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EVALUACION DE LA ATENUACIÓN NATURAL DE HIDROCARBUROS DEL PETRÓLEO UTILIZADOS COMO
SUPRESORES DE POLVO EN CARRETERAS SIN PAVIMENTAR
Carolina Maldonado Mendoza
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Bogotá, Agosto 2003
EVALUACION DE LA ATENUACIÓN NATURAL DE HIDROCARBUROS DEL PETRÓLEO UTILIZADOS COMO
SUPRESORES DE POLVO EN CARRETERAS SIN PAVIMENTAR
Carolina Maldonado Mendoza
Trabajo de grado como requisito parcial para optar al título de Biología y Microbiología
Director Fabio A. Roldan Ph.D
Co-director Martha J. Vives, Candidata Ph.D
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Bogotá, Agosto 2003
Agradecimientos
A Fabio Roldán, Claudia Guevara y todas las personas de la Unidad de
Saneamiento y Biotecnología Ambiental por su ayuda y colaboración para la
realización de este trabajo.
A mi papá Guillermo Maldonado y mi mamá Bertha Mendoza que durante toda
mi vida me han apoyado y guiado.
A Carlos A. Borda, por su compañía y paciencia.
I
TABLA DE CONTENIDO
Página
Lista de tablas IV
Lista de figuras V
INTRODUCCION 1
1. JUSTIFICACION 3
2. OBJETIVOS 4
2.1. Objetivo general 4
2.2. Objetivos específicos 4
3. MARCO TEORICO 5
3.1. Supresores de polvo 5
3.2. Atenuación natural (AN) 6
3.2.1. Procesos químicos de atenuación natural 7
3.2.2. Procesos físicos de atenuación natural 7
3.2.3. Procesos biológicos de atenuación 8
3.3. Evaluación de atenuación natural (MAN) 9
3.3.1. Condiciones ambientales 10
3.3.1.1. Temperatura 10
3.3.1.2. Humedad 11
3.3.1.3. Nutrientes 11
3.3.2. Hidrocarburos del petróleo 11
3.3.3. Biodegradación de hidrocarburos 13
3.3.4. Recuento de microorganismos heterótrofos totales 14
3.3.5. Recuento de microorganismos degradadores de
Hidrocarburos 15
3.3.5.1. Identificación molecular 15
II
3.3.5.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 17
3.3.5.3. Secuenciación y análisis bioinformático 17
4. METODOLOGIA 19
4.1. Descripción del estudio 21
4.1.1. Diseño experimental in situ 21
4.1.2. Diseño experimental de columnas 24
4.1.2.1. Ensamblaje de las columnas 25
4.1.2.2. Montaje de las columnas en el laboratorio 26
4.2. Análisis del suelo 27
4.3. Análisis fisicoquímicos de las muestras de suelo 28
4.3.1. pH 28
4.3.2. Humedad 28
4.3.3. Hidrocarburos totales del petróleo (TPH) in situ 28
4.4. Nutrientes 29
4.4.1. Nitrógeno 29
4.4.1.1. Amonio 30
4.4.1.2. Nitrato 30
4.4.2. Fósforo 30
4.5. Análisis de las contra-muestras 31
4.6. Análisis microbiológicos 32
4.6.1. Recuento de microorganismo heterótrofos totales 32
4.6.2. Recuento de microorganismos degradadores de
Hidrocarburos 32
4.6.3. Recuperación de microorganismos degradadores 34
4.6.4. Identificación molecular 35
4.6.4.1. Extracción de ADN 36
4.6.4.2. Amplificación del 16S ADN ribosomal 36
4.6.4.3. Purificación y secuenciación del ADN amplificado 37
4.6.4.4. Análisis bioinformático de la secuenciación 37
4.7. Análisis de las muestras de agua en el lixiviado 38
III
4.7.1. pH 38
4.7.2. Hidrocarburos totales del petróleo 38
4.7.3. Nutrientes 38
4.7.3.1. Amonio 39
4.7.3.2. Fósforo 39
4.8. Análisis estadístico de los resultados 39
5. RESULTADOS Y DISCUSION 41
5.1. Análisis de suelos 41
5.2. Análisis fisicoquímicos de las muestras de suelo 42
5.2.1. pH 42
5.2.2. Humedad 44
5.2.3. Hidrocarburos totales del petróleo (TPH) in situ 46
5.2.4. Tasa de atenuación natural in situ 50
5.3. Nutrientes 51
5.4. Análisis de contra-muestra 54
5.5. Análisis microbiológicos 54
5.5.1. Recuento de microorganismos heterótrofos totales 54
5.5.2. Recuento de microorganismo degradadores de
Hidrocarburos 56
5.5.3. Recuperación de microorganismos degradadores 63
5.5.4. Identificación molecular 65
5.6. Análisis de las muestras de lixiviado en las columnas 69
5.6.1. pH 69
5.6.2. Hidrocarburos totales del petróleo 70
5.6.3. Nutrientes 71
5.7. Correlaciones 73
6. CONCLUSIONES 77
BIBLIOGRAFÍA 79
Anexos 90
IV
LISTA DE TABLAS
Pagina Tabla 1. Evaluación de los tratamientos y controles en las columnas del laboratorio. 25 Tabla 2. Reactivos y condiciones de la PCR para la amplificación del 16S ADNr. 36 Tabla 3. Análisis de granulometría y clase textural del suelo de la carretera estudiada. 41 Tabla 4. Porcentaje de humedad en las columnas durante el estudio. 45 Tabla 5. Concentración de TPH in situ en las diferentes profundidades durante el estudio. 47 Tabla 6. Análisis de referencia de los parámetros fisicoquímicos evaluados. 54 Tabla 7. Descripción morfológica macro y microscópica de las 19 bacterias seleccionadas para la identificación molecular. 64 Tabla 8. Identificación molecular de las 19 bacterias degradadoras de HCs 67 Tabla 9. Concentraciones de TPH en el agua de lixiviado durante el estudio. 71
V
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Principales etapas del PCR. 18 Figura 2. Esquema general del estudio. 20 Figura 3. Vista inicial de la carretera utilizada para el estudio in situ. 21 Figura 4. Carretera utilizada para el estudio. 22 Figura 5. Cuadrante seleccionado y marcaje de la cuadriculas seleccionadas para la toma de sub-muestras. 23 Figura 6. Homogenización y recolección de las submuestras. 23 Figura 7. Ensamblaje de las columnas utilizadas durante el estudio. 26 Figura 8 Montaje de las columnas en el laboratorio. 27 Figura 9. Técnica de número más probable para microorganismos degradadores de HC’s. 33 Figura 10. Lectura del NMP dos días después de la adición de INT. 34 Figura 11. Crecimiento selectivo de bacterias degradadoras de HCs. 35 Figura 12. Valores de pH de las muestras de suelo in situ durante el estudio. 42 Figura 13. Valores de pH de suelo en las columnas. 43 Figura 14. Porcentaje de humedad durante el estudio in situ. 44 Figura 15. Porcentaje de humedad de las columnas durante el estudio. 45 Figura 16. Concentración de TPH in situ durante el estudio. 47 Figura 17. Concentración de nutrientes in situ durante el estudio. 53 Figura 18. Recuento de microorganismos heterótrofos de HCs in situ. 55
VI
Figura 19. Recuento de microorganismos heterótrofos en las columnas durante el estudio. 56 Figura 20. Recuento de microorganismos degradadores de HC in situ. 57 Figura 21. Recuento de microorganismo heterótrofos y degradadores de HCs durante el estudio in situ. 57 Figura 22. Relación de degradadores:heterótrofos in situ. 59 Figura 23. Recuento de microorganismos degradadores en las columnas durante el estudio. 59 Figura 24. Recuento de microorganismos heterótrofos y degradadores de HCs en las columnas durante el estudio. 60 Figura 25. Relación de degradadores:heterótrofos en el suelo del estudio en columnas. 61 Figura 26. Aislamiento de las bacterias degradadoras en agar Bushnell-Hass. 65 Figura 27. Valores de pH determinados en el agua de lixiviado. 70 Figura 28. Valores de las concentraciones de nutrientes en el agua de lixiviado. 72 Figura 29. Correlación de microorganismos degradadores, concentración de TPH y nutrientes in situ. 74
1
INTRODUCCION
Los supresores de polvo son sustancias utilizadas para el mantenimiento y
estabilización de carreteras no pavimentadas, existen muchas clases de
sustancias que pueden ser usadas como supresores (p.e., agua, MgCl2, resinas o
hidrocarburos). Sin embargo, algunos de estos compuestos pueden deteriorar el
suelo o contaminar aguas tanto superficiales como subterráneas. Durante el
mantenimiento de carreteras es necesario controlar que el supresor utilizado no
afecte o contamine zonas cercanas o alrededores, que no produzca ningún
lixiviado tóxico y finalmente que no sean empleados en temporada de lluvias para
evitar el lavado del supresor.
En Colombia se utilizan lodos aceitosos (provenientes de la extracción y
almacenamiento del petróleo) como supresores de polvo para el mantenimiento de
carreteras. Sin embargo, el destino final de los hidrocarburos (HCs) provenientes
de estos lodos en suelos todavía no es conocido. Una aproximación para evaluar
el impacto de los hidrocarburos (HCs) sobre los ambientes es la evaluación de la
atenuación natural (AN), la cual comprende una serie de procesos físicos,
químicos y biológicos. Entre los procesos físicos se encuentran la lixiviación, la
escorrentía, la adsorción o absorción en la matriz del suelo. Los procesos
químicos comprenden la degradación por luz ultravioleta, inmovilización química y
procesos de oxido-reducción. Finalmente entre los procesos biológicos, la
biodegradación esta dada por la actividad metabólica de los microorganismos
capaces de mineralizar compuestos, y la fitorremediación como la inmovilización o
asimilación de HCs por plantas. La evaluación de la AN permite determinar los
posibles impactos y la persistencia de los HCs en el medio ambiente.
2
Durante el presente estudio se evaluaron los procesos de biodegradación y
lixiviación como parte de la AN de HCs del petróleo utilizados como supresores de
polvo para el mantenimiento de las carreteras sin pavimentar. Para determinar la
biodegradación se evaluaron algunas de las condiciones ambientales que influyen
en la biodegradación (pH, humedad y nutrientes) y la degradación de HCs. Se
evaluaron las poblaciones de heterótrofos totales y la de los microorganismos
degradadores de HCs presentes en el suelo. Finalmente, para la evaluación de la
lixiviación se realizó un montaje de columnas en el laboratorio, evaluando
diferentes caudales sobre la degradación de HCs.
El proyecto fue desarrollado en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología
ambiental en el Departamento de Biología de la Pontificia Universidad Javeriana y
con la financiación de una industria del sector petrolero.
3
1. JUSTIFICACION
Los estudios realizados sobre la degradación de HC’s en suelos de
Colombia son bastante escasos y son menos los realizados sobre AN de HC’s en
ambientes terrestres. La mayoría de estudios se han enfocado en ecosistemas
marinos o acuáticos subterráneos debido a su alto impacto a corto plazo en la
salud humana (EPA, 1998; Koren et al., 2003). Sin embargo, la importancia de
ampliar el conocimiento sobre el destino de los HC’s en ambientes terrestres
radica en el aumento de la posibilidad de que estos lleguen a aguas subterráneas
o reservorios hídricos (humedales, nacimientos de ríos, etc). Los estudios
realizados en Colombia se basan en la biodegradación de HCs del petróleo por
medio de la bioestimulación (Castañeda, 1997), o en la identificación de bacterias
degradadoras de HCs bajo condiciones controladas (laboratorio) (Vives, 1994;
Rincon, 1997).
En Colombia se están utilizando lodos de fondos de tanque de
almacenamiento como supresores de polvo para el mantenimiento de carreteras
sin pavimentar. Generalmente esta práctica no es evaluada ni se conoce su
impacto a corto, mediano y largo plazo, por este motivo en este estudio se evaluó
el proceso de AN en las carreteras donde se han adicionado lodos de fondo de
tanque de almacenamiento de petróleo. Como parte de los procesos evaluados
están la actividad degradadora de HC’s de microorganismos nativos, como un
proceso biológico y la lixiviación que se presenta en la columna de suelo, como un
proceso físico.
4
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Evaluar la atenuación natural de HC’s de petróleo utilizados como
supresores de polvo en carreras sin pavimentar.
2.2 Objetivos específicos
• Evaluar el proceso de biodegradación como parte de la atenuación natural
realizando un seguimiento en la reducción de TPH y cuantificando los
microorganismos degradadores de HC’s.
• Aislar e identificar molecularmente los microorganismos nativos
degradadores de HCs.
• Evaluar el proceso de lixiviación como un factor significativo en la reducción
de los HCs en las carreteras por medio de diferentes caudales sobre la
columna de suelo.
• Evaluar la degradación de HCs bajo condiciones de laboratorio usando
columnas y compararlas con la degradación in situ.
5
3. MARCO TEORICO
3.1 Supresores de polvo
Los supresores de polvo (p.e., agua, lodos de hidrocarburos de fondo de
tanque, MgCl2 o aceites usados) son sustancias que pueden ser utilizadas para el
mantenimiento de carreteras no pavimentadas (Environmental Protection Service,
EPS; Environmental Protection Agency, EPA) (EPA, 1997; EPS, 1998b; EPA,
2002). Las partículas de polvo producidas en las carreteras pueden generar daños
a la vegetación disminuyendo la absorción de luz y transpiración en las hojas.
Adicionalmente, pueden producir problemas respiratorios (p.e., as ma, bronquitis,
alergias, etc). Los cuerpos de agua cercanos a las carreteras pueden verse
afectados con la sedimentación de partículas de polvo en su fondo interfiriendo
con los ciclos normales de nutrientes, así como la acumulación en la superficie
interfiriendo con la entrada de luz (EPS, 1998b; EPA, 2002).
La cantidad de supresor utilizado depende de las características de la
carretera donde se aplique (p.e., condiciones hidrológicas del suelo y composición
física), controlando la cantidad adicionada del supresor sin exceder la capacidad
de carga de la carretera (máxima cantidad de agua que puede soportar antes de
inundarse) (Margalef, 1983; EPA, 2002). Los supresores de polvo varían en su
composición, existen supresores de agua dulce, los cuales humedecen el área
aumentando la masa y haciéndola más compacta, las ventajas del agua como
supresor radica en su bajo costo, su disponibilidad y fácil aplicación (EPA, 1997;
EPA, 2002). Sin embargo, la necesidad de aplicaciones continuas en épocas de
poca lluvia puede causar erosión, o fraccionamiento de la vía. Otra opción es el
agua de mar, la cual puede ser utilizada como supresor ya que contiene cloruro de
6
magnesio (MgCl2), que ayuda a retener el agua aumentando el tiempo de
humedad en las partículas de la carretera (EPA, 2002). Aunque el agua de mar
funciona un poco mejor que el agua dulce es necesario estar cerca de regiones
costeras y puede llevar a la erosión así como a la corrosión de metales causado
por las altas concentraciones de MgCl2 acumuladas en el suelo (EPA, 2002).
Las resinas, aceites y productos provenientes de la refinanción del petróleo
son compuestos químicos que pueden ser utilizados como supresores de polvo
para el mantenimiento de carreteras (EPA, 2002). Estos productos son altamente
adhesivos que forman una capa en la superficie del suelo y debido a su
hidrofobicidad al secarse mantienen una barrera resistente al agua.
Sin embargo, algunas fracciones de HCs del petróleo como los HCs
aromáticos (BTEX y PAH’s) son altamente carcinogénicos y solubles en agua
corriendo el riesgo de permanecer por largos periodos de tiempo en aguas
subterráneas (EPS, 1998b; EPA, 1999b; WDNR, 1999; EPA, 2002). El uso sin
control de derivados de petróleo como supresores de polvo puede ser peligroso y
es necesario tener en cuenta aspectos de seguridad como: a) presencia de un
cuerpo de agua en la cercanía, b) presencia de ambientes muy sensibles como
ciénagas, humedales o zonas inundables (EPS, 1998b), c) volatización de algunos
compuestos de menor peso molecular presentes en los supresores, y d) transporte
a aguas subterráneas (EPA, 2002).
3.2 Atenuación natural (AN)
La atenuación natural (AN) comprende una gran variedad de procesos
físicos, químicos y biológicos que bajo las condiciones ambientales, reducen la
masa, toxicidad, movilidad, volumen y concentración de un contaminante en el
medio ambiente (Atlas y Bartha, 1987; EPA, 1996; Alexander, 1999; EPA, 1999a;
7
Margesin y Schinner, 2001; Van Hamme et al., 2003). Estos procesos incluyen la
lixiviación, dispersión, dilución, volatilización, absorción, adsorción, degradación
por UV, estabilización química o biológica, y la biodegradación (Atlas y Bartha,
1987; Madsen, 1997; EPA, 1999a; EPA, 1999b; WDNR, 1999; Lee et al., 2001).
3.2.1 Procesos químicos de atenuación natural
La oxidación consiste en la combinación química de los HC’s con el O2 que
lleva a la oxidación de algunas fracciones de HC’s, siendo uno de los principales
procesos químicos que ocurren en la AN (Gaudy y Gaudy, 1980). Los HC’s que
son afectados por este proceso son los de menor peso molecular y su tasa de
degradación depende del área afectada y las fracciones predominantes de HCs
(Ramírez y Viña, 1998).
La degradación por luz ultravioleta (UV) es la oxidación fotoquímica y es
uno de los factores más importantes para que ocurra una degradación efectiva
(mineralización completa) (Ramírez y Viña, 1998; EPA, 1999b).
3.2.2 Procesos físicos de atenuación natural
La escorrentía es el proceso por el cual los HC’s son transportados sobre
las superficies del área afectada, y pueden llegar a cuerpos de agua superficiales
(ríos o lagunas) (Margalef, 1983). La lixiviación es el lavado de la matriz del suelo
por el efecto de las lluvias . En este caso se presenta un transporte de HC’s a
aguas subterráneas diluyendo la concentración en el suelo, transfiriendo los HC’s
y movilizándolos de la matriz del suelo (Margalef, 1983; Ramírez y Viña, 1998;
WDNR, 1999).
8
Por medio de la adsorción los HC’s se pueden retener en las superficies de
las partículas del suelo (p.e., arena, materia orgánica, arcilla), disminuyendo el
movimiento de estos, de tal forma que el contaminante no llegue a aguas
subterráneas (EPA, 1999a).
La evaporación es un proceso donde las corrientes de aire volatilizan los
HC’s de peso molecular más bajo reduciendo su concentración. Paralelamente los
vapores producidos pueden ser más fácilmente degradados por microorganismos
(EPA, 1999a), casi el 50% de los HC’s más tóxicos se pierden en el ambiente por
este proceso quedando las fracciones de alto peso molecular (Townsend et al.,
2000).
3.2.3 Procesos biológicos de atenuación natural
La biorremediación es el resultado de la utilización biológica de HC’s debido
al metabolismo de los organismos. Un proceso importante es la biodegradación, la
cual está determinada por la actividad metabólica de los microorganismos de
utilizar los HCs como fuente de energía y carbono obteniendo compuestos menos
complejos y tóxicos (Leahy y Colwell, 1990; Shuttleworth y Cerniglia, 1997;
Ramírez y Viña, 1998; Kao y Wang, 2001). El objetivo final de la biodegradación
es llegar a la completa mineralización de los HCs con la producción de biomasa
(agua y dióxido de carbono o metano) (EPA, 1999a; WDNR, 1999) .
La tasa de biodegradación de HCs depende de la interacción de los
factores en el ambiente (temperatura, humedad, disponibilidad de nutrientes y tipo
de suelo), número y clase de microorganismos presentes, estructura química de
los HCs y la bio-disponibilidad de estos para los microorganismos (Atlas y Bartha,
1987; Shuttleworth y Cerniglia, 1997; Weisman, 1998; Roldán, 2002). Así mismo la
tasa de biodegradación está en gran parte determinada por las condiciones
9
aeróbicas o anaeróbicas (presencia de O2 como aceptor de electrones AE). La
biodegradación bajo condiciones anaeróbicas se presenta un poco más lenta que
la observada en condiciones aeróbicas, utilizando como AE compuestos como el
nitrato (NO3-), sulfato (SO4
-2) o hierro (Fe+3) (Koizumi et al., 2002; Roldán, 2002).
3.3 Evaluación de atenuación natural
La evaluación de los procesos de AN (MAN) requieren un conocimiento
detallado del área de estudio (p.e., hidrología, geología, etc), las condiciones que
están asociadas con la actividad microbiana (p.e., presencia de AE, donadores de
electrones (DE), nutrientes, pH, humedad y temperatura), y el efecto de cualquier
otro proceso que pueda estar reduciendo los HC’s en el ambiente (EPA, 1998;
EPS, 1998a; EPA, 1999b). El MAN se entiende como la evaluación de los
procesos naturales que actúan sobre áreas contaminadas (EPA, 1998; EPA,
1999a; EPA, 1999b; WDNR, 1999).
Para aceptar el MAN como un método efectivo de remediación este debe
ser comparable en cuanto a su eficiencia de mineralización (costos, tiempo) con
otras técnicas de remediación activas (remoción mecánica, biopilas, lavado,
biorreactores, bioaumentación) las cuales son mucho más costosas pero más
rápidas (EPS, 1998a; EPA, 1999a; EPA, 1999b; WDNR, 1999).
Para poder evaluar la contribución de la AN en la reducción de HC’s en el
ambiente, es necesario realizar investigaciones detalladas de los componentes
asociados a la actividad microbiana, el origen y clase de la contaminación (EPA,
1999a). Evaluar y entender los procesos de atenuación natural para poder
predecir los resultados a largo plazo (alteraciones en la toxicidad del HC o
transporte en la matriz del suelo) (EPA, 1999b).
10
Durante el MAN se puede realizar un seguimiento de la reducción en la
concentración de HCs en el área contaminada a través del tiempo. La evaluación
puede llevarse a cabo determinando la desaparición de los compuestos iniciales,
la formación de subproductos, disminución de AEs, o la producción de dióxido de
carbono dependiendo de factores como disponibilidad de equipos y tipo de la
muestra (Shuttleworth y Cerniglia, 1997) .
Un componente importante en el MAN es el proceso de biodegradación,
usualmente determinada en laboratorio por medio de muestras de suelo de áreas
contaminadas y utilizadas para confirmar, demostrar e investigar los cambios
químicos y de poblaciones de microorganismos a través de la degradación de los
contaminantes (Madsen, 1997; Townsend et al., 2000).
3.3.1 Condiciones ambientales
La biodegradación es uno de los mecanismos principales de la AN y por
este motivo es indispensable tener en cuenta las condiciones ambientales
apropiadas para que la actividad de los microorganismos degradadores sea la
mejor (Atlas y Bartha, 1987; Leahy y Colwell, 1990; Vives, 1994; Castañeda, 1997;
Alexander, 1999).
3.3.1.1 Temperatura
La actividad enzimática de los microorganismos depende directamente de
las fluctuaciones de la temperatura o el efecto Q10 (por el aumento en 10 grados
centígrados la actividad metabólica se duplica), esta actividad suele estar
representada por una gráfica de distribución normal en donde los microorganismos
tiene una temperatura óptima de metabolismo pero a una mayor o menor
11
temperatura su actividad disminuye (Atlas y Bartha, 1987; Leahy y Colwell, 1990;
Vives, 1994; Castañeda, 1997; WDNR, 1999; Van Hamme et al., 2003).
3.3.1.2 Humedad
La humedad es un factor determinante para la biodegradación de HC’s ya
que el agua disponible determina el crecimiento y metabolismo microbiano,
además de la disponibilidad de HCs para los microorganismos. Sin embargo, un
exceso en la presencia de esta puede llevar a alteraciones en los AE (Atlas y
Bartha, 1987; Leahy y Colwell, 1990; Vives, 1994; Castañeda, 1997; Van Hamme
et al., 2003).
3.3.1.3 Nutrientes
Los nutrientes disponibles y en la relación adecuada son determinantes en
el proceso de biodegradación, usualmente las relaciones que se deben tener en
cuenta para los nutrientes C:N:P son 100:10:1 (Margesin y Schinner, 1997;
Cunningham y Philp, 2000; Margesin y Schinner, 2001; Van Hamme et al., 2003).
Las principales formas preferidas para los microorganismos de asimilar el
nitrógeno son el amonio (NH4+) o nitrato (NO3
-) y para el fósforo la forma preferida
es el fosfato (PO4-3) (Atlas y Bartha, 1987; Alexander, 1999). La concentración de
los nutrientes determina la utilización de carbono obtenido a partir de los HC’s y
su degradación (Dibble y Bartha, 1979; Castañeda, 1997; Van Hamme et al.,
2003).
3.3.2 Hidrocarburos del petróleo
En el proceso de extracción y almacenamiento del petróleo se obtienen
grandes volúmenes de lodos. La fuente principal de estos lodos son los fondos de
12
tanques de almacenamiento, separadores de agua-crudo, y piscinas de oxidación
(Deuel y Holliday, 1994). La composición de estos lodos depende del origen, el
almacenamiento y tratamiento, usualmente las proporciones de agua, HC’s y
sólidos minerales (arena) son 1:1:1 (Dibble y Bartha, 1979). Estos lodos contienen
fracciones de alto peso molecular por lo que la biodegradación puede ser una
buena opción para el tratamiento de estos residuos. Otra forma de tratamiento es
la creación de piscinas de oxidación basándose en la capacidad anaeróbica
degradadora de los microorganismos. Sin embargo, esta práctica tiene una alta
probabilidad de contaminar aguas subterráneas y presenta una degradación más
lenta (Dibble y Bartha, 1979). Otra opción de manejo de los lodos es su utilización
en el mantenimiento de carreteras, pero bajo condiciones controladas.
La determinación de los hidrocarburos totales del petróleo (TPH) se utiliza
para describir el conjunto de compuestos químicos que provienen del petróleo, ya
que este tiene una composición hetereogénea y muchas veces no es práctico
realizar mediciones de cada compuesto por separado (Potter y Simmons, 1998;
Weisman, 1998; http://www.atsdr.cdc.gov/tfacts123.html, 2003). La composición
de los TPH varia pero en general está compuesto de carbono (83-87%), hidrógeno
(10-14%), nitrógeno (0.1-2%), oxígeno (0.05-1.5%), sulfuro (0.05-6%), y algunos
metales como vanadio, hierro, cobre entre otros (menos del 0.1%) (Speight, 1991;
Potter y Simmons, 1998; http://www.epa.gov/ORD/SITE/TPHsoil.htm, 2003). No
obstante la composición química de los TPH puede cambiar a través del tiempo
debido al efecto de weathering (efecto del medio ambiente sobre la concentración
de las HC’s en las primeras 72 horas) (Speight, 1991; Weisman, 1998; Roldán,
2002).
Los TPH están definidos por al técnica analítica utilizada. Son la cantidad
extraíble y medible del petróleo basado en los HC’s presentes en la muestra. Sin
embargo, la presencia de TPH no es un indicador directo del riesgo de toxicidad
por ciertas fracciones de HCs (Weisman, 1998; Roldán, 2002), por lo que esta
13
medida no puede ser utilizada para identificar la toxicidad para los organismos
vivos . La concentración de los TPH se usa para determinar si existe algún riesgo
potencial, estudiar la severidad del problema (concentración de HC’s) y determinar
un proceso adecuado para la remediación (Weisman, 1998).
Los métodos para determinar la concentración de TPH en suelos
recomendado por la EPA son por infrarrojo, gravimétrico o por cromatografía de
gases. La técnica por IR ha sido ampliamente utilizada debido a su bajo costo, la
rapidez y facilidad con la que se puede llevar a cabo el análisis.
3.3.3 Biodegradación de hidrocarburos
Los microorganismos degradadores de HC’s están presentes en casi todos
los ambientes, debido a la amplia distribución de estos microorganismos
generalmente se elimina la necesidad de adicionar microorganismos para obtener
una biodegradación en algún ambiente contaminado (EPA, 1999a; Margesin et al.,
2003a).
La susceptibilidad a la degradación de HC’s varía con el tipo y el tamaño de
la molécula. Los alcanos de cadenas cortas aunque son altamente tóxicos se
evaporan rápidamente en el ambiente, los n-alcanos (C10-C14) son degradados
más rápidamente y alcanos de cadena muy larga son proporcionalmente más
difíciles de biodegradar (Atlas y Bartha, 1987; Weisman, 1998). En general las
ramificaciones en las moléculas de los HCs presentan una menor biodegradación,
como los compuestos aromáticos y los alicíclicos (Gaudy y Gaudy, 1980; Atlas y
Bartha, 1987; Madsen, 1997; Potter y Simmons, 1998; Weisman, 1998; EPA,
1999a; EPA, 1999b; Lee et al., 2001).
14
Los principales componentes del petróleo como las fracciones alifáticas y
aromáticas pueden llegar a ser completamente degradados si las condiciones
ambientales necesarias están presentes (p.e., temperatura, nutrientes, AE,
humedad, etc). En el caso de los HCs alifáticos volátiles quedan solo cadenas
cortas mucho más fáciles de degradar. Algunos compuestos aromáticos como los
PAH, son altamente solubles en agua y permanecen en la matriz del suelo
llegando a ser altamente persistentes y presentan el riesgo de llegar a aguas
subterráneas (Atlas y Bartha, 1987; Potter y Simmons, 1998; EPA, 1999b; Kao y
Wang, 2001; Kim et al., 2002; Sedran et al., 2002).
3.3.4 Recuento de microorganismos heterótrofos totales
Existen metodologías para el muestreo y aislamiento de microorganismos
del suelo directas e indirectas; las primeras son en las que se utilizan técnicas de
conteo directo y las segundas se hacen diluciones en placa o número más
probable (NMP) (Elsas y Smalla, 1997). Los métodos indirectos usan la dilución de
la muestra y su posterior conteo en sustratos líquidos o sólidos especiales para el
crecimiento de microorganismos. Aunque en esta técnica sólo se pueden contar
microorganismos cultivables es la más utilizada, subestimando la población total
de microorganismos presentes en la matriz del suelo. En los conteos en
microcosmos sólo se recuperan microorganismos capaces de soportar las
condiciones de incubación, medio de cultivo y la competencia (Elsas y Smalla,
1997; Ogram y Feng, 1997).
Las técnicas de aislamiento e identificación de microorganismos
degradadores de HC’s van desde el us o de medios enriquecidos hasta el uso de
técnicas de biología molecular in situ (McInerney y Sublette, 1997; Shuttleworth y
Cerniglia, 1997).
15
3.3.5 Recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos
La técnica del número más probable (NMP) puede ser utilizada para
determinar la densidad de microorganismos degradadores de HCs. Por medio de
esta técnica se obtienen resultados consistentes para realizar aproximaciones a la
dinámica de poblaciones microbianas en suelos contaminados (Brown y Braddock,
1990; Long et al., 1995; Wrenn y Venosa, 1996) y con substratos insolubles (p.e.,
HC’s) (Brown & Braddock, 1990; Haines et al., 1996).
Con la técnica del NMP existen diferentes formas de ver la actividad
metabólica de los microorganismos (p.e., C14 radiactivo, indicadores de
respiración, o simplemente la turbidez en las diluciones). El uso de un competidor
con el AE como lo es cloruro de yodotetrazolium (INT), que actúa como indicador
de respiración facilita la realización de esta técnica con substratos insolubles. El
INT compite por el O2 en la cadena de electrones que al reducirse produce
formazán (insoluble) y se visualiza con la presencia de un color o precipitado rojo
(Haines et al., 1996; Wrenn y Venosa, 1996).
3.3.5.1 Identificación molecular
En estudios de AN es importante la identificación de los microorganismos
que intervienen durante la biodegradación, debido al posible uso de los
microorganismos en procesos biotecnológicos. Se han realizado estudios sobre el
aislamiento y la caracterización molecular de comunidades bacterianas y sus
respuestas a los HC’s en diferentes ambientes (Atlas y Bartha, 1973; Atlas, 1978;
Long et al., 1995; Rooney-Varga et al., 1997; Margesin y Schinner, 2001; Abed et
al., 2002; Espitia, 2002; Margesin et al., 2003a; Calvaca et al., 2004; Chao y Hsu,
2004; Evans et al., 2004) . Con la utilización de técnicas moleculares,
especialmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han identificado
los genes funcionales (plásmido TOL para la degradación de tolueno, genes alk
16
para la degradación de alcanos) en los procesos de degradación de HC’s (Haigler
y Spain, 1991; Rooney-Varga et al., 1997; Whyte et al., 1997; Torsvik et al., 1998;
Abed et al., 2002; Koizumi et al., 2002; Koma et al., 2003; Moody et al., 2004;
Shinoda et al., 2004).
La subunidad 16S ribosomal en procariotes es una región del ADN
altamente conservada a través de l tiempo evolutivo y es útil como indicador
filogenético específico en microorganismos aislados de diferentes ambientes.
Algunas regiones de la subunidad 16S o 23S tiene una baja variabilidad, las
cuales son esenciales para la identificación de relaciones filogenéticas (grupos)
(Audesirk y Audesirk, 1996; Geiselbrecht et al., 1996; Ogram y Feng, 1997; Song
et al., 2000). Con la utilización de la secuencia del ADN que codifica la subunidad
16S ribosomal se ha estudiado la ecología de las comunidades en ambientes
contaminados con HCs (Geiselbrecht et al., 1996; Macnaughton et al., 1999;
Kaplan y Kitts, 2004).
Para caracterizar la subunidad 16s rRNA, existen varios métodos entre ellos
la secuenciación del ADN que codifica para esta subunidad. El ADN se obtiene y
aísla a partir de colonias previamente seleccionadas, utilizando cebadores
específicos conocidos para la subunidad 16s y llevando a cabo una amplificación
por PCR. Los tamaños obtenidos en los productos amplificados dependen de los
cebadores seleccionados, los cuales usualmente oscilan entre 1–1.5 kbp. Los
productos amplificados, luego son separados y visualizados por electroforesis en
gel de agarosa determinando si la banda observada pertenece al peso esperado
(Ogram y Feng, 1997), Una vez obtenido el producto amplificado este puede ser
secuenciado.
17
3.3.5.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La técnica del PCR consiste en la amplificación de una región específica de
ADN, su principio radica en una denaturación de la doble hélice de ADN, una
alineación de un cebador y una extensión dada por la presencia de una
polimerasa para crear un aumento de un fragmento específico de ADN que se
encuentra entre dos regiones de una secuencia específica (Sambrook et al., 1989;
Eeles, 1993; Elliot y Elliot, 1997) (Figura1).
La denaturación consiste en la separación de la secuencia de ADN de doble
hélice, lograda por un rápido aumento en la temperatura (usualmente 94ºC) y un
rápido enfriamiento, esto último con el objetivo de inhibir la actividad de enzimas
denaturantes pero sin afectar a la Taq polimerasa. En el anillamiento el cebador
debe estar completamente unido al templado para que la Taq polimerasa se una al
extremo 3’ del cebador y permita el paso de elongación (Sambrook et al., 1989;
Eeles, 1993; Elliot y Elliot, 1997). Finalmente, en la elongación la temperatura es
ajustada para que la Taq polimerasa empiece a funcionar e incorpore nucleótidos
en la cadena complementaria de ADN; produciendo una copia en la región
específica del primer anillado (Eeles, 1993).
3.3.5.3 Secuenciación y análisis bio-informático
Una vez amplificado el 16S ADN ribosomal, se realiza la secuenciación del
fragmento obtenido. A partir de las secuencias obtenidas (forward y reverse) se
pueden comparar con bases de datos determinando el género y en algunos casos
la especie (Herrick et al., 1993; Geiselbrecht et al., 1996; Koizumi et al., 2002).
18
Figura 1. Principales etapas de PCR. Fuente: Madigan et al., 1997.
Una de las bases de datos más ampliamente usadas es la del GenBank, en
donde se publican todas las secuencias de nucleótidos y proteínas con soporte
bibliográfico (Benson et al., 2000). Esta base de datos esta distribuída y mantenida
por NCBI (Nacional Centre of Biotechnology Information). La NCBI ofrece
programas de búsqueda tipo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Donde
se realiza una búsqueda de similitudes en BLASTn (comparando nucleótidos con
nucleótidos) usando una matriz de identidades. En los resultados se obtienen
alineamientos de las cadenas agrupados. Cada alineamiento está acompañado de
un puntaje y una medida de significancia estadística llamado el valor E
(expectation), lo que ayuda a juzgar la calidad del alineamiento (Wheeler, 1995;
Altschul et al., 1997; Wheeler et al., 2000).
Paso 1: Denaturación
Paso 2: Anillaje
Paso 3: Elongación
19
4. METODOLOGIA
El estudio se llevó a cabo en un campo petrolero en los llanos orientales de
Colombia durante los meses de agosto-diciembre del año 2003. Con el objetivo de
evaluar la degradación de HCs utilizados como supresores de polvo en el
mantenimiento de carreteras , se estudió el proceso de biodegradación y
lixiviación.
Se desarrolló un estudio simultáneo in situ y en columnas mantenidas en el
laboratorio. In situ se deseaba observar el proceso de biodegradación y en
laboratorio principalmente, el proceso de lixiviación. Las muestras que se
evaluaron in situ durante el estudio, así como el montaje de laboratorio procedían
de la misma carretera del campo petrolero.
Los parámetros analizados durante el estudio fueron fisicoquímicos: pH
humedad y TPH. Nutrientes: amonio, nitrato y fósforo, como factores que
estimulan la biodegradación. Y parámetros microbiológicos: recuento de
heterótrofos totales y degradadores de HCs, con una posterior identificación
molecular de estos últimos. Adicionalmente en las columnas en laboratorio se
evaluó el proceso de lixiviación de TPH y nutrientes (amonio fósforo) (Figura 2).
20
Figura 2. Esquema general del estudio.
Selección de la carretera
Evaluación in situ
Toma de muestras de suelo
Análisis de muestras de suelo
Análisis de lixiviado Fisicoquímicos Microbiológicos
Nutrientes
Nutrientes
Recuento heterótrofos
Recuento degradadores
HC’s
Simulación de precipitación
Toma de muestras de agua
pH TPH
Amonio, nitrato y fósforo
Aislamiento bacterias degradadoras
Amplificación y secuenciación de 16S ADN
Análisis bioinformático e identificación molecular
Montaje de columnas
Amonio y fósforo
pH humedad
TPH
Antes de la disposición de lodos
Disposición de lodos
Evaluación de lixiviación
21
4.1 Descripción del estudio
4.1.1 Diseño experimental in situ
El estudio se inició en el mes de agosto del año 2003 (finalización de
temporada húmeda) en un campo petrolero en los llanos orientales de Colombia.
Se seleccionó una carretera de composición arenosa utilizada para la disposición
de lodos (7 x 80 m) (Figura 3). Durante el estudio se realizaron cuatro eventos de
muestreo (EM) cada 40 días. Se seleccionaron 3 cuadrantes (6 x 20 m), divididos
en cuadrículas (1 x 1 m). Por cada cuadrante se tomaron dos muestras
compuestas (15 submuestras) a tres profundidades diferentes (5, 50 y 80 cm). Se
realizaron análisis fisicoquímicos (pH, humedad y TPH), nutrientes (amonio, nitrato
y fósforo) y microbiológicos (recuento de heterótrofos totales y degradadores).
Figura 3. Vista inicial de la carretera utilizada para el estudio in situ.
22
Para establecer las condiciones iniciales del área de estudio se realizó un
muestreo antes de la disposición de lodos (Figura 4). Se determinaron las
características iniciales del suelo (evaluando los mismos parámetros
fisicoquímicos, nutrientes y microbiológicos). Este muestreo inicial se realizó igual
que el planteado en el diseño experimental pero sólo tomando dos profundidades
(5 y 50 cm), debido a que no se esperaba que la adición de los lodos afectara
significativamente los parámetros evaluados en la profundidad de 80 cm.
Figura 4. Carretera utilizada para el estudio A) antes y B) después de la adición de los lodos.
Se utilizó un barreno para la toma de muestras, descontaminado con D-
limonene (solvente a base de aceite de cítricos). Las 15 sub-muestras (cuadrículas
marcadas con banderas de colores: azul y rojo) (figura 5) se recolectaron en
bandejas de aluminio y se homogenizaron sobre papel aluminio (Figura 6).
A) B)
23
Figura 5. Cuadrante seleccionado y marcaje de la cuadriculas seleccionadas.
La muestra de suelo (~250 g) compuesta para el análisis de TPH se colocó
en una bolsa resellable cubierta en su interior por papel aluminio (Ordoñez, 2003)
para evitar contacto con las superficies de plástico lo cual podría interferir en el
análisis (EPA, 1992; Gustafson et al., 1997) (Figura 6). Para los análisis físic o-
químicos, nutrientes y microbiológicos otra fracción de la muestra de suelo
compuesta (~250 g) se colocó en bolsa resellable plástica. Las bolsas fueron
cerradas evitando la presencia de aire y mantenidas a 4oC durante su transporte
hasta su análisis en Bogotá.
Figura 6. Homogenización y recolección de las submuestras.
24
4.1.2 Diseño experimental en columnas
Para evaluar el efecto de la precipitación sobre la lixiviación de HCs
presentes en la carretera se realizó un estudio utilizando columnas de suelo
durante 129 días (en el laboratorio y un control en campo). Las columnas fueron
tomadas de la carretera del área de estudio y llevadas al invernadero ~25 días
después a la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ).
Se realizaron cuatro EM cada ~40 días. Se evaluaron 4 tratamientos
(precipitaciones simuladas) , un control con suelo sin HCs y otro control mantenido
en campo. Los caudales elegidos para los tratamientos fueron tomados de la
precipitación observada en los años de 1999 a 2003.
El tratamiento A (TA) recibió la mayor precipitación que se observa en el
mes de julio (promedio de los años de 2000, 2001 y 2003). La precipitación para el
tratamiento B (TB) fue tomada del mes de octubre (promedio de los años 1999 y
2000). El tratamiento C (TC) recibió la menor precipitación observada en el mes de
agosto (tomada del año 2001). Finalmente se realizó el montaje de dos controles,
uno que se mantuvo en campo (CC) y otro donde el suelo utilizado no tenía
adición de HCs (CL) y con la misma precipitación simulada que para el tratamiento
TB (Tabla 1).
Para cada tratamiento se utilizaron dos unidades experimentales (UE),
para un total de 12 UE. Se tomó una muestra de lixiviado y suelo superficial por
EM. Para las muestras de suelo se realizaron los mismos análisis realizados a las
muestras in situ y para las muestras de lixiviado se realizaron los análisis
fisicoquímicos: pH y TPH, nutrientes: amonio y fósforo.
25
Tabla 1. Evaluación de los 4 tratamientos y controles en las columnas.
TRATAMIENTO DESCRIPCION CAUDAL (ml/día)
A Precipitación mayor 1000 B Precipitación media 666 C Precipitación menor 183 D Sin precipitación 0 CC Precipitación in situ ND CL Precipitación media 666
ND: no determinado
4.1.2.1 Ensamblaje de las columnas
Se utilizaron columnas de suelo que simularon las condiciones in situ de la
carretera manteniendo su estructura. Estas columnas de suelo fueron extraídas en
tubos de PVC (35 x 80 cm) (Figura 7A), por ser un material resistente y de fácil
transporte. Se realizaron cortes en forma de triangulo en un extremo de las
columnas y en el otro extremo se le realizaron perforaciones laterales para tener la
ayuda de una palanca (barra metálica) (~80 cm) con el fin de facilitar la inserción
de estas en el suelo (Figura 7B). Una vez se extrajo la columna de suelo en el
tubo de PVC, se selló en el extremo inferior con una malla en fibra de vidrio para
retener el suelo y dejar filtrar el lixiviado (Figura 7D). Luego se colocó una unión
con un embudo de aluminio (para la recolección del lixiviado) y con un tapón de
rosca. La parte superior de las columnas fueron selladas con una tapa de aluminio
y asegurada con cinta para impedir la salida del suelo durante su transporte hasta
Bogotá (Figura 7E).
26
Figura 7. Ensamblaje de las columnas de suelo utilizadas durante el estudio. A) columnas de 1 m con los cortes triangulares en la base, B) Introducción de las columnas en la carretera, C) corte de las columnas de PVC con la columna de suelo extraída, D) ensamblaje de la columna sobre la malla y tapón y E) sellado de las columnas para su transporte a Bogotá. 4.1.2.2 Montaje de las columnas en el laboratorio
Las columnas fueron colocadas en el invernadero de la PUJ (Figura 8A),
soportadas por una placa de cemento con orificios permitiendo la toma de
muestras de lixiviado (Figura 8C). El volumen de agua sobre cada columna se
reguló por un sistema de aspersión (Figura 8B). Para la recolección del lixiviado en
cada columna, se insertó dentro del tapón de rosca un frasco de vidrio (500 ml) el
cual se cambió en cada EM (Figura 8D).
A B
E C D
27
Figura 8. Montaje de las columnas en el laboratorio. A) montaje de las columnas en el invernadero, B) sistema de aspersión, C) montaje para la recolección del lixiviado y D) muestra de lixiviado.
4.2 Análisis del suelo
Se realizó una caracterización de la textura y granulometría del suelo de la
carretera de estudio, estos análisis se llevaron a cabo en el laboratorio de suelos
del Instituto Geográfico Agustin Codazzi (IGAC).
A B
C D
28
4.3 Análisis fisicoquímicos de las muestras de suelo
4.3.1 pH
El pH se determinó por medio del p/v 1:1 (9045C EPA, 1999). Se colocaron
~20 g de suelo en un vaso de precipitado con 20 ml de agua desionizada, se agitó
durante 5 min y se dejó decantar durante 1 h. Transcurrido este tiempo se midió el
pH con un pH-metro HACH con control de temperatura.
4.3.2 Humedad
La humedad relativa del las muestras de suelo, se determinó a partir de la
fracción de peso seco. Se pesaron ~10 g de la muestra de suelo en una bandeja
de aluminio (previamente pesada) y se secaron durante 12 h a 105ºC. La
diferencia del peso antes y después del suelo, descontando el peso de la bandeja,
permitieron obtener la fracción de peso seco (ps) (ecuación 1) (IGAC, 1979;
Roldán, 2002). El peso seco fue utilizado para la corrección de los resultados y su
posterior análisis. El porcentaje de humedad fue utilizado como parámetro
fisicoquímico durante el estudio (ecuación 2).
)(
)(secghumedopeso
gopesoPS = Ecuación 1
100)(
)(sec)(×
−=
ghumedopesogopesoghumedopeso
H Ecuación 2
4.3.3 Hidrocarburos totales del petróleo (TPH) in situ
Las muestras de suelo para el análisis de TPH se llevaron al laboratorio
analítico Prodycon S.A. La concentración de TPH se determinó por el método
29
infrarrojo (IR) (EPA 8440,1999), el cual se basa en medir la energía de
absorbancia de los enlaces C-H a una frecuencia de onda de 2950 cm-1. Este
resultado es reportado en concentración de mg TPH /kg peso seco.
4.4 Nutrientes
Como parte del programa de control de calidad se realizó la determinación
de precisión y exactitud de cada uno de los análisis y durante cada EM. Para
amonio (N-NH4+), se utilizó una solución estándar de 1 mg/L (a partir de una
solución de 1,000 mg/L) (Standard-Methods, 2000). Para nitrato (N-NO3-,) se
realizó una solución estándar con nitrato de potasio (KNO3, Carlo Erba) de 10
mg/L (a partir de una solución de 100 mg/L) (Standard-Methods, 2000). Para
fósforo 16.3 mg/L de P (a partir de una solución de 50 mg/L) (Standard-Methods,
2000).
La precisión y exactitud fueron estadísticamente comparados con los
valores reportados por HACH (1995). Los análisis de nutrientes se realizaron por
el método colorimétrico de HACH. Para N-NH4+ se utilizó el método 391 a 425 nm,
para N-NO3- 366 a 500 nm y para P 531 a 890. Las muestras de suelo en cada EM
(~20 g) se secaron durante toda la noche 60ºC, y se tamizaron para su posterior
análisis de nutrientes.
4.1.1 Nitrógeno
Para la extracción de amonio y nitrato se realizó una extracción acuosa
según HACH (1995) con el fin de extraer todas las formas de nitrógeno presentes
en la muestra. En esta extracción se tomó 3.5 cm3 de suelo, se adicionaron 25 ml
de agua desionizada y se agregaron 0.02 g de polvo de extracción para nitrato
(HACH). Se agitó durante 30 seg, obteniendo un extracto transparente, para su
posterior determinación de N-NH3+ y N-NO3
- (HACH-DREL/2000, 1995).
30
4.4.1.1 Amonio
Se realizó una determinación colorimétrica (HACH, 1995) de la
concentración de amonio presente en las muestras de suelo analizadas. Esta
determinación se basa en la reacción del reactivo de Nessler con los iones de
amonio presentes en la muestra. Se colocó 1 ml del extracto acuoso en una celda
con 25 ml de agua desionizada, se agregaron 5 gotas de la solución 1 de amonio
(HACH), se añadió 1 ml del reactivo de Nessler (HACH). Se mezcló y se dejó
reaccionar durante 1 min. El blanco se preparó con agua desionizada y se procesó
como una muestra (HACH-DREL/2000, 1995).
4.4.1.2 Nitrato
Se realizó una determinación colorimétrica (HACH, 1995), en el cual se
basa en la reducción del NO3- a NO2 por medio de la reacción de los iones de
NO3- con el cadmio. Una vez obtenido este compuesto, la reacción colorimétrica
sucede por la presencia de sulfamidas. Se colocó 1 ml del extracto acuoso
(también utilizado para la determinación de amonio) en una celda y se diluyó con
25 ml de agua desionizada, se adicionó el contenido de 1 sobre de NitraVer 6
(cadmio) (HACH), agitando vigorosamente durante 3 min reduciendo el. Luego de
2 min, se pasó cuidadosamente el sobrenadante a otra celda (sin transferir el
cadmio sedimentado). Se añadió un sobre de NitriVer 3 (sulfamida)(HACH) y se
agitó durante 30 s, el cual reacciona con el nitrito. El blanco se preparó con agua
desionizada (HACH-DREL/2000, 1995).
4.4.2 Fósforo
Se realizó una extracción con bicarbonato para la posterior determinación
de P. Durante esta extracción se realiza una conversión de todas las formas de
fósforo a orto-fosfato. Que luego por la reacción del ácido ascórbico con el
31
ortofosfato se determina colorimétricamente la concentración de fósforo (HACH,
1995). Para la extracción con bicarbonato se colocó 1 g de suelo en la botella de
extracción, se añadieron 20 ml de agua desionizada y 0.9 g de polvo de extracción
de bicarbonato (Nº 4) (HACH), se agitó durante 30 s y se esperó durante 10 min.
Se adicionaron 0.02 g polvo de extracción para nitrato y se agitó durante 30 s,
hasta observar que el extracto fuera transparente, para su posterior determinación
de fósforo.
La determinación de fósforo se realizó colocando 5 ml del extracto de
bicarbonato dentro de la celda y se aforó a 25 ml con agua desionizada. Se añadió
un sobre de PhosVer 4 (ác ido ascórbico)(HACH) sobre la celda (agitando
suavemente), el ácido reacciona con los iones de ortofosfato indicando
colorimétricamente la presencia de fósforo. El blanco se tomó del extracto,
compensando algún color o turbidez de la muestra (HACH-DREL/2000, 1995).
4.5 Análisis de contra-muestra
Como parte del control de calidad durante los análisis que se realizaron en
el laboratorio USBA se enviaron contra-muestras al laboratorio de suelos del
Instituto Geográfico Agustín Codazzi (IGAC). Los análisis realizados fueron pH
(KCl), nutrientes (carbono orgánico: Walkley-Black, amonio y nitrato: KCl y fósforo:
Bray II). Estas muestras permitieron comparar los resultados con los obtenidos
durante el estudio en USBA.
32
4.6 Análisis microbiológicos
4.6.1 Recuento de microorganismos heterótrofos totales
Para el recuento de heterótrofos totales se utilizó la técnica de recuento en
placa (Standard-Methods, 2000; Margesin y Schinner, 2001). Se pesó ~10 g de
muestra y se diluyó en 90 ml de agua bufferada estéril (Anexo 1). Se agitó durante
25 min a 150 rpm, para facilitar el desprendimiento de los microorganismos de la
matriz del suelo (Townsend et al., 2000). Se realizaron diluciones seriadas (10-2
hasta 10-7) y se colocaron 0.1 mL en superficie sobre cajas con Agar Infusión
Suelo (AIS, n=2) (Anexo 2). Las cajas se incubaron a temperatura ambiente y el
recuento de microorganismos heterótrofos totales se realizó a los días 7 (Margesin
et al., 2003a) .
4.6.2 Recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos
Para el recuento de microorganismos degradadores de HCs se utilizó la
técnica del NMP. El recuento por NMP se realizó en placas de 96 pozos. Se
colocaron 180 µl de medio Bushnell-Haas (B-H) (Anexo 3), 20 µl de cada una de
las diluciones, 10-4 hasta 10-7 utilizadas para el recuento de heterótrofos totales y
como fuente de carbono 5 µl ACPM, con 5 réplicas (Figura 9) (Brown y Braddock,
1990; Wrenn y Venosa, 1996). Las placas se incubaron durante 15 d, a
temperatura ambiente, en condiciones aerobias y cubiertas con plástico para evitar
la pérdida de HCs por volatilización (Haines et al., 1996).
Se evaluaron las diferencias en el montaje, manipulación y lectura de las
fuentes de carbono utilizadas: crudo (chichimene APIº16), lodos (utilizados para la
disposición en las carreteras) y ACPM.
33
Figura 9. Técnica de NMP para la cuantificación de microorganismos degradadores de HC’s.
Después de incubar las placas de 96 pozos (15 d) se añadió 50 µl de
cloruro de yodotetrazolium (INT) (Sigma) al 0.3% (Anexo 3) en cada uno de los
pozos. El INT compite con el aceptor de electrones (O2) en la cadena respiratoria,
donde la formación de un precipitado de color rojo o rosado indican la reducción
del INT a formazán insoluble indicando metabolismo aerobio activo (Haines et al.,
1996). La lectura se realizó a las 48 h de incubación a temperatura ambiente por
conteo de pozos positivos en cada dilución (Figura 10). La relación de tubos
positivos y negativos eran ingresados al programa de NMP (NMP calculator,
versión 4.04 EPA) (Anexo 4) obteniendo la densidad de microorganismos
degradadores. Como parte del control de calidad, se usaron tres controles
negativos: a) B-H, b) B-H y la fuente de carbono y c) B-H y la menor dilución.
34
Figura 10. Lectura del NMP dos días después de la adición de INT.
4.6.3 Recuperación de microorganismos degradadores de HCs
Para recuperar los microorganismos degradadores se tomó una gota de los
pozos positivos de las diluciones más altas del NMP y se sembró en agar mínimo
de sales (B-H) por aislamiento (Margesin et al., 2003a). Con el objetivo de obtener
la fuente de HCs adecuada se simuló un ambiente saturado de HCs, donde se
colocó 20 µl crudo (chichimene, APIº16) en la tapa un sensidisco (papel de filtro
Whatman 40) y se incubó a temperatura ambiente por 4 días (Figura 11A). Para
confirmar que las cepas seleccionadas poseían la capacidad degradadora de HCs,
estas fueron repicadas varias veces (>4) en el mismo medio BH y bajo las mismas
condiciones usando ACPM como fuente de carbono (Figura 11B) (Margesin et al.,
2003a). Esta prueba se realizo para evitar la contaminación cruzada de
compuestos orgánicos.
35
Figura 11. Crecimiento selectivo de bacterias degradadoras de HCs en agar B-H. A) selección de bacterias con crudo y B) con ACPM como única fuente de carbono.
Para realizar la identificación molecular de las bacterias degradadoras de
HC’s se tomaron colonias puras, las cuales fueron sembradas en AIS por
aislamiento e incubadas por 2 d a temperatura ambiente. Las colonias se
caracterizaron morfológicamente macro y microscópicamente (coloración de
Gram), para su posterior identificación molecular.
La conservación de los microorganismos degradadores se realizó en Skim
Milk al 10% (Difco) y se almacenaron a -70ºC hasta su posterior identificación
molecular.
4.6.4 Identificación molecular
Las bacterias degradadores de HC’s se identificaron molecularmente por
medio de la amplificación y purificación del 16S ADNr realizado en CorpoGen y su
posterior secuenciación (Department of microbiology, Harvard). Esta fase fue
llevada a cabo al final del estudio cuando se tuvieron las cepas aisladas de todos
los EM.
36
4.6.4.1 Extracción de ADN
La extracción del ADN se realizó por ebullición de las células (Suescun,
2003). Se tomó una colonia aislada en agar nutritivo (OXOID) y se resuspendió en
un tubo con 200 µl de Tween 20 al 1% (v:v) y TE 1X (v:v) , la mezcla se llevó a
ebullición (90ºC por 10 min). Posteriormente la suspensión se centrifugó a 13,000
rpm por 1 min, obteniendo en el sobrenadante el ADN.
4.6.4.2 Amplificación del 16S ADN ribosomal
Se realizó la amplificación por PCR de la subunidad ribosomal 16S. La
mezcla de PCR con buffer 10mM Tris-HCl (GIBCO) pH 8.0, 50 mM KCl (SIGMA),
0.1% Triton X-100 (Promega) y 2.5 mM MgCl2, (Kit CorpoGen), 0.2 mM de
deoxinucleótidos trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP-Promega), 0.3 mM de los
iniciadores 1492F universal (GGTTACCTTGTTACGACTT), y bacteria
(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 0.025 U/µl de Taq polimerasa (Tucantaq
CorpoGen) y 5 µl de ADN para un volumen final de 50 µl (Tabla 2).
Tabla 2. Reactivos y condiciones de la PCR para la amplificación del 16S ADNr.
Reactivos Concentración inicial Concentración final
Buffer 10X 1X
MgCl 25 mM 2.5 mM
iniciadores 5 mM 0.3 mM
dNTPs 1 mM 0.2 mM
Taq polimerasa 5 U/µl 0.025 u/µl
ADN 5 µl
La PCR se llevó a cabo en un termociclador PTC-100 (MJ Research, USA)
con el siguiente programa: denaturación inicial a 94ºC por 5 min, luego 35 ciclos
37
de 30 seg de denaturación a 95ºC, 45 seg de anillaje a 55ºC y 1 min de extensión
a 72 ºC. Finalmente se dejó por 12 minutos a 72ºC para la extensión final.
Se hizo una electroforesis del ADN amplificado en gel de agarosa al 1% con
1.5% de bromuro de etidio en una fuente de poder Power Pac 3000 (Bio Rad) a
140 mV durante 20 min, y se visualizó en un trasiluminador. En los pozos del gel
se cargó el ADN de las bacterias amplificadas, un control de la extracción del ADN
(Twenn 20 al 1% (v:v) y TE 1X (v:v) utilizados para extraer el DNA), control de
PCR (agua desionizada), y un control positivo (ADN de Klebsiella pneumoniae).
4.6.4.3 Purificación y secuenciación del ADN amplificado
Los productos de PCR fueron purificados por medio del kit QIAquick (PCR
purification Qiagen) y se enviaron a secuenciar al Departamento de Microbiología
de Harvard Medical School (Boston, MA).
4.6.4.4 Análisis bionformático de la secuenciación
La secuenciación se realizó con los cebadores 27F y X-91R, obteniendo
dos secuencias para cada cepa aislada. Con el fin de obtener una secuencia
consenso (Contig), las dos secuencias se ingresaron al programa CAP2
(http://www.infobiogen.fr/services/), donde se obtenía una sola secuencia
consenso. La secuencia obtenida se comparó en BLASTn (nucleótido-nucleótido)
(Altschul et al., 1997; Benson et al., 2000) del NCBI, donde se obtenían las
secuencias más similares entre las bacterias reportadas anteriormente por otros
autores.
38
4.7 Análisis de las muestras de agua de lixiviado en las columnas
Para la estimación del efecto del proceso de lixiviación sobre los HCs, se
realizó un estudio en columnas mantenidas in situ y laboratorio. Realizando EM
paralelos a los realizados para suelo (40 días) las cuales eran evaluadas para
determinar la concentración de TPH, pH y nutrientes (amonio y fósforo).
4.7.1 pH
Se realizó directamente la medición del pH con un Phmetro HACH sobre
cada una de las muestras con control de temperatura agitando uniformemente la
muestra (Método 2310; Standard-Methods, 2000) .
4.7.2 Hidrocarburos totales del petróleo
Las muestras del lixiviado fueron procesadas en el laboratorio analítico
Prodycon S.A. por el método infrarrojo 5520 (Standard-Methods, 2000), donde el
uso del tricloroetileno (TCE) como solvente de extracción permite determinar los
enlaces C-H de la muestra de lixiviado (Standard-Methods, 2000).
4.7.3 Nutrientes
Debido a las características propias de las muestras (matriz arenosa) las
determinaciones de amonio y fósforo para el agua de lixiviado difieren de la
usadas para la determinación de amonio y fósforo en el suelo.
39
4.7.3.1 Amonio
La determinación de amonio en las muestras de lixiviado se evaluó por el
método de nesslerización directa (Método 4500C; Standard-Methods, 2000). Se
tomó 10 ml de la muestra en un balón aforado de 50 ml y se añadieron 0.1 ml de
arsenito de sodio (agente dispersante). Luego se añadió 1 gota de sal de Rochelle
(agente estabilizador) y se diluyó a 50 ml con agua desionizada. Luego se añadió
1 ml de reactivo de nessler (HACH) para determinar la absorbancia en el
espectofotómetro HACH DR2000. Para determinar la concentración de amonio en
las muestras de lixiviado se realizó curva de calibración de amonio a partir de una
solución estandar de 3.819 g/l NH4Cl (Standard-Methods, 2000).
4.3.2 Fósforo
Este método se basa en la conversión del fósforo a orto-fosfatos para su
posterior determinación colorimétrica por una absorbancia de 420 nm en un
espectrofotómetro HACH DR2000. El pH se ajustó a 7.0 para el procesamiento de
las muestras, se tomaron 35 ml de la muestra (a temperatura ambiente) en un
balón aforado de 50 ml, se añadió 10 ml del reactivo vanadato-molibdato (HACH),
el cual reacciona con el molibdato amónico formando ácido molibdofosfórico que
en presencia de vanadio forma ácido vanadomolobdofosfórico. La curva de
calibración para fósforo se realizó utilizando concentraciones estándares de
fósforo de KH2PO4, (Carlo Erba) (Standard-Methods, 2000) .
4.8 Análisis estadístico de los resultados
Se realizó un análisis de normalidad Shapiro-Wilk (p<0.05) por medio del
paquete estadístico Statistix 8 (2003) evaluando si los datos seguían una
distribución normal durante el estudio. Aquellas variables que no presentaron una
40
distribución normal se normalizaron por el uso del logaritmo en base 10. Se realizó
un análisis multivariado de varianzas (MANOVA) por medio del paquete
estadístico SPSS 10.05 evaluando las interacciones de las variables (Hair et al.,
1998; Zar, 1999; Scheiner y Gurevitch, 2001). Una vez identificadas las diferencias
significativas entre las variables se realizó una comparación múltiple entre los
grupos de las variables por la prueba de Tuckey evaluando cual población era
significativamente diferente (Zar, 1999).
41
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Análisis del suelo
El suelo utilizado para el estudio presentó características de un suelo
arenoso (86.9+1.41%) con la presencia de arcilla y limo (Tabla 3), Lo que
corresponde al origen arenoso del suelo, debido a que para la construcción de las
carreteras en el campo petrolero utilizan el suelo y sedimentos de río. En cuanto a
la presencia de limo en la muestra, esto puede deberse a que en los sedimentos
del río es donde se presenta la mayor acumulación de materia.
Tabla 3. Análisis de granulometría y clase textural del suelo de carretera estudiada (IGAC, 2004).
Granulometría
Muestra Arena
%
Limo
%
Arcilla
%
Clase
textural
1 85.9 10.1 4.0 AF
2 87.9 8.1 4.0 A
A: Arena F: Franco
Debido a estas características (arena) no se espera encontrar unos recuentos muy
altos de microorganismos tanto heterótrofos como degradadores. Aun cuando este
suelo es utilizado para la formación de carreteras (gran compactación), los
recuentos de microorganismos deberían descender a medida que se aumenta la
profundidad y una alta lixiviación debido a los bajos porcentajes de arcilla (que
serviría como un impermeabilizante) (Sylvia et al., 1997; Madigan et al., 1997).
42
5.2 Análisis fisicoquímicos del las muestras de suelo
5.2.1 pH
Los valores de pH in situ en las tres profundidades evaluadas para los días
-2 y 0 (7.09+0.28) fueron significativamente más altos que el resto del estudio
(6.45+0.23) (Tuckey, p<0.05, n=84). Al inicio del estudio los valores observados
fueron más neutros y a partir del 3 EM (día 44) el pH del suelo descendió
ligeramente (Figura 12).
Tiempo (Días)
-2 0 44 81 129
pH
0,0
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0 5 cm50 cm80 cm
Figura 12. Valores de pH de las muestras de suelo in situ durante el estudio . Las barras de error representan una desviación estándar (n=84).
Para el estudio del suelo en columnas no se observó que los tratamientos
evaluados tuvieron un efecto significativo sobre el pH (MANOVA, p<0.05, n=44).
43
Sin embargo, los días 0 y 44 (7.30+0.14 y 6.80+0.23, respectivamente) fueron
significativamente más altos a los observados en el resto del estudio
(6.36+0.21)(Tuckey, p<0.05, n=44)(Figura 13).
T i e m p o ( D í a s )
0 4 4 83 1 2 9
pH
0,0
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0T A T B T C T D C C C L
Figura 13. Valores de pH de suelo en las columnas. TA: precipitación mayor, TB: precipitación media, TC: precipitación menor, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC. Las barras de error representan una desviación estándar (n=44). El pH durante nuestro estudio se mantuvo cercano a valores neutros
(6.68+0.39) y óptimo para que se presentara una adecuada biodegradación.
Dibble y Bartha (1979), en su estudio de los factores que afectaban la
biodegradación observaron que los valores en pH más cercano a neutro (7.0 y 7.8)
aumentaban la actividad degradadora de los microorganismos sobre lodos de
fondo de tanque. Marguesin y Schinner (2001), observaron cómo el pH del suelo
alpino (8.0) facilitó una alta biodegradación de diesel. Cunningham y Philip (2000),
reportaron que el pH 8.1 para un suelo contaminado con ACPM ayudó para que se
presentara una eficiente degradación. El descenso del pH durante el estudio se
debe usualmente a los efectos de la actividad metabólica de los microorganismos,
44
obteniendo intermediarios ácidos en los procesos de biodegradación (Dibble y
Bartha, 1979; Marguesin y Shinner, 1997; Marguesin et al., 2003).
5.2.2 Humedad
El mayor porcentaje de humedad se presentó en la superficie después de la
adición de los lodos sobre la carretera (0= 12.09+0.23) (Tuckey, p<0.05, n=84). Al
añadir los lodos se observó un evidente aumento en la humedad superficial del
suelo, que durante el estudio fue disminuyendo drásticamente (0.63+0.10). La
humedad de las muestras in situ en la profundidad en 5 cm (2.00+0.39, 1.72+0.60
y 0.63+0.10 para los días 44,83, y 129 respectivamente), fueron significativamente
más bajas que las observadas en las otras dos profundidades eva luadas
(5.36+1.89) (MANOVA, p<0.05, n=84) (Figura 14). Este efecto puede estar
relacionado con el régimen de precipitación en los llanos orientales que a partir del
mes de septiembre (2003) para el momento de los últimos 3 muestreos (44, 81 y
129 días) fue bastante bajo.
T iempo (D ías )
-2 0 4 4 8 1 1 2 9
% H
umed
ad
0
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
5 c m5 0 c m8 0 c m
Figura 14. Porcentaje de humedad durante el estudio in situ. Las barras de error representan una desviación estándar (n=84).
45
En las columnas, el porcentaje de humedad fue significativamente más alto
en TA y CC (9.08+7.91 y 9.95+5.06, respectivamente) que en los tratamientos TB,
TC y TD (4.81+2.2.62, 3.66+1.44, 5.81+4.07, respectivamente) (Figura 15).
Además el tratamiento CL presentó los porcentajes más bajos de humedad
(1.49+1.30) (Tuckey, p<0.05, n=44) (Tabla 4).
Tabla 4. Porcentaje de humedad en las columnas durante el estudio (n=44).
TA: precipitación mayor, TB: precipitación media, TC: precipitación menor, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC. a: No se realizó muestreo de esta columna en 1er EM.
T i e m p o ( D í a s )
0 4 4 8 1 1 2 9
% H
umed
ad
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5T A T B T C T D C C C L
Figura 15. Porcentaje de humedad de las columnas durante el estudio. Las barras de error representan una desviación estándar (n=44). TA: precipitación mayor, TB: precipitación media, TC: precipitación menor, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC.
Tiempo (días)
TA TB TC TD CC CL
0 9.77± 5.395 5.11 ± 0.18 4.59±1.0 8.13±3.99 5.0±4.24 a
44 18.9±10.3 8.49±0.36 4.29±0.14 8.78±1.67 11.10±0.03 2.75±0.37 81 4.79±0.0 2.55±2.05 1.7±0.96 4.80±5.4 11.97±9.83 2.56±0.80 129 3.15±1.4 3.08±0.68 4.05±1.42 1.52±0.11 6.77±0.55 0.34±0.091
46
La humedad del suelo durante todo el estudio fue bastante baja (<14%)
comparada con previos estudios en los que se ha observado que la humedad
óptima para la biodegradación debe estar entre el 50-70%. Debajo de este rango
la biodegradación es reducida debido a la baja actividad del agua (Leahy y
Colwell, 1990). Dibble y Bartha (1979), al estudiar los efectos ambiéntales sobre la
biodegradación de lodos aceitosos bajo condiciones controladas (laboratorio),
obtuvieron altas tasas de degradación de estos lodos con porcentajes de humedad
desde 30% hasta 90%. Igualmente, Marguesin y Schinner (2001), en su estudio
con suelos arenosos alpinos mostraron que los bajos resultados en la
biodegradación en gran parte fueron causados a los bajos porcentajes de
humedad (1-16%) en los suelos evaluados.
Durante el presente estudio el mayor descenso de la humedad observado
se presentó en la profundidad 5 cm. La presencia de los lodos fue evidente a esta
profundidad y estos en altas concentraciones disminuyen la capacidad de carga
en el suelo incrementando la disponibilidad del agua, lo cual ha sido reportado por
Dibble y Bartha, 1979. Hacia el final del estudio la humedad disminuyó debido a
las altas temperaturas y la baja precipitación, reduciendo el contenido de agua
inherente a estos lodos (10%-50% de agua).
5.2.3 Hidrocarburos totales del petróleo (TPH) in situ
Después de la adición de los lodos sobre la carretera y durante el resto del
estudio se observaron las concentraciones más altas de TPH en la profundidad de
5 cm (31.549+16.787 mgTPH/Kgps) mientras que para las otras dos profundidades
evaluadas (50 y 80 cm) los valores observados fueron significativamente más
bajos (519+461 y 502+543 mgTPH/Kgps, respectivamente) (Tuckey, p<0.05, n=84)
(Figura 16) (Tabla 5).
47
Tabla 5. Concentración de TPH in situ en las diferentes profundidades durante el estudio (n=84).
Concentración de TPH (mg/kgps de TPH) en las diferentes profundidades (cm)(a)
Tiempo, días 5 cm 50 cm 80 cm -2 3.856+3.838 136+180 -----(b) 0 47.418+26.948 818+385 512+289
44 28.717+11.019 998+434 830+922 81 28.569+4.745 296+236 359+374 129 21.491+6.223 311+481 311+356
(a) Los valores son el promedio de 6 muestras compuestas por 15 puntos de muestreo para cada profundidad (b) Para la evaluación inicial antes de la adición de los lodos no se tomaron muestras a 80 cm porque la adición solo se realiza en los primeros 30 cm.
Tiempo (días)
-2 0 44 81 129
Log
mgT
PH
/Kg ps
0
1
2
3
4
5
65 cm50 cm80 cm
Figura 16. Concentración de TPH in situ durante el estudio. Las barras de error representan una desviación estándar (n=84).
48
Se observó la gran variación inherente debido al tipo de muestra (suelo) y al
tipo de hidrocarburo (hidrofóbico que forma agregados). Al final del estudio se
observó un porcentaje de remoción de TPH in situ del 54.8% para 5 cm (donde las
concentraciones de TPH eran las más altas), 62% y 39% para 50 y 80 cm
respectivamente (para estas dos profundidades la concentraciones de TPH
siempre fueron significativamente más bajas). La mayor reducción en 5 cm se
presentó entre los días 0 y 44 con un 39% de reducción de TPH. Para la
profundidad 50 y 80 cm, la mayor remoción de TPH se presentó entre los días 44
al 81, con 70% y 56%, respectivamente. Después de el día 81 para dos de las
profundidades evaluadas el porcentaje de degradación fue más bajo (25% y 13%
para 5 y 80 cm respectivamente). Para 50 cm no se presentó degradación,
aumentando la concentración de TPH. Aún cuando se observó una disminución de
más del 50% de TPH in situ, esta disminución no es significativa debido a las altas
desviaciones observadas.
Durante el estudio in situ, se observó una mancha de lodos a ~20 cm de
profundidad y al evaluar sus concentraciones de TPH en los días 81 y 129 se
observaron valores de 42.799+9.869 y 28.905+7.960 mgTPH/kgps,
respectivamente.
Las concentraciones de TPH en suelos observadas en el presente estudio
fue una de las más altas reportadas en estudios donde se ha evaluado la
degradación de HCs, además de ser uno de los pocos estudios donde se evaluó la
AN de HCs de cadenas de alto peso molecular (Dibble y Bartha, 1979; Van
Hamme et al., 2003). Röling y colaboradores (2001) realizaron una simulación en
microcosmos con arena de playa, contaminados con 31.200 mgTPH/kg. Dos años
después, Marguesin y colaboradores (2003a), en la búsqueda de genes
degradadores de HCs en suelos alpinos, observaron que las concentraciones más
altas fueron de 30.644 mg TPH/kg. Salminen y colaboradores (2004), observaron
las concentraciones más altas de aceites 68.600 mg/Kgps, presentadas en suelos
49
cercanos a una tanque de almacenamiento de residuos aceitosos en Finlandia.
Marguesin y Schinner (2001) en una zona alpina glaciar contaminada con ACPM,
observó que la mayoría de las concentraciones reportadas de HCs eran de 2.612
mgTPH/kg. En otro estudio, Marguesin y colaboradores (2003b) bajo condiciones
controladas (laboratorio) contaminaron suelo con 100 mg TPH/kg de BTEX.
Boopathy (2003) durante un estudio en suelos cercanos a tanques de
almacenamiento observó que la degradación por el uso de reactores anaeróbicos
era inhibida con concentraciones de diesel de 550 mgTPH/kg. Townsend y
colaboradores (2000), contaminaron controladamente un marisma con 962.7
mg/kg de HCs alifáticos y 271.3 mg/kg de PAH. Lee y colaboradores (2001),
encontraron que las concentraciones máximas de contaminación de 2.653 mg
Tolueno/Kg, cuando evaluaban AN en un cuerpo de agua subterránea en Korea
contaminado con solventes de tanques de almacenamiento.
La degradación de TPH en la profundidad de 5 cm durante el estudio (55%)
fue relativamente alta si se tiene en cuenta el tipo de HCs estudiado (cadenas de
alto peso molecular), sin embargo es necesario recordar que esta degradación se
presentó con valores altamente variables . Los resultados obtenidos en los
controles de AN (suelo con HCs sin adiciión de nutrientes) utilizados por Kaplan y
Kitts (2004), durante el estudio de biodegradación en suelos arenosos
contaminados con HCs de cadena larga obtuvieron un porcentaje de degradación
del 61%, similares a los obtenidos en este estudio. Estudios donde se han
evaluado la degradación de fracciones de TPH se han obtenido degradaciones
similares de algunos HCs. Durante la evaluación de la degradación de ACPM los
porcentajes de degradación fueron del 17% para el estudio realizado por Margesin
y Schinner, 1997, del 12.6% para Cunningham y Philp, 2000 y del 50%, Margesin
y Schinner, 2001. Marguesin y colaboradores (2003b) observó una reducción de
BETX del 59% en suelos con bajas concentraciones de nutrientes . Salminen y
colaboradores (2004), un año después observó una degradación de alcanos (C15-
C35) del 31y 27% en un estudio de 3 y 4 meses respectivamente. En un estudio
50
realizado por Nicholson y Fathepure (2004) bajo condiciones controladas de
laboratorio y utilizando un medio enriquecido obtuvieron mineralización del 46% de
benceno.
5.2.4 Tasa de Atenuación Natural in situ
La tasa de atenuación natural de los TPH usualmente se presenta como
una cinética de primer orden (Ecuación 3). (Alexander, 1999; Schnoor, 1996;
Tinoco et al., 1995; Yeung et al., 1997)
kCdTdC
k −== Ecuación 3
Las constantes de degradación observadas en el presente estudio en las
profundidades de 5, 50 y 80 cm fueron de 0.0903/d, 0.1245/d y 0.2655/d
respectivamente (Anexo 6). Obteniendo una tasa de degradación de 201.06, 4.05
y 1.82 mg/Kg/d para 5, 50 y 80 cm, respectivamente.
Sin embargo, el mayor porcentaje de biodegradación se presentó en el
primer mes de estudio (44 d) para 5 cm con una constante de 0.1985/d y una tasa
de degradación de 425.22 mg/Kd/d. Para este EM (44 d) y las profundidades de
50 y 80 cm se observó que no se presentó biodegradación, si no que al contrario
aumentó la concentración de TPH. Debido a que las fracciones más livianas
pudieron haberse lavado en la columna de suelo.
La tasa de biodegradación observada en este estudio fue ligeramente alta
teniendo en cuenta que el tipo de HCs adicionados a las carreteras eran lodos de
fondo de tanque con HCs de cadenas largas, generalmente de menor degradación
(Dibble y Bartha, 1979). Sin embargo, las altas variaciones en las concentraciones
de TPH pueden influir en que la tasa de biodegradación no sea significativamente
51
alta. La mayor tasa de biodegradación se presentó durante el primer mes de
estudio (44 días). Durante este periodo las fracciones de los HCs más disponibles
fueron degradadas quedando las fracciones de mayor peso molecular haciendo
más lenta la degradación. Kaplan y Kitts (2004) reportaron en suelos
contaminados con HCs de cadenas largas constantes de biodegradación de
0.021/d en las primeras 3 semanas del estudio y de 0.0026/d para las últimas 21
semanas. Igualmente Lee y colaboradores (2001) reportaron constantes similares
de biodegradación (0.0083-0.011/d) para su estudio en ambientes anaeróbicos y
contaminación con tolueno. En un estudio durante 2 años con suelos arenosos
Siciliano y colaboradores (2003), mostraron constantes de biodegradación más
altas (0.633/d) en presencia de PAH y bajas concentraciones de materia orgánica.
5.3 Nutrientes
Las concentraciones de amonio durante el estudio se mantuvieron
relativamente estables para las tres profundidades evaluadas durante el estudio
(5, 50 y 80 cm con 11+9.44, 12+9.42 y 12+9.80 mgN-NH4+/Kgps, respectivamente)
(MANOVA, p<0.05, n= 84) (Figura 17).
Las concentraciones de nitrato observadas in situ aumentaron
significativamente (MANOVA, p<0.05, n=84) después de la adición de lodos sobre
la carretera (día 0). Este aumento se observó en la profundidad de 50 y 80 cm
(7.5+2.58 y 9.33+2.42 mg N-NO3-/Kgps, respectivamente) (Tuckey, p<0.05, n=84)
mientras que para el resto del estudio estas concentraciones se mantuvieron
estables (5, 50 y 80 cm con 5+3.07, 4+1.18 y 4+1.22 mgN-NO3-/Kgps,
respectivamente) (Figura 17). Este aumento en las concentraciones de nitrato
pudo deberse a un aporte en los lodos utilizados como supresores de polvo debido
al origen de estos lodos).
52
Finalmente la concentración de fósforo para el día 44 fue significativamente
más bajo en las tres profundidades (5, 50 y 80 cm con 1+0.58, 1+0.58 y 1+0.01
mg P-PO4-3/kgps) que para el resto del estudio (5, 50 y 80 cm 4+1.83, 3+1.92,
4+1.97 mg P-PO4-3/kgps) (Tuckey, p<0.05, n=84) (Figura 17). El descenso de
fósforo observado a la mitad del estudio pudo deberse a errores en el
procesamiento de las muestras para la determinación de este nutriente.
Para una adecuada biodegradación con la concentración de TPH, de
nitrógeno y fósforo observadas (balance de masas) después de la adición de lodos
(47.418 mgTPH/Kgps, 21 mgN/Kgps y 87 mgP/Kgps), sería necesario una
concentración de 4.696 mgN/Kgps y 464 mgP/Kgps en 5 cm. 59 mgN/Kgps y 4
mgP/Kgps en 50 cm y finalmente de 32 mgN/Kgps y 8 mgP/Kgps para 80 cm (Anexo
7).
Las concentraciones de nutrientes observadas durante el presente estudio
fueron bajas por ser un suelo arenoso 87%, proveniente del río, para que no
existiera un balance de masas y observar una biodegradación.
Marguesin y Schinner (2001), reportaron durante su estudio con suelos
alpinos contaminados con diesel bajas concentraciones de nutrientes 14 mgN/Kg y
4.3 mgP/Kg, lo cual limitó la biodegradación. Con base en la literatura en el suelo
de la carretera estudiado no existe un balance adecuado de C:N:P (100:10:1)
(Atlas y Bartha, 1973; Dibble y Bartha, 1979; Margesin y Schinner, 1997;
Alexander, 1999; Townsend et al., 2000; Margesin y Schinner, 2001; Van Hamme
et al., 2003), lo cual se presentó por el exceso de carbono en la carretera
estudiada (40.000 mgTPH/Kgps).
53
-2 0 4 4 8 3 1 2 9
mg
N-N
H4+
/Kg
ps
0 , 0
1 0 , 0
2 0 , 0
3 0 , 0
mg
N-N
O3- /K
gps
0 , 0
5 , 0
1 0 , 0
1 5 , 0
2 0 , 0
2 5 , 0
3 0 , 0
T i e m p o ( D í a s )
-2 0 4 4 8 3 1 2 9
mg
P-P
O4
-3/K
gps
0 , 0
5 , 0
1 0 , 0
1 5 , 0
2 0 , 0
2 5 , 0
3 0 , 0 5 c m5 0 c m8 0 c m
Figura 17. Concentraciones de nutrientes in situ durante el estudio. Las barras de error representan una desviación estándar (n=84). A= amonio, B= nitrato y C= fósforo.
A
B
C
54
5.4 Análisis de contra-muestra
En cuanto al análisis de referencia de los parámetros fisicoquímicos
evaluados en el laboratorio, no se observaron diferencias significativas entre el
IGAC y USBA (Tabla 6), posiblemente a que entre los mismos laboratorios las
desviaciones son bastante altas. Una vez más se observó el efecto de la clase de
muestra (suelo) en la homogeneidad de los resultados. Se descartó las diferencias
entre los diferentes métodos evaluados, debido a que el fundamento de los
usados por el IGAC fueron similares a los utilizados en este estudio.
Tabla 6. Análisis de referencia de los parámetros fisicoquímicos evaluados.
Parámetro evaluado IGAC USBA pH 5.75+0.6 6.4+0.3
N-NO3 (mg/kgps) * 12+4.3 N-NH4
+ (mg/kgps) 1.28+1.3 5.0 P (mg/kgps) 3.82+5.3 2.4+0.7
* No determinado.
5.5 Análisis microbiológicos
5.5.1 Recuento de microorganismos heterótrofos totales
Los recuentos in situ de heterótrofos se mantuvieron estables
(1.15+4.47x107 UFC/gps) durante el estudio y no se presentaron diferencias
significativas entre las tres profundidades estudiadas (MANOVA, p<0.05, n=84)
(Figura 18). Estos resultados son contrarios a lo esperado debido a que no se
observó una disminución de los microorganismos aerobios en la columna de
suelo. Posiblemente, a la porosidad del suelo y a un buen drenaje de la carretera
permitiendo una adecuada aireación aún a las profundidades estudiadas (50 y 80
cm).
55
Tiempo (Días)
-2 0 44 81 129
Het
erót
rofo
s (L
og U
FC
/gps
ps)
0
4
6
8
105 cm50 cm80 cm
Figura 18. Recuento de heterótrofos totales in situ. Las barras de error representan una desviación estándar (n= 84).
Los recuentos de heterótrofos observados en las columnas indican que los
tratamientos tuvieron un efecto significativo durante el estudio en las poblaciones
de estos microorganismos (MANOVA, p<0.05, n=44) (Figura 19). TA presentó los
recuentos de heterótrofos significativamente más altos (5.47+15.13x107 UFC/gps)
en los primeros 83 días que el resto de los tratamiento estudiados TB, TC, TD
(1.05+4.78x107, 9.12+4.36x106y 1.17+4.46x107 UFC/gps, respectivamente)
(Tuckey, p<0.05, n=44). Los recuentos más bajos de los microorganismos
heterótrofos durante el estudio se observaron en CC y CL (3.16+7.41x106 y
3.24+3.89x106 UFC/gps respectivamente) (Figura 19).
56
0
2
4
6
8
10
TA TB TC TD CC CL
Tratamientos
Het
erót
rofo
s (L
og U
FC
/gps
)
0 días 44 días 83 días 129 días
Figura 19. Recuento de microorganismos heterótrofos totales en el suelo de las columnas. Las barras de error representan una desviación estándar (n= 44). TA: precipitación mayor, TB: precipitación in situ, TC: precipitación menor, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC.
Durante el presente estudio los recuentos de heterótrofos in situ fueron
estables y similares a los reportados por otros estudios donde se evaluaba esta
población en suelos arenosos. Marguesin y Schinner (1997), encontraron que los
recuentos de microorganismos heterótrofos fueron de 1.1x109 UFCgps. Siciliano y
colaboradores (2003), encontraron poblaciones de heterótrofos alrededor de 2-
10x107 UFC/g en un suelo contaminado con PAH. Igualmente Kaplan y Kitts
(2004), encontraron poblaciones de heterótrofos de 1.7x107-1.3x108 mientras
evaluaban la sucesión de bacterias en suelos contaminados durante 30 años con
HCs de cadena larga. Marguesin y Schinner (2001) reportaron que la población de
microorganismos heterótrofos totales en un suelo arenoso alpino contaminado con
diesel fue de 6.5x107.
5.5.2 Recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos
Al inicio del estudio se evaluaron crudo, lodos (utilizados para la adición
sobre la carretera) y ACPM como fuente de carbono. Sin embargo se observó que
57
el montaje con crudo interfería con la lectura de los pozos positivos, ya que no se
podía observar cambio de color a rojo. Al realizar el montaje de la técnica del
NMP con los lodos utilizados para el mantenimiento de carreteras se observó que
los recuentos obtenidos eran más altos con lodos que con ACPM (5.1+8.91x104 y
1.5+7.07x103 NMP/gps, respectivamente). Debido a estos resultados se decidió
sembrar muestras de lodos en agar nutritivo (OXOID) donde se observó el
crecimiento de bacterias, por lo que se descartó el uso de estos lodos para la
técnica. Además estas bacterias fueron identificadas molecularmente (LODOS
Cepa No 11).
Los recuentos de degradadores de HCs in situ fueron significativamente
más altos (1 a 3 ordenes de magnitud) al inicio del estudio en las 3 profundidades
evaluadas (6.17+13.49x104 NMP/gps días -2 y 0) que los observados en el resto
del estudio (1.29+7.41 x103 NMP/gps días 44, 81 y 129) (MANOVA, p<0.05, n=84)
(Figura 20). Los recuentos más altos (inicio del estudio) se pudieron observar
debido a que problemas en la estandarización del montaje de la técnica. Para el
día 44 se observó un ligero aumento de los degradadores en la profundidad de 80
cm (4.27+6.16x105 NMP/gps), posiblemente causado al movimiento de fracciones
más solubles de HCs y asimilables que en los horizontes superficiales,
inversamente se observó que en la superficie (5 cm) los recuentos de
degradadores disminuyeron (1.23+7.24x103 NMP/gps).
En general in situ los recuentos de microorganismos degradadores fueron
significativamente menores a los recuentos de microorganismos heterótrofos (de 1
a 4 órdenes de magnitud)(Gráfica 21). En la relación de degradadores:heterótrofos
se observó un descenso durante los primeros 44 días del estudio (0.45 y 0.45 en 5
y 50 cm, respectivamente) causado por el descenso en el recuento de
degradadores y aumento en los heterótrofos. Esta relación aumenta en los 80 cm
hacia el final del estudio (0.58) debido al descenso en los heterótrofos y aumento
en los degradadores (Figura 22).
58
Tiempo (Días)
-2 0 44 81 129
Deg
rada
dore
s (L
og N
MP
/gps
ps)
0
1
2
3
4
5
6
7
5 cm50 cm80 cm
Figura 20. Recuento de microorganismos degradadores de HCs in situ.Las barras de error representan una desviación estándar (n=84).
012345678
-2 0 44 81 129 -2 0 44 81 129 0 44 81 129
5cm 50 cm 80 cm
Rec
uen
to (
Lo
g/g
ps)
Heterótrofos Degradadores
Tiempo (Días)
Figura 21. Recuento de microorganismos heterótrofos y degradadores de HCs durante el estudio in situ. Las barras de error representan una desviación estándar (n= 84).
59
T i e m p o ( D í a s )
-2 0 4 4 8 1 129
Rel
ació
n po
blac
ione
s (d
egra
dado
res/
hete
rotro
fos)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
5 c m5 0 c m8 0 c m
Figura 22. Relación de degradadores:heterótrofos in situ (n=84).
Los tratamientos evaluados en las columnas no tuvieron un efecto
significativo en los recuentos de degradadores (MANOVA, p<0.05, n=44) (Figura
23). En los días 0 y 129 los recuentos fueron significativamente más altos
(1.29+6.91x104 NMP/gps) que los recuentos observados en los días 44 y 81
(6.46+5.75x102 NMP/gps) (Tuckey, p<0.05, n=44). No se observaron diferencias
significativas entre los tratamientos y el control en campo.
0
1
2
3
4
5
6
7
TA TB TC TD CC CL
Tratamientos
Deg
rada
dore
s (L
og N
MP
/gps
)
0 días 44 días 83 días 129 días
Figura 23. Recuento de degradadores en las columnas durante el estudio. Las barras de error representan una desviación estándar (n= 44). TA: precipitación mayor, TB: precipitación media, TC: precipitación menor, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC.
Tiempo (Días)
60
En el suelo de las columnas los recuentos de heterótrofos se mantuvieron
constantes y superiores a los recuentos de degradadores (de 2 a 5 órdenes de
magnitud) (Figura 24).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 44 81 129 0 44 81 129 0 44 81 129 0 44 81 129 44 81 129 44 81 129
TA TB TC TD CC CL
Rec
uent
o (L
og/g
ps)
Heterótrofos Degradadores
Figura 24. Recuento de heterótrofos y degradadores de HCs en las columnas durante el estudio. Las barras de error representan una desviación estándar (n=44). TA: mayor precipitación, TB: precipitación in situ, TC: menor precipitación, TD: sin precipitación, CC: control en campo, CL: suelo sin HC.
Los valores más bajos de heterótrofos se observaron en las últimos
muestreos (81-129 días) para la mayoría de los tratamientos evaluados. La
relación degradadores:heterótrofos observada en las columnas de laboratorio fue
similar a la observada in situ (Figura 25). Se observó un descenso en el recuento
de degradadores que a partir del día 44 aumentó y el de heterótrofos disminuyó.
Sin embargo en CL se observó una relación inversa en donde se los recuentos
más altos de degradadores estuvieron en el día 81.
Tiempo (Días)
Tratamientos
61
Tiempo (Días)
0 44 8 1 129
Rel
ació
n po
blac
ión
degr
adad
ores
/ he
teró
trof
os
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8T AT BT CT DC CC L
Figura 25. Relación de degradadores:heterótrofos en el suelo del estudio en columnas (n=44). TA: mayor precipitación, TB: precipitación in situ, TC: menor precipitación, TD: sin precipitación, CC: control en campo, CL: suelo sin HC.
No se observaron diferencias significativas entre los recuentos de
degradadores in situ y de columnas (tratamientos y controles). La población de
microorganismos degradadores de HCs in situ disminuyó al final del estudio como
se observa después de un derrame de petróleo (Van Hamme et al., 2003). El
descenso en las poblaciones de microorganismos degradadores hacia el final del
estudio pudieron verse inhibidas por las altas concentraciones de HCs en la
carretera, la alta densidad de los lodos y la presencia de las fracciones más
pesadas (Leahy y Colwell, 1990; Van Hamme et al., 2003). Marguesin y Schinner
(2001), observaron recuentos de 106 UFC/gps donde descendió los recuentos de
degradadores (1 orden de magnitud) lo cual lo explican en función de la
concentración del sustrato (HCs) a través del tiempo, sin embargo no encontraron
una correlación significativa entre estas variables . Los recuentos de degradadores
62
en el presente estudio fueron bastante bajos (posiblemente a la baja
concentración de nutrientes, al bajo porcentaje de humedad), si se compara con
estudio de biorremediación en microcosmos donde la población de degradadores
se encuentra en 108 UFC/gps (Margesin y Schinner, 1997).
En el presente estudio no se observó un aumento significativo en el
recuento de degradadores antes y después de la adición de lodos sobre la
carretera. Posiblemente este cambio no pudo ser apreciado por los largos
periodos entre la adición de lodos y el siguiente EM (44 d). Adicionalmente, los
microorganismos presentes en la carretera podrían haber estado adaptados a las
altas concentraciones de HCs (Leahy y Colwell, 1990; Townsend et al., 2000).
Además, existen reportes del aumento en la densidad de microorganismos
degradadores tras la adición de HCs en ambientes terrestres. Townsend y
colaboradores (2000), observaron un aumento (2 a 3 órdenes de magnitud) en los
microorganismos degradadores después de la adición de HCs, mientras
evaluaban la dinámica de los microorganismos en manglares contaminados con
gasolina y crudo. Si se comparan las poblaciones de microorganismos
degradadores obtenidos en este estudio con reportes donde la fracción
contaminante de HCs fue más volátil la densidad e microorganismos
degradadores fue mucho más alta (108-1012 UFC/g) como lo observó Hickey
(1995) cuando evaluó la ventilación del suelo como una opción de optimización de
la biodegradación de gasolina.
En el presente estudio se descartó una toxicidad de las fracciones más
volátiles y tóxicas de los lodos debido a que estas se pierden en la primeras 72 h
(Townsend et al., 2000). Debido a que estos lodos permanec ieron en piscinas de
almacenamiento durante periodos de tiempo considerables, soportando un
proceso de weathering en el momento de adicionarlos a la carretera quedando
solo las fracciones más pesadas.
63
Los recuentos de degradadores de HCs en los días -2 y 0 siempre fueron
más altos que los observados en el resto del estudio, posiblemente por la
saturación en el ambiente por las fracciones más volátiles contenidas en el ACPM
(sustrato utilizado como única fuente de carbono) utilizadas para realizar el
montaje de la técnica del NMP. Pudieron causar recuentos más altos en el 1er EM
(antes de la adición de los lodos).
5.5.3 Recuperación de microorganismos degradadores de hidrocarburos
Se seleccionaron 19 bacterias degradadoras por su morfología macro y
microscópica para su identificación molecular (Tabla 7). Estas cepas fueron
recuperadas a partir de las diluciones más altas de la técnica del NMP -INT y
aisladas en agar B-H (Figura 26). A partir de los lodos utilizados para la adición
sobre las carreteras (y con base a los resultados de NMP) se realizó un
aislamiento directo sobre agar B-H, donde se encontró una cepa degradadora
(LODOS, cepa No.11) la cual fue identificada molecularmente.
Esta cepa aislada de los lodos utilizados para el mantenimiento de
carreteras (LODOS, No. 11) se observó como un bacilo pequeño gram negativo,
formando colonias con borde definido de color crema y mostrando una apariencia
aceitosa a través de la luz.
64
Tabla 7. Descripción morfológica macro y microscópica de la 19 bacterias seleccionadas para la identificación molecular.
Muestra No. Identificación Macroscópica
Identificación Microscópica
IA2 1. Colonia blanca cremosa, mediana elevada, borde regular, traslúc ida azul
Bacilo gram negativo
IIIC1 2. Colonia mediana, blanca cremosa, elevada, borde regular, halo
Bacilo gram negativo
IIB2 3. Colonia mediana, blanca cremosa, elevada, borde regular, halo, traslúcida azul
Bacilo gram negativo
IIIA1. 4. Colonia mediana, blanca cremosa, elevada, borde regular, halo, traslúcida azul
Bacilo gram negativo
IIC1. 5. Colonia mediana, blanca cremosa, elevada, borde regular, halo, traslúcida azul
Bacilo gram negativo
IA1 6. Colonia pequeña, amarrilla clara, elevada, borde regular, halo, traslúcida azul
Bacilo gram negativo
IB1 7. Colonia pequeña, amarrilla, elevada, borde regular,
Bacilo gram negativo
L5 8. Colonia mediana, blanca cremosa, elevada, borde regular, halo
Bacilo gram negativo
IIB2ª 9. Colonia pequeña, blanca cremosa, elevada, borde regular,
Bacilo gram negativo
IIIA2 10. Colonia mediana. Elevada, borde regular,
color crema, traslúcida azul Bacilo gram positivo
espora
LODOS 11. Colonia pequeña
Elevada, borde regular, color crema. Bacilo gram
negativo
IA2 (1) 12. Colonia pequeña
Elevada, borde regular, color crema. Bacilo gram negativo
IIIC1* 13. Colonia pequeña. Elevada, borde regular,
color crema, traslúcida azul. Bacilo gram negativo
IIA1(D) 14. Colonia pequeña. Elevada, borde regular,
color amarrillo crema, traslúcida azul. Bacilo gram negativo
IIIA2 15. Colonia pequeña. Elevada, borde irregular,
color amarrillo crema. Bacilo gram negativo
TC2 16. Colonia mediana. Elevada, borde regular,
color crema, traslúcida azul. Bacilo gram positivo
esporaformador
CL1 17. Colonia mediana.
Elevada, borde regular, color terracota. Bacilo gram positivo
TA2 18. Colonia pequeña. Elevada, borde regular,
color amarrillo crema, traslúcida azul. Bacilo gram negativo
TA1 19. Colonia mediana
Elevada, borde regular, color terracota Bacilo gram positivo
Números romanos: El cuadrante de origen de la cepa (I, II o III). Letras: La profundidad estudiada (A= 5, B= 50 y C= 80 cm). Número arábigos: muestra compuesta (1 o 2). Lodos: Bacteria aislada directamente de los lodos utilizados como supresores de polvo.
65
Figura 26. Aislamiento de las bacterias degradadoras en agar Bushnell-Hass.
5.5.4 Identificación molecular
Se amplificaron los fragmentos del 16S del ADNr (un peso aproximado de
1465 pb). Este fragmento se visualizó en un gel de agarosa. Una vez visualizado
los fragmentos se purificaron y secuenciaron para se comparados en la base de
datos del GenBank. De las 19 bacterias seleccionadas como degradadoras de
HCs se encontraron que estas bacterias se enc uentran en proporción entre los
grupos taxonómicos alfaproteobacteria (5%), gammaproteobacteria (68%),
Actinobacteria (16%) y Bacillales (10%) (Tabla 8).
Entre estos se encontraron las siguientes bacterias entre las
gammaproteobacterias Acinetobacter sp. (10%), Pseudomonas aeruginosa (16%),
Pseudomonas beteli (5%), Pseudomonas fluorescens (5%), Acinetobacter
baumannii (16%) , Stenotrophomonas acidaminiphila (10%), Stenotrophomonas
maltophilia (5%). Entre el grupo de las Actinobacterias Arthrobacter sp. (5%),
Microbacterium arborescens (5%), y Microbacterium barkeri (5%) . Entre el grupo
66
de los Bacillales Bacillus sp (10%). Y finalmente entre el grupo de
alfaproteobacterias Ochrobactrum intermedium (5%).
La bacteria recuperada y aislada de los lodos utilizados para el
mantenimiento de las carreteras fue del género Acinetobacter sp., con una
similaridad del 100% (Tabla 8). Las bacterias más comunes encontradas en el
suelo de la carretera evaluado fueron Pseudomonas sp. (26%) y Acinetobacter sp
(36%).
En el presente estudio se observó una gran variedad de bacterias
degradadoras de HCs aisladas e identificadas durante el estudio. Estas bacterias
han sido reportadas anteriormente como degradadoras de HCs en ambientes
terrestres. Debido a la amplia ubicuidad del género Pseudomonas sp. se han
podido recuperar de una gran variedad de ambientes terrestres contaminados con
HCs de sedimentos anaerobios (Herrick et al., 1993; Song et al., 2000), suelos
aerobios con bajas temperaturas (Eriksson et al., 2003) . Además Pseudomonas
fluorescens en suelos cercanos a una refinería en India (Barathi y Vasudevan,
2001). Eriksson y colaboradores (2002), evaluaron las vías metabólicas de
Pseudomonas putida en biopelículas degradadoras de pireno.
Song y colaboradores (2000) aislaron Ochrobactrum sp., de sedimentos en
ríos y estuarios contaminados con HCs bajo condiciones denitrificantes. El género
Acinetobacter sp., tambien ha sido reportado como degradador en suelos
arenosos contaminados con altas concentraciones de crudo (Saadoun, 2002), en
suelos contaminados con tolueno (Chao y Hsu, 2004), en suelos alpinos arenosos
(Margesin et al., 2003a), y como degradadora de parafinas en contaminación por
aceites usados en suelo (Koma et al., 2001) . Adicionalmente, se ha reportado este
género como degradador de acil-ciclohexanos (Koma et al., 2003).
67
Tabla 8. Identificación molecular de las 19 cepas de bacterias degradadoras de HCs
No. Secuencia más cercana
GenBank Identidad
%
similaridad Grupo filogenético
1 Ochrobactrum intermedium 1133/1136 99 alfaproteobacteria
2 Pseudomonas aeruginosa 1177/1177 100 gammaproteobacteria
3 Acinetobacter baumannii 1115/1198 93 gammaproteobacteria
4 Acinetobacter baumannii 1113/1187 93 gammaproteobacteria
5 Acinetobacter baumannii 1191/1191 100 gammaproteobacteria
6 Stenotrophomonas
acidaminiphila 1198/1198 100 gammaproteobacteria
7 Pseudomonas beteli 1191/1196 99 gammaproteobacteria
8 Pseudomonas aeruginosa 1184/1184 100 gammaproteobacteria
9 Stenotrophomonas
maltophilia 1196/1196 100 gammaproteobacteria
10 Bacillus sp. 1204/1204 100 Bacillales
11 Acinetobacter sp. 1189/1189 100 gammaproteobacteria
12 Acinetobacter sp. 1183/1188 99 gammaproteobacteria
13 Pseudomonas aeruginosa 1184/1184 100 gammaproteobacteria
14 Pseudomonas fluorescens 1189/1189 100 gammaproteobacteria
15 Stenotrophomonas
acidaminiphila 1197/1197 100 gammaproteobacteria
16 Bacillus sp. 1201/1202 99 Bacillales
17 Microbacterium barkeri 1137/1176 96 Actinobacteria
18 Arthrobacter sp. 1067/1185 90 Actinobacteria
19 Microbacterium
arborescens 1154/1174 98 Actinobacteria
68
Acinetobacter baumanii ha sido reportada específicamente como tolerante y
degradadora de crudo bajo condiciones de laboratorio (Koren et al., 2003). En un
estudio realizado por Rahman y colaboradores (2003) evaluaron consorcios de
microorganismos degradadores de HCs, donde la presencia de Pseudomonas sp.,
Bacillus sp., y Acinetobacter sp., mostró altas tasas de biodegradación de ACPM y
gasolina además de obtener producción de biosurfactantes (Rahman et al., 2003).
Chao y Shu (2004) evaluaron los cambios en la diversidad de un suelo aluvial tras
la adición de un consorcio de bacterias degradadoras como Bacillus sp.,
Pseudomonas sp. y Acinetobacter sp.
Mills y colaboradores (2003), aislaron de suelos contaminados con HCs
Bacillus sp. y gammaproteobacterias como Stenotrophomonas sp., capaces de
degradar. Un año antes Juhasz y colaboradores (2002) aislaron
Stenotrophomonas maltophilia de suelos cercanos al puerto de Melbourne
(Australia), la cual fue utilizada para estudios posteriores en la degradación de
benzoαpireno bajo condiciones de laboratorio.
El género Arthrobacter sp., también ha sido utilizado como bacteria
degradadora en suelos contaminados con tolueno (Chao y Hsu, 2004). Finalmente
Microbacterium sp., ha sido reportada como bacteria degradadora de HCs, en un
estudio realizado por Calvaca y colaboradores (2004), donde aislaron a
Microbacterium sp. de un suelo contaminado con HCs aromáticos cercano a una
fábrica de pinturas en Milán.
De acuerdo a la revisión realizada en este estudio, la mayoría de estudios
han evaluado el comportamiento e identificado los microorganismos degradadores
de HCs de peso molecular ligero, o HCs solubles en agua.
69
5.6 Análisis de las muestras de agua de lixiviado en las columnas
Para los tratamientos TA, TB, TC, CL se obtuvieron durante todos los EM
cantidades adecuadas de agua (500 ml) para al análisis de los parámetros
fisicoquímicos y de nutrientes. Sin embargo, para el tratamiento D (sin
precipitación) se pudo recolectar lixiviado sólo hasta el último muestreo, debido a
que este tratamiento no recibía precipitación y las cantidades de agua
recolectadas no eran suficientes para su uso en los análisis fisicoquímicos
evaluados. De igual forma, para el control CC no se pudo realizar la determinación
de ningún análisis en el último EM (129 días) debido a que entre los días 81 y 129
no se presentaron lluvias en campo.
5.6.1 pH
En el estudio los valores de pH en el agua de lixiviado en los tratamientos
evaluados se mantuvieron en el rango de 5.81-7.29. No se observó un efecto
significativo de los diferentes caudales evaluados (tratamientos), ni en los
controles utilizados (control en campo y control con suelo sin HCs) sobre el valor
de pH durante el estudio (MANOVA, p<0.05, n=40) (Figura 27). Adicionalmente,
no se observó el descenso observado en los resultados del pH del suelo in situ o
en los tratamientos. Sin embargo, siempre se observaron valores más bajos en
agua que en suelo.
70
5,5
6
6,5
7
7,5
8
TA TB TC TD CC Tratamientos
pH
0 días 44 días 83 días 129 días
Figura 27. Valores de pH determinados en el agua de lixiviado. Las barras de error representan una desviación estándar (n=40). TA: mayor precipitación, TB: precipitación media, TC: menor precipitación, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC. 5.6.2 Hidrocarburos totales del petróleo
Las concentraciones de TPH de lixiviado observadas durante el estudio en
columnas fueron bajas (Tabla 9). Se observó que las concentraciones de los 3
primeros EM (0-81) fueron significativamente más bajas que las observadas en el
último muestreo (MANOVA, p<0.05, n=40).
Como parte del control de calidad del estudio se utilizaron dos muestras de
agua preparadas en el laboratorio, la primera sin contaminar y la segunda
contaminada con 100 mgACPM/L. Los resultados del laboratorio analítico fueron
de 0.6 y 8.3 mgTPH/L, respectivamente. Los resultados podrían indicar fallas en
la exactitud del laboratorio analítico durante los análisis de las muestras de agua
de los lixiviados de las columnas. Con base en la muestra control enviada al
laboratorio, la técnica empleada solamente tendría un porcentaje de recuperación
del 8.3%.
Tiempo (Días)
71
Tabla 9. Concentraciones de TPH en el agua de lixiviado durante el estudio.
TPH (mg/L) Tratamiento
1er EM 2do EM 3ro EM 4to EM
A <0.5 <0.5 10.4
B <0.5 <0.5 1.6
C
<0.5
<0.5 <0.5 1.05
CL - <0.5 2 <0.5
CC <0.5 <0.5 <0.5 -
TA: mayor precipitación, TB: precipitación media, TC: menor precipitación, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC (n=40).
5.6.3 Nutrientes
No se observaron diferencias significativas en la concentración de los
nutrientes evaluados (amonio y fósforo) y los diferentes tratamientos (MANOVA,
p<0.05, n=40) (Figura 28). Sin embargo, las concentraciones de amonio para el
día 0 (0.23+0 mg/L) fueron significativamente más bajas que las concentraciones
observadas para el día 83 (0.87+0.88 mg/L) (Tuckey, p<0.05, n=40).
Para las concentraciones de fósforo en el agua de lixiviado se observó que
en el día 0 (0.06 mg/L) fueron significativamente más bajas que las observadas en
el día 44 (2.31+0.35mg/L) (Tuckey, p<0.05, n=40) (Figura 28).
Las bajas concentraciones de TPH en los lixiviados demostraron un bajo
aporte de la lixiviación a la AN de HCs en la carretera del estudio. Posiblemente la
lixiviación (transporte) de las fracciones más pesadas que conforman los lodos,
son mucho más lentas. Este resultado es similar al reportado por Marguesin y
Schinner (2001) donde estudiaron la lixiviación de HCs en un montaje de
columnas con suelos arenosos alpinos durante tres años observando
concentraciones de <0.1mgTPH/L.
72
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
TA TB TC TD CC CL
mg
NH
4+/L
0
1
2
3
4
5
6
TA TB TC TD CC CL Tratamientos
mgP
/L
0 días 44 días 83 días 129 días
Figura 28. Valores de las concentraciones de nutrientes en el agua de lixiviado. A) amonio y B) fósforo. Las barras de error representan una desviación estándar (n=40). TA: mayor precipitación, TB: precipitación in situ, TC: menor precipitación, TD: sin precipitación, CC: control en campo y CL: control de suelo sin HC.
De igual forma en el presente estudio se observó que las concentraciones
de nutrientes fueron bajas en los lixiviados de los tratamientos evaluados en las
columnas (precipitaciones simuladas de 1000 ml/d, 666 ml/d y 183 ml/d). Los
nutrientes (nitrógeno y fósforo) pudieron ser inmovilizados en la matiz del suelo
A
B
Tiempo (Días)
73
como apatita (Margesin y Schinner, 2001) o consumidos antes de ser lavados de
la columna de suelo obteniendo bajas concentraciones de nutrientes en lixiviado.
Adicionalmente, las bajas concentraciones de HCs observadas durante el
estudio en los lixiviados de las columnas de suelo pudieron deberse al montaje
usado para la recolección de los lixiviados para los tratamientos . Ya que se utilizó
una botella de 500 mL con el fin de recolectar los lixiviados en cada evento de
muestreo. Sin embargo muchos de los tratamientos produjeron un volumen mayor
de la capacidad de la botella y esto pudo ocasionar perdida de los HCs en la
muestra por dilución de la muestra.
5.7 Correlaciones
Se observó que existe una correlación positiva que entre la humedad y el
pH y los degradadores in situ (Pearson, p<0.05, n=84) (Anexo 7). Por el contrario
en el presente estudio no se observó una relación en la concentración de TPH y el
recuento de microorganismos degradadores (Figura 29). Marguesin y
Colaboradores (2003) no observó una correlación en la concentración de TPH y
los recuentos de microorganismos degradadores en suelos alpinos contaminados
con HCs, lo cual afirma el hecho que los microorganismos degradadores están
presentes en la mayoría los ambientes (gran ubiquidad) y no dependen del
substrato. Aún cuando existen otros estudios que demuestran esta correlación
(Dibble y Bartha, 1979; Cunningham, y Philp, 2000; Eriksson, et al., 2000).
74
0
1
2
3
4
5
6
-2 0 44 81 129
Loga
ritm
o
0
5
10
15
20
25
mg/
Kgp
s
0
1
2
3
4
5
6
7
-2 0 44 81 129
Loga
ritm
o
0
5
10
15
20
25
30
35
mg/
Kgp
s
0
1
2
3
4
5
6
7
0 44 81 129
Loga
ritm
o
-505101520253035404550
Tiempo (Días)
mg/
Kgp
s
Degradadores TPH nitrógeno Fósforo
Figura 30. Correlación de degradadores, concentración de TPH y nutrientes (nitrógeno y fósforo) in situ A)5 cm, B) 50 cm y C) 80 cm. Las barras de error representan una desviación estándar.
A
B
C
75
Entre variables en las columnas existió una correlación negativa (Pearson,
p<0.05, n=44) (Anexo 8) entre el recuento de heterótrofos y la concentración de
amonio en el agua de lixiviado. Además, de una correlación positiva entre el pH
del suelo y el recuento de heterótrofos (Pearson, p<0.05, n=44) (Anexo 8).
También se observó que existe una cor relación negativa (Pearson, p<0.05, n=44)
(Anexo 8) entre la concentración de amonio y el pH del suelo, debido a que un
incremento en el valor de pH, estimularía el crecimiento de heterótrofos lo que
llevaría a un mayor consumo de amonio.
Aunque se observaron buenas constantes de degradación, con un
porcentaje del 50% de degradación con concentraciones de TPH bastante altas ,
es necesario tener en cuenta que estos resultados presentaron una alta
variabilidad debido a las propiedades inherentes del tipo de muestra estudiado
(suelo). Esta degradación puede atribuirse a otros factores aparte de la
biodegradación debido a que las concentraciones observadas de nutrientes
(balance de masas) no eran suficientes para la degradación de los TPH presentes
en la carretera. Además de la baja lixiviación observada y variabilidad inherente al
tipo de muestra estudiado (suelo).
Aún en las condiciones menos favorables (altas temperaturas, bajas
concentraciones de nutrientes, baja humedad) los recuentos de microorganismos
degradadores fueron buenos, indicando la presencia ubicuota de estos en el
ambiente.
Entre las ventajas de realizar una evaluación de la AN sobre metodologías
de remediación activa se tienen que se pueden generar una menor cantidad de
desechos, una menor alteración en receptores biológicos cercanos, un menor
impacto humano y un bajo costo (EPA, 1999a; EPA, 1999b). Sin embargo, el
tiempo de degradación puede ser bastante largo (dependiendo las condiciones
ambientales y el tipo de HCs presente). Es necesario realizar una adecuada
76
caracterización de las condiciones del área con la posibilidad que se aumente el
riesgo de migración o movilización de ciertas fracciones de HCs a ambientes más
sensibles. Así mismo cuando las concentraciones de HCs son muy elevadas y se
mantienen por largos periodos de tiempo es necesario realizar un cambio en la
técnica de remediación pasiva por una activa como la bioestimulación o la
bioaumentación (EPA, 1999b).
77
7. CONCLUSIONES
• Durante el estudio se observó una degradación del ~50% de los TPHs,
utilizados en el mantenimiento de las carreteras sin pavimentar, por
procesos de la atenuación natural (escorrentía, UV, etc), aún teniendo en
cuenta la alta variabilidad de los datos .
• Factores como el bajo contenido de agua, bajas concentraciones de
nutrientes (nitrógeno y fósforo) y la presencia de altas concentraciones de
hidrocarburos de alto peso molecular pudieron limitar una mayor
biodegradación de los TPHs
• Aunque se presentaron bajos recuentos de microorganismos degradadores
in situ (102-103/gps) estos recuentos pueden ser suficientes llevar a cabo
una biodegradación como parte de la AN. La presencia de degradadores en
esta tipo de suelos (arena de río), confirman su amplia distribución.
• Durante el presente estudio se aislaron e identificaron molecularmente
bacterias degradadoras de HCs donde las más abundantes fueron
Pseudomonas sp. (26%) y Acinetobacter sp. (26%) Este tipo de estudios
puede llevar a un conocimiento mas completo de la diversidad de los
microorganismos involucrados en la degradación de HCs en Colombia.
• El proceso de lixiviación, como parte de la atenuación natural de
hidrocarburos en la carretera, no parece ser el proceso predominante
durante la reducción de TPHs (<0.5 mg/L), posiblemente por la presencia
de HCs de cadenas largas y alto peso molecular los cuales tienen muy baja
movilidad en la columna de suelo.
78
• El uso de las columnas permitió comparar los parámetros ambientales
(bióticos y abióticos) in situ y de laboratorio durante el desarrollo del modelo
para el estudio de la atenuación natural de en la degradación de
hidrocarburos.
• Una evaluación más completa de otros factores (p.e., volatilización,
adsorción, escorrentía, etc.) de la atenuación natural y un periodo de tiempo
mayor permitiría una determinación del destino de los hidrocarburos
utilizados como supresores de polvo en el mantenimiento de carreteras sin
pavimentar.
79
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90
ANEXO 1
Solución Buffer (Standard-Methods 2000).
Solución 1. Fosfato de potasio
34 g KH2PO4
500 ml H2O desionizada
Ajuste pH a 7.2-7.5 con NaOH 1N y diluya a 1000 ml con H2O desionizada.
Solución 2. Cloruro de Magnesio
81.1 g. MgCl26H2O
1000 ml H2O desionizada
Tome 1.25 ml. de la solución 1 y 5 ml de la solución 2, lleve a 1 litro de H2O
desionizada y autoclave a 121ºC durante 15 min.
91
ANEXO 2
Agar infusión suelo, AIS
El agar infusión suelo esta compuesto de agar nutritivo y de una infusión de suelo,
esta infusión se obtiene al filtrar la mezcla de 1000 mL de agua destilada con 250
g de suelo del mismo lugar de muestreo (ASM, 1986) .
600 ml Agua destilada
400 ml Infusión suelo
20 g Agar nutritivo
Agite y autoclave a 121ºC por 15 min.
Infusión suelo
250 g Suelo
1000 ml Agua desionizada
Agite y caliente sin hervir durante 15 min y filtre.
92
ANEXO 3
Bushnell-Haas
0.2 g MgSO4 . 7H2O
1.0 g K2HPO4
1.0 g KH2PO4
0.005 g FeCl3
1.0 g NH4NO3
0.02 g CaCl2
Llevar a 1 litro de agua desionizada, ajustar pH a 7-7.2, con HCl. Esterilizar por
autoclave 15 min.
INT al 0.3%
Se pesa 3 g. para 1000 ml de agua desionizada estéril (121 ºC por 15 min), se
agita durante 1 hora.
93
ANEXO 4
Análisis de NMP con MPN calculator, versión 4.04, EPA, 1996
Una vez obtenido la relación de pozos positivos y negativos de NMP, estos
datos se ingresan al MPN calculador (este programa opera en DOS).
Se elige el número de diluciones, la cantidad de réplicas por dilución y la
muestra inicial (p.e., 20 µl de muestra inicial equivalen a 0.02 ml), luego se escoge
la opción de diluciones seriadas.
Una vez se ingresan las anteriores opciones se procede a introducir los
datos. Es necesario incluir todas la diluciones aún cuando estas no se hayan
hecho directamente en la técnica (p.e., si en la técnica se utilizaron las diluciones
104, 105, 106 y 107, en el momento de ingresar las diluciones al programa se
ingresan desde 101). Se asume que las diluciones menores darán todos los pozos
positivos.
Finalmente el valor obtenido se expresa como NMP/ml de muestra, sin
embargo cuando se trabaja con suelo, es necesario realizar las conversiones
necesarias. Por lo tanto es necesario convertir el resultado de ml a g de peso
húmedo, luego eso cuanto equivale en 10 g (de la muestra utilizada) y finalmente
convertirlo a gramos de peso seco (FPS).
94
ANEXO 5
Ecuaciones de la línea de tendencia para la degradación de TPH durante el
estudio in situ.
Ecuación de la recta Profundidad
(cm) estudio dias 2 al 44 días 44-129
5 Y=-0.0903x+4.6798 Y=-0.1985x+4.8229 Y=-0.0554x+4.5080
50 Y=-0.1245x+2.8293 Y=-0.0878x+2.7860 Y=-0.3979x+3.2817
80 Y=-0.2655x+3.2618 Y=-0.1282x+2.4834 Y=-0.2176x+2.9922
95
ANEXO 6
Ecuaciones para el balance de masas in situ.
Se tiene que la mejor relación de nutrientes es 100:10:1 C:N:P
10010
×=Kgmg
CKgmg
Nf
Nf: el nitrógeno final que se necesita para una balance de nutrientes
C: la concentración de carbono que contiene la muestra
1001
×=Kgmg
CKgmg
Pf
Pf: El fósforo necesario para que exista un balance de nutrientes
C: concentración de carbono inicial en la muestra
96
ANEXO 7
Análisis multivariado in situ y en columnas
Análisis de normalidad (Statistix 88.0) Shapiro-Wilk para los datos in situ
Ho= Hay distribución normal en las variables Ha= No existe distribución normal en las variables
Variable N W P
pH 84 0.9647 0.0210
Humedad 84 0.9123 0.0000
Log UFC/gps 84 0.9696 0.0439
Log NMP/gps 79 0.9423 0.0014
Log TPH/gps 83 0.9302 0.0002
97
MANOVA (SPSS 10.05) para los datos in situ
Ho= No hay diferencias entre las medias Ha= Hay diferencia entre medias
Variable independiente Variable dependiente gl F P
Tiempo (Días) pH 4 32,533 ,000
Humedad 4 10,435 ,000
Log_TPH 4 17,374 ,000
Log_UFC 4 2,210 ,076
Log_NMP 4 15,817 ,000
Muestra pH 1 ,980 ,326
Humedad 1 ,203 ,654
Log_TPH 1 ,387 ,536
Log_UFC 1 ,453 ,503
Log_NMP 1 ,135 ,714
Profundidad pH 2 1,658 ,198
Humedad 2 4,143 ,020
Log_TPH 2 143,613 ,000
Log_UFC 2 ,013 ,988
Log_NMP 2 3,900 ,025
Cuadrante pH 2 ,122 ,885
Humedad 2 ,443 ,644
Log_TPH 2 1,229 ,299
Log_UFC 2 2,980 ,057
Log_NMP 2 4,270 ,018
98
MANOVA (SPSS 10.05) para las concentraciones de nutrientes in situ
Ho= No hay diferencias entre las medias Ha= Hay diferencia entre medias
Variable independiante Variable dependiente gl F P
Cuadrante Amonio 2 ,593 ,557
Nitrato 2 ,669 ,517
Fósforo 2 ,852 ,433
Muestra Amonio 1 ,182 ,672
Nitrato 1 ,983 ,327
Fósforo 1 ,107 ,745
Profun didad Amonio 2 ,358 ,701
Nitrato 2 ,460 ,634
Fósforo 2 ,168 ,846
Tiempo (días) Amonio 4 1,348 ,266
Nitrato 4 4,708 ,003
Fósforo 4 3,512 ,014
Análisis de normalidad (Statistix 8.0) Shapiro-Wilk para los datos en
columnas
Ho= Hay distribución normal en las variables Ha= No existe distribución normal en las variables
Variable N W P
Humedad 44 0.8321 0.0000
pH suelo 44 0.9517 0.0637
Log UFC/gps 43 0.5380 0.0000
Log NMP/gps 44 0.2946 0.0000
pH lixiviado 40 0.8990 0.0024
Amonio lix 40 0.8192 0.0000
Fósforo lix 40 0.7206 0.0000
99
MANOVA (SPSS 10.05) para los datos en columnas
Ho= No hay diferencias entre las medias Ha= Hay diferencia entre medias
Variable independie nte Variable dependiente gl F P
Muestreo Log UFC/gps 3 7,967 ,000
Log NMP/gps 3 12,381 ,000
pH lixiviado 3 ,090 ,965
Fósforo lixiviado 3 5,019 ,006
Amonio lixiviado 3 3,389 ,029
Humedad 3 4,611 ,008
pH suelo 3 48,344 ,000
Tratamiento Log UFC/gps 5 2,501 ,050
Log NMP/gps 5 1,685 ,166
pH lixiviado 5 4,859 ,002
Fósforo lixiviado 5 2,516 ,049
Amonio lixiviado 5 ,251 ,936
Humedad 5 4,052 ,006
pH suelo 5 2,651 ,040
Muestra Log UFC/gps 1 ,271 ,606
Log NMP/gps 1 ,014 ,907
pH lixiviado 1 ,052 ,821
Fósforo lixiviado 1 ,780 ,383
Amonio lixiviado 1 1,466 ,235
Humedad 1 ,471 ,497
pH suelo 1 ,016 ,899
100
ANEXO 8
Análisis de correlaciones (SPSS 10.05) in situ
Matriz de correlaciones (coeficientes y nivel de significancia) para los parámetros
evaluados durante el estudio in situ (n=84).
Humedad pH Log
TPH/gps
Log
NMP/gps
Log
UFC/gps
Pearson 1,000 ,552** ,001 ,358** ,067 Humedad
Sig. , ,000 ,996 ,001 ,542
Pearson 1,000 -,192 ,548** ,050 pH
Sig. , ,081 ,000 ,652
Pearson 1,000 -,167 ,060 Log TPH/gps
Sig. , ,128 ,588
Pearson 1,000 ,178 Log NMP/gps
Sig. , ,106
Pearson 1,000 Log UFC/gps
Sig. ,
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
101
Análisis de correlaciones (SPSS 10.05) en columnas
Matriz de correlaciones (coeficientes y nivel de significancia) para los parámetros
evaluados durante el estudio en el laboratorio.
Log
NMP/gps
Log
UFC/gps Amonio Fósforo pH lix pH suelo Humedad
Pearson 1,000 ,214 ,052 -,063 ,200 ,051 -,126 Log
NMP/gps Sig. , ,168 ,738 ,684 ,194 ,740 ,414
Pearson 1,000 -,350 -,079 ,110 ,455 ,296 Log
UFC/gps Sig. , ,021 ,615 ,482 ,002 ,054
Pearson 1,000 ,031 ,398 -,432 -,222 Amonio
Sig. , ,842 ,007 ,003 ,147
Pearson 1,000 ,289 -,047 ,102 Fosforo
Sig. , ,057 ,763 ,511
Pearson 1,000 ,094 ,069 pH lixiviado
Sig. , ,542 ,656
Pearson 1,000 ,471 pH suelo
Sig. , ,001
Pearson 1,000 Humedad
Sig. ,
* La correlación es significante al nivel 0,05 (bilateral).
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
102
ANEXO 9
MANOVA (SPSS 10.05) de las variables evaluadas in situ y en columnas
Ho= No hay diferencias entre in situ y columnas Ha= Hay diferencia entre in situ y columnas
Variable
independiente
Variable
dependiente gl F P
in situ-columnas pH 1 11,463 ,001
Humedad 1 ,426 ,516
Log UFC/gps 1 2,088 ,154
Log NMP/gps 1 1,404 ,241
