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EVALUACION MORFOLOGICA DE LOS EMBRIONES G. A. Palma Desarrollo embrionario. Nomenclatura Después de su liberación, el ovocito es "atrapado" por las fimbrias del infundibulum y dirigido al interior del oviducto a través de la actividad ciliar. El ovocito bovino, fertilizado o no, es una célula de 150-190 m de diámetro (LINDNER y col. 1983), incluyendo a la zona o membrana pelúcida, una capa acelular glicoproteica (NODEN y NAHUNTA, 1985) de 12 a 15 m de espesor producida por el ovocito (DIETL, 1986). En la ampolla del oviducto la fecundación desencadena el comienzo del desarrollo previo a la nidación del embrión. Pocas horas después de la fusión nuclear el cigoto comienza a dividirse. La división nuclear es mitótica y las nuevas células se denominan blastómeros. El desarrollo del embrión hasta los 8 días ocurre dentro de la zona pelúcida. En los primeros 6 días de desarrollo no se manifiesta aumento de tamaño, sólo el incremento del número de blastómeros. La edad del embrión es establecida a partir del día del estro (d0). Al d1 le corresponde la ovulación. De esta forma entre 24 y 36 h después de la fertilización el cigoto de una célula se divide en 2 células ovales (d2, Fig. 1); 24 h más tarde (d3) el embrión cuenta ya con 4 células. La división de los blastómeros puede cumplirse en forma asincrónica, razón por la cual es posible observar en estadios tempranos un número impar de células. El intervalo entre la división más temprana y la más tardía es de alrededor de 4h (PEDERSEN, 1988). Hasta el estadio de 8 células (d4) el cigoto es transportado a través del oviducto. El día 5 -aproximadamente- se produce el ingreso al cuerno uterino en estadio de 16 células, momento a partir del cual es posible obtener el embrión en forma no quirúrgica y evaluarlo de acuerdo a su estadio y calidad. Dentro del 5o dia el cigoto continúa su desarrollo a 32 blastómeros y su forma es similar a la de una mora, razón por la cual se lo denomina mórula temprana (Foto 1), en la cual es posible distinguir individualmente a los blastómeros. Su masa celular ocupa casi todo el espacio perivitelino. Mórula compacta Mc, d 5-6, aprox. 32-64 blastómeros. Sus blastómeros están unidos y constituyen una masa compacta que ocupa sólo el 60-70% del espacio perivitelino (Foto 2). La compactación es considerada como uno de los signos de diferenciación embrionaria (PEDERSEN, 1988), aunque los blastómeros conserven su capacidad totipotente. Blastocisto temprano Bt, d7 100-200 células. Se caracteriza por el comienzo del transporte de fluido en las células trofoectodérmicas y por la formación de una cavidad (blastocele) en el interior del embrión, dando la apariencia de un anillo de sello (LEIBO, 1985). El Bt ocupa 70-80% del espacio perivitelino. Es posible diferenciar el trofoblasto de la masa celular interna (Foto 3). Blastocisto B, d 7-8, 100-200 células. Existe una marcada diferenciación entre las células del trofoblasto, que constituyen una pared -que se adosa a la zona pelúcida- y la masa celular interna (o disco embrionario) más oscura (Foto 4). Blastocisto expandido Be, d 7-8, más de 200 células. El diámetro aumenta considerablemente (1,2 a 1,5x), con el consecuente adelgazamiento de la zona pelúcida a 1/3 de su espesor original (Foto 5). La presión creciente del blastocisto en crecimiento provoca la ruptura de la zona pelúcida, a través de la cual comienza su protrusión (foto 5, 6, y 7). Los embriones recuperados en este estadio se pueden colapsar temporalmente, esto se caracteriza por una pérdida completa o parcial del blastocele. Blastocisto protruido Bp, d 8-9, 200-800 células. Los embriones han abandonado la zona pelúcida. Su forma puede ser esférica, con un blastocele bien definido ("burbuja") o colapsado. La identificación en este estadio puede ser dificultosa para el operador inexperto (Foto 8). Los Bp pueden ser igualmente

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transferidos, sin embargo, los embriones desprovistos de la zona pelúcida son extremadamente frágiles y pegajosos, razón por la cual se acostumbra a transferir estadios de Mt a Be. En condiciones naturales, el ovocito liberado y fertilizado sigue el desarrollo mencionado anteriormente. Sin embargo, los ovocitos producidos por hembras superovuladas, en muchos casos, no son liberados simultáneamente sino en un período de varias horas (LINDNER, 1983, ver tabla 3), CALLENSEN y col. (1986) observaron que vacas superovuladas comenzaban a ovular 24h después del pico de LH prolongándose la ovulación aún 33h después del mismo. En consecuencia, los ovocitos liberados no son fertilizados en el mismo momento. También puede ocurrir que el desarrollo de los ovocitos, fertilizados al mismo tiempo, no sea sincrónico. La consecuencia práctica de estos fenómenos es que los embriones obtenidos de una vaca donante se encuentren en diferentes estadios de su desarrollo (mórulas y blastocistos). Estas diferencias pueden ser encontradas en una donante como también entre donantes, son dependientes del tipo de tratamiento hormonal y no son consideradas como anómalas siempre que la asincronía no exceda los valores preestablecidos (ver Tablas 1, 2 y 3). Las donantes difieren en su respuesta superovulatoria por factores que dependen de sus cualidades genéticas, edad, estado fisiológico y salud reproductiva. Todos estos factores se traducen en diferencias cuanti- y cualitativas. Las últimas son importantes de reconocer para determinar qué embriones están en condiciones de desarrollar y concluir en un ternero vivo, qué embriones están degenerados y cuáles presentan anormalidades que permiten tener solo reducidas expectativas de sobrevida (SHEA y col., 1976). Tabla 1: Cronograma normal del desarrollo de los embriones d6-9 después de un tratamiento

superovulatorio con PMSG (eCG), KAUFFOLD y col. (1985)

Estadios de desarrollo Tipo de desarrollo

d6 d7 d8 d9

Normal

Mt

Mc

B

Bp

Bt Be Be B Ligeramente retrasado (24 h)

16 blastómeros Mt

Mc B

Bt Be Retardado (48 h) 8 blastómeros 16 blastómeros Mt Bt

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Fig. 1: Desarrollo y tránsito embrionario en el tracto genital

Evaluación morfológica Criterios La evaluación morfológica de un embrión considera los siguientes criterios sobre las estructuras y cualidades de un embrión de excelente calidad:

Forma esferoide Simetría de los blastómeros Apariencia clara y neta de los blastómeros. Tonalidad oscura y uniforme Uniformidad de la membrana celular Proporcionalidad entre el embrión y el espacio perivitelino. Integridad de la zona pelúcida Ausencia de vacuolas en el embrión y bridas celulares en el espacio perivitelino Ausencia de detritus celulares adheridos a la zona pelúcida Compactación de los blastómeros entre si



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Foto 1: Mórula temprana d 5 (Mt GII)

Foto 2: Mórulas compactas d 6 (Mc GI-II)

Foto 3: Blastocistos tempranos d 7 (Bt G I)

Foto 4: Blastocistos d 7 (B GI)

Foto 5: Blastocistos expandidos protruyendo d8

(Be GI) Foto 6: Blastocisto expandido protruyendo d 8 (Be

GI)

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Foto 7: Blastocistos expandidos d 8-9 (Be GI-II)

Foto 8: Blastocisto protruido y zona pelúcida 8-9

(Bp GI)

Foto 9: Blastocistos protruido d 8-9 (Bp GI y III), 16x Foto 10: Blastocisto protruido (Bp GI) d 9-10 y embrión degenerado (GIV)

Grados de calidad La determinación del grado de calidad del embrión permite caracterizar en términos (más o menos) cuantitativos las posibilidades de desarrollo y posterior nacimiento de un ternero a partir del embrión obtenido (tabla 4). Los diferentes grados de calidad son determinados por medio de la observación microscópica de la morfología con ayuda de una lupa estereoscópica (0,7-6,4x). Existen distintas escalas de calidad embrionaria, desarrolladas por distintos equipos de trabajo. Tanto la observación per se, como la diferenciación entre un grado y otro es subjetiva y depende, en gran parte, de la experiencia del operador. G I: Excelente, el desarrollo corresponde al día de la recolección. No existen defectos visibles. Los

blastómeros son claramente visibles, de color y estructura uniformes, simétricos, de forma esferoide y la zona pelúcida está intacta (Fotos 2, 5-8 y 10)

G II: Bueno, el embrión tiene muy pocos blastómeros desprendidos de la masa celular y/o posee una pequeña cantidad de detritus celulares. Su forma puede ser ligeramente irregular (Foto 2, 9).

G III: Regular, el embrión posee varios defectos: detritus celulares, forma irregular, de color muy oscuro o muy claro y/o ligero agrietamiento de la zona pelúcida (Foto 11).

G IV: Malo, el embrión posee muchos defectos: los correspondientes al G III más desarrollo retardado, seria ruptura de la zona pelúcida -el embrión puede encontrarse parcialmente fuera de ella-, forma muy asimétrica, tendencia a la desintegración como granulación o vacuolización de los



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blastómeros. Incluye también a los estadios hasta 8 células y la clara degeneración. Esta categoría es considerada como no transferible (Foto 12).

Ovocito sin fertilizar (Foto 13) KUZAN (1988) califica a los embriones en 6 categorías. Las primeras 3 coinciden con las del cuadro superior. La 4. caracteriza a los embriones de baja calidad que aún son considerados transferibles, la 5. a los degenerados y la 6. a los ovocitos sin fertilizar o a las zonas pelúcidas vacías. Un bajo número de blastómeros libres no afecta la capacidad de desarrollo del embrión, sin embargo más de 5 blastómeros separados de la masa celular o degenerados disminuyen su capacidad de sobrevivencia (KUZAN, 1988).

Foto 11: M G III

Foto 12: M G IV

Foto 13: Ovocito sin fertilizar Foto 14: Existen, como en este caso embriones, sobre los cuales el criterio y experiencia determinarán si son transferibles. Las necesidades y disponibilidad de receptoras, sin embargo, sí se transferirán

El éxito de la TE depende, entre otros factores, de una intensa experiencia en la evaluación y manipulación del embrión. Embriones clasificados como excelentes o buenos tienen una alta probabilidad de alcanzar la preñez (60-70%). Embriones calificados como dudosos pueden ser cultivados durante unas horas (2-4) -para evaluar su desarrollo- o transferidos, según el criterio del operador y los medios disponibles (No de embriones obtenidos, No de receptoras, etc.). No obstante la correcta evaluación de los embriones obtenidos, es importante tener en cuenta que existen casos en los cuales embriones calificados excelentes luego de una perfecta transferencia no concluyen en una

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preñez mientras que embriones de muy baja calidad y transferidos con dificultad, concluyeron en preñeces y nacimientos normales (ELSDEN y SEIDEL, 1990). Tabla 2: Cronograma de desarrollo embrionario (%) en varios momentos después del celo con PMSG

(n = 3301 embriones, KAUFFOLD y col., 1985)

Estadio Dias después del celo

6 7 8 Desarrollo

2-8 células 29,9 9,8 8,0

16 células 11,0 2,0 0,7 retardado

Mt 42,6 8,5 6,2

Mc 15,8 32,9 9,5 ligeramente subnormal

Bt 0,3 26,4 16,6

B 19,1 45,4 normal

Be 0,4 0,9 0,8

Bp 0,4 12,4

Tabla 3: Estadios de desarrollo de embriones recolectados en distintos momentos después del estro

(LINDNER y col., 1983).

Días después del estro

Estadio de desarrollo embrionario (% del total de embriones recuperados)

n= 1043 embriones 16

células M Mc Bt B Be Bp total embriones

5 10 55 35 - - - - 20

6 5 20 67 8 - - - 79

7 - 3 37 30 23 6 1 274

8 - - 14 21 24 36 5 499

9 - - - 7 22 4 28 171



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Tabla 4: Tasas de preñez (n) obtenidas en 5 estudios diferentes con embriones clasificados morfológicamente en distintas categorías. Revisión de BETTERIDGE y col. (1989)

Calidad*

ELSDEN & col., 1978

SHEA, 1981

LINDNER & WRIGTH, 1983

HASLER & col., 1987

HASLER & col., 1987

A 63 (173/275)

71 (5/7)

45 (130/292)

73 (4073/5521)

83 (451/542)

B 58 (88/152)

56 (576/672)

44 (128/292)

60 (181/304)

75 (307/408)

C 31 (13/42)

44 (57/130)

27 (40/149)

41 (31/76)

63 (135/214)

D 12 (5/42)

20 (10/50)

46 (6/13)

* Las clasificaciones varían entre autores. A es excelente y D malo La evaluación morfológica de los embriones es uno de los pasos más importantes para el éxito de un programa de transferencia de embriones. Determinar la transferencia de un embrión exclusivamente a través de sus cualidades morfológicas es, sin embargo, una equivocación. Otros factores como el valor del embrión en particular y también la disponibilidad de receptoras son importantes en la decisión. Es conveniente además acentuar que una estricta selección de los embriones por medio de su evaluación morfológica aumenta la tasa de gestaciones por transferencia pero, al mismo tiempo, disminuye la tasa de preñez por cada donante (BETTERIDGE y col., 1989). Bibliografía BETTERIGE, K.J., KING, W.A., RIEGER, D. 1989. Bovine embryo development from conception to collection. En:

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