Expresin del factor de crecimiento de fibroblastos 23,Por sarcomas de tejidos blandos caninos

Integrantes: - Manuel Colhuan - Jean Czischke - Enzo soto

Introduccin. El raquitismo y la osteomalacia son enfermedades seas poco frecuente que afectan a

los seres humanos y animales

Osteomalacia inducida por tumor (TIO): es un raro sndrome para-neoplsico de los seres humanos.

Materiales y mtodos Muestras de seleccin y de casos y controles 51 tumores fijados Incluidos

en parafina y formol Los tumores mesenquimales seleccionados fueron diversamente

diagnosticados. Especial atencin en la seleccin de casos, se le dio a los rasgos histricos o

clnicos sugerentes de los tumores que causan TIO (por ejemplo, ubicacin dentro de un msculo). Ninguno se asoci con un diagnstico de osteomalacia.

Para establecer la distribucin en el tejido normal de la expresin de FGF23 en los perros, y controlar los tejidos blandos, fueron tomadas muestras de tres hembras mestizas clnicamente sanas

La extraccin de RNA ARN fue extrado de los huesos de control utilizando el siguiente protocolo: 1- EL Hueso congelado fue mantenido en nitrgeno lquido, para despus transformarlo en un polvo fino, por medio de un mortero. 2- El polvo fino y congelado fue transferido a un tubo de 15 mL que contiene bolas de acero inoxidable y el TRI reactivo. 3- Los tubos fueron introducidos al vrtex durante 4-15 min4- El homogeneizado se transfiere a un tubo de 15 ml y se centrifug a 12.000 g durante 5-10 min. 5- El sobrenadante claro (que contiene ARN) se transfiri a un tubo de 15 ml fresca y luego se dej reposar durante 5 min a temperatura ambiente y luego se dej reposar durante 5 min a temperatura ambiente.6- el ARN total fue extrado de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Cadena de la polimerasa con transcripcin reactiva inversa

Los cebadores o partidores fueron diseados para que coincidan con las secuencias de nucletidos de ARN canino.

La prueba se realiz utilizando la secuencia de sper comandos de One-Step RT-PCR con Platinum Taq kit (Invitrogen)

Las muestras se mezclaron suavemente y se sometieron a las siguientes condiciones de PCR: 55 C durante 30 min, 94 C durante 2 min, 40 ciclos de 95C durante 30 s, 58 C durante 30 s, 72 C durante 1 min y finalmente 72C durante 10 min

Los productos de PCR fueron analizados en un bromuro de etidio marcado 1,33% (w / v) en gel de agarosa ultra puro y se visualizaron bajo luz transiluminador UV

Reaccin de la cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

Los tumores que fueron positivos para la expresin FGF23 utilizando RT-PCR convencional, y los tejidos de perros fueron analizados utilizando la reaccin cuantitativa en tiempo real de la cadena de la polimerasa (qPCR).

La referencia de genes seleccionados fue la protena ribosomal L13a (RPL13A) y sintasa hidroximetilbilano (HMBS).

El ARN extrado anteriormente, fue convertido a cDNA por medio de la Roche Transcriptor Kit

Las muestras fueron suavemente mezcladas e incubadas a 25 C durante 10 min, 55 C durante 30 min y 85 C durante 5 min.

La qPCR se realiz utilizando el StepOne Plus, para la debida obtencin de datos.

Resultados

De las 49 muestras obtenidas 15 fueron positivas para la expresin de FGF23 Diez eran subcutneos Tres eran intramuscular Uno fue encontrado dentro de una vaina nerviosa y otro en la submucosa

farngea.

Muestras tumorales - resultados qPCR en tiempo real

15 tumores analizados expresan FGF23, HMBS y RPL13A. La expresin de FGF23 en tejidos blandos sarcomas se compar con la expresin de FGF23 en las dos muestras de hueso.

Trece de los tumores tenan mayor expresin de FGF23 que el hueso 1 Tres de estos tambin tena una mayor expresin FGF23 que el hueso 2

Tejidos de perros normales - resultados qPCR en tiempo real

Las dos muestras de hueso fueron positivos para FGF23 expresin. Las muestras de piel, msculo esqueltico, tendones, cardiacas msculo,

grasa, fascia, vasos, nervios, ovario, ploro, el intestino delgado, el hgado y el bazo no expresaron FGF23.

Ganglio linftico mesentrico y el timo fueron probados en perro y mostraron la expresin de FGF23 positivo.

Tanto pulmn y rin expresin de FGF23 era variable