Exploracion bioquimica de la Enfermedad inflamatoria ... · Reactantes de fase aguda VSG, PCR (Importancia en terapia biológica), ... En 1992 Roseth et al. desarrollaron el primer

EXPERIENCIA DEL LABORATORIO DE

GASTROENTEROLOGÍA EN LA DETERMINACIÓN DE

CALPROTECTINA FECAL

EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA

INTESTINAL

17-noviembre 2017 MªJosé Ariza Astolfi

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Índice

1ª PARTE: EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENFERMEDAD

LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA

PAPEL DE LOS MARCADORES BIOLOGICOS

MARCADORES FECALES

CALPROTECTINA

CONSIDERACIONES PREANALÍTICAS

CONSIDERACIONES ANALÍTICAS: MÉTODOS

CONSIDERACIONES POSTANALÍTICAS

2ª PARTE: EXPERIENCIA EN EL LABORATORIO

TRAYECTORIA


LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA

1ª PARTE: EXPLORACIÓN BIOQUÍMICA DE LA INFERMEDAD


Definición

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se define como un trastorno constituido por dos entidades clínicas diferentes: la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). El denominador común es la presencia de inflamación crónica a nivel intestinal, que suele acompañarse de manifestaciones extradigestivas

Colitis ulcerosa Enfermeda de Crohn


Curso Clínico

Curso clínico

Diagnóstico/ Diferencial diagnóstico

Pronóstico/ riesgo de

complicaciones

Actividad inflamatoria

Predición de

recurrencia de la enfermedad

Optimización de farmacoterapia

Riesgo de recurrencia post cirugia

Síntomas Diagnóstico Actividad

intermitente Cirugía


MARCADORES BIOLÓGICOS



Tipos

Bioquímicos de rutina

Serológicos

Fecales


Tipos

Hematimetría completa

Reactantes de fase aguda VSG, PCR (Importancia en terapia biológica), Orosomucoide (alfa 1 glicoproteína) Albumina

Anticuerpos anti Transglutaminasa

Heces Aspectos macro y microscópico, alfa 1-antitripsina y estudio microbiológico

Bioquímica general

Enzimas hepáticas, parámetros de función renal, electrolitos, estudio de tiroides, hierro, ferritina, proteínas totales, vitamina B12, acido fólico

Bioquímicos de rutina


Tipos

Fecales

Anticuerpos séricos frente a antígenos microbianos Anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae ASCA (CD)

Anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos perinucleares P-ANCA (CU) Anti-OmpC Anti-pseudomonas 12 Anti-flagelin

Nuevos marcadores: Antiglicoproteina 2(Anti-GP2)

Hepatitis B,C,HIV y Prueba de Tuberculina Niveles de Anti-TNF y anticuerpos y metabolitos de Tiopurinas TPMT(Polimorfismo de Tiopurin metil transferasa)

Serológicos


MARCADORES FECALES



Tres razones a tener en cuenta…

Sirven de medida objetiva de la actividad de la enfermedad

Evitan métodos invasivos

Interés del estudio se debe a la propia fisiopatología de la enfermedad

Vermiere et al .Gut 2006; 55: 426-431


Un marcador ideal

Vermiere et al.Gut 2006; 55: 426-431


Marcadores fecales en uso clínico

Lehmann et al. Ther Adv Gastroenterol 2015; Vol. 8(1) 23–36


Una representación Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

CALPROTECTINA



Estructura y localización

S100A8/S100A9

Epitelio escamoso y neutrófilos, también en macrófagos y monocitos. Representa el 60% de las proteínas

citoplasmáticas del neutrófilo

Fijadora de Ca2+ y Zn2+

Forma parte de la família de las proteínas S100

Fagerhol et al. 1980


Características

Papel importante en la regulación de la inflamación , procesos neoplásicos e infecciosos.

Buena correlación con la excreción fecal de leucocitos marcados con Indio111

Estable en heces

Se encuentra en plasma y otros fluidos corporales . En heces, se halla 6 veces más concentrada

POR TODO ESTO SE CONSIDERA TEST DE ELECCIÓN COMO MARCADOR DE INFLAMACION INTESTINAL


Diversos usos

Diferenciar Síndrome de Intestino Irritable vs Enfermedad Inflamatoria Intestinal

o Roseth el al 1992

o Gisbert and Mc Nicholl 2009 (metaanálisis 2475 pacientes sensibilidad de 83% y especificidad 84%)

Evaluación de la actividad de la enfermedad

o Schoepfer et al 2013

Respuesta a tratamientos y predicción de recaídas

o Burry et al 2015;

Eficiencia de la CF frente a síntomas clínicos para reducir colonoscopia (67% en adultos y 35% en niños)

o Van Rheenen et al 2010

Otros desordenes tracto gastro intestinales:

o Screening y vigilancia en pacientes de alto riesgo de cáncer colorectal

o Tratamiento de drogas antiinflamatoria no esteroideas

o Gastroenteritis infecciosa

o Diverticulitis

Walshman et al.Clinical and Experimental Gastroenterology 2016;9 :21-29


No existe un punto de corte para definir actividad y remisión clínica de la enfermedad

Superposición entre enfermedad orgánica y funcional. Valores entre 50-100µg/g de heces. Repetir test

CF y lactoferrina puede ser normal en pacientes con enfermedad clínica y endoscópica activa, particularmente en enfermedad ileal o (Sipponen et al.2008)

CF no ayuda a diferenciar entre Enfermedad de Crohn y Colitis ulcerosa

CF no puede ser usada para la localización de la enfermedad inflamatoria intestinal

Lehmann et al. TheAdv Gastroenterol 2015 ; vol 8(1)23-26

Inconvenientes Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Fecal Calprotectin NOT ELEVATED

No Evidence of Inflammation

Infection C-difficile Stool test by PCR C&S Stool T Ova & parasite stool tests

Inflam.Bowl disease ASCA Serum T CRP Serum T ESR Serum T pANCA Serum T Endoscopy & Medical Imaging

Microscopic Colitis ASCA Serum T pANCA Serum T Endoscopy & Medical Imaging

Food intolerance Lactose Intolerance Serum and Breath tests SAIGE Serum (IgE)

Rare Disorders Bile Acids Serum test SIBO Breath test Endoscopy & Medical Imaging

Irritable bowl Syndrome Psychogenic Factors

Abdominal Pain & Change in Bowel Habit

Patient History & Physical Exam

Fecal Calprotectin

Fecal Calprotectin ELEVATED

Inflammation present

Celiac Disease Deaminated Gliadin Peptides(IgA/IgG) Endomysial Anti- Serum test HLA-DQ2 test IgA Quantitation Serum T Tissue Transglutaminase Serum test (IgA) Endoscopy & Medical Imaging

Pancreatic Insufficiency Fat & Meat Fibers Fecal Elastase Xylose test

Malignancy Cologic Serum testFecal Immunochemical T (FIT) Guaiac Stool T Lynch Disease Genetic T* Endoscopy & Medical aging

Ayuda al diagnóstico

Aids the Diagnosis

of GI disease


Es suficiente muestra aislada, buena correlación 24 horas

Es recomendable que las muestras se obtengan de la primera excreción del día Can J GastroenterolHepatol 2015;29(7):369-372.

Estabilidad de la muestra

hasta 7 días a temperatura ambiente

Si almacenamiento > 7 días (congelar -20ºC)

Extracción

Gold standard: pesada

Uso de dispositivos

Consistencia de la muestra

Heces con sangre deben ser rechazadas

Consideraciones Preanalíticas Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

En 1992 Roseth et al. desarrollaron el primer método de

determinación de calprotectina fecal (CPF), mediante una técnica de

ELISA.

Técnicas inmunoquímicas utilizando bien anticuerpos policlonales

o monoclonales frente a varios epítopos del dímero de la molécula

de CPF.

Métodos cuantitativos o cualitativos

Metodología Point of care

Se han mejorado y validado extensamente los métodos

Hoy día hay múltiples ensayos disponibles

Consideraciones Analíticas Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Consideraciones Analíticas - Inmunoensayos disponibles

Enzimoinmunoanálisis ELISA Calprest, Eurospital (inc. NG) Bühlmann Euroinmun Orgentec

Inmunoquímicos ramdomizados Inmunoturbidimétricos (Bühlmann) Inmunofluorescencia ( Thermo Fisher Diagnostics) Inmunoquimioluminiscencia (Liaison DiaSorin e Inova Werfen)

Test rápido Quantum blue® - Bühlmann Calfast (Vircell Eurospital)


Enzimoinmunoanálisis ELISA Calprest

Anticuerpo policlonal. Material de referencia interno procedente de extracción de calprotectina de pool de neutrófilos

Intervalo de medición 15-500 µg/g

Enzimoinmunoanálisis ELISA Calprest NG

Calprotectina humana recombinante.

0-3000 µg/g

Enzimoinmunoanálisis ELISA Bühlmann

Material de referencia interno procedente de extracción de calprotectina de pool de neutrófilos

30-1800 µg/g

Consideraciones Analíticas - ELISA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

5/6 Viales calibradores

2 Viales de control

Tampón de extracción

Microplaca

Tampón de lavado

Tampón de incubación

Conjugado

Sustratro

Solución de parada

Manual o automatizado

1h 30min-2h 30min para resultado

Obligatorio realizar curva de calibración (recomendado por duplicado)

Montaje por tandas para optimizar el número de determinaciones efectivo de cada placa

Extrapolación de los resultados superiores al último punto de calibración

Consideraciones Analíticas - ELISA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Inmunoturbidimétrico: Bülhmann fCALturbo

Anticuerpos policlonales anti-calprotectina humana

Material de referencia: calprotectina extraída de pool de neutrófilos.

Metodología PETIA (Particle enhanced turbidimetric inmunoassay)

Intervalo de calibración 15-2000 µg/g

Intervalo de medición 15-8000 µg/g

Resultados comparables a ELISA Bülhmann

Posibilidad de autodilución

Curva de calibración cada cuatro semanas

Obtención del primer resultado en 10 min

Posibilidad de montarlo en diferentes equipos de bioquímica (equipo ofrecido Mindray 200E)

Consideraciones Analíticas - PETIA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Consideraciones Analíticas - PETIA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Fluoroenzimoinmunoensayo (ELiA/FEIA): ELiA Calprotectin/ELiACalprotectin 2 Thermofisher

Anticuerpos monoclonales anti-calprotectina de ratón (ELiACalpro 2)

Intervalo de medición: 15-3000 µg/g / 3,8-6000 µg/g

Dilución: 1:100 / 1:200

Curva de calibración: una vez al mes

Mayor estabilidad del extracto Elia Calprotectin 2 (3 dias T.ambiente)

Extrapolación de los resultados superiores al último punto de calibración (750 ng/mL)

Obtención de los resultados aprox 2h

Diferente instrumentación: Phadia 100 ELiA Calprotectin

Phadia 250/2500/5000 ELiA Calprotectin y ELiA Calprotectin 2

Consideraciones Analíticas – ELiA/FEIA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Consideraciones Analíticas – ELiA/FEIA

Anticuerpos de la FS unen antigenos CF de la muestra

Se añaden anticuerpos conjugados a una enzima,que a

su vez se une al complejo antigeno anticuerpo

El complejo se incuba con agente de desarrollo.

Medimos Fluorescencia.

1

2

3

4


Quimioluminiscencia: Liaison Calprotectina - DiaSorin Anticuerpo monoclonal frente a dímero S100A8-S100A9, fabricado con

antígeno recombinante (estructura 3D) .

Intervalo de medición:5 – 800 µg/g; autodilución hasta 8000 µg/g

Curva de calibración cada cuatro semanas

Equipo de carga continua para muestras, reactivo y fungible

Consideraciones Analíticas - CLIA

S10

0A

8

S10

0A

9

ABEI Magnetic Particle

MAb Anti – Heterodimer Calprotectin

IgG Mab anti-S100A9 ABEI

labelled Emitted light


Consideraciones Analíticas - CLIA

Reactivo único que incluye todas las soluciones necesarias para la reacción

Proceso de extracción y procesamiento en el mismo dispositivo, sin trasvases.

Carga continua de muestras y reactivos Tiempo para primer resultado 35 min Instrumentacion LIAISON Y LIAISON XL


Test rápido (inmunocromatografía):

Quantum blue – Bülhmann

Anticuerpos policlonales anti-calprotectina humana

Material de referencia: calprotectina extraída de pool de neutrófilos

Intervalo de medición:

Quantum Blue® fCAL: 30-300 µg/g

Quantum Blue® fCAL extended: 30 – 1000 µg/g

Quantum Blue® fCAL high range: 100-1800 µg/g

Obtención del primer resultado en 15 min

Bajo volumen de muestras

Consideraciones Analíticas - IC Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Consideraciones Analíticas - IC Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Consideraciones Postanalíticas

Basso et al. Clinical Chem Lab Med 2014; 52(4):471-481

Marcadores fecales no son específicos de la enfermedad inflamatoria

La concentración de CP

Diversos factores fisiológicos (edad, comorbilidades clínicas) Joshi et al 2010

Considerable variación día a día. Lasson et al 2014

Puntos de corte


Consideraciones Postanalíticas: Puntos de corte

Walsham et al. 2016; 9: 21–29

* Un valor entre 50-150 µg/g, se puede interpretar como zona gris y debería repetirse entre 4 y 6 semanas

Se ha asumido un punto de corte universal 50 µg/g para diferenciar EII de SII


Se sugieren los siguientes puntos de corte para monitorización y manejo de estrategias

Consideraciones Postanalíticas: Puntos de corte

Panaccione et al. Can J GastroenterolHepatol.2015 ;29(7):369-372.


Gran dispersión de cut-off “ideales” para las diferentes metodologías Es necesaria la estandarización del material de referencia .

Oyaert et al. Clin Chem Lab Med 2017; 55(10): 1564–1573

Consideraciones Postanalíticas: Puntos de corte Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

TRAYECTORIA

2ª PARTE: EXPERIENCIA DEL LABORATORIO


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014 2016 2018

Nº

Cal

pro

tect

ina

Año

>13 años determinando calprotectina

ELISA

Método de pesada Quimioluminiscencia

Dispositivo extracción

ELISA Dispositivo extracción

EQAS INSTAND


Estudio de la utilidad de la Calprotectina fecal como marcador de inflamación en pacientes pediátricos con enfermedad intestinal inflamatoria

Estudio realizado en 43 pacientes(19H y 24 M con edades entre los 1,5 y 24,5 años. Objetivo: estudiar el comportamiento de la CF como marcador de inflamación en pacientes pediátricos . Resultados :Los niveles de CF fueron significativamente mas altos en el grupo de EII media de 155,7µg/g heces frente al grupo control media de 24,2µg/g .


Calprotectina y Lactoferrina fecal: dos proteinas leucoitarias como indicadores de enfermedad inflamatoria intestinal activa

Estudio realizado en 55 pacientes adultos. objetivo: determinar correlación de estos parámetros con los índices de actividad en EC y CU y el efecto del consumo de tabaco sobre ellos Resultados : Con los índices de corte considerados como patológicos >200µg/g de heces para calprotectina y 12,5µg/g de heces para lactoferrina, se observa que el 88% de los pacientes tienen ambos parámetros elevados. El consumo de tabaco modifica la excreción de ambos


Enfermedad inflamatoria intestinal: Calprotectina vs Hemoglobina fecal

Se estudiaron 80 pacientes,23 con EC,11 con CU y 45 con otras patologías. Objetivo : comprobar si el aumento de Hb F influye en la concentración de CF en los pacientes con EII Resultados : La relación entre CF y Hb F es débil, solo se encuentra una correlación significativamente positiva en la CU. Estos resultados apoyan la hipótesis de que en la EC, existe un mecanismo de excreción luminal de CF diferente del sangrado.


Calprotectina fecal: un nuevo parámetro de actividad de Enfermedad Inflamatoria

Estudio realizado en 32 pacientes (1-56 años) con el objetivo de evaluar la efectividad de la CF como marcador clínico, no-invasivo, de actividad de inflamación intestinal en presencia de EII en sus dos principales enfermedades: colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC)


Estudio analítico comparativo de la determinación de Calprotectina fecal

CONCLUSIONES

Los test rápidos pueden servir como una prueba de cribado de inflamación intestinal, debido a su alta sensibilidad. La banda de sensibilidad de 200µg/g tiene una FC buena con el ELISA automatizado, por lo que ofrece resultados fiables

como apoyo para la detección de agudizaciones de la enfermedad inflamatoria intestinal. Aparecen dos falsos negativos en el test cualitativo que corresponden a valores >700µg/g, pudiendo ser un “efecto

prozona” a valorar en posteriores estudios. Los test rápidos constituyen una herramienta clínica rápida y fiable, útil para el diagnóstico y control de tratamiento de

enfermedades con actividad inflamatoria intestinal en el ámbito sanitario.

MATERIAL Y MÉTODOSSe estudiaron 100 muestras fecales remitidas por el Servicio de Gastroenterología. Se extrajeron según el método especificado por

el fabricante, conservándose a -20ºC hasta su análisis. El mismo extracto se procesó por el método ELISA automatizado Calprest®

Eurospital (ELISA automatizado) y por 2 test rápidos inmunocromatográficos (Certest Calprotectin-Lactoferrin (test cualitativo) y

Certest Calprotectin 50+200 Combo Card (test semicuantitativo)), utilizando las siguientes equivalencias en la posterior

interpretación de resultados:

Para comparar las pruebas se estudiaron la sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo

negativo (VPN), e índice Kappa (IK), utilizando como método de referencia el ELISA automatizado.

RESULTADOSResultados del ELISA automatizado (µg/g): Mediana: 55,2; Máximo: 849,9; Mínimo: 0,1.

ELISA automatizado vs test semicuantitativo (valoración de los 3 rangos): IK=0,48 (SD=0,07; IC95% (0,34-0,62)); FC: moderada.

Se encontraron dos falsos negativos en el test cualitativo que correspondieron a dos valores de Cp-f>700µg/g.

ESTUDIO ANALÍTICO COMPARATIVO DE LA DETERMINACIÓN DE

CALPROTECTINA FECAL: ENSAYO ELISA AUTOMATIZADO VS DOS

TESTS RÁPIDOS INMUNOCROMATOGRÁFICOS

R. Serrano1, JM. Lezana1, I. Martín Mérida1, N. Rico1, S. Gordillo2, MD. Sarrión1 .1Laboratorio de Gastroenterología. Servicio de Bioquímica Clínica . Hospital Universitario La Paz. Madrid; 2Alere Healthcare SAU2. Barcelona.

INTRODUCCIÓNLa calprotectina (Cp) es una proteína muy abundante en neutrófilos. Se encuentra elevada en múltiples estados patológicos

inflamatorios y neoplásicos. En la inflamación intestinal los neutrófilos migran hacia el lumen, donde liberan, tras su activación y

muerte, gran cantidad de Cp. Su excreción fecal, por tanto, es muy útil en la valoración del riesgo inflamatorio intestinal, tratamiento

y evaluación de recidivas. Es una molécula muy estable a temperatura ambiente y fácilmente cuantificable, estando establecido el

punto de corte para actividad inflamatoria intestinal en 50µg/g de heces. En los últimos años están apareciendo a nivel comercial

test rápidos para la detección de Cp fecal (Cp-f), potencialmente útiles en la práctica clínica.

CONCLUSIONES Los test rápidos pueden servir como una prueba de cribado de inflamación intestinal, debido a su alta sensibilidad.

La banda de sensibilidad de 200µg/g tiene una FC buena con el ELISA automatizado, por lo que ofrece resultados fiables como

apoyo para la detección de agudizaciones de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Aparecen dos falsos negativos en el test cualitativo que corresponden a valores >700µg/g, pudiendo ser un “efecto prozona” a

valorar en posteriores estudios.

Los test rápidos constituyen una herramienta clínica rápida y fiable, útil para el diagnóstico y control de tratamiento de

enfermedades con actividad inflamatoria intestinal en el ámbito sanitario.

OBJETIVORealizar un estudio comparativo de las determinaciones de Cp-f entre un método cuantitativo ELISA automatizado y dos test rápidos

inmunocromatográficos, uno de ellos semi-cuantitativo y otro cualitativo.

Calprest® Eurospital Certest Calprotectin-Lactoferrin Certest Calprotectin 50+200 Combo Card

<50µg/g Banda negativa/ténue Banda de 50 negativa/ténue y banda de 200 negativa

50-200µg/g Banda positiva Banda de 50 positiva y banda de 200 negativa/ténue

>200µg/g Banda positiva Banda de 50 positiva y banda de 200 positiva

Sensibilidad Especificidad VPP VPN IKFuerza de

concordancia

ELISA automatizado vs test cualitativo

90.9 % IC

95%(79,3-96,6)

51,1% IC

95%(36-66,1)

69,4%IC

95%(57,3-79,5)

82,1%IC

95%(36-66,1)

0,46; SD=0,09 IC

95%(0,27-0,64)

Moderada

ELISA automatizado vs test semicualitativo

(Banda 50μg/g)

94,3% IC

95%(83,8-98,5)

48,9% IC

95%(34,3-63,7)

67,6%IC

95%(55,6-77,7)

88,5%IC

95%(68,7-97)

0,44; SD=0,09 IC

95%(0,27-0,62)

Moderada

ELISA automatizado vs test semicualitativo

(Banda 200μg/g)

83,3%IC

95%(61,8-94,5)

88,2% IC

95%(78,22-94,1)

69%IC

95%(49,-84)

94,4%IC

95%(85,5-98,2)

0,67; SD=0,09;IC

95%(0,50-0,84)

Buena


0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014 2016 2018

Nº

Cal

pro

tect

ina

Año

>13 años determinando calprotectina

ELISA

Método de pesada Quimioluminiscencia

Dispositivo extracción

ELISA Dispositivo extracción

EQAS INSTAND


2016. Situación en el laboratorio de Gastroenterología Ensayo en rutina: ELISA CALPREST Características NO ideales intrínsecas al la metodología ELISA:

calibración en cada montaje necesidad de recolectar muestras diluciones debían esperar al siguiente montaje extrapolación en valores superiores al último punto de calibración

Necesidad del laboratorio de automatizar completamente el ensayo debido a un aumento de la carga asistencial

Mejoras ofrecidas con el cambio a la metodología CLIA Extracto n0 necesita centrifugación (no trasvase del extracto) Mismo dispositivo para la extracción y su posterior análisis en el equipo Mayor rango y dilución automática (no existe extrapolación de resultados) Mejor estandarización al utilizar una calprotectina recombinante como material

de referencia. Mejora en repetibilidad. Menor tiempo de procesamiento de las pruebas 35 minutos Carga continua en el equipo Menor tiempo de repuesta

2016 De ELISA a CLIA


Estudio de 62 muestras de heces remitidas al laboratorio para la determinación de calprotectina fecal

Procesamiento en paralelo por el ELISA habitual Calprest (con anticuerpos policlonales) y por el inmunoensayo quimioluminiscente Liaison Calprotectina (con anticuerpos monoclonales frente a el dímero recombinante S100A8-S100A9).

2016 De ELISA a CLIA

Extracción de Cp-f siguiendo el protocolo de cada método.

Los extractos del método Calprest fueron congelados hasta su procesamiento

Los extractos del método de DiaSorin, fueron procesados en el día en el autoanalizador Liaison. Todas las muestras fueron procesadas en duplicado para poder calcular la precisión del dispositivo de extracción.

Se descartaron 13 muestras fuera del rango de linealidad (15-500µg/g en Calprest) y 4 outliers; quedando 45 muestras para el estudio estadístico.


2016 De ELISA Calprest a CLIA Liaison

DISCUSIÓN

Se observa buena comparabilidad de resultados a pesar de la heterogeneidad de la muestra y de la variabilidad añadida por la etapa de extracción de cada método. Los resultados de ambos métodos en el rango de medición estudiado son intercambiables. Estos resultados son coherentes con la literatura, donde están descritos similares rendimientos diagnósticos entre varios tests pero con diferencias cuantitativas relativamente grandes.

Precisión calculada para el dispositivo de extracción: 11,13%


Estudio de Estabilidad del extracto

Caso Media Lsn Lsn 6 días 4ºC % desviación

Lsn 10 días 4ºC % desviación

Lsn 10 días -20ºC % desviación

6 días 4ºC 10 días 4ºC 10 días -20ºC

1 14,35 17 18,47 10,1 -29,62 7,9 -44,95

3 56,65 55,6 -1,85 39,9 -29,57 29 -48,81

6 700,5 745 6,35 634 -9,49 476 -32,05

9 535 546 2,06 424 -20,75 352 -34,21

10 37,8 40,9 8,2 26,4 -30,16 22 -41,8

12 136 122 -10,29 87,3 -35,81 78,2 -42,5

21 61,6 69,5 12,82 51,9 -15,75 27,7 -55,03

5,11 % % Desv media 42,76 % 24,45%

Estabilidad del extracto acorde con lo descrito en el protocolo del

fabricante


Protocolo oficial para el procesamiento de muestras líquidas: método de pesada Objetivo del estudio

Validación de un nuevo protocolo de extracción para muestras líquidas usando el método de pesada como método de referencia

Protocolo de extracción a validar

Coger 10 µl de muestra líquida con punta de pipeta cortada

Añadir los 10 µl de muestra líquida a los 6 mL de buffer de extracción contenidos en el dispositivo de extracción DiaSorin

Agitar 30 min en multivortex junto con el resto de muestras

Procesar en el autoanalizador Liaison®/Liaison XL®

Validación de nuevo protocolo de extracción en muestras líquidas. Protocolo

10 µl muestra


Se estudiaron 29 muestras procesadas en duplicado por cada uno de los métodos: pesada y nuevo protocolo de extracción

Coeficientes de variación obtenidos: Método de pesada: 5,8 %

Método a validar: 13,5% *Coeficiente de variación calculado para el dispositivo de extracción: 11,13% **Coeficiente de variación óptimo <20% teniendo en cuenta que son muestras de heces (muy heterogéneas) e implica un procedimiento de extracción previo a la medida.

Desviación media del nuevo protocolo de extracción respecto al método de pesada (referencia): +4,36 %

Validación de nuevo protocolo de extracción en muestras líquidas. Resultados

A la vista de los resultados obtenidos podemos confirmar que el nuevo protocolo de extracción para el procesamiento de muestras líquidas es

equiparable al método de referencia establecido en el protocolo del ensayo Liaison® Calprotectin


Validación clínica. King´s College Londres

Objetivo: establecer los valores de cut-off

Estudio retrospectivo

Pacientes:

Mínimo 60 pacientes con Síndrome de Intestino Irritable (SII)

Mínimo 100 pacientes con Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII)

Datos clínicos disponibles

Enfermedad Inflamatoria Intestinal dividida en:

Activa. Pacientes nuevos o monitorizados con diagnóstico de EII en colonoscopia y/o historia clínica

Inactivos. Pacientes en remisión

IBS. Pacientes con diagnóstico por endoscopia, historia clínica y/o valores de Calprotectina

Elección del punto de corte Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Distribución de los resultados por enfermedades.

Categorización de los diferentes pacientes con el ensayo LIAISON® Calprotectin

Clasificación de pacientes usando un Cut Off de 50µg/g

Elección del punto de corte Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Elección del punto de corte

Clinical LIAISON

Diagnosis < 50 μg/g 50 -100 μg/g > 100 μg/g Total

IBS 67 10 7 84

79.8% 11.9% 8.3% 100%

IBD - Active 3 17 116 136

2.2% 12.5% 85.3% 100%

IBD - Inactive 30 13 3 46

65.2% 28.3% 6.5% 100%


EQAS INSTAND (Julio 2017) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Biomarcador valioso para el diagnóstico diferencial entre enfermedad orgánica y funcional y para medir actividad de enfermedad inflamatoria.

Capacidad de evaluar la respuesta al tratamiento, obviando la necesidad de depender de sintomas subjetivos del paciente.

CF reduce el número de pruebas endoscópicas invasivas.

CF puede tener otras aplicaciones. Ejemplo: infeccion aguda, trasplante, cancer.

Marcador estable, sencillo de manejar y con una amplia metodología disponible.

Gran dispersión de cut-off “ideales” para las diferentes metodologías.

Es necesaria la estandarización del material de referencia .

Conclusiones Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Documents

Exploracion bioquimica de la Enfermedad inflamatoria ... · Reactantes de fase aguda VSG, PCR (Importancia en terapia biológica), ... En 1992 Roseth et al. desarrollaron el primer