Evolución de las herramientas del Laboratorio en el diagnostico de enfermedades infecciosas

Patricia Bravo

Asesoria Microbiología

Enfermedades infecciosas y Microbiología

El hombre ha evolucionado también los microbios, de ahí la necesidad de Innovar y avanzar

Enfermedades infecciosas causa muerte 24%

Cuatro Etapas de la Microbiología

� Primer periodo, especulativo, antigüedad a los primeros microscopistas.

� Segundo periodo, lenta acumulación de observaciones (desde 1675 aprox. hasta mitad del siglo XIX), inicia con descubrimiento de Leeuwenhoek.

� Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, � Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, llega hasta finales del siglo XIX, Pasteur y Koch posicionan Microbiología como ciencia experimental.

� Cuarto periodo (inicios siglo XX hasta nuestros días), estudio de microorganismos por fisiología, bioquímica, genética, epidemiología; Surgimiento de microbiología especializada (Virología, Inmunología, etc), inclusión de microbiología como Ciencia Biológica.

Microbiología Clínica ¿Que nos espera?

Necesidad:� Rapidez en Diagnóstico � Mayor estandarización � Capacidad respuesta a nuevos desafíos: agentes de bioterrorismo y patógenos emergentes. agentes de bioterrorismo y patógenos emergentes.

� Costo razonable� Presentación unitaria � Pruebas en la misma consulta médica o “pie de cama”, fuera del laboratorio.

� Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo.

¿Que se espera de Resultados de microbiología?:Obtener un organismo "culpable", la visualización.◦ Confirmación de diagnostico clínico:

� Identificación del agente

�Detección Serológica

◦ Identificación de cepa/aislamiento/subtipo

◦ Caracterización de sensibilidad a antimicrobianos.

◦ Identificación de sero-conversiones o portadores en la población.

◦ Colección de datos epidemiológicos

RUTA MICROBIOLOGICA

Sangre, HecesOrina

Biopsia de TejidoEscobillón secreción

MICROBIOLOGIA CONVENCIONAL

Muestra de Sangre (Búsqueda de Ac contra patógeno sospechoso

RUTA INMUNOLOGICA

Inmunológica (Búsqueda depatógenos microbianos

o partículas virales)Anticuerpos Fluorescentes

PACIENTE SOSPECHOSO DE

ENFERMEDAD INFECCIOSA

MICROBIOLOGIA MOLECULAR

Cultivo enriquecido,Selectivo,

Medios diferenciales

Aislamiento en cultivo Puro

Ensayos de Anticuerpos(Aglutinación, RIA, ELISA)

Identificación, con ensayos Cultivo Dependientes,

Identificación Inmunológica,Identificación Molecular

Búsqueda e identificación del Genoma del patógenoPor Hibridación Acido Nucleico PCRSusceptibilidad antibiótica

Susceptibilidad Antibiótica

(Decisión en eficacia de Terapia)

Métodos disponibles en microbiología: tradicionales y modernos

◦ Microscopia: Tinciones. – Cultivo

◦ Métodos Bioquímicos: Identificación Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana

◦ Métodos inmunológicos ◦ Métodos inmunológicos

◦ Métodos Moleculares en bacterias, virus, hongos.

Microscopia: Tinciones. - Cultivo

Características microscópicas:

◦ Estudio microscópico en fresco◦ Tinciones: forma, agrupación, estructura y tamaño.

� Tinciones primarias: Gram y Ziehl Neelsen. Microscopia óptica, electrónica, de barrido, � Microscopia óptica, electrónica, de barrido, fluorescente, campo oscuro.

Microscopia: Tinciones. - “Cultivo”:

◦ Características fenotípicas: tamizaje primario: Gram, morfología en cultivo, catalasa, oxidasa, atmosfera de crecimiento, movilidad, medios de cultivo básicos, selectivos y diferenciales.

◦ Pruebas secundarias: Determinar género del ◦ Pruebas secundarias: Determinar género del microorganismo. Cultivos medios especiales, oxido-fermentación, producción de esporas, fermentación de glucosa y pruebas primarias.

Métodos Bioquímicos: Identificación Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana

Métodos Bioquímicos: Identificación Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana

� ID y sensibilidad automatizada: bioquímicas, ABO por MIC. Mecanismos de resistencia. Aplicación de marcadores marcadores epidemiológicos.

� Datos analizados en un ordenador, que proporciona, la identificación del microorganismo y antibiograma.

Sistema

Bactec 9000 BD

BacTAlert 3D BioMerieux

Versa Trek Trek Diagnostic System

Automatización Hemocultivos

Sistema

TecnologíaSistema detecta producción de CO2 por fluorescencia

Medición de produccion de CO2 por colorimetria

Sistema con detección de gases orgánicos (02, CO2, N2,H2), por cambios de presión.

Conección a LIS Si por EpiCenter Si con Copernico Si, no opcion manejo de curvas.

Control de calidad Automatico Semi-Automatico ND *

Neutralización de antibioticos

Resinas polimericas de intercambio iónico y cationico.

Carbón activado y tierra de Neón Solo inhibe aminoglicosidos

Interferencia Coloración de Gram

Las particulas de resinas no interfieren en la coloración.

Interferencia en las botellas FAN No inteferencia.

Métodos inmunológicos

� - Aparición precoz de IgM persiste poco tiempo. Indica infección en fase aguda. (No siempre es detectable).

� - Aparición más tardía de IgG, persiste a altas concentraciones periodos altas concentraciones periodos prolongados y en ocasiones de por vida. Ayuda detección de seroconversión .

� Permiten diagnósticos indirectos y estudios epidemiológicos.

Métodos inmunológicos - diagnostico indirecto:

� -Cultivos negativos: Tratamiento ABO o agente no es cultivable.

� -Toma de muestra tardía el patógeno ya no se recupera.

-En fases sub-agudas microorganismos son � -En fases sub-agudas microorganismos son difíciles de recuperar.

� -Interpretación de un aislamiento en portadores sanos difícil.

� - Casos atípicos o asintomáticos.

� -En los casos de aislamientos mixtos

Ventajas de los métodos tradicionales

◦ Pueden captar todo lo que crece, mejor detección de infecciones mixtas

◦ Sensibilidad de los métodos establecida

◦ Organismos viables pueden ser recuperados◦ Organismos viables pueden ser recuperados

Desventajas de métodos tradicionales

� Labor intensiva

� Costoso

� Toma tiempo: lento� Toma tiempo: lento

� Una actividad ‘habilidad’ dependiente de operador

� Resultados pueden no tener una identificación definitiva.

Métodos Moleculares en bacterias, parásitos; virus, hongos.

Métodos Moleculares en bacterias, parásitos, virus, hongos.

Aplicación:• Cepas escasa descripción,

Nuevos patógenos• Cepas baja frecuencia de

aislamiento • Cepas con fenotipos atípicos• Cepas con fenotipos atípicos• Cepas difícil identificación

fenotípica• Cepas de crecimiento lento o

fastidioso• Bacterias de difícil cultivo • Antibioticoterapia• Bacterias de impacto

comunidad

Tomado de Rodicio M, Mendoza MC. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2004

Biología Molecular:

Evolución de métodos analíticos

1993 2000 2008

GeneXpert

Deteccion Virus Tiempo de diagnostico

Sensibilidad Especificidad

- Aislamiento virus 1 – 7 dias Alta* Alta**

- Hibridizacion 3 – 4 hrs Alta1 Buena

- PCR 3 – 4 hrs Alta2 Buena

- MicroscopiaElectronica

30 min Baja3 Alta

- ELISA de captura 3 – 5 hrs Buena4 Alta

Serologia

TIEMPOS DE METODOS DIAGNOSTICOS

Serologia

- ELISA 3 – 4 hrs Alta Baja

- Immunofluorescencia

2 – 4 hrs Bueno Buena

- Immunoblot 2 – 4 hrs Bueno Buena

- Neutralizacion 4 – 7 dias Bueno Alta

- HIA 2 – 4 hrs Baja Buena 1 ca. 104 part/ml,

2 ca. 200 genoma equival/ml, 3 ≥ 106 particula/ml, 4 ca. 0.01 µg antigeno/ml

* Dependiendo del sistema de cultivo

** Dependiendo del sistema de deteccion

Prof. Matthias Niedrig, RKI

Diagnostico Molecular – Pruebas basadas en ácidos nucleicos

� Amplificación (e.j. PCR): obtiene gran numero de copias de un gen.

� No requiere organismos viables � Puede ser muy sensible – pero sujeto a � Puede ser muy sensible – pero sujeto a contaminación

� Por su rapidez requiere una secuencia blanco del gen conocida

� Por lo tanto se pueden perder los desconocidos� Pruebas Moleculares están restringidas a detección (cualitativa), cuantificación (carga viral) y genotipificacion.

Diagnostico Molecular:Técnicas

� 1. Enzimas de restricción

� 2. Técnicas de separación electroforética de ácidos nucleicos

� 3. Hibridación de ácidos nucleicos� 3. Hibridación de ácidos nucleicos

� 4. Amplificación enzimática del ADN (PCR)

� 5. Microarreglos

� 6. Espectrometría de masa

Enzimas de restricción: ER

El actual aislamiento de ADN es sencillo involucra

la ruptura de las células y la posterior purificación

del componente de ADN.

◦ ER son Proteínas que reconocen secuencias especificas del ADN, con actividad de endonucleasas especificas del ADN, con actividad de endonucleasas (hacen cortes secuenciales específicos de nucleótidos en ambas hebras del DNA).

◦ Sitio de Restricción es la secuencia de nucleótidos en una pieza de DNA que una enzima de restricción corta.

Técnicas de separación electroforética de ácidos nucleicos� Electroforesis en Gel

◦ Técnica mas utilizada para estudio de macrocromoleculas: proteínas y ácidos nucleicos

◦ Moléculas cargadas pasan a través del gel de agarosa o polímeros de poliacrilamida para ser separadas:o polímeros de poliacrilamida para ser separadas:

� Las moléculas mas grandes o mas difusas se mueven mas lento, tienden a quedarse colgadas en la matriz del gel.

� Moléculas con grandes cargas se mueven mas rápido debido al voltaje eléctrico que es empleado para empujar a las moléculas a través del gel.

Hibridación de ácidos nucleicos

� La doble cadena en ADN es separada mediante un proceso físico (calor) o químico (como soda cáustica).

� Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.

� Una muestra de cadenas simples (o � Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.

� La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias se va formando una nueva molécula hibridada

Hibridación de ácidos nucleicos

� Los métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea con Radioactividad o con Fluorocromos. Esta cadena tiene una Secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como SONDA para detectar otras moléculas como SONDA para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.

� Dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan en los laboratorios de biología molecular: ◦ Método tipo Southern o Southern blot: ADN◦ Método tipo Northern o Northern blot: ARN

Hibridación de ácidos nucleicos: PCR

� La PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa, se basa en secuenciación de una fracción especifica de DNA, utiliza hibridación de oligonucleotidos para completar el proceso.

� Amplificación : Entre la desnaturalización de hebras de ADN y antes de extensión del cebador hay una unión ADN y antes de extensión del cebador hay una unión de los cebadores a la hebra de secuencia complementaria mediante una hibridación de ADN. Esto marca la especificidad de la reacción.

16S

Utilidad de PCR- RT Virologia

� Una infección viral Severa puede ser detectada en fase aguda en muestras de sangre o del sitio de infección.

� Algunos virus humanos incluyen:

HPV, Citomegalovirus, Herpes Simple virus, HPV, Citomegalovirus, Herpes Simple virus, Rotavirus, Virus Influenzae A, B, H1N1, Enterovirus

� Sub-tipificación o Cuantificación Viral – HSV, HPV, HCV

Utilidad de PCR- RT: Bacteriología

� Resultados de Microscopia dan falsos positivos:

- T.vaginalis, N.gonorrhoeae

� Patógenos Intracelulares – virus, Mycop.genitalium � Patógenos Intracelulares – virus, Mycop.genitalium

� Baja Sensibilidad – Chlamydia sp.,Neisseria sp.

� Seropositividad es común – Chlamydia sp.

� Crecimiento del Microbio es lenta – M. tuberculosis

� Cuantificación de expresión genes

� Medir Eficacia de la antibioticoterapia

� Genotipificacion

Métodos de tipificación Genotípica

�Metodos basados en Fingerprint

Perfil Plasmido, RFLP(restriction fragment length polymorphism), PFGE, AFLP

�Metodos basados Character

MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis), ribotyping (fragmentos de restriccion ribotyping (fragmentos de restriccion que contienen todos o parte de los genes codificando para el rRNA 16S y 23S), microarreglos

�Metodos basados en Secuenciacion

◦ MLST

◦ SNP=single nucleotide polymorphism typing

Minimum spanning tree of 240 strains Salmonella Enteritidis by MLVA

Tipos MRSA con PFGE & MLST

PFGE

McDougal LK et al, 2003, J Clin Microbiol 41:5113-20

Microarreglos - Microarrays

� Los chips o arrays de ADN son sondas moleculares fijadas y ordenadas sobre un soporte sólido nitrocelulosa, nylon o portaobjetos con residuos de polilisinas en disposición regular y prefijada.

� Las sondas, pueden ser clones de ADN, ARN, productos de PCR uoligonucleotidos sintéticos y previo a la hibridación se marca con

una sustancia fluorescente o radiactiva.una sustancia fluorescente o radiactiva.

� La principal ventaja: en una única prueba pueden detectarse miles de genes.

� Aplicación de arrays en microbiología clínica es escasa: a) patogenia bacteriana; b) análisis de evolución bacteriana y epidemiología molecular; c) mecanismos de acción y de resistencia antibiótica. d) diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas.

DESARROLLO MICROARRAYS

Espectrometría de masaIdentificación bacteriana mediante espectrometría de masas

(MALDI-TOF)Se emplea un espectrómetro de masas, para generar un perfil proteico

(“huella química”) que es una representación gráfica, por orden creciente

de masa frente a la abundancia relativa de las proteínas del

microorganismo.

4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z

200

400

600

800

1000

1200

1400

a.i.

Característico de cada microorganismo.

Espectrometría de masa

Veamos un Ejemplo: Tuberculosis - TBC

PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO DEL REPORTE DESDE EL DIA EN QUE SE PROCESA LA MUESTRA

EXAMEN DIRECTO Coloración de KinyounEXAMEN DIRECTO Coloración de Kinyoun

Coloración de Ziehl-Neelsen

2- 24 HORAS

DETECCION DE CRECIMIENTO

Lowestein-Jensen

Ogawa- Kudoh 20-25 DÌAS

IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE

Pbas bioquímicas tradicionales (Niacina, Catalasa, Red. Nitratos)

50-55 DIAS

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Método proporciones múltiples

60 DIAS

Tuberculosis -TBCMicroscopía Ziehl Neelsen:

Baja Sensibilidad 70 a 80%,OMS recomienda 2 o 3 frotis de muestras del caso sospechadoRequiere un técnico capacitadoLaborioso: 1-2 horas

Overall Sensitivity of AFB smear: 22-80%

Tuberculosis -TBC

Coloraciones fluoro cromáticas: Auramina O – Rodamina 2.15 hr.

Overall Sensitivity of AFB smear: 22-80%

Inmunológicas: ADA, Prueba de Interferón Gamma Quantiferon TB: ensayo de liberación de cito quinas.

Tuberculosis - TBC: Cultivo

� Cultivo Medio cultivo convencional:◦ Altamente sensible

◦ Lento: 4 a 6 semanas

MGIT 960

Tuberculosis - TBC: Cultivo 15-18 dias

Positive

Average TTD: 7days

Tuberculosis - TBC: Identificación fenotipica: 50 a 55 dias

Medio Solido

Tuberculosis – TBC: Susceptibilidad 30 dias

MGIT 960

1. Conc. Absoluta2. Metodos Proporciones3. Radio Resistencia

Average TAT: 8 wks 2-3 weeks

MMéétodo MODS :todo MODS :(M(Méétodo Susceptibilidad Directa por todo Susceptibilidad Directa por

ObservaciObservacióón Microscn Microscóópica) pica)

J. Clinic. Microbiol. p. 1093–1097 Vol. 45, Nº4

Evaluation of Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay for detection of Multidrug-Resistant Mycobacterium

tuberculosis.

Girum Shiferaw, Yimtubezinash Woldeamanue Mekdes Gebeyehu, Feven Girmachew, Daniel Demessie, and Eshetu Lemma

Tuberculosis –TBC: Molecular 2 hrs a 2 diasMétodos de Amplificación de Ácidos Nucleicos:

- Gen-Probe AccuProbe®- GeneXpert - PCR- HPLC (hrs)- HAIN

Altamente específicos.Altamente específicos.En muestras Clínicas desempeño variable:

Altamente sensible en muestraspositivas por frotis (95-100%)Hasta ahora, no tan sensible en muestrasnegativas por frotis (60-75%)

Muy sensible en cultivo :Para identificaciónPara susceptibilidad a medicamentos

Identificación correcta por HPLC de M. tuberculosis según diferentes

autores

REFERENCIA NO CEPAS

EVALUADAS

No. confir. HPCL

CONCOR. ( %)

1 649 648 99Glickman(1994)

2

Guthertz (1993)

122 122 100

3

Butler (1991)

CIB

319

82

319

80

100

98

Tuberculosis –TBC: PCR -GeneXpert

n % (IC 95%) n % (IC 95%)

Sensibilidad BK+ 893/913 97,9 (96,9-98,8) 19/19 100 (98,5-100,0)

BK-C+ 293/391 74,9 (70,6-79,2) 34/71 47,9 (36,3-59,5)

Población HIV positiva

BK-C+ 293/391 74,9 34/71 47,9

Especificidad 852/861 99,0 (98,3-99,7) 423/429 98,6 (97,5-99,7)

Paises

1 Helb D et al J Clin Microbiol. 2010 ; 48:229-37 Vietnan Uganda

2 Boehme CC et al N Engl J Med. 2010 9; 363:1005-15 Peu Azerbajan Sudafrica India

4 Marlowe EM et al . J Clin Microbiol. 2011 .Feb 2. [Epub ahead of print] EEUU

5 Moure R et al. J Clin Microbiol 2011, 49:1137-9 España

6 Malbruny B et al. Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 553-5 Francia

7 Holanda

8 Friedrich SO et al J Clin Microbiol 2011, 49:2827-31 Sudafrica

9 Ionnidis P et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3068-70 Grecia

10 Scott LE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001061 Sudafrica

11 Lawn SDE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001067 Sudafrica

Bowles EC et al Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 988-9

Tuberculosis –TBC

Oportunidad de respuesta: Resultados en tiempo real (Horas –7d).

Mejora Calidad del servicio de laboratorio.Agilizar el flujo de trabajoEstandariza, promueve precisión.Mejora vigilancia epidemiológica: oportunidad Reducción de

infecciones intrahospitalarias y brotes epidémicos.

IMPACTO DE INNOVACION EN MICROBIOLOGIA

infecciones intrahospitalarias y brotes epidémicos.Ayuda a controlar Resistencia bacteriana. Disminuye DDD antibiótica.Reducción tiempo hospitalización pacienteMejor pronostico de las enfermedades infecciosas