EXTRACCIÓN DE ADN

OBJETIVOS

Lograr la extracción de ADN de una muestra vegetal.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los ácidos nucleicos están siempre asociados con proteínas, de allí que una

vez hecha la ruptura de las células se proceda a la desproteinización. Esta

puede realizarse agitando suavemente la mezcla ácido nucleico-proteina con

una solución de fenol y/o una mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico a fin de

precipitar las proteinas, la que se remueven por centrifugación. Las proteinas

pueden también disociarse de los ácidos nucleicos con detergentes, cloruro de

guanidina o altas concentraciones salinas, pueden también degradarse

mediante proetasas, tal como la pronasa. Se obtiene así una mezcla de RNA y

DNA que puede aislarse precipitando con etanol. El RNA se recupera de estos

precipitados tratándolo con DNAsa pancreática para eliminar el DNA, y el DNA

puede liberarse del RNA tratando el precipitado con RNasa. El DNA y RNA

pueden también separase por ultracentrifugaciones. En todo este proceso y las

maniulaciones subsecuentes, los ácidos nucleidos deben protegerse de la

acción degradativa de las nucleasas. Estas pueden inhibirse por agentes

quelantes como el EDTA que secuestra los iones metálicos divalentes que son

esenciales para la actividad de las nucleasas. Los ácidos nucleicos son

generalmente de más fácil manipulación que las proteínas por carecer, en la

mayoría de los casos, de estructura terciaria, haciéndolas más tolerantes a

condiciones extremas.

Procedimiento Experimental

Materiales y reactivos

Vasos de precipitado de: 500, 250 y 100 ml; probeta de 100 ml, 2 pipetas de 10

ml, una propipeta, pisceta, gasa, hielo, pipeta pasteur, tubos de ensayo de 15

ml, tubos de ensayo para centrifuga 10 ml, gotero, gradilla, varilla de vidrio.

Bicarbonato de sodio, cloruro de sodio (sal de mesa), alcohol isoamilico o

etanol, a bajas temperaturas, azul de metileno.

Solución Tampón: mantener en la nevera o en un baño de hielo triturado.

120 ml de agua, si es posible destilada (o mineral)

1.5 g de sal de mesa, preferiblemente pura.

5 g de bicarbonato sódico.

Muestra vegetal: tomate, plátano seda.

Procedimiento:

1. Triturar la muestra con un poco de agua destilada en la licuadora

accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Así se romperán

muchas células y otras quedarán expuestas a la acción del detergente.

2. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del

tampón frío y agitar vigorosamente durante al meno 2 minutos.

3. Separar después los restos vegetales más grandes de la suspensión

molecular haciéndolo pasar por un tamiz (gasa). Ó centrifugar a baja

velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.

4. Tomar 5 ml de la suspensión molecular a un tubo de ensayo y añadir 5 ml

de alcohol isoamílico a 0 °C. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol

por la cara interna del recipiente, teniendo éste inclinado. El alcohol quedará

flotando sobre el tampón. Cuando el alcohol se agrega a la mezcla, los

componentes, excepto el ADN, permanecen en la solución mientras el ADN

precipita en la capa de alcohol.

5. La solución se deja reposar por 2 a 3 minutos sin mover. Es importante no

batir el tubo de ensayo. Se puede observar el ADN blanco el cual precipita

en la capa de alcohol.

6. Se introduce en la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la

separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla hacia delante y

hacia atrás poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor

tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de

alcohol con la cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto

de un copo de algodón mojado.

Cuestionario

1. ¿Cuál es la función del cloruro de sodio, detergente, alcohol

isoamílico?

La sal evita la unión de las proteínas al ADN. La sal permite que el ADN

precipite en una solución fría del alcohol y que las cadenas de ADN no se

corten.

El detergente contiene lauril sulfato de sodio, el cual limpia los trastes

removiendo grasas y proteínas.

La función del alcohol isoamílico es de precipitar las proteínas, las que se

remueven por centrifugación.

2. ¿Cuál es la función del detergente sobre la membrana celular?

El detergente disuelve los lípidos (moléculas grasas) y las proteínas de la

membrana celular, rompiendo las uniones que mantienen la integridad de la

misma. De esta forma se libera el contenido celular. Luego, el detergente

forma complejos con los lípidos y las proteínas, permitiendo que los mismos

sean separados del ADN por filtración. Así se libera el ADN.

LOS NÚMEROS CUÁNTICOS DE UN ELEMENTO ES (4,1,0,-

1/2),CUANDO SE CONVIERTE EN ION LOS NÚMEROS LOS NÚMEROS

CUÁNTICOS ES (4,1,1,-1/2) ¿CUAL ES LA CARGA DEL ION.