et al., 2011

con modificaciones (60). Las células fueron mantenidas en medio RPMI-1640 (1X) con L-

Glutamina (GIBCO) suplementado con 10% de suero fetal bovino (GIBCO) y 1% de una

mezcla de antibiótico-antimicótico (100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de Estreptomicina

y 0, 25 µg/mL de Anfotericina B Thermo Fisher Scientific) a 37°C en una atmosfera con 5%

Capítulo 2 23

de CO2 y humedad relativa del 90%. Los cultivos fueron mantenidos por adición de medio

fresco cada 3 días con el fin de mantener una densidad celular entre 1 X 105 y 2 X 106

células /mL, siguiendo las recomendaciones de la ATCC, todos los experimentos se

realizaron al tercer pase.

2.3.1 Diferenciación de monocito U937 a macrófago

Para inducir la diferenciación de monocitos U937 a macrófagos adherentes, se sembraron

150.000 células por pozo en placas de 24 pozos a un volumen final de 500 µL y una

concentración de 200ng/mL de PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma)) como

agente diferenciador, la concentración fue definida después de un proceso de

estandarización (datos no mostrados). Las células fueron incubadas por 72 horas a 37°C

en una atmosfera con 5% de CO2 y humedad relativa del 90%. Después de la incubación,

se realizó un recambio de medio, adicionando a las células medio libre de PMA e

incubando nuevamente durante 24 horas.

Después de 24 horas de incubación de las células con medio libre de PMA, se retiró el

medio y se agregó medio fresco, se verificó la adherencia de las células a la placa y el

cambio de tamaño y morfología celular para confirmar la diferenciación celular.

2.4 Evaluación de la viabilidad de macrófagos-U937 estimulados con P. gingivalis

Se determinó la viabilidad de las células infectadas con diferentes multiplicidades de

infección (MOI) de P. gingivalis W83 y 33277 así como con diferentes concentraciones de

lisado celular y OMV con el fin de definir la concentración de bacterias, lisado y vesículas

a la que se obtendría un efecto importante sin daño de la célula. Para ello se realizó el

protocolo de viabilidad celular con el método resazurina, como lo describe Riss et al., 2011,

con modificaciones. Las células viables con metabolismo activo pueden reducir la

resazurina en el producto de resorufina, que es de color rosado y fluorescente (61). Para

este fin macrófagos-U937 fueron estimulados con P. gingivalis W83 y 33277 a una MOI:

10, 50, 100 y 200 y lisado celular o vesículas a 20 μg/mL durante 30 minutos, 1 hora, 2

horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas y 24 horas. Posterior al tiempo de estímulo, este fue

retirado y las células fueron lavadas con PBS apirogénico, se usaron como control

macrófagos -U937 sin tratamiento. Resazurina a una concentración de 4,4 μM fue


macrófagos humanos

adicionada en cada pozo. Se realizó observación del cambio de color de morado a rosado

a partir de la hora de contacto de las células con el reactivo, las placas fueron leídas en un

fotofluorómetro Infinite® 200 PRO Tecan, una excitación: 535 nm y de emisión: 630

nm. Se obtuvieron las unidades de fluorescencia, con las que se calculó el porcentaje de

viabilidad de las células estimuladas comparadas con las células sin estímulo. Todos los

experimentos fueron realizados por triplicado.

2.5 Modelo de infección de macrófagos - U937 con OMV de P. gingivalis

La estimulación de macrófagos con OMV se realizó como lo describe Friedrich et al., 2015

con modificaciones (62). Los macrófagos adherentes sembrados en placas de 24 pozos a

una densidad de 150.000 células por pozo en un volumen de 500 μL RPMI-1640 fueron

estimulados con OMV y lisados celulares de P. gingivalis W83 y 33277 a una concentración

de 20 μg/mL y con bacteria completa a MOI: 100, durante 30 min, 2 horas, 6 horas y 24

horas. Posterior a cada tiempo de estímulo, el estímulo fue retirado y las células lavadas 2

veces con PBS 1X para adicionarles medio fresco. 24 horas después, fueron colectados

los sobrenadantes para evaluación de niveles solubles de citocinas mediante citometría de

flujo, las células fueron desprendidas y conservadas en Trizol® (Invitrogen) a -80oC para

extracción de RNA y determinación de la expresión genes de citocinas y quimiocinas, se

realizaron tres replicas biológicas para todos los experimentos y se incluyeron células sin

estímulo como control.

2.5.1 Evaluación de los niveles solubles de citocinas por citometría de flujo

Sobrenadantes de cultivo después de cada uno de los tiempos de estímulo, fueron

utilizados para determinar los niveles solubles de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, RANTES, MCP-

1 y MIP-1α por citometría de flujo usando el panel de citocinas proinflamatorias (Human

inflammation panel Cat. No. 740118 LEGENDplex (Multi-Analyte Flow Assay Kit)

BioLegend) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Este es un inmunoensayo

basado en perlas, que utiliza los mismos principios básicos de los inmunoensayos tipo

sándwich, mediante el cual se captura un analito soluble entre dos anticuerpos. Cada

conjunto de perlas está conjugado con un anticuerpo específico en la superficie y sirve

Capítulo 2 25

como base de captura para ese analito en particular. Los anticuerpos de detección

biotinilados y cada anticuerpo de detección se unen a su analito específico unido a las

perlas de captura, formando así sándwiches de captura de perlas, analitos y anticuerpos

de detección. Posteriormente, se agrega estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE), que se unirá

a los anticuerpos de detección biotinilados, proporcionando una señal fluorescente con

intensidades en proporción a la cantidad de analito unido (Información disponible en página

web https://www.biolegend.com/legendplex). Para cada población de perlas, la intensidad

de fluorescencia de la señal de PE fue cuantificada utilizando un citómetro de flujo (BD

Accuri™ C6). La concentración particular de cada analito se determinó en base a una curva

estándar conocida usando el software de análisis de datos LEGENDplex ™.

2.6 Evaluación de la expresión de citocinas proinflamatorias por macrófagos-U937 estimulados con OMV de P. gingivalis W83 y 33277

La monocapa celular fue utilizada para extracción de RNA usando Trizol® (Invitrogen), se

realizó tratamiento con DNase (Promega); retro-transcripción y síntesis de cDNA usando

M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) y posteriormente qPCR usando el kit Precision

Melt Supermix for High Resolution Melt (HRM) Analysis (BIORAD). Se determinó la

expresión relativa de ARNm en los diferentes tiempos de estímulo para TNF-α, IL-1β, IL-

6, IL-8, RANTES, MCP-1 y MIP-1α, usando β-actina como housekeeping. En la tabla 2, se

muestran las secuencias de primer utilizadas para la determinación de expresión de las

citocinas, los primers para MIP-1α y β-actina fueron diseñados en este estudio usando el

software Beacon Designer 8, PREMIER Biosoft International. Las muestras fueron

amplificadas en un termociclador BioRad CFX96, las concentraciones y secuencias de los

primers se muestran en la tabla 2. El protocolo de amplificación consistió en un ciclo inicial

de 95°C por 3 minutos, posteriormente 40 ciclos de 95°C 30 segundos y 62°C 1 minuto. La

expresión génica fue calculada usando la fórmula descrita por Schefe et al, 2006 (63).

https://www.biolegend.com/legendplex


macrófagos humanos

Tabla 2. Secuencias de primer y concentración utilizadas para detección de citocinas

2.7 Evaluación del efecto de la inhibición de gingipaínas y LPS de OMV en los niveles y expresión de citocinas en proinflamatorias

Ensayos independientes fueron realizados con macrófagos co-cultivados con vesículas,

lisados celulares o bacteria viva de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 pre-tratados durante

5 minutos a 37°C con inhibidores específicos como lo describe Kadowaki et al., 2004 con

modificaciones (67). Los estímulos fueron bloqueados con 3 tipos de sustancias

inhibidoras, grupo I: inhibidor específico de gingipaínas Rgp [KYT-36: Carbobenzoxy Glu

(NHN (CH3) Ph)-Lys-CO-NHCH2Ph], grupo II: inhibidor específico de gingipaínas Kgp

[KYT-1: Carbobenzoxy-Lys-Arg-CO-Lys-N-(CH3)2) (Peptanova)] usados a una

concentración final de 10-4 M; y un tercer grupo inhibidor de LPS (InvivoGen) a una

concentración final de 100 μg/mL.

De esta manera se determinó el efecto que tienen estos factores de virulencia encontrados

en vesículas con la actividad biológica de las OMV en macrófagos, determinando niveles

solubles de citocinas por citometría de flujo y expresión relativa de genes para cada una

de las citocinas evaluadas a los 30 minutos y 6 horas de estímulo de macrófagos. Se

realizaron experimentos por triplicado de cada ensayo y cada grupo evaluado fue

comparado con los ensayos previos sin inhibidores, con células sin estímulo o estimuladas

Gen Tamaño

(Pb)

Concentració

n final Primer Secuencia de primers Referencia

IL-6 86 0,60 µM F: 5´-GGCACTGGCAGAAAACAACC-3´ R: 5´-GGCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3´

Scheres et al., 2010 (64)

IL-8 119 0,45 µM F: 5´-GCGCCAACACAGAAATTATTGTAA-3´ R: 5´- TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAA-3´

Tong et al., 2001 (65)

IL-1 β 101 0,60 µM F: 5´-CTTTGAAGCTGATGGCCCTAAA-3´ R: 5´- AGTGGTGGTCGGAGATTCGT-3´


TNF-α 84 0,30 µM F: 5´-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3´ R: 5´- ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3´

Stordeur et al., 2002 (66)

MCP-1 103 0,30 µM F: 5´-CAGCCAGATGCAATCAATGC-3´ R: 5´- TGCTGCTGGTGATTCTTCTATAGCT-3´


MIP-1 α 88 0,45 µM F: 5´-TCAGACTTCAGAAGGACACGG-3´ R: 5´- GAGCAGGTGACGGAATGTGG-3´

Este estudio

RANTES 105 0,30 µM F: 5´-CATCTGCCTCCCCATATTCCT-3´ R: 5´- TGCCACTGGTGTAGAAATACTCCTT-3´


β –actina 90 0,45 µM F: 5´-GGATGCAGAAGGAGATCACTG-3´ F: 5´- CGATCCACACGGAGTACTTG-3´

Este estudio

Capítulo 2 27

con el vehículo Dimetilsulfóxido (DMSO) al 1%, utilizada para la solubilización de los

inhibidores KYT-1 y KYT-36.

2.8 Plan de análisis

Se utilizó ANOVA factorial, con el fin de evaluar el efecto individual de cada uno de los

grupos de tratamiento (variables independientes) ajustado al tiempo y a la interacción

tiempo tratamiento sobre los niveles y expresión de citocinas proinflamatorias (variable

dependiente).

Para los ensayos de qPCR, se empleó el cálculo de expresión relativa génica (GED-Gene

Expression’s CT Diference) (64).

Se utilizó el paquete estadístico STATA versión 12 para Windows, todos los análisis se

realizaron con un nivel de significancia del 5%.

3 Resultados

3.1 Recuentos bacterianos del pre-inóculo e inóculos P. gingivalis ATCC 33277 y W83

En la tabla 3 se muestran los resultados de los promedios en logaritmo base 10 de los

recuentos del pre-inóculo de P. gingivalis en ensayos por triplicado para P. gingivalis ATCC

33277 y para P. gingivalis W83, donde se logró estandarizar a densidades ópticas

diferentes para cada bacteria, recuentos similares y reproducibles entre experimentos. De

esta manera fueron normalizados los resultados de todos los ensayos debido a que las

dos bacterias exhiben patrones de crecimiento diferentes.

Tabla 3.Promedios de recuentos de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en

Log 10.

En el inóculo bacteriano, también se estandarizó el recuento de UFC/mL después de 48

horas de incubación a 37°C en agitación a 90 rpm en condiciones anaeróbicas. Con el fin

de tener un dato normalizado de la obtención de OMV a partir de dos cepas de P. gingivalis

que parten de un cultivo (pre-inóculo) con concentraciones bacterianas idénticas. En la

tabla 4, se muestran los resultados de los promedios en logaritmo base 10 los recuentos

del inóculo de 48 horas de P. gingivalis en ensayos por triplicado evaluados a una longitud

de onda () de 620 nm.

Bacteria DO 620 nm

Promedio de

UFC en Log 10 ±

(DE)

Promedio UFC

/mL CV

P. gingivalis ATCC: 33277 1.000-1.008 7,49 ± (0.04) 31000000,0 0,591

P. gingivalis W83 0.970-0.972 7,54 ± (0.02) 35000000,0 0,218


macrófagos humanos

Tabla 4. Promedios de recuentos del inóculo de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 expresados en Log 10.

Se puede observar que a partir de un pre-inóculo que estaba a una concentración de

31.000.000,0 UFC/mL para P. gingivalis ATCC 33277 y de 35.000.000,0 UFC/ mL para P.

gingivalis W83, se tomaron 100 μL de estas bacterias para ajustar el inóculo final y a las

48 horas de incubación se obtuvo un recuento bacteriano mayor en la cepa de P. gingivalis

W83 (89.666.667 UFC/mL) que P. gingivalis 33277 (26.666.667 UFC/mL) aun cuando las

dos bacterias son de la misma especie y además iniciaron el cultivo a partir de un pre-

inóculo con iguales concentraciones para las dos, lo cual también indica que las dos

bacterias tienen una tasa de crecimiento distinto que puede influir al final cuando se

analizan efectos de las bacterias en modelos in vitro.

Los resultados de los recuentos de los inóculos bacterianos, fueron corroborados con

experimentos de viabilidad bacteriana, las imágenes obtenidas de células vivas

(Fluorescencia verde) y muertas (fluorescencia roja), fueron procesadas en el software

ImageJ (NIH). Se determinó el porcentaje de viabilidad para P. gingivalis W83 (95%) y P.

gingivalis ATCC 33277 (92%) a las 48 horas de incubación.

Estos resultados son congruentes con los recuentos bacterianos obtenidos por plaqueo de

los mismos inóculos, donde se determinó que el crecimiento bacteriano de P. gingivalis

W83 fue mayor comparado con P. gingivalis 33277 y los resultados de los recuentos no

son producto de la muerte de bacterias durante el manejo microbiológico, la tasa de muerte

en estos inóculos fue muy baja, y los porcentajes de muerte son los normales de cualquier

manejo de cultivos bacterianos.

Bacteria DO 620 nm Promedio de UFC en Log 10 ± (DE)

Promedio UFC /mL

CV

P. gingivalis ATCC 33277

1,430 ± 0,004

7,421 ± 0,08

26666667 1,098

P. gingivalis W83 1,626 ± 0,004 8,000 ± 0,00 89666667 0,035

Capítulo 3 31

3.2 Actividad de la Arg-gingipaína Rgp en los Pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis

Fue determinado el límite de detección de actividad Arg-gingipaína con el sustrato

fluorogénico en la última dilución a la que se comprobó actividad enzimática diferente con

respecto a la dilución anterior (p<0,05). Los resultados son presentados en actividad Rgp

específica por cantidad de proteína y en UFC/mL. La tabla 5, muestra los resultados del

límite de detección de actividad enzimática en pre-inóculos e inóculos bacterianos de P.

gingivalis W83 y 33277, como método de seguimiento de la actividad Arg-gingipaína en

cultivos de P. gingivalis que fue también utilizado para la detección de actividad enzimática

en OMV.

Se logró establecer una actividad específica Rgp de 67,49 y 18,80 Unidades de

Fluorescencia (UF) por cada 50µg de proteína en el pre-inóculo de P. gingivalis 33277 y

W83 respectivamente. Esta actividad fue mayor en los inóculos a las 48 horas de

incubación con valores de 62.138,34 y 3.881,12 UF/50µg de proteína para P. gingivalis

33277 y W83 respectivamente, dato que es congruente con los recuentos bacterianos a

las 48 horas. P. gingivalis 33277 es la bacteria en donde se detecta mayor actividad Rgp

y este dato se mantiene entre el pre-inóculo y el inóculo.

Tabla 5. Actividad Arg-gingipaína de pre-inóculo e inóculo de P. gingivalis

Bacteria Bacteria Dilución

(µg/50µL) UFC/mL

Promedio de

UF ± DE

Actividad

RgP

UF/50µg

CV

Pre-

inóculo

P. gingivalis 33277 1/128 [3,01] 227344 203,00 ± 25,0 67,49 13,00

P. gingivalis W83 1/128 [2,50] 234115 50,00 ± 2,0 18,80 4,00

Inóculo

48h

P. gingivalis 33277 1/1024 [0,234] 26042 291 ± 16,17 1265,21 6,00

P. gingivalis W83 1/256 [0,973] 175130 75,0 ± 6,36 77,08 8,40


macrófagos humanos

3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y ATCC 33277

Después de la ultracentrifugación a 100.000g durante 1 hora, las vesículas fueron

resuspendidas en 50 µL de Tris HCl 20 mM pH: 8.0 con 10% de glicerol. 3 µg / µL de Pool

OMV fueron sembradas por pozo en un gel (SDS-PAGE) al 14%. En la figura 3 se puede

observar el perfil de bandeo de un pool de OMV de P. gingivalis ATCC 33277 (Carril 3) y

de P. gingivalis W83 (Carril 7) representativo de 4 lotes de OMV obtenidas en diferente

tiempo y conservadas a -20°C hasta su uso. Con este resultado se demuestra que el

proceso de obtención de OMV fue estandarizado y las proteínas derivadas de las vesículas

se encuentran integras y con un perfil de bandeo comparable con el reportado por otros

autores (19, 8).

Figura 3.SDS-PAGE de Pool OMV de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 (30 µg/pozo). Carril MP: (Protein Ladder 260 kDa); carril 1: Sonicado Pg 33277; carril 2: Sonicado Pg 33277 1/100; carril 3: OMV Pg 33277; carril 4: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg 33277; carril 5: Sonicado PgW83; carril 6: Sonicado PgW83 1/100; carril 7: OMV W83; carril 8: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg W83; carril 9: Caldo BHI ultracentrifugado.

Capítulo 3 33

3.3.1 Microscopia Electrónica de Transmisión de vesículas de membrana externa de P. gingivalis

Con el fin de determinar la integridad de las vesículas, como condición necesaria para el

uso de estas estructuras como estímulo en un modelo celular con macrófago-U937, un

pool de OMV representativo de cuatro lotes de OMV colectadas en tiempos diferentes, fue

analizando mediante microscopia electrónica de transmisión. En la figura 4A se pueden

observar vesículas purificadas de P. gingivalis como estructuras esféricas irregulares de

tamaño variable, congruente con lo reportado en la literatura, que describe el tamaño de

las OMV entre 50 y 250 nm. Así mismo se puede observar en la figura 4B una bacteria de

P. gingivalis con sus OMV libres en el medio circundante y adheridas a la membrana

externa de la bacteria. Con este resultado se confirma que el proceso de obtención de las

vesículas fue estandarizado y que las OMV se mantienen integras con el método de

conservación utilizado.

Figura 4. Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de vesículas purificadas de P. gingivalis (A) y Bacteria con vesículas de membrana externa (B).

3.3.2 Actividad Arg-gingipaína de vesículas de P. gingivalis

Se determinó el límite de detección de actividad Rgp con el sustrato fluorogénico CAAM.

En la tabla 6 se muestran los resultados de la actividad Arg-gingipaína de las OMV. En las

OMV de P. gingivalis W83 hubo actividad Rgp detectable hasta las dilución 1/32 con un

promedio de UF de73 y actividad específica de 23,36. Estos resultados confirman que en

las OMV hay actividad


macrófagos humanos

Arg-gingipaína y esta es detectable hasta en concentraciones bajas de proteínas de

vesículas desde 0,02 µg/µL (3,13 µg/50µL).

Tabla 6. Límite de detección de actividad Arg-gingipaína de OMV de P. gingivalis

3.4 Diferenciación celular de Monocitos U937 a Macrófagos-U937

Ensayos de diferenciación celular fueron estandarizados con diferentes concentraciones

de PMA, con el fin de determinar cuál es la mejor concentración a la que se tiene una tasa

de diferenciación celular sin afectar la viabilidad de las células. Después de 72 horas de

incubación, se pudo determinar que a 200ng/mL es la mejor concentración de PMA, donde

se logró la diferenciación total de las células. Concentraciones de PMA de 100ng/mL

resultaron ser insuficientes para lograr una buena diferenciación celular y estabilidad en la

adhesión a las cajas de cultivo, debido a que después de 24 horas de incubación con

medio libre de PMA, las células se desprendieron; por otra parte, concentraciones de 400

y 800ng/mL de PMA resultaron muy agresivas para las células. En la figura 5 se muestran

fotografías tomadas a cajas de cultivo de una línea celular monocitica ATCC U937 sin PMA

y con PMA (200ng/mL) después de 72 horas de incubación a 37°C en una atmosfera con

5% de CO2 y humedad relativa del 90%.

Figura 5. Micrografía de un cultivo de monocito U937 (A) y Monocito U937 diferenciado a macrófago

con 200ng/mL de PMA (B).

OMV Dilución

(µg/50µL)

Promedio de

UF ± DE CV

Actividad RgP

UF/50µg

P. gingivalis ATCC 33277 1/8 (12,50) 365 ± 0,2 11,00 29,20

P. gingivalis W83 1/32 (3,13) 73 ± 0,1 15,00 23,36

Capítulo 3 35

3.5 Viabilidad celular de macrófagos U937 estimulados

Se determinó la viabilidad celular de macrófagos-U937 mediante el método de resazurina

y se definió como concentración final a utilizar 20 µg/mL tanto para lisado celular como

para OMV, la bacteria viva de P. gingivalis W83 y 33277 quedó definida a una MOI: 100

equivalente en concentración de proteínas a 4 mg/mL, lo que corresponde a 200 veces

mayor concentración de proteínas con respecto al lisado y vesículas. Los resultados se

muestran en la tabla 7 como porcentaje de viabilidad celular determinado con respecto a

células sin estímulo, el cual fue mayor al 90% en la mayoría de los tiempos con un rango

entre 93%-100% de viabilidad. Todos los datos corresponden al promedio de experimentos

por triplicado.

Tabla 7. Viabilidad de macrófagos U937 estimulados con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis

3.6 Niveles solubles de citocinas proinflamatorias producidas por macrófagos-U937 estimulados

Se realizó una cinética de producción de citocinas y quimiocinas por macrófagos-U937

estimulados con lisado, bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y ATCC 33277 a los 30

minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas, determinado los niveles de las citocinas

proinflamatorias IL-1β, TNFα, IL-6 (figura 6) y quimiocinas IL-8, RANTES, MCP-1 y MIP-

1α (figura 7) respectivamente, los resultados corresponden a de 3 réplicas biológicas. En

la figura 6A se presentan los resultados obtenidos de la cinética para IL-1 β, donde se

Tiempo de

estímulo

% de viabilidad P. gingivalis W83 % de viabilidad P. gingivalis

33277

Lisado

[20µ/mL]

Vesícula

[20µ/mL]

Bacteria

MOI 100

Lisado

[20µ/mL]

Vesícula

[20µ/mL]

Bacteria

MOI 100

30 min 95% 94% 96% 97% 98% 96%

1 Hora 96% 98% 96% 96% 92% 95%

2 Horas 97% 99% 100% 94% 83% 98%

3 Horas 83% 86% 95% 99% 84% 93%

6 Horas 93% 96% 95% 93% 98% 100%

12 Horas 100% 100% 94% 100% 100% 90%

24 Horas 100% 100% 94% 100% 100% 96%


macrófagos humanos

puede observar que las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 inducen aumento en los niveles

solubles de esta citocina a los 30 minutos (161 pg/mL; 232 pg/mL), a las 2 horas (234

pg/mL; 232 pg/mL), a las 6 horas (292 pg/mL; 291 pg/mL) y 24 horas (278 pg/mL; 363

pg/mL) respectivamente comparados con las células sin estímulo (85 pg/mL). El pico

máximo de estímulo es a las 6 horas para OMV de P. gingivalis W83 y 24 horas para OMV

de P. gingivalis 33277. Las vesículas y los lisados inducen niveles de esta citocina

proinflamatoria de manera similar, mientras que la bacteria viva estimula la producción de

IL-1 β significativamente más que las células sin estímulo, pero menor que las vesículas o

el lisado. El estímulo de 30 minutos induce una respuesta del macrófago similar a la que

ocurre a las 2 horas y cuando se estimulan las células por 6 horas la respuesta del

macrófago es similar al estímulo a las 24 horas (Figura 6A).

Los niveles solubles de TNF-α producidos por macrófagos estimulados con OMV a los 30

minutos fueron mayores (682 pg/mL; 436 pg/mL), a las 2 horas (700 pg/mL; 660 pg/mL), a

las 6 horas (242 pg/mL; 188 pg/mL) y 24 horas (61 pg/mL; 72 pg/mL) respectivamente

comparados con las células sin estímulo (85 pg/mL). Los niveles solubles de TNF-α son

inducidos por las vesículas a los 30 minutos y 6 horas son similares y disminuyen a partir

de las 6 horas teniendo su menor pico de producción a las 24 horas. Las OMV y los lisados

inducen niveles de esta citocina proinflamatoria de manera similar, mientras que la bacteria

viva estimula la producción de esta citocina significativamente más que las células sin

estímulo, pero menor que las vesículas o el lisado (Figura 6B).

En este mismo sentido, las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 inducen aumento en los

niveles solubles de IL-6 a los 30 minutos (992 pg/mL; 982 pg/mL), a las 2 horas (1954

pg/mL; 676 pg/mL), a las 6 horas (681 pg/mL; 745 pg/mL) y 24 horas (248 pg/mL; 249

pg/mL) respectivamente comparados con las células sin estímulo (48 pg/mL). Las

vesículas y los lisados inducen niveles de esta citocina de manera similar, mientras que la

bacteria viva estimula su producción significativamente más que las células sin estímulo,

pero menor que las vesículas o el lisado (Figura 6C).

Cuando se evaluaron los niveles de las quimiocinas IL-8, RANTES, MCP-1 y MIP-1α en

macrófagos estimulados, se pudo observar que las vesículas de P. gingivalis W83 y 33277

reprimen los niveles solubles de IL-8 a los 30 minutos (607 pg/mL; 594 pg/mL), a las 2

Capítulo 3 37

horas (564 pg/mL; 612 pg/mL), a las 6 horas (636 pg/mL; 743 pg/mL), a las 24 horas estos

niveles aumentaron para P. gingivalis W83 (1437 pg/mL) mientras que fueron bajos para

P. gingivalis 33277 (659 pg/mL) respectivamente comparados con las células sin estímulo

(845 pg/mL). El estímulo con las OMV redujo de manera similar los niveles de IL-8 a los

lisados celulares y este comportamiento es diferente cuando los macrófagos son

estimulados con bacteria viva, adicionalmente la respuesta de los macrófagos a la

estimulación con las dos bacterias es diferencial (Figura 7A).

En cuanto a la producción de RANTES tras el estímulo con las dos cepas W83 y 33277, el

pico máximo de estimulación fue a las dos horas para ambas bacterias (1865 pg/mL; 1364

pg/mL). A las 6 horas (568 pg/mL; 669 pg/mL) estos niveles disminuyen significativamente

con respecto a las células sin estímulo (658 pg/mL) y a los estímulos de 30 minutos y 2

horas. Las OMV de P. gingivalis reducen de manera similar los niveles de RANTES a los


estimulados con bacteria viva. La bacteria viva reprime por completo la producción de esta

quimiocina por los macrófagos (Figura 7B).

La producción de MCP-1 se ve reprimida por las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 a los

30 minutos (701 pg/mL; 564 pg/mL), a las 2 horas hay un aumento de esta quimiocina

cuando los macrófagos son estimulados con OMV de P. gingivalis W83 (1766 pg/mL) pero

se mantienen disminuidos con OMV de P. gingivalis 33277 a las 2 horas (704 pg/mL), 6

horas (721 pg/mL) y 24 horas (732 pg/mL) con respecto a las células sin estímulo (985

pg/mL). Las OMV de P. gingivalis inducen un comportamiento similar en macrófagos

estimulados con lisados celulares y este comportamiento es diferente cuando el estímulo

es con bacteria viva. La bacteria viva reprime significativamente más los niveles de MCP-

1 que las células sin estímulo y los lisados y vesículas (Figura 7C). En cuanto a MIP-1α las

OMV reprimen su producción a los 30 minutos (1306 pg/mL; 1336 pg/mL), a las 2 horas

hay un aumento de esta quimiocina cuando los macrófagos son estimulados con OMV de

P. gingivalis W83 (3843 pg/mL) comparado con las células sin estímulo (1540 pg/mL); los

niveles de esta quimiocina se mantienen reprimidos cuando los macrófagos son

estimulados con OMV de P. gingivalis 33277 a las 2 horas (1343/mL), 6 horas (1438 pg/mL)

y 24 horas (1448 pg/mL) con respecto a las células sin estímulo (1540 pg/mL) (Figura 7D).

Figura 6. Niveles de citocinas pro-inflamatorias en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de IL-1β; B) Niveles de TNF-α; C) Niveles de IL-6

*p<0,05 ANOVA Factorial.

Capítulo 3 39

Figura 7.Niveles de quimiocinas en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de IL-8; B) Niveles de RANTES; C) Niveles de MCP-1; D) Niveles de MIP-1 α.


3.7 Evaluación de la inhibición de Rgp y Kgp en OMV de P. gingivalis

Se determinó el efecto de la Inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas y LPS de

Lisado, bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 sobre la estimulación de

macrófagos-U937 y los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-1 β, TNFα, IL-6) y

quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α) por citometría de flujo.

En la figura 8, 9 y 10 se presentan los resultados obtenidos para las citocinas pro-

inflamatorias IL-1 β, IL-6 y TNFα y en las figuras No 11, 12, 13 y 14 las quimiocinas IL-8,

RANTES, MCP-1 y MIP-1α respectivamente en macrófagos estimulados durante 30 min y

6 horas con lisado, OMV y bacteria viva de P. gingivalis sin bloqueo y con bloqueo con los

Inhibidores KYT-1, KYT-36 y PMXB comparados con macrófagos sin estímulo. Los tiempos

evaluados para inhibición fueron determinados, basados en la cinética de citocinas

mostrada anteriormente, siendo 30 min y 6 horas los tiempos donde se obtuvieron los datos

más representativos.

En la figura 8 se observa que, las vesículas sin bloqueo inducen niveles de IL-1β de manera

similar al inducido por los lisados celulares y mayor al inducido por bacteria viva sin

bloqueo. Cuando se bloquearon las Arg-gingipaínas de vesículas se observó un aumento

drástico en los niveles de esta citocina con respecto a las células sin estímulo y a los

estímulos sin inhibición siendo consistente el dato con respecto al resultado encontrado en

los estímulos sin bloqueo a 30 minutos (241pg/mL; 237pg/mL) y 6 horas (711pg/mL;

543pg/mL) respectivamente, para OMV de P. gingivalis W83 y 33277. Las OMV de P.

gingivalis W83 indujeron mayores niveles de esta citocina cuando se compara con las OMV

de P. gingivalis 33277. Estos resultados son similares cuando se bloquean las Lys-

gingipaínas de vesículas. Cuando se bloqueó el LPS derivado de OMV se aumentan los

niveles de IL-1β significativamente con respecto a las células sin estímulo y al estímulo sin

bloqueo, pero menor que los niveles inducidos cuando se bloquean las gingipaínas (Figura

8).

En cuanto a la producción de TNF-α, contario a los resultados observados con IL-1β

(Figura 8), cuando se bloquearon las Arg-gingipaínas de vesículas se observó una

disminución significativa en los niveles de TNF-α con respecto a las células sin estímulo y

los estímulos sin inhibición. Sin embargo, en los lisados celulares y bacterias, el bloqueo

Capítulo 3 41

de esta gingipaína no afecto los niveles de TNF-α como ocurrió con las vesículas. Las

OMV sin bloqueo de P. gingivalis W83 fueron las que indujeron mayores niveles de TNF-

α cuando se compara con las OMV de P. gingivalis 33277. Cuando se bloquean las Lys-

gingipaínas de vesículas aumentan significativamente los niveles de TNF-α comparado

con el bloqueo de Arg-gingipaínas. Sin embargo, estos niveles disminuyen con respecto al

estímulo sin bloqueo. Cuando se bloqueó el LPS se disminuyen los niveles de TNF-α

respectivamente con respecto a las células sin estímulo en los primeros 30 minutos y esta

disminución fue mayor que cuando se bloquearon las gingipaínas (Figura 9).

En la figura 10, se muestran los resultados de los niveles solubles de IL-6 en macrófagos

estimulados con lisado, bacteria y OMV de P. gingivalis pre-tratados con KYT-1, KYT-36 o

PMXB, aquí se puede observar que las OMV de P. gingivalis W83 con boqueo de Arg-

gingipaínas indujeron mayores niveles de IL-6. Estos resultados son similares cuando se

bloquean las Lys-gingipaínas de vesículas a los 30 minutos (2268 pg/mL; 356 pg/mL) y a

las 6 horas (2756 pg/mL; 1407 pg/mL) respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y

33277. Cuando se bloqueó el LPS se disminuyó significativamente el nivel de IL-6 en los

primeros 30 minutos (184 pg/mL; 268 pg/mL) con respecto al estímulo sin bloqueo y el

bloqueo de gingipaínas.

Figura 8.Niveles de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-1β sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).

*p<0,05 ANOVA Factorial

Capítulo 3 43

Figura 9. Niveles de TNF-α en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de TNF-α sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).



macrófagos humanos

Figura 10.Niveles de IL-6 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-6

sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-6 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).


En cuanto a la inducción de quimiocinas tras el bloqueo de las gingipaínas y el LPS, se

pudo apreciar que las vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y 33277 que,

cuando se bloquearon las Arg-gingipaínas de vesículas se observó un aumento en los

niveles de esta quimiocina con respecto a las células sin estímulo y los estímulos sin

inhibición a los 30 minutos (1283 pg/mL; 1257 pg/mL). Sin embargo, se disminuyó a las 6

horas (517 pg/mL; 1000 pg/mL) respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y 33277.

Las OMV de P. gingivalis W83 con boqueo de Arg-gingipaínas indujeron mayores niveles

de IL-8 en los primeros 30 minutos comparado con las células sin estímulo y los estímulos

sin bloqueo. Cuando se bloquean las Lys-gingipaínas de vesículas a los 30 minutos

aumenta IL-8 (1584 pg/mL; 3690 pg/mL) y a las 6 horas disminuye (559 pg/mL; 786 pg/mL)

respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y 33277. Las OMV de P. gingivalis 33277

con boqueo de Lys-gingipaínas indujeron mayores niveles de IL-8 en los primeros 30

minutos comparado con las células sin estímulo y los estímulos sin bloqueo. Cuando se

bloqueó el LPS derivado de OMV los resultados son comprables con lo encontrado cuando

se bloquea Arg-gingipaínas y Lys-gingipaínas (Figura 11).

Por otra parte, los niveles de MCP-1, cuando se bloquean las Arg-gingipaínas de vesículas

se aumentan a los 30 minutos para P. gingivalis W83 (1249 pg/mL) mientras que después

del estímulo con vesículas de P. gingivalis 33277 en los primeros 30 minutos esta

quimiocinas estuvo con niveles inferiores a células sin estímulo e indujeron un aumento

significativo en los niveles de MCP-1 a las 6 horas (2756 pg/mL). Cuando se bloquean las

Lys-gingipaínas de vesículas se aumentan los niveles de MCP-1 (1472 pg/mL; 1620

pg/mL) a los 30 minutos significativamente con respecto a las células sin estímulo, al

estímulo sin bloqueo y al bloqueo de Arg-gingipaínas, estos niveles disminuyen a las 6

horas (847 pg/mL; 898 pg/mL). El bloqueo del LPS derivado de vesículas resulta en el

aumento en los niveles de MCP-1 significativamente a los 30 minutos (2385 pg/mL; 1385

pg/mL) y a las 6 horas (1100 pg/mL; 1219 pg/mL) respectivamente. Las vesículas de P.

gingivalis W83 a los 30 minutos inducen niveles mayores de MCP-1 (2385 pg/mL) que la

bacteria viva (1804 pg/mL) y que el lisado (1418 pg/mL). Cuando se bloquean las OMV de

P. gingivalis 33277, también se aumentan los niveles de esta quimiocinas comparado con

la bacteria viva y los lisados. Sin embargo, la bacteria viva reduce los niveles de MCP-1 2

,45 veces con respecto a los niveles producidos por las células sin estimulo (Figura 12).


macrófagos humanos

Para la quimiocina RANTES, el bloqueo de las Arg-gingipaínas de vesículas induce un

aumento en los niveles de esta quimiocina con respecto a las células sin estímulo y los

estímulos sin inhibición a los 30 minutos (2271 pg/mL; 2374 pg/mL). Sin embargo, esta

quimiocina se disminuyó a las 6 horas (1721 pg/mL; 1680 pg/mL) comparada con el

bloqueo a 30 minutos respectivamente para OMV de P. gingivalis W83 y 33277. Cuando

se bloquean las Lys-gingipaínas de vesículas de P. gingivalis W83 a los 30 minutos

aumenta RANTES (1584 pg/mL) significativamente con respecto a las células sin estímulo

y a los estímulos sin inhibición a los 30 minutos. El evento contrario ocurre con P. gingivalis

33277 en el cual se inhibió por completo la producción de esta quimiocina. A las 6 horas

aumenta RANTES (1695 pg/mL; 1525 pg/mL) respectivamente para OMV de P. gingivalis

W83 y 33277, estos resultados son similares entre lisado y vesícula, sin embargo, difieren

de la respuesta del macrófago a la bacteria viva, en la cual en la mayoría de los casos se

inhibió esta quimiocina. Cuando se bloqueó el LPS derivado de OMV a los 30 minutos

hubo una disminución significativa de los niveles de RANTES (0 pg/mL; 67 pg/mL), este

resultado fue consistente a las 6 horas para bacteria viva, mientras que los lisados (1963

pg/mL; 1805) y vesículas (1543 pg/mL; 1606 pg/mL) aumentaron significativamente esta

quimiocina con respecto a las células sin estímulo y los estímulos a los 30 minutos.

Por último, la concentración de MIP-1α se aumentó al bloquear las Arg-gingipaínas de

vesículas a los 30 minutos (1774 pg/mL; 1738) un valor que es significativamente mayor

comparado con las células sin estímulo (1540 pg/mL). A las 6 horas los niveles de esta

quimiocinas se restablecieron a valores similares al producido por las células sin estímulo

(Datos no mostrados)

Figura 11.Niveles de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).



macrófagos humanos

Figura 12.Niveles de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).


Capítulo 3 49

Figura 13. Niveles de RANTES en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C: niveles de RANTES sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).


3.8 Niveles de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados

Se determinó la cinética de expresión de ARNm de las citocinas proinflamatorias (IL-1 β,

TNFα, IL-6) y quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α) en macrófagos-U937

estimulados con lisado, bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 a los 30 minutos,

2 horas, 6 horas y 24 horas.

Las vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 inducen un aumento en la

expresión de ARNm de IL-1β a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas, siendo el pico

más alto de expresión a las 2 horas de estímulo con vesículas y esta inducción fue mayor

cuando los macrófagos fueron estimulados con OMV que con lisados celulares. Las OMV

de P. gingivalis 33277 indujeron un leve aumento en los niveles de ARNm a los 30 minutos

de estímulo comparado con las células sin estímulo, pero los niveles de ARNm en los

macrófagos estimulados con vesículas de P. gingivalis 33277 disminuyeron a las 2 horas

y 6 horas de estímulo mayor que las células sin estímulo (Figura 14A).

Además, las OMV de P. gingivalis W83 y 33277 reprimen significativamente la expresión

de ARNm de MCP-1 a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas de estímulo comparado

con las células sin estímulo. La bacteria viva de P. gingivalis W83 por el contrario aumentan

significativamente de los niveles de ARNm a las 2 horas post-estimulo, mientras que P.

gingivalis 33277 tiene este efecto a los 30 minutos de estímulo; en los tiempos posteriores

los niveles de ARNm para MCP-1 son inferiores a las células sin estímulo (Figura 14B). La

expresión de IL8 post-estimulo con OMV de P. gingivalis W83 y 33277 se ve reprimida a

los 30 minutos de estímulo. A las 2 horas hay un aumento en la expresión de esta

quimiocina comparado con las células sin estímulo; la expresión de IL8 se mantiene

reprimida con OMV de P. gingivalis 33277 a las 2 horas, 6 horas y 24 horas con respecto

a las células sin estímulo. Las OMV de P. gingivalis inhiben la expresión de IL-8 en

macrófago manera similar a los lisados celulares y este comportamiento es diferente

cuando los macrófagos son estimulados con bacteria viva, la bacteria viva a las dos horas

induce un aumento en la expresión de ARNm de IL-8 mayor que las células sin estímulo,

lisados y vesículas, siendo P. gingivalis 33277 la bacteria que induce aumento en

expresión de IL-8 en todos los tiempos evaluados (Figura 14C).

La expresión de ARNm para las citocinas proinflamatorias IL-6 y TNFα, así como para las

quimiocinas RANTES y MIP-1α no fue detectado en macrófagos estimulados con lisado,

bacteria o vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24

horas. Excepto P. gingivalis W83 que indujo un aumento significativo de ARNm a los 30

minutos de estímulo con bacteria viva.

Figura 14. Expresión relativa de ARNm en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 durante 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A). IL-1β; B). MCP-1; C) IL8.


3.9 Efecto de la inhibición de Rgp, Kgp y LPS sobre la expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados

Se determinó el efecto de la Inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas y LPS de lisado,

bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 sobre la expresión de ARNm de citocinas

proinflamatorias (IL-1 β, TNFα, IL-6) y quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α) en

macrófagos–U937 estimulados por 30 minutos y 6 horas.

Con relación a la citocina IL-1 β, cuando se bloquean las Arg-gingipaínas se aumentan

significativamente la expresión de esta citocina en macrófagos estimulados con OMV de

las dos cepas durante los primeros 30 minutos. Las OMV de P. gingivalis 33277 inducen

los mayores niveles de ARNm para IL-1β comparado con las células sin estímulo, los

estímulos sin bloqueo y las vesículas de P. gingivalis W83. Contrariamente a las 6 horas,

la expresión de IL-1β está completamente reprimida.

En los macrófagos estimulados con OMV pre-tratadas con inhibidor de Lys-gingipaínas a

los 30 minutos y 6 horas, se reprime la expresión de ARNm para IL-1β tanto en OMV de

P. gingivalis W83 y 33277. Este efecto es similar entre lisados y OMV y difiere del efecto

inducido por la bacteria viva. El tratamiento con PMXB reprime la expresión de IL-1β en

los macrófagos estimulados durante los primeros 30 minutos. Sin embargo, a las 6 horas

estas OMV inducen un aumento en la expresión de IL-1β mayor a las células sin estímulo

y a los estímulos pre tratados por 30 minutos.

La expresión relativa de ARNm para IL-8 aumenta cuando los macrófagos son estimulados

con OMV de P. gingivalis W83 pre-tratadas con KYT-1 durante los primeros 30 minutos y

este efecto, es mayor al inducido por bacteria viva y lisado. Para P. gingivalis 33277 en los

primeros 30 minutos también se induce un aumento en la expresión de IL-8 en los

macrófagos, sin embargo, es inferior al inducido por lisado o bacteria viva e inferior al efecto

de las vesículas de P. gingivalis W83. A las 6 horas de estímulo con lisado, bacteria o

vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 la expresión de esta citocina está completamente

reprimido. Cuando se bloquean las Lys-gingipaínas se ve un efecto contrario, macrófagos

estimulados con OMV pre tratadas con KYT-36 (inhibidor de Lys-gingipaínas) en los

primeros 30 minutos se reprime la expresión de IL-8 tanto en OMV de P. gingivalis W83 y

Capítulo 3 53

33277. A las 6 horas se aumentan los niveles de expresión de cuando los macrófagos son

estimulados con OMV de P. gingivalis W83 mientras que se mantiene reprimido cuando

son estimulados con OMV de P. gingivalis 33277. El estímulo de macrófagos con lisado,

bacteria o vesículas pre tratados con PMXB se induce una represión en la expresión similar

a cuando se bloquean las Lys-gingipaínas (figura 16).

Por otra parte, la expresión de MCP-1, cuando se bloquean las Arg-gingipaínas aumenta

significativamente en macrófagos estimulados con OMV de P. gingivalis W83 y 33277

durante los primeros 30 minutos. Las OMV de P. gingivalis 33277 inducen mayor expresión

de esta quimiocina comparado con las células sin estímulo, los estímulos sin bloqueo y las

vesículas de P. gingivalis W83 con bloqueo de Arg-gingipaína. A las 6 horas de estímulo

de los macrófagos con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 pre

tratados KYT-1 la expresión de MCP-1 está completamente reprimida. Los macrófagos

estimulados con OMV pre tratadas con KYT-36 o PMXB a los 30 minutos y 6 horas,

reprimen la expresión de MCP-1 tanto en OMV de P. gingivalis W83 y 33277 (figura 17).

La expresión de ARNm para las citocinas proinflamatorias IL-6 y TNF-α, así como para las

quimiocinas RANTES y MIP-1α no fue detectado en las células sin estímulo ni en los

macrófagos estimulados con lisado, bacteria o vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 pre

tratados con KYT-1, KYT-36 y PMXB a los 30 minutos ni a las 6 horas. Este efecto se

mantiene cuando se bloquean Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas o LPS (datos no

mostrados).

Figura 15.Expresión relativa de ARNm de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-1β sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-1β sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-1β sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).


Capítulo 3 55

Figura 16. Expresión relativa de ARNm de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-8 sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-8 sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-8 sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).



macrófagos humanos

Figura 17. Expresión relativa de ARNm de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de MCP-1 sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de MCP-1 sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de MCP-1 sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).


4 Discusión

La persistencia crónica de P. gingivalis en el periodonto está determinada por su habilidad

para evadir la inmunidad del hospedador sin inhibir por completo la respuesta inmune

inflamatoria general, necesaria para la adquisición de nutrientes esenciales para la

supervivencia y multiplicación bacteriana. En este estudio se demostró que las OMV de P.

gingivalis tienen la capacidad de modular la respuesta inmune inflamatoria y quimiotáctica

de macrófagos humanos por eventos dependientes de proteólisis mediada por gingipaínas.

También se demostró que existe una inducción diferencial de la respuesta inmune del

macrófago cuando es estimulado con vesículas comparado con bacteria viva y esta

respuesta adicionalmente varía cuando los macrófagos son estimulados con dos cepas

distintitas de P. gingivalis.

Diferentes estudios han reportado las características diferenciales entre P. gingivalis W83

y 33277, lo cual que hace razonable los resultados encontrados en este trabajo. Las cepas

de P. gingivalis se dividen en cepas virulentas (P. gingivalis W83) y menos virulentas (P.

gingivalis 33277) (68), en función de sus tipos de fimbrias (20, 69), antígeno capsular (69-

71), capacidad invasiva (71,72), proteolítica y colagenolítica (72), capacidad de evadir

fagocitosis (71, 72), su hidrofobicidad (72), entre otras. En este estudio se pudo confirmar

que las dos cepas evaluadas presentan un comportamiento diferente en su tasa de

multiplicación por lo que es fundamental asegurar que en los experimentos in vitro con

cepas diferentes esto no afecte los resultados como se logró para este estudio. Estas

bacterias estructuralmente, fisiológicamente y metabólicamente son diferentes. La cepa de

P. gingivalis ATCC 33277 ha sido ampliamente utilizada para la identificación de las

características fisiopatológicas del microorganismo (68), así como para estudios de

invasión, cambios de la respuesta inmune, entre otros. Sin embargo, es importante tener

en cuenta que los resultados obtenidos en modelos de infección in vivo e in vitro frente a

cepas de P. gingivalis varían en función de la naturaleza de la cepa evaluada.


macrófagos humanos

Además, en este trabajo se pudo determinar que P. gingivalis 33277 tiene mayor actividad

Arg-gingipaína cuando se compara con P. gingivalis W83, aunque en el pre-inóculo se

estabilizó en número de bacterias y la actividad Arg-gingipaína para las dos bacterias, sin

embargo, este evento no ocurre a las 48 horas de crecimiento, cuando el recuento

bacteriano de P. gingivalis 33277 es inferior a P. gingivalis W83. A pesar de este protocolo

de control de las bacterias, la actividad proteasa fue mayor, requiriendo tan solo 0,0046

µg/µL de proteína total para ser detectada con CAAM; mientras que para detectar actividad

Arg-gingipaína en P. gingivalis W83 se requiere tener 0,02 µg/µL, 4,23 veces más proteína

que la requerida para P. gingivalis 33277. Estos resultados son sustentados con lo

reportado por otros autores (20, 37), quienes confirman que existe un perfil diferencial de

proteínas entre P. gingivalis W83 y 33277 siendo más abundantes las Arg-gingipaínas en

OMV de P. gingivalis 33277 que en W83 (20). Aunque se conoce que, para ambas cepas,

estas son las proteínas que se encuentran en mayor abundancia en las vesículas (45,

12,73).

Sorprendentemente, cuando se determinó el límite de detección de actividad Arg-

gingipaína en las vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 la actividad Arg-gingipaína fue

mayor para las OMV de P. gingivalis W83. Este resultado pudo estar influenciado por la

tasa de crecimiento más rápida de esta cepa comparada con P. gingivalis 33277. Debido

a que la expresión de las gingipaínas se autorregula, con una mayor concentración de

gingipaínas estas mismas se auto degradan. Se ha reportado también la capacidad que

estas tienen para degradar los inhibidores de proteasas in vivo e in vitro, probablemente

este sea un punto crítico en la medición de estas proteasas (36, 37, 74).

Los macrófagos desempeñan un papel importante en la regulación de la respuesta

inflamatoria del hospedador, en parte a través de su capacidad para secretar mediadores,

(particularmente citocinas), en respuesta a microorganismos y productos microbianos,

ellos constituyen una importante fuente células recuperadas de los tejidos gingivales,

particularmente los tejidos inflamados, de pacientes con periodontitis. Estos macrófagos

desempeñan un papel esencial en el desarrollo y la progresión de periodontitis (75). Por

ello son considerados un modelo celular importante para diferentes estudios in vitro que

evalúan la patogenicidad de P. gingivalis y sus componentes celulares como las OMV.

Capítulo 4 59

Se realizó una evaluación de producción de citocinas y quimiocinas en macrófagos-U937,

en experimentos independientes a los 30 minutos, 2 horas, 6 horas y 24 horas, la cual

permitió establecer los tiempos de estímulo utilizados para los experimentos de inhibición

de gingipaínas y LPS. A los 30 minutos y dos horas de estímulo no hubo diferencias

estadísticamente significativas para la mayoría de citocinas y quimiocinas así mismo

ocurrió con 6 horas y 24 horas. Por esta razón se establecieron los tiempos de 30 minutos

y 6 horas para evaluar el efecto de la inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-gingipaínas y LPS

derivado de vesículas, lisados y bacteria sobre la estimulación de macrófagos. Sin

embargo, la expresión de ARNm de citocinas y quimiocinas no fue comparable con los

niveles solubles de las proteínas. Estos datos han sido también reportados en otros

estudios en donde se ha demostrado que la actividad proteolítica de P. gingivalis atenúa

la expresión de ARNm y producción de citocinas y quimiocinas de las células del

hospedador (76).

Las OMV de P. gingivalis estimularon significativamente la secreción de IL-1β, IL-6, TNF-

α y RANTES e indujeron niveles de estas citocinas proinflamatorias y quimiocinas de

manera similar a los lisados, mientras los macrófagos censaron diferencialmente a la

bacteria viva. Estos resultados son comparables con lo reportado por otros autores (77,

56) quienes confirman que las OMV de P. gingivalis inducen aumentos en los niveles de

TNF-α e IL- β de manera dosis dependiente (56). Se ha reportado que las infecciones

agudas implican un reto de las células inmunes frente a bacterias vivas, mientras que las

infecciones crónicas implican una combinación de bacterias vivas y sus subproductos, es

por ello razonable que células de la respuesta inmune como macrófagos sean estimulados

diferencialmente por la bacteria viva o sus componentes como OMV y lisados. Esto ha sido

sustentado por otros autores (56, 76,77), quienes describen que las células son

estimuladas con bacteria viva pueden ser representativas de una respuesta aguda de la

enfermedad; mientras que el estímulo de las células con productos estructurales y

secretados de la bacteria podrían representar una respuesta crónica, lo cual puede estar

asociado con vías inmunitarias centrales, desencadenadas independientemente de los

estímulos específicos e indispensables para montar una respuesta inmune apropiada (77).

Estudios como el realizado por Zhou et al, 2005 sustentan que, el LPS y las fimbrias

mayores (FimA) de P. gingivalis inducen un perfil similar de expresión de citocinas en

macrófagos peritoneales de ratón, pero que este perfil difiere significativamente en

respuesta a P. gingivalis viva. En ese trabajo los macrófagos fueron estimulados para


macrófagos humanos

producir IL-6, factor estimulante de colonias de granulocitos y linfotactina por P. gingivalis

viva, pero este efecto no fue observado cuando las células fueron estimuladas con LPS o

fimbrias. Por otra parte, RANTES, interferón gamma, IL -17, VCAM-1 y el factor de

crecimiento endotelial vascular fueron inducidos por LPS o FimA, pero no por P. gingivalis

viva (75). De la misma manera, en este estudio se logró establecer que las vesículas y el

lisado estimulan significativamente la producción de la quimiocina RANTES mientras que

la bacteria viva es incapaz de inducirla. Esto puede ser argumentado desde lo propuesto

por Zhou et al., quienes indican que la respuesta diferencial P. gingivalis viva y a sus

componentes celulares sugieren que la bacteria y sus componentes desempeñan

diferentes roles frente a la respuesta aguda y crónica desencadenada por P. gingivalis

(75). Es comprensible además pensar que no es conveniente para la bacteria atraer

proteínas quimiotácticas que conducirán al reclutamiento de células inmunes y a la

eliminación de la bacteria.

Los niveles de IL-8, MCP-1 y MIP-1α fueron no inducidos por las OMV de P. gingivalis. Se

ha reportado que las gingipaínas de la bacteria, pueden convertir inicialmente IL-8 (77

residuos de aminoácidos) en una especie más potente truncada en el extremo amino,

seguida de la degradación lenta y destrucción de la actividad biológica de la quimiocina.

Por el contrario, las mismas enzimas cuando se asocian con vesículas, degradan al

instante esta quimiocina. Esta división de la actividad potenciadora e inactivadora entre las

gingipaínas solubles y ligadas a la membrana puede causar la compartimentalización de

las reacciones pro y anti-inflamatorias a posiciones distales y proximales de la placa

bacteriana, respectivamente, que puede explicar por qué, a pesar de la acumulación

masiva de neutrófilos en los sitios de periodontitis, no hay eliminación de la infección (78).

Adicionalmente, las OMV de P. gingivalis reprimieron los niveles de MCP-1 y MIP-1α, a los


estimulados con bacteria viva. La bacteria viva reprime significativamente más los niveles

de MCP-1 que las células sin estímulo y los lisados y vesículas. Choi et al, (2014)

demostraron que la producción MCP-1 era sustancialmente suprimida por altas dosis de

P. gingivalis y este efecto se demostró también a nivel de ARNm. Cuando estimularon

macrófagos-THP-1 con una cepa de P. gingivalis mutante para gingipaínas, se aumentó

significativamente la expresión de ARNm de MCP-1 (76).

Capítulo 4 61

Con el fin de determinar la función principal de las gingipaínas y el LPS, considerados

abundantes en las vesículas, se evaluó el efecto de la Inhibición de Arg-gingipaínas, Lys-

gingipaínas (usando los péptidos sintéticos KYT-1 y KYT-36 respectivamente) y LPS de

Lisado, bacteria y vesículas de P. gingivalis W83 y 33277 sobre la estimulación de

macrófagos-U937 y los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-1 β, TNFα, IL-6) y

quimiocinas (IL-8, RANTES, MCP-1, MIP-1α). El bloqueo de gingipaínas más que el

bloqueo de LPS condujo a un aumento significativo de los niveles de todas las citocinas

proinflamatorias y quimiocinas evaluadas y estos datos son comparables con la expresión

de ARNm para IL-1β, IL-8, MCP-1. Lo anterior explica el papel de las gingipaínas derivadas

de OMV sobre los cambios en la respuesta inmune de macrófagos humanos y estos

resultados aportan a la evidencia que, P. gingivalis utiliza las gingipaínas que son el

principal componente de las vesículas y mecanismo a distancia para modular la respuesta

inmune, incluso se ha propuesto que las vesículas inducen tolerancia en las células de la

respuesta inmune a la infección con P. gingivalis viva, favoreciendo de esta forma el

mantenimiento y supervivencia de la bacteria y por consiguiente la cronicidad de la

periodontitis (56).

Estos datos son consistentes con lo reportado por Barth et al., 2016 quienes estimularon

células HUVEC con P. gingivalis. La estimulación con cepas de P. gingivalis 381 o 33277

dio como resultado la detección de IL-8, IL-6 y MCP-1 a niveles de proteína similares al

control sin estímulo o niveles reducidos. El pre-tratamiento de cepas bacterianas con el

inhibidor de Rgp (KYT-1) aumentó significativamente la concentración de IL-8 y MCP-1,

mientras que la inhibición de Kgp con KYT-36 indujo un aumento en las concentraciones

de todas las citocinas probadas, lo que implica que P. gingivalis utiliza tanto Rgp como Kgp

para degradar estas citocinas (79).

La degradación selectiva de citocinas, complemento, moléculas de adhesión celular,

correceptores o vías de señalización, han sido descritas como mecanismos que conducen

a la desregulación de la respuesta inmune por P. gingivalis. Estos estudios destacan un

papel significativo de las gingipaínas en la alteración de la inmunidad innata y sugieren que

la desregulación de la señalización de las células del hospedador puede ser un factor

crítico en muchas de estas estrategias de evasión (79). Las gingipaínas degradan

directamente citocinas, pero también se ha descrito que pueden degradar receptores y co-

receptores celulares, así como también proteínas intracelulares importantes en vías de

señalización necesarias para la activación y/o secreción de mediadores inflamatorios. El


macrófagos humanos

factor nuclear-kappaB (NFκB) y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) son

componentes críticos de la inmunidad innata que orquestan respuestas inmunes

apropiadas para controlar y erradicar patógenos (79), su activación da como resultado la

inducción de mediadores proinflamatorios, como el TNFα, una potente molécula bioactiva

comúnmente secretada por células inflamatorias. P. gingivalis altera la respuesta de las

células hospedadoras a través de la degradación proteolítica de quinasas intracelulares

esenciales para la inmunidad innata. Principalmente se ha reportado de degradación

selectiva del receptor que interactúa con la proteína quinasa-1 (RIPK1), factor de

crecimiento transformante beta activado por cinasa 1 (TAK1) y AKT necesarias para la

señalización paracrina de TNFα (79). Lo que hace razonable los niveles de TNFα

detectados en este estudio. Así mismo, se ha descrito que P. gingivalis causa atenuación

de la vía de señalización de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) / Akt, y este efecto está

fuertemente asociado con la actividad de las gingipaínas. Los efectos proteolíticos de las

gingipaínas desempeñan un papel esencial en la disfunción de PI3K y los cambios en la

vía de señalización Akt durante la infección por P. gingivalis (80).

Las vesículas han cobrado importancia en la patogenia de P. gingivalis y su persistencia

en enfermedad periodontal no solo por la capacidad que tienen de transportar factores de

virulencia propios de la célula parental, si no, porque son usadas por P. gingivalis como

una estrategia adicional de evasión de la respuesta inmune, adquisición de nutrientes y

mecanismo de virulencia a distancia. Estas vesículas se han propuesto como centinelas,

que entran en contacto con las células de la respuesta inmune mucho antes que la bacteria

y con un contacto más cercano favoreciendo hipo-respuesta de las células a la infección

bacteriana (56). Esta disminución de la respuesta de las citocinas puede llevar a una

reducción de la capacidad para eliminar la infección y la transición a la inflamación crónica

que se observa en la periodontitis (81). Lo anterior se ha atribuido a las gingipaínas de esta

bacteria, por lo cual es razonable pensar que las OMV, por tener principalmente estas

proteasas ancladas a la superficie y como contenido luminal mayoritario, las convierte en

una de las estrategias más sofisticadas de P. gingivalis para la evasión de la respuesta

inmune mediada por eventos proteolíticos dependientes de gingipaínas.

5 Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

1. P. gingivalis W83 y 33277 tienen una tasa de crecimiento, metabolismo y recuentos

bacterianos distintos, por ello las concentraciones deben ser ajustadas para que el

recuento sea comparable, lo cual es muy importante cuando se desea comparar

los efectos inducidos por diferentes cepas en modelos in vivo e in vitro.

2. Las vesículas de P. gingivalis W83 indujeron mayor respuesta de los macrófagos,

lo que se correlaciona con la virulencia de esta bacteria comparada con P. gingivalis

33277.

3. El bloqueo de las gingipaínas, más que el bloqueo del LPS derivado de OMV

favoreció la sobreexpresión de citocinas y quimiocinas.

4. Las OMV de P. gingivalis tienen la capacidad inducir cambios en la respuesta

inmune inflamatoria y quimiotáctica de macrófagos humanos por eventos

dependientes de gingipaínas, de manera significativamente mayor que la bacteria

viva lo cual podría favorecer el estado crónico característico de la enfermedad

periodontal.

5.2 Recomendaciones

En este estudio se determinaron los niveles de citocinas solubles y ARNm en

macrófagos-U937. Sin embargo, la evaluación de la proteína y ARN se realizó a las

24 horas después de retirado el estímulo en todos los tiempos evaluados. Lo

anterior permitió determinar la persistencia de la respuesta del macrófago a cada

estímulo, pero no se conoce la respuesta inmediata. Por lo anterior para estudios

posteriores sería muy importante evaluar los niveles de la proteína y de ARNm

inmediatamente transcurrido el tiempo de estímulo para poder comparar la

respuesta inmediata del macrófago y la persistencia en la respuesta.

64 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios

inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis

en macrófagos humanos

Con el fin de determinar el efecto del DMSO como vehículo usado para disolver los

inhibidores KYT-1 y KYT-36, controles internos fueron usados estimulando

macrófagos solo con el vehículo y se pudo observar que, a la concentración usada,

el DMSO no causó ningún efecto en la célula y el comportamiento de los

macrófagos fue similar al encontrado cuando solamente fueron tratados con medio

de cultivo. Sin embargo, en este estudio no se incluyó un control de estimulación

de las células solo con los inhibidores KYT-1, KYT-36 o PMXB, lo cual sería muy

importante para corroborar que el efecto observado es directamente a causa de

bloqueo de los factores de virulencia y no de los inhibidores.

Se hace necesario confirmar los eventos de proteólisis de citocinas mediadas por

gingipaínas derivadas de vesículas en un modelo experimental que evalué la

estimulación de macrófagos y la presencia de citocinas intracelulares como

mecanismos de evidencia de activación de la célula y degradación de las proteínas

secretadas al medio extracelular.

Evaluar citocinas reguladoras que permitan determinar el efecto modulador de la

respuesta inmune inducida por vesículas de membrana externa de P. gingivalis en

macrófagos humanos.

Evaluar un modelo celular con macrófagos aislados de pacientes con periodontitis

y comparar los resultados con los encontrados en este trabajo para comprobar si

la respuesta es similar.

5.3 Perspectivas

Este estudio permitirá abrir perspectivas de trabajos enfocados a fortalecer el

entendimiento la patogenia de las OMV de P. gingivalis no solo en la enfermedad

periodontal sino también en enfermedades sistémicas relacionadas con la periodontitis,

como artritis reumatoide, enfermedad cardiovascular o resultados adversos en el

embarazo. Dentro de la línea de microbiología oral, sería muy importante evaluar la función

de las vesículas en la formación de un modelo de biofilm oral multiespecies in vitro y poder

comparar el efecto de estas vesículas con las de otras bacterias normales y patógenas de

interés oral.

Bibliografía 65

En un futuro para emprender investigaciones similares a las de este trabajo, es muy

importante determinar sí, los receptores intracelulares como los Receptores similares a

NOD (NLR) y Receptores similares a RIG-I (RLR) son activados por las vesículas una vez

estas son internalizadas en la célula hospedadora y que vías de señalización celular se

ven activadas o reprimidas por la invasión de vesículas.

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Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores