EVOLUCIÓN DE LAS PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EN …werfencampushemostasia.com/images/archivos/historico/C_3/... · 2017-09-26 · • La deficiencia de VFW y/o la pérdida de su capacidad

III Campus Hemostasia WerfenJosep Serra. 12 de Mayo 2016

EVOLUCIÓN DE LAS PRUEBAS DIAGNÓSTICAS EN HEMOSTASIA:

INMUNOENSAYOS

Living Immunoassay Excellence 2

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Tests de laboratorio para Coagulación• Tiempo de sangría (BT) antes de los 1950• Tiempo de protrombina (PT) 1935

Dr. Armand Quick et al. Am J Med Sci 190(4):501• Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (aPTT) 1953

Langdell et al. J. Lab. Clin. Med 41(4): 637-47• Tiempo de trombina• Mixing tests para saber la causa de un tiempo anormal de coagulación es debida

a inhibidores o a deficiencias de un factor• Plasma Deficientes de un Factor• Tests cromogénicos• Inmunoensayos• Tests Moleculares


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Inmunoensayosen Hemostasia


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El primer inmunoensayo?• A Wassermann, A. Neisser and C. Bruck. Eine serodiagnostische Reaktion bei

Syphilis. Deutsche medicinische Wochenschrift, Berlin, 1906, 32: 745-746


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Historia de los Inmunoensayos

2009AcuStar

Autoimmune Autoimmune

HemostasisHemostasis

1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010

1983Chemiluminescentimmunoassay

Anthony Campbell & Ashok Patel

Use in clinical chemistryUse in clinical chemistry

1977Nobel price

Rosalyn Yalow & Solomon Berson

1950sImmunoassay

Yalow & BersonSinger & Plotz

1971ELISA

Engvall & Perlmanvan Weemen & Schuurs


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Determinación de Fibrinógeno por LIA (I)


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Determinación de Fibrinógeno por LIA (II)


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Determinación de VWF:Ag por Immunoelectroforesis


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Rocket Inmunoelectroforesis (Laurell)

Descrito por primera vez en “Quantitative estimation of proteins by electrophoresis in agarose gel containing antibodies. Laurell CB. Anal Biochem 1966: 15-45


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Determinación de Dímero-D per ELISA


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Determinación de Dímero-D per ELISA

La determinación fiable de moléculas que comparten la mayor parte de su secuencia con sus predecesoras (Dímero-D con Fibrinógeno) sólo fue posible después del desarrollo de los anticuerpos monoclonales por Millsteinand Kohler (Premio Nobel en 1984)


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Resumen I• Los inmunoensayos en serología aparecieron a principios del siglo pasado• Hitos en la historia de los inmunoensyos:

- “Latex Fixation Test” para Factor Reumatoide (Singer and Plotz in 1956)- RIA para Insulina (Yalow and Berson 1959)- ELISA (Engvall & Perlman; van Weemen & Schuurs en 1971)- Anticuerpos monoclonales (Millstein and Kohler 1975)- CLIA (Anthony Campbell & Ashok Patel, 1983)

• La utilización de inmunoensayos de manera general en los laboratorios de hemostasia estaba ralentizada por la falta de automatización


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Automatización en elLaboratorio de Hemostasia


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Evolución hacia la automatización• En Química Clínica, los ensayos enzimáticos se automatizaron en

espectrofotómetros robotizados desde mediados de los 50

Leonard Skeggs (1956)AutoAnalyzer para medirurea, glucosa y calcio


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Evolución hacia la automatización• Los inmunensayos homogéneos, es decir, que no requieren separación, como

por ejemplo las Inmunoturbidimetrias (TIAs) y de Aglutinación de Partícuals de Latex (LIAs) se adaptaron rápidamente a estos espectrofotómetros automáticos

• Se desarrollaron instrumentos específicos para inmunoenayos


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Automatización en el Lab. de Hemostasia19851985ACL™ 810 – El primer coagulómetroautomático

20042004ACL TOP® – La plataforma automática más avanzada para tests de hemostasia

19971997ACL™ 6000 – El primer coagulómetro en incluir uninmunoensayo: D-Dimer


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Automatización en el Lab. de Hemostasia

20092009ACL TOP 700 LAS – El primer sistema de IL que se conecta al Sistema de Automatización del Laboratorio (LAS), cumpliendo los necesidades de los laboratorios más grandes y modernos de hoy en día

ACL AcuStar – El primer sistema de alta sensibilidad totalmente automatizado para los inmunoensayos de hemostasia

20092009


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Resumen II• La automatización de los inmunoensayos en el laboratorio de hemostasia no

llegó hasta mediados de los ‘90• La medida del Dímero-D fue de los primeros inmunoensayos adaptados a los

coagulómetros automáticos. Le siguió la medida de VWF:Ag• La atomatización de los inmunoensayos en los coagulómetros automáticos

(ACL-6000 – ACL-TOP) o en instrumentos dedicados (AcuStar), ha permitido la adopción generalizada de los mismos por los laboratorios de hemostasia


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Los “otros” inmunoensayosautomatizados


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Los Inmunoensayos más comunes (I)• La detección de antígeno por sándwich de anticuerpos en CLIA• La detección de antígeno por aglutinación de partículas de látex por LIA

Ensayo Fase Sólida Conjugado-ABEI TécnicaHemosIL D-DimerHemosIL D-Dimer HSHemosIL D-Dimer HS 500

mAb anti D-Dimer N/A LIA

AcuStar D-Dimer mAb anti D-Dimer mAb anti D-Dimer CLIA

HemosIL FDP mAb(s) anti anti-FDP N/A LIA

HemosIL VWF:Ag Policlonal anti-VWF N/A LIA

AcuStar VWF:Ag Policlonal anti-VWF Policlonal anti-VWF CLIA

HemosIL FXIII Ag Policlonal anti-FXIII N/A LIA

No todos los ensayos están disponibles a fecha de hoy


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Los Inmunoensayos más comunes (II)• La detección de anticuepos por captura de los mismos y revelado con un

conjugado específico para IgG, IgM o IgA humana por CLIA• La detección de anticuepos por competencia por LIA

Ensayo Fase Sólida Conjugado-ABEI Técnica

HemsoIL HIT Ab(PF4-H) mAb anti PF4-Heparina N/A LIA

AcuStar HIT Ab(PF4-H) PF4-PVS mAb anti IgG/M/A humana CLIA

AcuStar HIT IgG(PF4-H) PF4-PVS mAb anti IgG humana CLIA

AcuStar aCL IgG CL bovina/ β2GPI h. mAb anti IgG humana CLIA

AcuStar aCL IgA CL bovina/ β2GPI h. mAb anti IgA humana CLIA

AcuStar aCL IgM CL bovina/ β2GPI h. mAb anti IgM humana CLIA

AcuStar anti-β2GPI IgG β2GPI humana mAb anti IgG humana CLIA

AcuStar anti-β2GPI IgA β2GPI humana mAb anti IgA humana CLIA

AcuStar anti-β2GPI IgM β2GPI humana mAb anti IgM humana CLIA

AcuStar anti-β2GPIDomain 1 IgG

Dominio 1 de β2GPIrecombinante mAb anti IgG humana CLIA


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Los “otros” Inmunoensayos• Utilizando los mismos instrumentos, coagulómetros automáticos o

autoanalizadores de quimioluminiscencia, con esquemas distintos y conceptos distintos que no se ajustan totalmente a la definición de immunoensayo, se han podido detectar analitos que no hubiera sido posible con el esquema clásico mostrado en diapositivas anteriores

Ensayo Fase Sólida Conjugado/Otros Técnica

HemosIL Free-PS C4BP mAb anti-PS LIA

HemosIL VWF:Activity Epitope specific mAb anti-VWF N/A LIA

HemosIL Homocysteine anti-S-adenosil-L-homocisteína(SAH)

Reductor y SAHH enzima

LIA

HemosIL VWF:RCo glicoproteína 1bα N/A LIA

AcuStar VWF:RCo glicoproteína 1bα Monoclonal anti-VWF CLIA

AcuStar VWF:CB Péptido de colágeno tipo III Policlonal anti-VWF CLIA

AcuStar ADAMTS13 VWF73 mAb anti-N10 CLIA

No todos los ensayos están disponibles a fecha de hoy


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LIA o CLIA

• A parte de Ag o Ab, podemos detectar distintas actividades, utilizando variaciones de los esquemas cásicos de LIA o CLIA

LIA CLIAVelocidad primerresultado

5-10 minutos: 1 sola incubación, sin lavados

30-35 minutos: 3 incubaciones, dos lavados

Sensibilidad analítica Menor que ELISA Mayor o equivalente a

ELISADiferenciación de isotipos de Ig No es posible Posible


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El Factor Von Willebrand (VWF):

La EnfermedadVon Willebrand (VWD)

Púrpura TrombocitopénicaTrombótica (TTP)


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El VWF y la VWD• El VWF promueve la adhesión y agregación plaquetaria en los sitios de lesión

vascular que provocan condiciones “high shear stress”

• La deficiencia de VFW y/o la pérdida de su capacidad de unión al colágeno expuesto cuando se produce daño tisular, o pérdida de su capacidad de unión a plaquetas, es la causa la enfermedad hemorrágica más común, la enfermedad de Von Willebrand (VWD)

Tsai H-M. Int J Hematol 2010; 91: 1

Globular


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VWF y TTP

Tsai H-M. Kidney Int 2006; 70: 16

Moake JL (2002). "Thrombotic microangiopathies". N. Engl. J. Med. 347 (8): 589–600. Copyright © [2002] Massachusetts Medical Society. All rights reserved

A Disintegrin And Metalloprotease with TromboSpondin-1-like domains (member 13)

ADAMTS13:

La deficiencia de ADAMTS13 provoca multímeros de VWF ultra-grandes, que se despliegan en condiciones de flujo en las que no deberían, causando agregación intravascular diseminada de plaquetas, por lo tanto trombosis microvascular, y caida del contaje de plaquetas: Púrpura Trombocitopénica Trombótica (TTP)


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VWD y TTP: Diagnóstico en el Laboratorio• La deficiencia cuantitativa de VWF

(menos cantidad), se mide mediante inmunoensayos comunes:- sandwich de anticuerpos policlonales

de conejo para la detección de antígeno, por ELISA o Quimioluminiscencia (CLIA)

Prediluciónmuestrasi aplica

BufferPart. Mag.+

Muestra

9:30 min.Incubación

LavadoTrazador

+MIX

9:30 min.Incubación

LavadoIniciadores

+ Lectura


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VWD y TTP: Diagnóstico en el Laboratorio• La deficiencia cuantitativa de VWF

(menos cantidad), se mide mediante inmunoensayos comunes:- sandwich de anticuerpos policlonales

de conejo para la detección de antígeno, por ELISA o Quimioluminiscencia (CLIA)

- O por agglutinación de partículas de látex seguida por turbidimertía en un coagulómetro automático: LIA

0 50 100 150 200 250 3000.60

0.65

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Time (s)

Abso

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Positive Sample

Negative Sample


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CLIA para determinar VWF:CB

WW

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NH

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Triple helixCollagen. III

Partícula: Péptido de colágeno tipo III, que forma una estructura de triple hélice

(Lisman T. et al. Blood 2006; 108:3753‐3756)

Trazador: anticuerpo policlonal de conejo anti‐VWF conjugado con isoluminol

El colágeno purificado natural tiene grandes problemas de reproducibilidad lote a lote, lo que se evita con la utilización del péptido sintético


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CLIA para determinar VWF:RCo

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Partículas: fragmento recombinante de la glicoproteína 1bα de plaquetas unido a las partículas vía mAb

Tampón de ensayo: Contiene ristocetina

Trazador: mAb anti‐VWF conjugado con isoluminol

(Vanhoorelbeke K. et al. Thromb Haemost 2005; 93: 165‐171)


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LIA para determinar VWF:RCo

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rGPIbα

mAb a-rGPIbα

VWF + Ristocetin

Nanoparticles

Sample: 20 µL Buffer: 110 µL Latex Reagent: 50 µLRistocetin: 40 µL

Wavelength: 670 nmAlgorithm: Final - InitialAcquisition time: 10 minutes

ACL Top Family


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CLIA para determinar ADAMTS13

Partículas: GST‐VWF73‐His unido a las partículas vía un anticuerpo monoclonal

VWF73: Péptido derivado del VWF cuya secuencia es la mínima que incluye la diana reconocible como sustrato por ADAMTS‐13(Kokame K. et al. Blood 2004;103:607)

Trazador: mAb anti‐N10 conjugado con Isoluminol

Reconoce de manera específica el fragmento GST‐VWF10 generado cuando ADAMTS‐13 digiere VWF73(Kato S. et al. Transfusion 2006;46:1444)


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Resumen


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Donde van los inmunoensayos en hemostasia

• Total automatizaciónPara conseguir resultados robustos, fiables y rápidos

• Utilización de la metodología adecuada a las necesidades del analito, aprovechando una tecnología punta como es la quimioluminiscencia- LIA: da resultados rápidos y fiables cuando no se requiere alta sensibilidad, ni

diferenciación del isotipo de Inmunoglobulinas- CLIA: cuando se requiera alta sensibilidad o diferenciación de isotipos de Ig

• Esquemas de reacción imaginativos, más allá del sandwich clásico para determinación de Ag o Ab- Lo que permite determinar actividades enzimáticas como ADAMTS13, interacciones

entre moléculas como VWF-Plaqueta o VWF-Colágeno, o C4BP-PS

• Cual es el futuro inmediato?- Continuar desarrollando ensayos para cubrir las necesidades del laboratorio de

hemostasia- Integración


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ACL TOP• ACL TOP: Una familia de coagulómetros automáticos de alta calidad. Ha

permitido a IL situarse a la cabeza en el campo de la hemostasia- No distingue entre isotipos de Ig- No llega a los mismos niveles de detección (LoD) del los ELISA, y per tanto no llega a

todas las necesidades de laboratorio de hemostasia


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ACL TOP 970 CL• ACL TOP: Una familia de coagulómetros automáticos de alta calidad. Ha

permitido a IL situarse a la cabeza en el campo de la hemostasia- No distingue entre isotipos de Ig- No llega a los mismos niveles de detección (LoD) del los ELISA, y per tanto no llega a

todas las necesidades de laboratorio de hemostasia• Integra ensayos de quimioluminiscencia al la línea ACL TOP


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ACL TOP 970 CL• Un súper menú de ensayos en un solo instrumento

General Screening PT APTT Fib-C/QFA Thrombin Time ISI Calibrate INR Validate

D-Dimer D-Dimer HS 500 D-Dimer 500 D-Dimer HS D-Dimer

Thrombophilia Antithrombin Protein C ProClot Free Protein S PS Activity APC-R V Homocysteine

VWD vWF: Ag vWF Activity vWF:Rco vWF: CB

UF/LMW Heparin Heparin (2 stage) Anti-Xa (1 stage)

HIT HIT Ab (PF4-H) HIT Ab (IgG) HIT Ab (IgG/IgM/IgA)

Lupus Anticoagulants dRVVT Screen/Confirm SCT Screen/Confirm LA Controls

Fibrinolysis Plasminogen Plasmin Inhibitor FDP

Factors Intrinsic Factors Extrinsic Factors FXIII Antigen

Antiphospholipid Antibodies aCL IgG aCL IgM aCL IgA B2GPI IgG B2GPI IgMB2GPI IgA Multi-Ab Controls B2GPI Domain 1*

ADAMTS13 ADAMTS13 Act

Chemiluminescence AssayAvailable as CL or LatexLatex* Manufactured at Inova

Living ImmunoassayExcellence

13/05/2016

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