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Expresión de proteínas recombinantesen levaduras
Mercedes GoinLaboratorio Denver Farma
Área Biotecnología
Elección del sistema de expresión
Complejidad de la molécula: estructura terciaria y
cuaternaria, modificaciones postraduccionales
Uso: investigación, diagnóstico, farmacéutico
Cantidad de producto
Economía
Aspectos regulatorios
Convenientes para crecimiento en grandes fermentadores.
Se obtienen altos rendimientos (0,1-5 g/L).
En general las proteínas tendrán metionina N-terminal.
Es frecuente la producción en forma de cuerpos de inclusión.
No produce eventos postraduccionales.
Endotoxinas
BACTERIAS
Conveniente para el crecimiento en grandes fermentadores.
Buenos rendimientos (0.01-1 g/L).
Introduce modificaciones postraduccionales.
La glicosilación es distinta de la de mamíferos: “high manosas”
La proteólisis suele ser un problema.
LEVADURAS
CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Los cultivos en grandes escalas son difíciles de
realizar y muy costosos.
Los rendimientos son generalmente bajos (0,001-0,1
g/L).
Se producen modificaciones postraduccionales.
Para ciertas proteínas puede ser el único sistema de
expresión posible.
PLANTAS
Se producen modificaciones postraduccionales
Expresión localizada en diferentes órganos
Expresión en estadíos específicos del crecimiento
Crecimiento en campo barato
La glicosilación es distinta que la de mamíferos
Eficiencias bajas de transformación y expresión
Seguridad controvertida
Levaduras
E. coli
Cel. Eucariotas superiores
Producción de proteínas biofarmaceúticas
Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17.
Vectores de Saccharomyces cerevisiae
2,8-0,2 %10425-200ORI/STB/REP
/FLP
Basados en 2µ (YEp)
1 %1041-2ARS/CENCentroméricos (YCp)
20 %1041-20ARSReplicadores (YRp)
Episomales
Establend100-200ADNrADNr
Estable101ADN homólogoReemplazo
0,1 %102≥ 1ADN homólogoYIp
Integrativos
Inestabilidad mitótica (b)
Frec. trans-formación (a)
Nº de copias /célula
Secuencias de levadura
Vector
(a) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos(b) Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.
Vectores de Saccharomyces cerevisiae
2,8-0,2 %10425-200ORI/STB/REP
/FLP
Basados en 2µ (YEp)
1 %1041-2ARS/CENCentroméricos (YCp)
20 %1041-20ARSReplicadores (YRp)
Episomales
Establend100-200ADNrADNr
Estable101ADN homólogoReemplazo
0,1 %102≥ 1ADN homólogoYIp
Integrativos
Inestabilidad mitótica (b)
Frec. trans-formación (a)
Nº de copias /célula
Secuencias de levadura
Vector
(a) Transformantes por µg de ADN con esferoplastos(b) Células sin plásmido por generación en medio no selectivo.
Marcadores de selección
1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en
cepas auxotróficas.
Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficas
para leucina, triptofano, uracilo e histidina
2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de
cepas.
Ej: Tn903kanr: selección con G418
DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamida
Cmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol
Promotores y terminadores transcripcionales
Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables
Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa
GAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa
ADH: alcohol deshidrogenasa
Son inducidos varias veces por glucosa
Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados.
Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa
Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL
Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2µ
Secreción de proteínas en Saccharomycescerevisiae
¿Para qué?
Plegamiento correcto
Evitar efectos tóxicos
Facilita la purificación
Péptido señal péptido N-terminal hidrofóbico
propio de levaduras
MFα1: feromona
SUC2: invertasa
PHO5: fosfatasa ácida
Construcción del gen para expresar en levaduras
• 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son inhibitorias de la iniciación de la traducción
• 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentementeAAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción
• 3- Uso de codones propios del sistema
• 4- Usar ADNc
• 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc.
• 6- Incluir sitios de restricción para el clonado
•La mayoría son promotores constitutivos.
•Falta de promotores fuertes. El producto representa
1-5% del total de las proteínas producidas.
•Inestabilidad plasmídica.
•Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.
Problemas asociados a la producción en S. c.
Casi todos los productos derivados de levaduras
que están en el mercado son producidos en
Saccharomyces cereviciae
2009: la FDA apueba la 1era proteína
biofarmaceútica producida en una levadura
distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreína
producida en Pichia pastoris por Dynax Inc.
LEVADURAS METILOTRÓFICAS
• Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C
• Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente
escalable a grandes volúmenes de producción
• La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas
con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar
rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles
celulares.
• Sistema actualmente muy difundido
•Son las primeras enzimas del camino metabólico de
metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.
•A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de
homología
•AOX esta constituída por un octámero de subunidades
idénticas a las que se le unen moléculas de FAD.
ALCOHOL OXIDASA
PEROXISOMA CITOSOL
CH3OH
O2 AOX GSH FDH
H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2
CATALASA FLDH NAD NAD
1/2O2 + H2O DHAS NADH2 NADH2
Xu5P
GAP DHA
1/3 GAP constituyentes
DHA DHAP celulares
ATP
ADP FBP F6P
GAP P2
CH3OH
•AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células
compensan esta baja actividad catalítica sintetizando
grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras
metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable,
mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de
las proteínas celulares solubles.
•La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional.
Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil
Inductor: Metanol
Represor: glucosa, glicerol, etanol
Medio MD Medio MM
Muts
Muts
Mut +
Selección de cepas recombinantes
His+Mut+ e His+Muts
Confirmación por PCR y Southern blot
Caracterización de la cepa productora
PCR: presencia y estabilidad del gen
Southern blot: Mut+/Muts
Dot Blot: Nº de copias del gen
PCR cuantitativa: Nº de copias del gen
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos
Glicosilación de proteínas
• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi
donde los hidratos de carbono sufren modificacines
• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la
misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También
ocurre O-Glicosilación.
• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150
manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones
terminales α 1-3 glicano
Ser/Treo
α - manosa
α – 1,2 manosa
O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS
Sequon? Abundancia inusual de ser/treoProlinas cerca de ser/thraa cargados cerca de ser/treo
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos
Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras, pueden tener efectos inmunogénicos en humanos
Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras
Tunicamicina
Cepas mutantes
Enzimas para desglicosilar
No usar la vía de secreción
Mutagénesis dirigida
La productividad de un sistema recombinante estádeterminada por muchos factores genéticos y fisiológicos.
Posibles cuellos de botella:
♣ Uso de codones
♣ Número de copias del gen
♣ Transcripción eficiente usando promotores fuertes
♣ Señales de traducción
♣ Translocación determinada por el péptido señal
♣ Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi
♣ Secreción
♣ Proteólisis
Cambio de escala
2.5 l Fermenters, with 1.5 l working
volume
50 mlShake-flask
cultures20 l Fermenters, with 15 l working
volume
400 l Fermenters, with 300 l working
volume