practica que contiene metodológica para la extracción de ADN a partir de cultivo bacteriano.
Practica 2: EXTRACCIN DE DNA A PARTIR DE CULTIVO HOMOGENEO DE
BACTERIAS
IntroduccinUn cultivo homogneo de bacteria, es cuando en una
placa de cultivo crecen colonias de una cepa, es decir todas las
colonias deben de ser iguales en cuanto a color, forma y tamao; es
decir las colonias que se observan deben ser uniformes (homogneas),
esto permite que el ADN que se obtiene pertenezca a una sola
variedad de bacteria (cepa pura), lo que garantizara que una
posterior secuenciacin del gen amplificado (RNAr 16S), sea
limpia.Un cultivo homogneo se obtiene despus de 6 repiques, a
partir de una colonia que haya sido aislada de una muestra (tejido,
liquido, tierra, etc) usando los protocolos estndar.La extraccin de
ADN utiliza una solucin Fenol:cloroformo para precipitar protenas y
Lpidos del lisado de proteinas, dejando en la solucin acuosa
(fraccin acuosa) los cidos nucleicos que son precipitados con
etanol. El precipitado luego de un breve secado puede ser
resuspendido en agua o solucin TE y analizado mediante
electroforesis en geles de agarosa.
Objetivo:Extraer ADN de bacterias, para amplificacin del gen
RNAr16S, mediante PCR.
Material y Mtodos Buffer de lisis10 mM Tris pH 8.01 mM EDTA100
mM NaCl1% SDS2% Triton Glass beads (perlas de vidrio) Buffer TE
Procedimiento.
1. A un tubo eppendorf que contiene 100 ul de suspensin
bacterian, aadir 0.3 g de perlas de vidrio, 200 ul de buffer de
lisis y 200 ul de la mezcla 1:1 Fenol-Cloroformo2. Vortex el tubo
por 2 min.3. Adicionar 200 ul de TE y Vortex otra vez por 2
minutos4. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura
ambiente, en una micro centrifuga.5. Transferir la fase acuosa (380
ul) a un nuevo tubo eppendorf, use tip nuevo para cada muestra.
Descarte el tubo con las perlas de vidrio.6. Adicionar 2 volmenes
de 100% etanol a temperatura ambiente, mezclar.7. Centrifugar los
tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una
microcentrifuga.8. Descarte el sobrenadante9. Enjuague en pellet
con 0.5 ml etanol fro al 70%, el etanol de debe aadir muy despacio
sin destruir o disolver el pellet.10. Centrifugar los tubos por 5
minutos a temperatura ambiente, en una microcentrifuga.11. Remover
el sobrenadante, deje los tubos abiertos e invertidos para secar
los pellet.12. Resuspender el pellet en 50 ul de aguas desionizada
o TE. 13. Esta muestra de ADN, contiene tambien plasmidos, Tambin
se puede utilizar para hacer la PCR (5 ul) para el anlisis de
secuenciacin del gen de inters (RNAr16S).
RESULTADOS Esquematizar el procedimiento
Correr 15 ul de muestra en gel de agarosa al 1.5% junto a un
marcador de peso molecular.
Dibujar y comentar los resultados.
