Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa BIOL 4008L-Laboratorio de Inmunologa Ejercicio # 7: ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN POLIACRILAMIDA Carlos A. Acevedo Surez Objetivos 1. Describir los fundamentos de la tcnica de electroforesis de protenas 2. Describir algunos usos de la electroforesis de protenas 3. Utilizar electroforesis de protenas en poliacrilamida para separar algunos componentes de las fracciones obtenidas por cromatografa de afinidad La electroforesis es una tcnica utilizada comnmente para separar y caracterizar macromolculas La electroforesis se define como el movimiento de partculas de carga bajo la influencia de un campo elctrico. Es una tcnica que se utiliza para separar macromolculas (protenas o cidos nucleicos) a base de su tamao molecular y/o su carga elctrica. En una corrida de electroforesis las muestras se colocan en un gel de agarosa o poliacrilamida al cual se le aplica una corriente elctrica para inducir el movimiento de las protenas o cidos nucleicos a travs de los poros del gel. Los poros retrasan el movimiento de las molculas permitiendo as que las ms pequeas migren ms rpido que las de mayor tamao. Dependiendo de las condiciones especficas bajo las cuales se corra la electroforesis, la carga elctrica neta de la protena o cido nucleico tambin puede influir en la migracin de las molculas. La electroforesis para el estudio de protenas La electroforesis se puede utilizar para caracterizar protenas o complejos de protenas. Esta tcnica sirve para: 1) separar complejos de mezclas protenicas, 2) estudiar la composicin de subunidades de protenas, 3) verificar la homogeneidad de muestras de polipptidos y 4) purificar protenas. La migracin de protenas sometidas a un campo elctrico en un gel de poliacrilamida depende del tamao de los poros en el gel y de la carga neta, el peso molecular y la conformacin de la protena. La decisin de usar poliacrilamida o agarosa para llevar a cabo electroforesis de protenas depende de varios factores, entre ellos el peso molecular de las protenas a separarse y la resolucin requerida para separar las protenas de inters. La agarosa sirve para separar protenas de mayor tamao que la poliacrilamida pero la resolucin de un gel de agarosa es menor que la de un gel de la misma concentracin de poliacrilamida. La electroforesis se puede llevar a cabo en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (en ingls, SDS: sodium dodecyl sulfate), el cual desnaturaliza las protenas (eliminando el efecto de la conformacin de los polipptidos en su migracin) y le imparte una carga negativa neta a stas. El SDS se enlaza a las protenas a razn de un anin del detergente por cada dos aminocidos (equivalente a 1.3 g de SDS por cada gramo de protena). Esta interaccin entre detergente y muestra ocasiona que la razn (proporcin) de masa a carga (abreviada m/z) de todas

las protenas en una muestra con SDS sea esencialmente de la misma magnitud (eliminando as el efecto de la carga neta de la protena en su migracin). De esta manera durante la electroforesis las protenas migran hacia el electrodo positivo (nodo) a una razn inversamente proporcional a su peso molecular, es decir, a mayor peso molecular, menor la migracin a travs del gel. Por lo tanto, en presencia de SDS la separacin de las protenas durante electroforesis depende solamente de su peso molecular. Si no se utiliza SDS, se dice que la corrida se llev a cabo en un gel nativo donde la carga neta de las protenas en las muestras afecta su migracin. En este laboratorio se llevar a cabo una corrida de electroforesis en poliacrilamida (en ingls, PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis) bajo condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS. Este tipo de electroforesis se conoce como SDS-PAGE. Las muestras que se someten a SDS-PAGE se hierven a 100 por C aproximadamente cinco minutos en presencia del detergente para desnaturalizarlas y hacerlas solubles. Se puede tambin aadir -mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT) u otros agentes reductores para eliminar los puentes de azufre (S-S) que contengan las protenas en la muestra. El gel consiste de una matriz (o reticulado) de acrilamida y bisacrilamida polimerizada entre dos placas de vidrio, la cual usualmente se corre de forma vertical. El espesor del gel vara de acuerdo al uso particular y depende del grosor de los separadores que se coloquen entre las placas de vidrio. La polimerizacin de la matriz de acrilamida/bisacrilamida es catalizada por dos agentes qumicos: persulfato de amonio y N,N,N',N'-tetrametiletano-1,2-diamina (en ingls, TEMED: N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine). Para una corrida de SDS-PAGE generalmente se preparan dos tipos de geles que se vierten por separado entre dos placas de vidrio (Figura 1). El gel separador (en ingls, separating gel) usualmente contiene una concentracin de acrilamida relativamente alta y sirve para separar las protenas ms pequeas y lograr una mejor resolucin de las muestras. Debe ser el gel ms grande (el que ocupa la mayor rea) entre las placas de vidrio y el primero en verterse, hasta llegar a aproximadamente 1 cm del tope de la placa ms pequea. El espacio restante entre las placas de vidrio ser ocupado por el gel concentrador (en ingls, concentrating gel). Este gel pequeo, que no siempre es necesario, est hecho con una concentracin baja de acrilamida y su funcin es separar las protenas extremadamente grandes y mejorar la resolucin del gel separador. Si se utiliza el gel concentrador se debe verter el gel separador primero, esperar a que polimerice y luego verter el gel concentrador entre las placas. Una vez se vierte el gel concentrador, se coloca una peinilla entre las placas de vidrio cuyos dientes permitirn que se formen las fosas donde se aplicarn las muestras una vez el gel concentrador polimerice. Despus de la electroforesis, se desprende el gel de las placas de vidrio y se coloca en una bandeja conteniendo la solucin teidora. Esta solucin consiste de una mezcla de cido actico (10%), etanol (50%), agua (40%) y el tinte Coomassie blue (0.05%). El cido fija las protenas al gel y el tinte se enlaza especficamente a stas. As se podrn ver bandas de color azul correspondientes a los polipptidos presentes en la muestra. El Coomassie blue tiene un lmite de deteccin de 200 nanogramos (ng) (un nanogramo = 10-9 g) por banda de protena. El gel completo se torna azul cuando se tie. El exceso de Coomassie blue se remueve lavando el gel en una bandeja con la solucin desteidora. Esta solucin es igual a la solucin teidora2

excepto que no contiene el tinte Coomassie blue. El enlace entre el tinte y las protenas es covalente, por lo tanto, cuando se destie el gel slo aquellos lugares en donde haya polipptidos permanecern azules. Despus de completar el proceso de tincin, se puede estimar el peso de las muestras comparando su migracin relativa a la de marcadores de peso molecular conocido. Cuando se hace SDS-PAGE con una muestra de IgG pura bajo condiciones no reductoras, se puede observar en el gel una sola banda de aproximadamente 150 kDa. Si la muestra de IgG se corre bajo condiciones reductoras, es decir, donde el amortiguador de muestra contiene un agente reductor como -mercaptoetanol o DTT, se podrn detectar dos bandas en el gel. La banda con la menor migracin corresponde a las dos cadenas pesadas de la molcula (alrededor de 50 kDa cada una). La otra banda representa las cadenas livianas del anticuerpo (con un peso aproximado de 25 kDa cada una). Cuando se utilizan muestras complejas de protenas, como por ejemplo, extractos celulares, para hacer una corrida de SDS-PAGE, es posible identificar protenas especficas en la muestra utilizando una tcnica conocida en ingls como western blot (o immunoblot). Para hacer un western blot las protenas en la(s) muestra(s) de inters se separan inicialmente por SDS-PAGE. Una vez terminada la corrida se remueve el gel del aparato de electroforesis y se coloca en contacto directo con una membrana hecha de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (en ingls, PVDF: polyvinylidene difluoride). Luego se transfieren las protenas desde la acrilamida a la membrana ya sea por capilaridad o aplicando una corriente elctrica al gel. Despus de la transferencia, la membrana es incubada con una combinacin de anticuerpos especficos que revelan si la(s) protena(s) de inters estn o no presentes en la(s) muestra(s). La especificidad del western blot lo hace una tcnica muy poderosa utilizada regularmente en la investigacin. Tambin se utiliza a menudo en el mbito clnico y se considera la prueba definitiva para determinar si un paciente ha sido infectado por el virus de inmunodeficiencia humana.

Ejercicio: Electroforesis de protenas en poliacrilamida NOTA: Recuerde seguir las reglas de seguridad discutidas al principio del semestre en todo momento! LA ACRILAMIDA SIN POLIMERIZAR ES NEUROTOXICA, MANEJELA CON SUMO CUIDADO! MANEJE EL APARATO DE ELECTROFORESIS CON PRECAUCION YA QUE SE UTILIZA ALTO VOLTAJE PARA CORRER EL GEL! Aada los reactivos en el orden en que aparecen en la tabla para as diluir la acrilamida. Los catalizadores (persulfato de amonio y TEMED) deben aadirse inmediatamente antes de verter cada gel. Prctica: Electroforesis de IgG por SDS-PAGE Para la electroforesis de protenas, el gel de poliacrilamida se preparar entre dos placas de vidrio. La electroforesis se correr de forma vertical en presencia de 0.1% SDS, es decir, bajo condiciones desnaturalizantes, en un sistema de gel discontinuo.3

Se le llama discontinuo ya que en este sistema de electroforesis, el amortiguador de corrida (en ingls, running buffer) se encuentra distribuido entre dos compartimientos, una cmara superior y una cmara inferior, que no tienen contacto directo entre s. Este formato tambin es conocido como el mtodo de Laemmli. La Tabla 1 describe los materiales necesarios para preparar el gel para la electroforesis de protenas: Tabla 1. Materiales para preparacin de gel para electroforesis de protenas Reactivo H2O 4x Tris-Cl/SDS acrilamida/bisacrilamida 10% persulfato de amonio TEMED Gel separador (8% acrilamida) 7.25 ml 3.75 ml, pH 8.8 4.0 ml 100 l 30 l Gel concentrador (3.9% acrilamida) 3.05 ml 1.25 ml, pH 6.8 650 l 25 l 5 l

Las siguientes instrucciones describen cmo montar el sistema de electroforesis de minigeles de poliacrilamida diseado por la compaa BioRad (Mini-PROTEAN 3 Cell System). Utilice la Figura 1 como gua. Preparacin del gel de poliacrilamida: 1. Limpie bien dos placas de vidrio, una pequea y una grande, que ya contiene los separadores (en ingls, spacers), primero con agua y luego con un poco de etanol. Asegrese que no queden manchas en la superficie del vidrio que estar en contacto con el gel. 2. Junte el vidrio pequeo con el grande y coloque ambos dentro del marco para geles (en ingls, casting frame) asegurndose que estn completamente parejos en la parte inferior. La placa pequea de vidrio debe quedar hacia el frente. Ajuste los pinches a ambos lados del marco para fijar las placas. 3. Coloque el marco con las placas de vidrio en el aparato de verter geles (en ingls, casting stand) y asegrese que queden bien ajustados entre la goma inferior y el resorte superior. Las placas de vidrio deben quedar perpendiculares a la goma y la parte de atrs del marco debe quedar pegada al aparato de verter geles. 4. A. Si se va a utilizar el gel concentrador para la corrida de electroforesis: 1. Vierta el gel separador (Tabla 1) entre las placas de vidrio hasta llegar aproximadamente a 1 cm del tope de la placa pequea. 2. Llene el espacio restante con etanol para asegurarse de que el borde del gel separador solidifique en lnea recta. 3. Espere 20 minutos para que el gel separador polimerice. Descarte el etanol invirtiendo las placas con el gel separador. 4. Vierta el gel concentrador (Tabla 1) hasta el tope de la placa pequea e inmediatamente coloque la peinilla (que formar las fosas donde se colocarn las muestras) entre las placas asegurndose que la parte de atrs de sta quede pegada a la placa grande de vidrio. No descarte el gel lquido sobrante. Espere a que polimerice y as sabr cundo el gel que acaba de verter solidific.4

B. Si NO se va a utilizar el gel concentrador para la corrida de electroforesis: Vierta el gel separador (Tabla 1) hasta el tope entre las placas de vidrio e inmediatamente coloque la peinilla entre las placas asegurndose que la parte de atrs de sta quede pegada a la placa grande de vidrio. No descarte el gel lquido sobrante. Espere a que polimerice y as sabr cundo el gel que acaba de verter solidific. Ensamblaje del aparato de electroforesis: 5. Una vez polimerice la acrilamida, remueva el marco con cuidado y coloque el gel en el aparato de ensamblaje del electrodo de electroforesis (en ingls, electrode assembly) con la placa pequea de vidrio hacia adentro (adyacente al electrodo). Cada aparato debe llevar dos geles. 6. Coloque el aparato de ensamblaje del electrodo de electroforesis junto con los geles dentro del marco del electrodo (en ingls, clamping frame) y asegrelo en su lugar. Coloque el aparato completo dentro de la cmara (o tanque) de electroforesis. 7. Llene la cmara de electroforesis con el amortiguador de corrida (25 mM Tris, 190 mM glicina, 0.2% SDS) y remueva la peinilla cuidadosamente, cerciorndose que las fosas se llenen con el amortiguador y que no se deformen. Preparacin de las muestras: 8. Prepare sus muestras de las fracciones de la cromatografa de afinidad (una muestra del lavado (L1, L2, L3 o L4) y las tres muestras de la elucin, E1-E3) junto a una muestra de marcadores de peso molecular. Las muestras que se van a correr en la electroforesis deberan tener aproximadamente 15 g de protena total (ver ejemplo ms adelante). El volumen total de la muestra deber ser de 30 l, de los cuales 5 l corresponden al amortiguador de muestra (en ingls, sample buffer). Puede utilizar amortiguador de corrida para llevar el volumen total de la muestra a 30 l de ser necesario. 9. Hierva las muestras a 95-100 por 5 minutos p ara desnaturalizar las protenas. C Las muestras de la elucin deben prepararse tanto bajo condiciones reductoras como bajo condiciones no reductoras. 10. Coloque las muestras en las fosas del gel con una jeringuilla o una pipeta siguiendo las instrucciones de su instructor(a). Escriba el orden de las muestras en el gel en la Figura 2. Use 7 l de los marcadores de peso molecular como muestra en el primer carril. (Opcional: Puede aadir 5 l de amortiguador de muestra a las fosas vacas y as la corriente elctrica se distribuir uniformemente entre todos los carriles.) Corrida de electroforesis y tincin del gel: 11. Selle la cmara de electroforesis cerciorndose que los cables estn colocados en el electrodo correcto (cada cable se conecta a la entrada del electrodo que tiene su mismo color). Asegrese que la fuente de poder (en ingls, power supply) est apagada y que los controles de voltaje o de corriente estn al mnimo. Conecte la cmara sellada a la fuente de poder asegurndose que los cables estn colocados en el electrodo correcto. Aplique un pequeo voltaje a la5

cmara de electroforesis y cercirese que se formen burbujas de aire en el amortiguador de corrida que est en la cmara superior. Si no se forman burbujas, apague todo el equipo y coteje todas las conexiones. Una vez conecte el equipo correctamente aplique un voltaje de 120-150 V a la cmara de electroforesis hasta que el tinte en el amortiguador de muestra llegue a la parte inferior del gel. 12. Una vez completada la corrida, reduzca el voltaje a cero, apague la fuente de poder y desconecte la cmara de electroforesis. 13. Separe las placas de vidrio cuidadosamente con una esptula y coloque el gel en una bandeja para teirlo por 1 hora y luego desteirlo hasta que se puedan ver las bandas de protena. 14. Una vez termine su trabajo de laboratorio por este da, devuelva todos los materiales pertinentes (incluyendo las sillas) a su lugar correspondiente y/o deseche aquellos que sea necesario en el recipiente designado. No podr irse del laboratorio sin antes limpiar su rea de trabajo con desinfectante.

Repaso: Determinacin del volumen de muestra necesario para verificar la presencia de protena por electroforesis en poliacrilamida de las fracciones obtenidas por cromatografa de afinidad En el ejemplo utilizado en el Ejercicio # 5: Cuantificacin de IgG de suero describimos cmo en el ensayo de BCA se obtuvo una concentracin de protena de 690.8 g/ml para la muestra E1 de la elucin de la protena A. Siga los pasos descritos a continuacin para calcular el volumen de muestra de protena necesario para cargar un gel de SDS-PAGE. 1. Cambie las unidades de concentracin de la muestra de elucin de g/ml a g/l (1 ml = 1000 l) [E1] = 0.691 g/l. 2. Ya que se requieren 15 g de protena en un total de 30 l de muestra para cada fosa del gel (paso # 8, Preparacin de las muestras) la concentracin final (Cf) de la muestra en la fosa ser 15 g/30 l = 0.5 g/l. 3. Utilice la frmula CiVi = CfVf para calcular su volumen. De acuerdo a los datos: Cf = 0.5 g/l; Vf = 30 l; Ci = [elucin] = 0.691 g/l y Vi = volumen que necesitamos de la elucin. 4. Al resolver la ecuacin obtenemos que Vi = 21.7 l. Para completar el volumen hasta 30 l necesitamos 3.3 l de amortiguador de corrida y 5 l de amortiguador de muestra. NOTA: Si el valor calculado de Vi sobrepasa 25 l, utilice 25 l de muestra de protena + 5 l de amortiguador de muestra para cargar la fosa.

6

peinilla placas de vidrio fosa gel concentrador separador gel separador

Figura 1. Arreglo de un gel vertical para electroforesis de protenas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. marcadores de peso molecular L1, L2, L3 o L4 E1 sin reducir E1 reducida E2 sin reducir E2 reducida E3 sin reducir E3 reducida

Figura 2. Orden de las muestras para corrida de electroforesis

Bibliografa Abbas, A. K., A. H. Lichtman, and S. Pillai. 2011. Cellular and Molecular Immunology. th 7 edition. Elsevier Saunders, Philadelphia, PA. 560 pp. Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, and K. Struhl. 2002. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. 5th edition. Wiley, Hoboken, NJ. 1512 pp. DeFranco, A. L., R. M. Locksley, and M. Robertson. 2007. Immunity: The Immune Response in Infectious and Inflammatory Disease. 1st edition. New Science Press, London. 387 pp.7

Delves, P. J., S. J. Martin, D. R. Burton, and I. M. Roitt. 2011. Roitts Essential th Immunology. 12 edition. Wiley-Blackwell, West Sussex. 560 pp. Geha, R. and F. Rosen. 2008. Case Studies in Immunology: A Clinical Companion. th 5 edition. Garland Science, New York, NY. 344 pp. th Kindt, T. J., R. A. Goldsby, and B. A. Osborne. 2007. Kuby Immunology. 6 edition. W. H. Freeman and Company, New York, NY. 697 pp. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Murphy, K. 2011. Janeways Immunobiology. 8th edition. Garland Science, New York, NY. 888 pp. th Paul, W. E. (Ed.) 2008. Fundamental Immunology. 6 edition. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 1632 pp. Strober, W. and S. R. S. Gottesman. 2009. Immunology: Clinical Case Studies and Disease Pathophysiology. 1st edition. Wiley-Blackwell, West Sussex. 424 pp. Virella, G. (Ed.) 2007. Medical Immunology. 6th edition. Informa Healthcare, New York, NY. 467 pp. Wood, P. 2006. Understanding Immunology. 2nd edition. Pearson Education Limited, Essex. 300 pp. st Zambrano Villa, S. 2007. Inmunologa Bsica y Clnica. 1 edition. McGraw Hill Interamericana, Mxico, D. F. 426 pp.

8

Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa BIOL 4008L-Laboratorio de Inmunologa Ejercicio # 8: ELISA Carlos A. Acevedo Surez Objetivos 1. Describir los fundamentos de la prueba de ELISA 2. Describir algunos usos del ELISA tanto en investigacin como en la clnica 3. Utilizar la tcnica del ELISA para la deteccin de protenas en diversas muestras El ELISA es un ensayo muy sensitivo y verstil utilizado en la investigacin y en la clnica Una de las tcnicas ms poderosas usadas actualmente en laboratorios de investigacin y en la clnica es un ensayo inmunoenzimtico que se conoce como ELISA. El nombre proviene de sus siglas en ingls: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. En este ensayo un anticuerpo o antgeno inmovilizado es detectado por una enzima conjugada que convierte a un sustrato sin color en un producto con color (Figura 1). El ELISA es una tcnica extremadamente sensitiva ya que puede detectar la presencia de slo nanogramos de protena. En trminos generales, el ensayo consiste de la adsorcin de una molcula de inters (o de un anticuerpo especfico contra dicha mlecula) a un material de soporte (usualmente plstico) seguida por su deteccin por un anticuerpo conjugado (es decir, unido covalentemente) a una enzima. La deteccin de la molcula de inters es posible ya que la enzima del conjugado que es utilizado en el ELISA reacciona con un sustrato que ocasiona un cambio de color en la solucin con la muestra. Un gran nmero de conjugados para ELISA estn disponibles comercialmente, con diversas combinaciones de anticuerpo y enzima. Sin embargo, a veces es preferible para el investigador preparar sus propios conjugados para su necesidad particular. Tambin existen muchas variaciones en la manera de preparar un ELISA, que requieren del uso de varias combinaciones de anticuerpos sin conjugar. El mtodo a escoger depender del uso particular que se le quiera dar a la prueba. Es importante sealar que el ELISA no es la nica tcnica donde se utilizan anticuerpos conjugados para la deteccin de molculas especficas sino que stos tambin son usados con regularidad en ensayos de inmunofluorescencia, western blot, etc. En estos casos, la molcula conjugada al anticuerpo no es necesariamente una enzima, pero cualquier otra molcula cuyas propiedades biolgicas, qumicas o fsicas permitan su deteccin. En el ELISA, la deteccin de la sustancia de inters puede hacerse de forma directa o indirecta. En un ELISA directo la molcula que se va a estudiar es detectada con un conjugado cuyo anticuerpo es especfico contra dicha sustancia. En un ELISA indirecto el conjugado va dirigido contra un anticuerpo que a su vez reconoce directa o indirectamente la sustancia a estudiarse. Algunos pasos del ELISA requieren una reaccin antgeno-anticuerpo que depender de la afinidad y la disponibilidad para reaccionar de ambos componentes. Usualmente para hacer un ELISA se utiliza una

placa (o plato) de microensayos (en ingls, microtiter plate) hecha de poliestireno que contiene 96 fosas o pozos. El poliestireno favorece la adhesin no especfica de protenas a su superficie. Una vez las fosas estn cubiertas (o sensitizadas) con el primer reactivo (en ingls, a este paso se le llama coating) es esencial bloquearlas con un exceso de alguna protena inerte que no reaccione en el ELISA, como por ejemplo albmina de suero bovino (en ingls, BSA; bovine serum albumin) o leche en polvo, ya que as se evitan los enlaces no especficos de los otros reactivos al plstico. A la misma vez, es muy importante lavar las fosas cuidadosamente despus de transcurrido cada paso del ELISA para remover todo material que no se haya enlazado. Sin embargo, las condiciones del lavado no deben ser tan severas que puedan romper los enlaces especficos dbiles. El ELISA es utilizado actualmente como una herramienta en el diagnstico de enfermedades y condiciones mdicas. Por ejemplo, se pueden detectar anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) con un ELISA. Tambin muchas pruebas de embarazo disponibles comercialmente consisten bsicamente de un ELISA. En estas pruebas se utiliza un anticuerpo conjugado que detecta la presencia de la hormona gonadotropina corinica humana (en ingls, HCG; human chorionic gonadotropin) en la orina. Esta hormona es secretada por una de las membranas que rodean al feto durante el embarazo. La tcnica del ELISA tambin se usa comnmente en el campo de la investigacin biomdica donde tiene un sinnmero de aplicaciones. Este ensayo puede ser utilizado para evaluar la produccin y especificidad de anticuerpos monoclonales obtenidos de hibridomas. Estas inmunoglobulinas derivan su nombre del hecho de que son producidos por un solo clon de un linfocito B y su progenie. El proceso para producir anticuerpos monoclonales fue desarrollado por Georges Khler y Csar Milstein en 1975. Estos investigadores recibieron el premio Nobel de Fisiologa o Medicina en 1984 por su trabajo. La Figura 2 presenta un diagrama general de cmo se obtienen estos anticuerpos. El primer paso consiste en inmunizar a un animal de laboratorio (usualmente un ratn) con el antgeno de inters. Despus de varios das se obtiene el bazo del ratn, el cual debe contener linfocitos B activados que reconozcan al antgeno de inters. El prximo paso es hacer una fusin entre un slo linfocito B activado y una clula de un mieloma, que es un cncer de linfocitos B, usando el compuesto glicol de polietileno o algn otro agente que promueva la fusin de las clulas. El producto de esta fusin se denomina un hibridoma y posee la habilidad de dividirse indefinidamente como el mieloma y la capacidad de producir anticuerpos del linfocito B normal. (Las lneas de clulas de mieloma usadas para hacer fusiones no producen anticuerpos.) Los anticuerpos monoclonales constituyen uno de los ms grandes avances en la inmunologa moderna porque le ofrecen al investigador la oportunidad de producir grandes cantidades de anticuerpos con una especificidad predeterminada. Adems, estos anticuerpos se pueden producir por un periodo de tiempo indefinido ya que una vez se obtiene la fusin deseada, lo nico que se necesita hacer para seguir produciendo el anticuerpo es mantener el cultivo de ese hibridoma. Actualmente, gran parte de los anticuerpos monoclonales que se producen provienen de ratones y otros roedores, aunque tambin se producen anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos tienen mltiples aplicaciones desde el punto de vista clnico, farmacolgico

2

e investigativo. En la actualidad, varios medicamentos a base de anticuerpos monoclonales estn siendo evaluados en estudios clnicos para tratar diversas enfermedades, como por ejemplo cncer y las enfermedades oportunistas encontradas en pacientes de SIDA.

Ejercicio: ELISA NOTA: Recuerde seguir las reglas de seguridad discutidas al principio del semestre en todo momento! Prctica: Deteccin de protenas en fracciones de cromatografa de afinidad mediante ELISA El ELISA es un ensayo largo que no se puede completar en un periodo de laboratorio. Por lo tanto, se le proveer una placa de microensayos de 96 fosas (o pozos) que ha sido preparada previamente de acuerdo al esquema descrito en la Figura 3. Las placas utilizadas estn hechas de poliestireno; las protenas se adhieren a este material. A. Las diluciones de las muestras (100 l/fosa) fueron preparadas en una solucin de lavado (1X PBS + 1% leche en polvo (o albmina de suero bovino [en ingls, BSA: bovine serum albumin]) + 0.05% Tween-20; Tween-20 es un detergente. Las placas con las muestras diludas se taparon con parafina y se incubaron a 4 por C 16 horas. B. Se descart el lquido de cada fosa y se reemplaz por 200 l/fosa de solucin bloqueadora (1X PBS + 2% leche en polvo (o BSA) + 0.1% Tween-20) para eliminar las interaccines no especficas con el plstico. Las placas se taparon con parafina y se bloquearon por 16 horas a 4 C. C. Se descart el lquido de cada fosa y se reemplaz por 50 l/fosa de una dilucin 1:5,000 de anticuerpo primario diludo en solucin de lavado (1 l de anticuerpo/5 ml de solucin). Las placas se incubaron con anticuerpo primario por 1 hora a 37 C. Los estudiantes continuarn con el ensayo de la siguiente manera: 1. Descarte cuidadosamente el contenido de las fosas. 2. Lave las fosas con 100 l de solucin de lavado: aada la solucin de lavado, agite la placa un poco y descarte cuidadosamente la solucin de lavado. 3. Repita el paso 2. 4. Prepare 5 ml de una dilucin 1:10,000 de anticuerpo conjugado a peroxidasa en solucin de lavado (0.5 l de rabbit anti-goat-HRP en un volumen total de 5 ml). Aada 50 l a cada fosa. Incube por una hora a 37 C. 5. Descarte cuidadosamente el contenido de las fosas y lave las placas 2 veces nuevamente. (Igual que en el paso 2.) 6. Prepare 5 ml del reactivo de deteccin mezclando partes iguales de H2O2 y ABTS (o cualquier otro reactivo equivalente) justo antes de usarlo. Aada 50 l a cada fosa, incube a temperatura ambiente y observe el cambio en color.3

7. Una vez termine su trabajo de laboratorio por este da, devuelva todos los materiales pertinentes (incluyendo las sillas) a su lugar correspondiente y/o deseche aquellos que sea necesario en el recipiente designado. No podr irse del laboratorio sin antes limpiar su rea de trabajo con desinfectante.

Figura 1. El ELISA se utiliza para detectar una sustancia de inters en una muestra

4

Figura 2. Generacin de anticuerpos monoclonales

A B C D E F G H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 desconocido H2O FT H2O L H2O E H2O desconocido H2O FT H2O L H2O E H2O Figura 3. Distribucin de muestras para el ELISA

Bibliografa Abbas, A. K., A. H. Lichtman, and S. Pillai. 2011. Cellular and Molecular Immunology. 7th edition. Elsevier Saunders, Philadelphia, PA. 560 pp. DeFranco, A. L., R. M. Locksley, and M. Robertson. 2007. Immunity: The Immune Response in Infectious and Inflammatory Disease. 1st edition. New Science Press, London. 387 pp. Delves, P. J., S. J. Martin, D. R. Burton, and I. M. Roitt. 2011. Roitts Essential Immunology. 12th edition. Wiley-Blackwell, West Sussex. 560 pp.

5

Hall, A. and C. Yates. (Eds.) 2010. Immunology (Fundamentals of Biomedical Science). 1st edition. Oxford University Press, New York, NY. 176 pp. Kindt, T. J., R. A. Goldsby, and B. A. Osborne. 2007. Kuby Immunology. 6th edition. W. H. Freeman and Company, New York, NY. 697 pp. Murphy, K. 2011. Janeways Immunobiology. 8th edition. Garland Science, New York, NY. 888 pp. Paul, W. E. (Ed.) 2008. Fundamental Immunology. 6th edition. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 1632 pp. Virella, G. (Ed.) 2007. Medical Immunology. 6th edition. Informa Healthcare, New York, NY. 467 pp. Wood, P. 2006. Understanding Immunology. 2nd edition. Pearson Education Limited, Essex. 300 pp. Zambrano Villa, S. 2007. Inmunologa Bsica y Clnica. 1st edition. McGraw Hill Interamericana, Mxico, D. F. 426 pp.

6

Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa BIOL 4008L-Laboratorio de Inmunologa Ejercicio # 9: PRECIPITACION DE COMPLEJOS INMUNES: INMUNOAGLUTINACION E INMUNODIFUSION Carlos A. Acevedo Surez Objetivos 1. Describir cmo se precipitan complejos inmunes producidos por reacciones antgeno-anticuerpo utilizando tcnicas de aglutinacin y difusin 2. Describir la base gentica e inmunolgica de los grupos sanguneos 3. Preparar reacciones de inmunoaglutinacin e inmunodifusin para determinar grupos sanguneos e identificar antgenos especficos en una muestra Reacciones antgeno-anticuerpo pueden formar complejos inmunes insolubles Cuando un anticuerpo reacciona con su respectivo antgeno se producen complejos inmunes que podran ser insolubles dependiendo de la concentracin de cada uno de los componentes. Para cada combinacin de antgeno-anticuerpo existe una concentracin ptima que permite la formacin de complejos inmunes insolubles. Por lo tanto, es posible determinar si ha ocurrido una reaccin especfica de antgenoanticuerpo entre dos o ms muestras observando si stas forman un precipitado despus de mezclarse. Cuando un antgeno en la superficie de una clula reacciona con anticuerpos solubles puede ocurrir una reaccin de inmunoaglutinacin donde los complejos antgeno-anticuerpo fomentan la agregacin de las clulas. Estos agregados pueden ser observados a simple vista. Un ejemplo de un ensayo de inmunoaglutinacin es la prueba para determinar los grupos sanguneos. Por otro lado, si tanto el antgeno como el anticuerpo se encuentran en solucin, se pueden utilizar tcnicas de inmunodifusin en un medio semislido (usualmente agar o agarosa) o lquido para visualizar los complejos inmunes que se precipitan. En este caso, los complejos antgeno-anticuerpo insolubles son visibles como una lnea (o banda) de precipitacin opaca. La imunodifusin se utiliza principalmente en la industria agrcola y en operaciones de manufactura para examinar la pureza de diversas muestras. La formacin de complejos inmunes en los ensayos de inmunoaglutinacin e inmunodifusin depender de varios factores. Las muestras de antgeno y anticuerpo migrarn a travs del medio a una razn directamente proporcional a su concentracin e inversamente proporcional a su tamao. La formacin de complejos antgenoanticuerpo en el medio depender mayormente de la especificidad de los componentes y de las concentraciones relativas de estos. Tambin la presencia de electrolitos en el medio, el pH del medio y la temperatura pueden afectar la reaccin de precipitacin. La concentracin de anticuerpo y antgeno a la que ocurre la cantidad ptima de interacciones y la mxima precipitacin se conoce como la zona de equivalencia. Fuera de esta zona, hay un exceso de antgeno o anticuerpo que evita que se forme un precipitado mayor (Figura 1).

Sistemas de clasificacin de grupos sanguneos Los glbulos rojos de la sangre poseen ciertas molculas (carbohidratos, protenas, entre otros) en su superficie conocidas como los antgenos de los grupos sanguneos. Se desconoce cul es la funcin de muchas de estas molculas, que se encuentran tambin en otros tipos de clulas, especialmente clulas epiteliales. La Sociedad Internacional de Transfusin de Sangre (SITS) reconoce 30 sistemas de clasificacin de grupos sanguneos que contienen ms de 600 variedades de antgenos. Los sistemas de clasificacin ms importantes son el sistema ABO y el sistema Rh. El sistema de antgenos sanguneos ABO (Figura 2) es el responsable por la mayor parte de las fallas de transfusions sanguneas entre individuos incompatibles. Fue descrito en 1900 por Karl Landsteiner quien gan el Premio Nobel en Fisiologa o Medicina en 1930 por descubrir los grupos de sangre A, B y O. La clasificacin de la sangre en cuatro grupos sanguneos (A, B, O, AB) la origin el checo Jan Jansk en 1907. En el sistema ABO los antgenos son tres carbohidratos denominados A, B y H. El antgeno H es un carbohidrato que contiene una subunidad terminal de galactosa a la cual se le puede aadir o una subunidad de N-acetilgalactosamina (GalNAc), convirtiendo al antgeno H en el antgeno A, u otra subunidad de galactosa (Gal), convirtiendo al carbohidrato H en el antgeno B. Cada una de estas reacciones es catalizada por enzimas (llamadas glicosiltransferasas) diferentes. Los genes que codifican para estas enzimas slo difieren por siete nucletidos entre s, lo cual resulta en una diferencia de cuatro aminocidos entre las protenas. Los genes para estas glicosiltransferasas se encuentran en el mismo locus del cromosoma 9 (9q34) y, por lo tanto, son alelos. Ambos genes se heredan de forma mendeliana y son codominantes. El tipo de sangre de la persona depender del antgeno que se produzca cuando se modifica el carbohidrato H. Individuos que poseen la enzima que convierte al antgeno H en el antgeno A tienen sangre tipo A. Las personas con sangre tipo B expresan la enzima que convierte al carbohidrato H en el carbohidrato B, mientras que las de sangre tipo AB tienen ambas enzimas y producen los antgenos A y B a partir del carbohidrato H. Individuos con sangre tipo O tienen una delecin de una base en su DNA que les impide producir una enzima funcional que pueda modificar al antgeno H. Los grupos sanguneos del sistema ABO fueron originalmente identificados porque cuando se mezclaba suero de individuos incompatibles ocurra una reaccin de aglutinacin en la sangre conocida como reaccin de transfusin. Esta condicin puede ocasionar una reaccin hemoltica inmediata en la cual los eritrocitos intravasculares son lisados (por mediacin de las protenas del complemento) y, en el hgado y el bazo, ocurre fagocitosis de complejos formados entre anticuerpos o complemento con eritrocitos. La hemoglobina liberada por los glbulos rojos lisados puede alcanzar niveles txicos para los riones produciendo necrosis y fallo renal. La reaccin de transfusin tambin puede causar fiebre alta y la diseminacin de cogulos (o trombos) intravasculares. Paradjicamente, estos cogulos pueden provocar la muerte del paciente por hemorragia ya que, en estos casos, la tasa de produccin de trombos supera la capacidad del cuerpo para reemplazar los factores de coagulacin. La reaccin de transfusin se debe al encuentro de los anticuerpos anti-A y/o anti-B que circulan por la sangre con el (los) antgeno(s) del grupo de sangre incompatible en la superficie de los eritrocitos. Estas inmunoglobulinas anti-A y/o anti-B

2

(Tabla 1) aparecen normalmente en la circulacin despus de los tres meses de edad y probablemente son generadas en respuesta a antgenos bacterianos, virales o ingeridos en la comida parecidos a los carbohidratos de los grupos sanguneos. Cada persona slo produce anticuerpos contra aquellos antgenos que no estn presentes en la superficie de sus eritrocitos. Las inmunoglobulinas anti-A y anti-B son de la clase M, por lo tanto, no pueden ser transportados a travs de la placenta. Estos anticuerpos (anti-A y anti-B) son usados en las pruebas de laboratorio para determinar el tipo de sangre de una persona. Dentro del sistema de grupos sanguneos ABO, a las personas que poseen sangre tipo O se les conoce como donantes universales ya que sus eritrocitos carecen de los antgenos A y B y, por lo tanto, pueden ser transferidos a pacientes de sangre tipo A, B o AB sin que ocurra una reaccin de transfusin. Tambin en situaciones de emergencias mdicas donde se requiere una transfusin sangunea se utiliza sangre tipo O- (se pronuncia O negativo; ver descripcin del grupo Rh) cuando el grupo sanguneo del paciente es desconocido. Por tal razn, se han intentado desarrollar mtodos que permitan producir sangre universal, o sea, sangre que pueda ser transferida a pacientes con cualquier tipo de sangre ABO. La produccin de sangre universal se lograra mediante la conversin enzimtica de los antgenos A y B de los eritrocitos al antgeno O. Recientemente (2007) se anunci el descubrimiento de varias enzimas que pertenecen a dos grupos novedosos de glicosidasas bacterianas cuya especificidad podra permitir la conversin de los antgenos A y B al antgeno O. El sistema de grupos sanguneos Rhesus (Rh) (Tabla 1) fue descrito originalmente por Karl Landsteiner y Alexander S. Wiener en 1937 en estudios con monos conocidos como Macacus rhesus. Se considera el sistema de grupos sanguneos ms importante despus del sistema ABO y se basa en la presencia del antgeno Rh en la membrana de los eritrocitos. Es el grupo sanguneo humano ms polimrfico que existe. Los antgenos principales en el sistema Rh son las protenas C, D, E, c y e, que son codificadas por dos loci de genes adyacentes, localizados en el cromosoma 1. El gen RHD codifica para el antgeno D mientras que el gen RHCE codifica para los dems. Se desconoce cul es la funcin exacta de estas protenas, pero se cree que estn encargadas de transportar material a travs de la membrana. La protena ms importante del sistema Rh es el antgeno D, tambin conocido como el factor Rh. En la nomenclatura de los grupos sanguneos la presencia o ausencia del factor Rh se indica por el trmino positivo o negativo, respectivamente, despus del grupo sanguneo ABO. Slo cuando el antgeno D est presente en la sangre de una persona se dice que sta es Rh+. Una persona Rh- carece tanto del antgeno D como de inmunoglobulinas anti-D en la sangre y slo puede recibir una transfusin de sangre de otro individuo Rh-. Sin embargo, una persona Rh+ puede recibir sangre de personas tipo Rh+ o Rh-. La Tabla 1 resume cules son los antgenos y anticuerpos principales que caracterizan la sangre en los grupos sanguneos ABO y Rh.

3

Tabla 1. Antgenos y anticuerpos de los grupos sanguneos ABO y Rh Grupo Antgeno en la superficie Anticuerpo en sanguneo del eritrocito el suero A A anti-B B B anti-A O (H) anti-A, anti-B AB A, B -+ Rh D -Rh--Enfermedad hemoltica del recin nacido Cuando una mujer est embarazada, sangre fetal llega a la circulacin materna en pequeas cantidades durante la gestacin y de forma substancial durante el parto, debido a la ruptura de la placenta. Esta situacin podra dar lugar a una condicin peligrosa denominada enfermedad hemoltica del recin nacido (llamada tambin eritroblastosis fetal). La enfermedad puede ocurrir cuando una mujer de sangre tipo Rh- da a luz por segunda vez a un beb cuyo tipo de sangre es Rh+ (ya que el beb hered el antgeno D del padre). Tarde durante el primer embarazo donde ocurre esta incompatibilidad del factor Rh, eritrocitos fetales llegan a la circulacin materna y provocan la formacin de anticuerpos anti-D en la madre. Estos anticuerpos son principalmente IgG y pueden ser transportados por la placenta. En el segundo embarazo donde el beb nuevamente tiene sangre tipo Rh+, los anticuerpos anti-D de la madre (formados durante el primer embarazo) destruyen los eritrocitos fetales. La tasa de destruccin de glbulos rojos maduros es mayor que la capacidad del feto de producirlos, por lo tanto, el feto responde a la destruccin de clulas rojas liberando eritroblastos (eritrocitos inmaduros) a su circulacin. En esta situacin, el beb al nacer podra verse azul a causa de anemia. Tambin se podra acumular un exceso de bilirrubina proveniente del metabolismo de la hemoglobina que estaba contenida en los glbulos rojos destruidos. El hgado del recin nacido an no puede convertir la bilirrubina a su forma no txica ocasionando daos adicionales al cuerpo. En casos severos el beb muere. Antes de 1968, unos 10,000 bebs moran al ao a causa de la eritroblastosis fetal. En el pasado se trataba la enfermedad hemoltica del recin nacido haciendo un intercambio completo de sangre en el beb. Actualmente el tratamiento consiste en evitar la formacin de inmunoglobulinas anti-D en la madre por medio de la transferencia pasiva de estos anticuerpos, provenientes de otra fuente. Las inmunoglobulinas anti-D se conocen como RhoGAM y se administran por inyeccin a las 28 semanas de embarazo y dentro de las primeras 72 horas despus del parto. Estos anticuerpos se enlazan a las clulas Rh+ fetales e inhiben la respuesta inmunolgica materna contra el antgeno Rh fetal que se encuentra en cada parto. Para detectar antgenos en la superficie de los glbulos rojos se utiliza la prueba de Coombs (Figura 3), un ensayo de inmunoaglutinacin que usa anti-IgG humana. En la prueba directa se detectan anticuerpos maternos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos. Tambin se usa la prueba de Coombs para detectar

4

drogas que se enlazan a los glbulos rojos causando anemia. La prueba indirecta de Coombs se usa para detectar anticuerpos anti-Rh en el suero materno. El suero materno primero se incuba con eritrocitos Rh+. Si el suero materno contiene anticuerpos contra el factor Rh, estos se enlazan a los eritrocitos y son detectados por aglutinacin con anti-IgG humana. Para que pueda haber una transfusin de sangre exitosa tanto los antgenos de los grupos ABO como el antgeno del grupo Rh tienen que ser compatibles. Una persona con sangre tipo O- puede donar sangre a personas de cualquier grupo sanguneo y se le llama el donante universal. Una persona con sangre tipo AB+ puede recibir sangre de cualquier tipo y se le llama el recibidor universal. Sin embargo, actualmente se recomienda que la primera opcin para una transfusin de sangre sea aqulla donde el donante y el recibidor sean del mismo grupo sanguneo. Tabla 2. Distribucin de grupos sanguneos entre donantes de sangre a la Cruz Roja Americana 38 son O+ 34 son A+ 9 son B+ 3 son AB+ ___ son Rh+ 7 son O6 son A2 son B1 es AB___ son Rh-

En enero de 2008 se report el caso de una nia australiana cuyo tipo de sangre cambi de Rh- a Rh+ luego de un transplante de hgado de un donante Rh+. Este es el nico caso confirmado en el mundo de cambio de grupo sanguneo en una persona luego de un transplante que no incluya mdula sea. Una posible explicacin para este cambio es que clulas troncales presentes en el hgado donado hayan migrado y repoblado la mdula sea de la nia, dando as origen al nuevo grupo sanguneo. Clasificacin de las tcnicas de inmunodifusin Las reacciones de inmunodifusin pueden clasificarse como sencillas o dobles. En la inmunodifusin sencilla (o radial) (Figura 4), el antgeno o el anticuerpo est fijo en el medio y el otro componente migra libremente hasta que se forman los complejos inmunes. En la inmunodifusin doble tanto el antgeno como el anticuerpo pueden moverse libremente en el medio hasta que se encuentran y se precipitan. La inmunodifusin doble puede ser lineal o angular (Figura 5). En el primer caso, las fosas donde se colocan las muestras se hacen en lnea recta y la banda de precipitado que se observa forma una lnea. En la inmunodifusin doble angular (llamada tambin tcnica de Ouchterlony), las muestras se colocan en una serie de fosas equidistantes de una fosa central y las bandas de precipitado podran ser curvas. La imunodifusin es una tcnica semi-cuantitativa ya que se puede determinar la concentracin aproximada de antgeno y/o anticuerpo en la muestra por medio del grosor de la lnea de precipitacin. Tambin es usada como una tcnica cualitativa. Por ejemplo, la inmunodifusin doble angular (Figura 5) se usa comnmente para determinar si varios antgenos comparten determinantes antignicos (lo cual podra ser

5

indicativo de contaminacin de las muestras). En este caso se pueden producir tres clases de reacciones: a. reaccin de identidad- Dos o ms Ags (o muestras) comparten determinantes antignicos. La lnea de precipitacin ser en forma de curva. b. reaccin parcial- Dos o ms Ags (o muestras) comparten slo algunos determinantes antignicos. La lnea de precipitacin ser en forma de espuela. c. reaccin de no identidad- Dos o ms antgenos (o muestras) no comparten determinantes antignicos. Las lneas de precipitacin se cruzarn. En el ambiente clnico, la inmunodifusin se utiliza como prueba diagnstica para detectar infeccin con Histoplasma por medio de la precipitacin de anticuerpos del paciente con antgenos derivados del patgeno. La presencia de precipitados de anticuerpo contra el antgeno H indica histoplasmosis activa. Por otro lado, la formacin de precipitados contra el antgeno M se observa en pacientes que han padecido de histoplasmosis en el pasado.

Ejercicio: Precipitacin de complejos inmunes: Inmunoaglutinacin e Inmunodifusin NOTA: Recuerde seguir las reglas de seguridad discutidas al principio del semestre en todo momento! La participacin en la prctica de determinacin de grupos sanguneos de este ejercicio de laboratorio es estrictamente voluntaria; si decide participar debe manejar slo su propia sangre! Prctica # 1: Determinacin del tipo de sangre de una muestra 1. Aada una gota de antisuero para los antgenos A, B y D por separado a una laminilla/tarjeta limpia (Figura 7). 2. Desinfecte la yema de su dedo con alcohol. Pinche su dedo en el area desinfectada con una lanceta estril y descarte la primera gota ya que est diluda por fluido intersticial. 3. Aplique un total de tres gotas de sangre por separado a la laminilla/tarjeta con el antisuero. Asegrese de colocar cada gota de sangre al lado de un antisuero diferente (Figura 7). 4. Mezcle bien el antisuero con la sangre, primero con un palillo de dientes y luego meciendo cuidadosamente la laminilla/tarjeta. 5. Observe cul antisuero, si alguno, produjo aglutinacin. La reaccin de la sangre con el antisuero anti-D es notablemente ms lenta que la del anti-A y el anti-B. Por lo tanto, al leer los resultados debe asegurarse de que haya transcurrido suficiente tiempo para determinar si una persona posee o no el factor Rh. Prctica # 2: Simulacin de una prueba de inmunodifusin (Prueba de Ouchterlony) Simulacin tomada de: jeeves.mmg.uci.edu/immunology/Ouchterlony/ouchterlony.html

6

Siga las instrucciones de su instructor(a) para llevar a cabo una prueba virtual de inmunodifusin con las siguientes combinaciones de antgeno y anticuerpo: 1. centro - antgeno: BSA alrededor - anticuerpos: anti-BSA, anti-HSA Resultado:

2. centro - antgeno: BSA alrededor - anticuerpos: anti-BSA, anti-HSA, anti-HSA absorbido con BSA Resultado:

3. centro - anticuerpo: anti-BSA alrededor - antgenos: BSA y HSA Resultado:

4. centro - anticuerpo: anti-HSA alrededor - antgenos: BSA y HSA Resultado:

5. centro - BSA alrededor anti-BSA, anti-HSA, anti-HSA absorbido con BSA, HSA, anti-HSA Resultado:

Prctica # 3A: Determinacin de la identidad de un antgeno por inmunodifusin Para hacer una prueba de inmunodifusin en un medio semislido; por ejemplo agarosa, se vierte una solucin caliente de sta (usualmente al 1% en amortiguador de barbital o 1X PBS) sobre una laminilla o una placa petri. La agarosa solidificada luego es perforada para crear las fosas donde se aplicarn las muestras. La laminilla o placa con las muestras se coloca en una cmara hmeda por 24-48 horas, al cabo de las cuales deben ser visibles las lneas de precipitacin que se hayan formado.

7

Utilice el esquema indicado en la Figura 6 para preparar dos (2) laminillas cubiertas con 1% de agarosa en amortiguador de barbital (o en 1X PBS). En la fosa central coloque una muestra de: a. albmina de suero bovino (BSA) b. albmina de suero de caballo (HSA) c. albmina de suero de cerdo (SSA) d. una de las siguientes mezclas 1. a y b 2. a y c 3. b y c 4. a, b y c En las fosas numeradas coloque: 1. amortiguador de barbital 2. anticuerpo contra albmina de suero bovino (anti-BSA) 3. anticuerpo contra albmina de suero de caballo (anti-HSA) 4. anticuerpo contra albmina de suero de cerdo (anti-SSA) 5. anti-BSA y anti-HSA 6. anti-BSA y anti-SSA 7. anti-HSA y anti-SSA 8. anti-BSA, anti-HSA y anti-SSA Prctica # 3B: Determinacin de la identidad de un antgeno por inmunodifusin Utilice el esquema indicado en la Figura 4 para colocar sus muestras en una laminilla cubierta con 1% de agarosa en amortiguador de barbital (o en 1X PBS) que a su vez contiene uno de los siguientes anticuerpos inmovilizados: A. anti-BSA B. anti-HSA C. anti-SSA Los antgenos se colocarn a distintas concentraciones en las fosas 1-4.

Figura 1. La formacin de complejos inmunes insolubles depende de la concentracin de los componentes

8

Figura 2. Sistema de antgenos sanguneos AB

Figura 3. Deteccin del factor Rh en la superficie de glbulos rojos fetales

9

1

2

3

4

(anticuerpo disuelto)Figura 4. Esquema para prueba de inmunodifusin radial (o sencilla)reaccin parcial

reaccin de identidad reaccin de no identidad

Figura 5. Inmunodifusin doble lineal vs inmunodifusin doble angular

1 8 7 6 4 5 2 3 7 6 8

1 2 3 4 5

Figura 6. Esquema para prueba de inmunodifusin doble angular

Tarjeta de prueba de sangreMezclar Mezclar Mezclar

Anti-A

Sangre

Anti-B

Sangre

Anti D

Sangre

Figura 7. Tarjeta para determinar grupos sanguneos

10

Bibliografa Abbas, A. K., A. H. Lichtman, and S. Pillai. 2007. Cellular and Molecular Immunology. 6th edition. Elsevier Saunders, Philadelphia, PA. 566 pp. Alexander, S. I., N. Smith, M. Hu, D. Verran, A. Shun, S. Dorney, A. Smith, B. Webster, P. J. Shaw, A. Lammi, and M. O. Stormon. 2008. Chimerism and Tolerance in a Recipient of a Deceased-Donor Liver Transplant. NEJM 358: 369-374. Brooks, G. F., K. C. Carroll, J. S. Butel, and S. A. Morse. 2007. Jawetz, Melnick, & Adelberg's Medical Microbiology. 24th edition. McGraw-Hill, New York, NY. 832 pp. DeFranco, A. L., R. M. Locksley, and M. Robertson. 2007. Immunity: The Immune Response in Infectious and Inflammatory Disease. 1st edition. New Science Press, London. 387 pp. Goldstein, J., G. Siviglia, R. Hurst, L. Lenny, and L. Reich. 1982. Group B Erythrocytes Enzymatically Converted to Group O Survive Normally in A, B, and O Individuals. Science 215: 168170. Kindt, T. J., R. A. Goldsby, and B. A. Osborne. 2007. Kuby Immunology. 6th edition. W. H. Freeman and Company, New York, NY. 697 pp. Liu, Q. P., G. Sulzenbacher, H. Yuan, E. P. Bennett, G. Pietz, K. Saunders, J. Spence, E. Nudelman, S. B. Levery, T. White, J. M. Neveu, W. S. Lane, Y. Bourne, M. L. Olsson, B. Henrissat, and H. Clausen. 2007. Bacterial Glycosidases for the Production of Universal Red Blood Cells. Nat. Biotech. 25: 454-464. Murphy, K. 2011. Janeways Immunobiology. 8th edition. Garland Science, New York, NY. 888 pp. Paul, W. E. (Ed.) 2008. Fundamental Immunology. 6th edition. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 1632 pp. Virella, G. (Ed.) 2007. Medical Immunology. 6th edition. Informa Healthcare, New York, NY. 467 pp. Wood, P. 2006. Understanding Immunology. 2nd edition. Pearson Education Limited, Essex. 300 pp. Zambrano Villa, S. 2007. Inmunologa Bsica y Clnica. 1st edition. McGraw Hill Interamericana, Mxico, D. F. 426 pp.

11

Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa BIOL 4008L-Laboratorio de Inmunologa Ejercicio # 10: WESTERN BLOT Carlos A. Acevedo Surez Objetivos 1. Describir los fundamentos de la tcnica de western blot 2. Preparar suero para anlisis de protenas 3. Identificar algunas protenas presentes en suero por medio de un western blot El western blot permite la identificacin de protenas especficas en una muestra La tcnica de electroforesis de protenas en poliacrilamida (Ejercicio # 6) permite la separacin de protenas a base de su carga neta, peso molecular y conformacin. Cuando se utilizan muestras complejas de protenas, como por ejemplo, extractos celulares, para hacer una corrida de SDS-PAGE o una electroforesis nativa, es posible identificar protenas especficas en la muestra utilizando una tcnica analtica conocida en ingls como western blot (o immunoblot). Para hacer un western blot las protenas en la(s) muestra(s) de inters se separan inicialmente por SDS-PAGE o bajo condiciones nativas. Una vez terminada la corrida se remueve el gel del aparato de electroforesis y se coloca en contacto directo con una membrana hecha de nitrocelulosa o de difluoruro de polivinilideno (en ingls, PVDF: polyvinylidene difluoride). Luego se transfieren las protenas desde la acrilamida a la membrana por capilaridad o aplicando una corriente elctrica al gel. Este paso donde se transfieren protenas desde un gel a una membrana es lo que se conoce como western blot. Despus de la transferencia, la membrana es incubada con una combinacin de anticuerpos especficos que revelan si la(s) protena(s) de inters est(n) o no presentes en la(s) muestra(s). En general, los resultados obtenidos por medio de un western blot no son considerados cuantitativos sino que son cualitativos. El uso de programas de densitometra de imgenes para analizar las bandas de protena obtenidas en un western blot, permite la determinacin de cantidades relativas de sta con respecto a un control apropiado. La especificidad del western blot lo hace una tcnica muy poderosa utilizada regularmente en la investigacin. Tambin se utiliza a menudo en el mbito clnico y, por ejemplo, se considera la prueba definitiva para determinar si un paciente ha sido infectado por el virus de inmunodeficiencia humana y para diagnosticar en el ganado la encefalopata espongiforme bovina (EEB; en ingls, BSE: bovine spongiform encephalopathy), mejor conocida como la enfermedad de las vacas locas.

Ejercicio: Western blot NOTA: Recuerde seguir las reglas de seguridad discutidas al principio del semestre en todo momento!

LA ACRILAMIDA SIN POLIMERIZAR ES NEUROTOXICA, MANEJELA CON SUMO CUIDADO! EL METANOL ES PELIGROSO, USE GUANTES AL MANEJARLO Y DESCARTELO EN EL ENVASE PROVISTO, NO POR EL FREGADERO! MANEJE EL APARATO DE ELECTROFORESIS CON PRECAUCION YA QUE SE UTILIZA ALTO VOLTAJE PARA CORRER EL GEL Y HACER LA TRANSFERENCIA! EL APARATO DE TRANSFERENCIA SE TORNA SUMAMENTE CALIENTE DURANTE LA CORRIDA, MANEJELO CON SUMO CUIDADO! Prctica: Anlisis de muestras por Western blot Para poder hacer un western blot primero debemos separar las protenas presentes en las muestras de extractos celulares por electroforesis. En nuestro caso las muestras deben correrse en un gel de SDS-PAGE usando las condiciones descritas en el Ejercicio # 6: Electroforesis de protenas en poliacrilamida. Debido a que el tiempo disponible en un periodo de laboratorio es limitado, la corrida de electroforesis de protenas se iniciar antes de la llegada de los estudiantes. De esta manera el periodo de laboratorio ser dedicado al proceso del western blot como tal, incluyendo la transferencia de protenas a la membrana y la deteccin de stas por medio de anticuerpos. Preparacin de la muestra A. Suero bovino: Diluya 600 l de suero bovino inactivado con 600 l de amortiguador de unin, 10 mM Tris, pH 7.5. B. Suero humano: 1. Desinfecte la yema de su dedo con alcohol. Pinche su dedo en el rea desinfectada con una lanceta estril. Coloque varias gotas de sangre ( 600 l) en un microtubo. 2. Centrifugue la sangre por 5 min a 10,000 RPM. Remueva cuidadosamente el sobrenadante y mzclelo con un volumen igual de amortiguador de unin, 10 mM Tris, pH 7.5. Western blot de suero Despus de haber determinado la cantidad de protena en las muestras para el western blot, se corrern en un gel de SDS-PAGE (Ejercicio # 6) para poder identificar IgG. Antes de que termine la corrida de SDS-PAGE: 1. Prepare el amortiguador de transferencia (en ingls, transfer buffer = 25 mM Tris, 190 mM glicina, 15% metanol) y colquelo a 4 C. 2. Corte un pedazo de membrana de PVDF que sea aproximadamente de 1-2 mm ms grande que el tamao del gel de poliacrilamida usada para el SDS-PAGE. Recuerde USAR GUANTES SIEMPRE que vaya a manejar la membrana! 3. Equilibre la membrana antes de usarla. Para equilibrar la membrana sumrjala en un recipiente apropiado por: a) 10 s en 100% metanol, b) 1-2 min en agua destilada y c) al menos 5 min en amortiguador de transferencia.

2

4. Sumerja dos esponjas y de 2-4 pedazos de papel de filtro precortados de aproximadamente el tamao de la membrana de PVDF en un recipiente apropiado con amortiguador de transferencia. Montando el western blot: Las siguientes instrucciones describen cmo montar el sistema de western blot utilizando minigeles de poliacrilamida diseado por la compaa BioRad (MiniPROTEAN 3 Cell System). Utilice la Figura 1 como gua. 5. Coloque el casete de western blot abierto (Figura 1A) sobre una superficie plana. 6. Coloque una esponja previamente sumergida en amortiguador de transferencia (paso 4) sobre la mitad negra (o cualquier color equivalente) del casete. 7. Al finalizar la corrida de SDS-PAGE reduzca el voltaje a cero y apague la fuente de poder antes de desmontar el aparato de electroforesis de protenas. Despegue cuidadosamente el gel de acrilamida del cristal pequeo. 8. Usando una esptula, remueva cuidadosamente las fosas y el gel concentrador (si lo hubiese) del gel de poliacrilamida. Despegue los bordes del gel de los separadores (en ingls, spacers) del cristal grande. 9. Cuidadosamente coloque 1-2 papeles de filtro previamente sumergidos en amortiguador de transferencia (paso 4) sobre el gel. Trate de minimizar la formacin de burbujas de aire entre el papel de filtro y el gel. 10. Aguantando el papel de filtro, invierta el cristal grande con el gel y con mucho cuidado despegue la poliacrilamida del cristal. El gel debe quedar pegado del papel de filtro. 11. Coloque el papel de filtro con el gel encima de la esponja colocada sobre el casete de western blot (paso 6). 12. Utilizando pinzas (o guantes, si prefiere usar sus manos) para sujetar una esquina de la membrana equilibrada en amortiguador de transferencia, colquela sobre el gel de acrilamida. Debe evitar mover la membrana una vez la coloca sobre el gel y minimizar la formacin de burbujas de aire entre el gel y la membrana. 13. Corte una esquina de la membrana para indicar la orientacin del gel. 14. Cuidadosamente coloque 1-2 papeles de filtro previamente sumergidos en amortiguador de transferencia (paso 4) sobre la membrana. Trate de minimizar la formacin de burbujas de aire entre el papel de filtro y la membrana. 15. Utilizando una pipeta de 1 5 ml, rudela una vez sobre el papel de filtro de izquierda a derecha (o viceversa) y de arriba hacia abajo (o viceversa) para remover el aire que haya quedado atrapado. 16. Coloque la segunda esponja (equilibrada en amortiguador de transferencia previamente) sobre el papel de filtro y cierre el casete (Figura 1B). Debe sentir un poco de resistencia al cerrar el casete. 17. Deslice cuidadosamente el casete con la membrana en el aparato del electrodo de transferencia y colquelo en la cmara (o tanque) de electroforesis. IMPORTANTE: El lado negro del casete con la membrana debe estar hacia el lado negro del aparato del electrodo de transferencia. 18. Coloque un molde plstico con hielo y un agitador magntico pequeo en la cmara de electroforesis y llnela con el amortiguador de transferencia fro.

3

19. Selle la cmara de electroforesis cerciorndose que los cables estn colocados en el electrodo correcto (cada cable se conecta a la entrada del electrodo que tiene su mismo color). 20. Coloque la cmara de electroforesis en un recipiente grande con hielo y ste a su vez sobre un plato de agitacin magntica (en ingls, magnetic plate stirrer). El amortiguador de transferencia debe agitarse ligeramente mientras se aplica la corriente elctrica para hacer el western blot. 21. Asegrese que la fuente de poder est apagada y que los controles de voltaje o de corriente estn al mnimo. Conecte la cmara sellada a la fuente de poder asegurndose que los cables estn colocados en el electrodo correcto. Aplique un pequeo voltaje a la cmara de electroforesis y cercirese que se formen burbujas de aire en el amortiguador de transferencia. Si no se forman burbujas, apague todo el equipo y coteje todas las conexiones. Una vez conecte el equipo correctamente aplique un voltaje de 100 V a la cmara de electroforesis por 30-60 min a temperatura ambiente. 22. Una vez completada la transferencia, reduzca el voltaje a cero, apague la fuente de poder y desconecte la cmara de electroforesis. 23. Remueva el casete de transferencia, bralo y cuidadosamente remueva todos los materiales colocados sobre la membrana. Sujete la membrana por una esquina utilizando pinzas. Deteccin de protenas 24. Coloque la membrana en una bandeja pequea que contenga 20 ml de solucin bloqueadora (TBS-T/1% BSA) por 30-45 min a temperatura ambiente con agitacin. 25. Descarte la solucin bloqueadora y aada a la membrana 10 ml de solucin bloqueadora conteniendo una dilucin de 1:1000 de anticuerpo IgG contra fosfotirosina (anticuerpo primario). Incube por 30-45 min a temperatura ambiente con agitacin. 26. Remueva el anticuerpo primario y gurdelo en un tubo de 15 ml a 4 C. Lave la membrana, con suficiente volumen de TBS-T para cubrirla en la bandeja, por 5 min a temperatura ambiente con agitacin. Haga un total de cuatro (4) lavados. 27. Aada a la membrana 10 ml de solucin bloqueadora conteniendo una dilucin de 1:5000 de anticuerpo policlonal contra IgG (anticuerpo secundario). Incube por 30 min a temperatura ambiente con agitacin. 28. Descarte el anticuerpo secundario y lave la membrana como lo hizo despus de incubar con el anticuerpo primario. 29. Aada partes iguales del reactivo de ECL a la membrana. Incube por 1 minuto. Coloque la membrana en el casete de revelado y llvelo al cuarto oscuro, exponiendo la pelcula entre 1-15 min. 30. Una vez termine su trabajo de laboratorio por este da, devuelva todos los materiales pertinentes (incluyendo las sillas) a su lugar correspondiente y/o deseche aquellos que sea necesario en el recipiente designado. No podr irse del laboratorio sin antes limpiar su rea de trabajo con desinfectante.

4

hacia electrodo

+

hacia electrodo

_(b)

(a)

direccin de transferencia

+electrodo

_(c)

casete esponja papel de filtro membrana gel de poliacrilamida papel de filtro esponja caseteFigura 1. Montaje de western blot.

(a) Casete abierto y (b) visto desde el lado, indicando colores correspondientes a electrodos (c) Casete visto desde arriba indicando el orden de los materiales necesarios para transferencia de protenas durante corrida de western blot

Bibliografa Abbas, A. K., A. H. Lichtman, and S. Pillai. 2011. Cellular and Molecular Immunology. 7th edition. Elsevier Saunders, Philadelphia, PA. 560 pp. Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, and K. Struhl. 2002. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. 5th edition. Wiley, Hoboken, NJ. 1512 pp.5

DeFranco, A. L., R. M. Locksley, and M. Robertson. 2007. Immunity: The Immune Response in Infectious and Inflammatory Disease. 1st edition. New Science Press, London. 387 pp. Delves, P. J., S. J. Martin, D. R. Burton, and I. M. Roitt. 2011. Roitts Essential Immunology. 12th edition. Wiley-Blackwell, West Sussex. 560 pp. Geha, R. and F. Rosen. 2008. Case Studies in Immunology: A Clinical Companion. 5th edition. Garland Science, New York, NY. 344 pp. Hall, A. and C. Yates. (Eds.) 2010. Immunology (Fundamentals of Biomedical Science). 1st edition. Oxford University Press, New York, NY. 176 pp. Kindt, T. J., R. A. Goldsby, and B. A. Osborne. 2007. Kuby Immunology. 6th edition. W. H. Freeman and Company, New York, NY. 697 pp. Murphy, K. 2011. Janeways Immunobiology. 8th edition. Garland Science, New York, NY. 888 pp. Paul, W. E. (Ed.) 2008. Fundamental Immunology. 6th edition. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 1632 pp. Renart, J., J. Reiser, and G. R. Stark. 1979. Transfer of Proteins from Gels to Diazobenzyloxymethyl-Paper and Detection with Antisera: A Method for Studying Antibody Specificity and Antigen Structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 3116 3120. Strober, W. and S. R. S. Gottesman. 2009. Immunology: Clinical Case Studies and Disease Pathophysiology. 1st edition. Wiley-Blackwell, West Sussex. 424 pp. Virella, G. (Ed.) 2007. Medical Immunology. 6th edition. Informa Healthcare, New York, NY. 467 pp. Wood, P. 2006. Understanding Immunology. 2nd edition. Pearson Education Limited, Essex. 300 pp. Zambrano Villa, S. 2007. Inmunologa Bsica y Clnica. 1st edition. McGraw Hill Interamericana, Mxico, D. F. 426 pp.

6

Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa BIOL 4008L- Laboratorio de Inmunologa Ejercicio # 11: ASUNTOS ETICOS EN INMUNOLOGIA Carlos A. Acevedo Surez Objetivos 1. Presentar diversos casos relevantes a asuntos ticos en el rea de inmunologa y salud 2. Discutir complejidad de la toma de decisiones en estas reas 3. Reconocer y discutir los distintos puntos de vista presentados en cada caso Caso # 1. Concurso de televisin Una cadena de televisin en los Pases Bajos anunci en mayo de 2007 que transmitira un concurso donde tres (3) pacientes esperando por un transplante competiran para decidir quin recibira el rin de Lisa (nombre ficticio), una mujer de 37 aos con un tumor cerebral inoperable. Lisa quera donar uno de sus riones antes de morir y se propona entrevistar a cada paciente junto con sus respectivos familiares y amigos. De acuerdo a los productores del programa, el pblico televidente podra votar por su concursante favorito por telfono a un costo aproximado de $1.35 por llamada. Sin embargo, la decisin final de quin recibira el rin sera tomada por Lisa. Caso # 2. Fallo renal Luis (nombre ficticio), un paciente que padeca de fallo renal, recibi una donacin de rin de un donante vivo. El cuadro clnico del donante mostr que haba tenido una infeccin previa por una enfermedad de transmisin sexual (ETS) y que llevaba a cabo prcticas sexuales riesgosas. Sin embargo, el hospital lo consider apto para donar su rgano. Previo al trasplante se le realizaron al donante las pruebas de laboratorio de rigor para un donante de rganos incluyendo una para deteccin de VIH y todas dieron resultados negativos. Luego del trasplante Luis present varias complicaciones mdicas que lo pusieron en riesgo de que su cuerpo rechazara el trasplante. Un ao despus del trasplante, Luis va a un hospital con una infeccin severa de candidiasis y, al realizarle nuevamente la prueba de VIH, esta vez el resultado fue positivo. Cuando el comit mdico de trasplante investiga el caso, descubren que el donante haba tenido prcticas sexuales de alto riesgo justo previo a la donacin y haba contrado el VIH. Cuando analizaron el tipo de virus del donante y el de Luis, encontraron que eran 98%. Este es el primer caso documentado en el que una persona contrae VIH luego de recibir un trasplante de rgano de un donante vivo.

Caso # 3. Mi hermanita Bella y Edward son una matrimonio joven que tienen a una nia llamada Nessie quien padece leucemia. Los mdicos les indican a los padres que la condicin de la

nia est empeorando y que la nica opcin es conseguir a un donante de mdula sea. Debido a la dificultad para conseguir un donante compatible para Nessie, Bella y Edward deciden consultar con un geneticista para explorar otros posibles tratamientos para su hija. El especialista les explica que como hoy en da es posible manipular los cigotos para que el beb resultante sea compatible con otra persona, su mejor alternativa es que tengan un beb manipulado genticamente para que sea el donante de mdula sea para su hermana.

2

Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa BIOL 4008L-Laboratorio de Inmunologa Ejercicio # 12: Informes Orales Carlos A. Acevedo Surez Objetivos 1. Describir diversas enfermedades o condiciones de salud que son causadas por aberraciones del sistema inmunolgico o que alteran la funcin de ste 2. Presentar caractersticas sobresalientes del cuadro clnico y de la incidencia de dichas enfermedades/condiciones 3. Discutir pruebas diagnsticas y/o tipos de tratamiento de dichas enfermedades que estn basadas en conceptos de inmunologa discutidos durante el curso Temas para las presentaciones orales Cada seccin de laboratorio se dividir en cuatro (4) grupos. Su instructor(a) de laboratorio asignar uno de los siguientes temas a cada grupo: 1. Edema angioneurtico hereditario (Hereditary Angioneurotic Edema) 2. Enfermedad celaca (Celiac Disease) 3. Sndrome de Wiskott-Aldrich (Wiskott-Aldrich Syndrome) 4. Sndrome linfoproliferativo ligado a X (X-linked Lymphoproliferative Syndrome) Gua para las presentaciones orales I. Contenido de la presentacin oral Cada grupo har una presentacin oral de 25-30 minutos, incluyendo una sesin de preguntas. La presentacin deber incluir: a) descripcin breve y general de la enfermedad o condicin a discutirse b) discusin de cul es el rol o el defecto (si aplica) del sistema inmunolgico en la patologa de la enfermedad c) estadsticas de incidencia de la enfermedad en la poblacin (preferiblemente en Puerto Rico, si es posible) d) descripcin de pruebas comunes para diagnosticar la enfermedad que utilicen tcnicas basadas en principios de inmunologa (si aplica) y tratamientos disponibles, si alguno II. Organizacin de la presentacin oral La presentacin oral se debe dividir en tres secciones: a) Introduccin: Indica el propsito de la presentacin, y enfatiza la importancia del tema a discutirse. Tambin se presentan los puntos principales que se van a discutir en la charla. b) Cuerpo: Exposicin lgica y organizada del tema. Recuerde discutir los puntos mencionados en la Seccin I de la gua. Esta debe ser la seccin ms extensa de la presentacin. c) Conclusin: Sinopsis de los puntos ms importantes de la presentacin.

III. Evaluacin A. Tanto el trabajo en grupo como la presentacin final en el laboratorio ser evaluada utilizando la siguiente escala: 5 = excelente, sobrepas todas las expectativas 4 = bueno, sobrepas algunas de las expectativas 3 = promedio, cumpli con las expectativas 2 = deficiente, cumpli slo algunas de las expectativas 1 = fall en cumplir con las expectativas mnimas B. Distribucin de puntos para la nota final de la evaluacin: Contribucin del estudiante al trabajo de su grupo-(Promedio de la evaluacin sometida por TODOS los miembros de su grupo) 10% Presentacin oral-(Promedio de la evaluacin sometida por TODOS los estudiantes presentes en la seccin de laboratorio) 20% Presentacin oral-(Evaluacin por el (la) instructor(a) de laboratorio) 70% C. La contribucin de cada estudiante al trabajo grupal ser evaluada por los miembros de su grupo (Tabla 2) de acuerdo a los criterios descritos en la prxima pgina. Se utilizar la escala descrita en la Seccin III A. TODOS los miembros del grupo debern someter esta evaluacin. D. La presentacin oral de cada estudiante ser evaluada de dos (2) maneras: junto con su grupo (Tabla 3) e individualmente (Tabla 4). TODOS los estudiantes presentes en la seccin de laboratorio, en adicin al/a la instructor(a), sometern ambas evaluaciones. Se utilizar la escala descrita en la Seccin III A. La presentacin oral del estudiante ser evaluada en las siguientes categoras: A) B) C) D) E) F) G) dominio del material durante la presentacin organizacin del material uso de ayudas audiovisuales cobertura adecuada del tema manejo de preguntas del pblico lenguaje corporal y tono de voz apropiado uso correcto del vocabulario de inmunologa, ortografa correcta en el texto de la presentacin

2

Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Departamento de Biologa BIOL 4008L-Laboratorio de Inmunologa Ejercicio # 12: Informes orales Contribucin del estudiante al trabajo del grupo Tema: ________________________________________________________________ Criterios para la evaluacin de tareas realizadas por los miembros del grupo: (Opcional: Puede utilizar la Tabla 1 para documentar su evaluacin.) A. B. C. D. E. Busc informacin relacionada al tema. Aport ideas, sugerencias, etc. para el contenido de la presentacin. Contribuy ideas, sugerencias, etc. para la preparacin de la presentacin electrnica. Asisti a reuniones y/o se mantuvo en comunicacin con el resto del grupo. Otras tareas; especifique: _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

Tabla 1. Reuniones de trabajo del grupo (Opcional) Fecha Hora PropsitoAsistencia (Iniciales)

Comentarios

Tabla 2. Evaluacin de la contribucin del estudiante al trabajo del grupo Nombre del estudiante Evaluacin (1-5)

3