FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES · A los que me acogieron y ayudaron en toda la memoria, el Pepe y la Vivi, gracias por la infraestructura, ánimo, el ejemplo y la consecuencia en

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES

ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES

DEPARTAMENTO DE MANEJO DE RECURSOS FORESTALES

EVALUACIÓN DE ENSAYOS DE PROCEDENCIA DE Sequoia

sempervirens (D. Don) Endl.

Memoria para optar al Título

Profesional de Ingeniero Forestal

JORGE DANIEL MIRANDA LEÓN

Profesores Guía: Ing. Forestal, Sr. Manuel Toral Ibáñez

Dra. en Ciencias, Margarita Carú Marambio

SANTIAGO - CHILE 2006

3

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES

DEPARTAMENTO DE MANEJO DE RECURSOS FORESTALES

EVALUACIÓN DE ENSAYOS DE PROCEDENCIA DE Sequoia sempervirens (D. Don) Endl.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Forestal

JORGE DANIEL MIRANDA LEÓN

Calificaciones: Nota Firma

Profesores Guías:

Sra. Margarita Carú M. 7,0 …………………………………..

Sr. Manuel Toral I. 6,8 …………………………………..

Profesores Consejeros:

Prof. Consejero Sr. Antonio Vita A. 6,5 …………………………………..

Prof. Consejero Sr. Sergio Mora O. 6,3 …………………………………..

SANTIAGO-CHILE 2006

4

DEDICATORIA

A Victoria León Madariaga y Jorge Miranda Aguilera

Que gracias a su lucha, esfuerzo y consecuencia lograron ser unos padres ejemplares

A Lorna, quien me acompaña en este camino

5

AGRADECIMIENTOS

A todos los que participaron transcribiendo datos, revisando ortografía y gramática,

traduciendo, arreglando mapas: Lorna, Obreque, Juan Díaz Reyes, Walla, Viviana LL.,

Viviana M., Jorge Miranda A, Eliana, Violeta y Mauro.

A mi compañera de terreno y amiga Mónica Terrada, muchísimas gracias por hacerme tan

grato el trabajo. A los obreros de huincha y pie de metro: Roberto Garfias, Emardo

Hantelmann y a mi amigazo Pablo Zúñiga.

A Forestal Natalhue y Forestal Voipir, por el apoyo en terreno. A todos los obreros de

ambas empresas que sin saberlo me ayudaron a terminar la memoria. Además me

hicieron entender que todavía queda mucho por hacer en pos de las condiciones

laborales de los obreros forestales.

A todos los que estuvieron, me apoyaron y enseñaron a trabajar en un laboratorio:

Juanita, Lorena, Betty, Pilar, Marcos y en especial a mi amigo Rafael Guevara por varias

cosas, primero por la música, luego por su alegría y finalmente por la disposición a

enseñarme.

A mis amigotes de Manejo A -Coloro, Juan Díaz Reyes, Obreque, Walla y Lucho-,

amigos: lo dijo Sabina, lo dijo Serrat: “…las malas compañías, son las mejores…” y punto.

A los que me acogieron y ayudaron en toda la memoria, el Pepe y la Vivi, gracias por la

infraestructura, ánimo, el ejemplo y la consecuencia en sus vidas.

Al “Club Social y Deportivo La Copa Rota”, conformado por Nicolás Fontecilla, Suraj

Vaswani, Ramón Valdés y Ernesto Moraga.

A Don Manuel Toral, primero como director del proyecto FONDEF D01 I 1008, y segundo

por el apoyo y aliento en aquellos momentos claves del desarrollo de la memoria. A

Margarita Carú, quien me recibió como uno más de los memorantes de Ciencias, por los

consejos y correcciones a tiempo.

A Don Sergio Mora, muchas gracias por su valioso tiempo, certeros comentarios, y por

demostrar una vocación severa que va más allá de los cálculos y estadísticas. A Don

Antonio Vita por la comprensión y la gran ayuda en la etapa final de la Memoria.

6

A Francisca Riveros (Panchita), por su constante apoyo, ánimo y grandiosa ayuda en la

etapa final de la memoria.

A todos mis amigos de carrete que preguntaron como iba la memoria y me dieron ánimo

para terminar: Macarena Barros, Sindy Durán, Claudia Silva, Javier San Martín, Juan

Carlos Riveros y Pablo Bruna.

A Juan Díaz, por su disposición, tiempo y amistad. Amigo, no existen las palabras para

expresar la gratitud que tengo hacia tu persona. Que esta memoria haya terminado de

buenas maneras se debe en gran parte a ti –al igual que Manejo I y II-; sinceramente

GRACIAS.

Y finalmente a quien me metió en este lío de la memoria, mi amigo Roberto Garfias. Que

cuando lo conocí era malo, pero ahora no tanto.

7

RESUMEN

En este estudio, se evaluaron genéticamente dos ensayos de procedencia, a tres años del

establecimiento, ubicados en la IX y X regiones. El primer ensayo -Voipir- está compuesto

por 34 clones y el segundo -Natalhue- por 88.

En ambos ensayos se evaluó la existencia de diferencias entre los efectos de los clones.

La evaluación se realizó utilizando los valores medios del incremento producido en el

periodo 2003-2005, para las variables DAC2*H –Índice de Biomasa-, DAC -Diámetro a la

Altura del Cuello- y Altura. Además, como ambos ensayos comparten 4 clones se evaluó

la existencia de interacción clon-sitio, y si existían diferencias entre los sitios.

En el ensayo Voipir se utilizó un diseño de bloques completamente al azar, con un modelo

mixto. En cambio, en el ensayo Natalhue se utilizó un diseño completamente al azar con

un modelo de efectos aleatorios. Finalmente, para evaluar la interacción clon-sitio y

diferencias entre sitios, se utilizó un diseño de bloques completamente al azar bifactorial

(4X2).

Los resultados entregados por el ANDEVA, indican existencia de diferencias significativas

entre los efectos de las tres variables en los clones del ensayo Voipir. Del mismo modo,

en el ensayo Natalhue se determinó la existencia de diferencias significativas para las tres

variables, cuando se probó dentro de los clones que pertenecen a Humboldt.

Además, se determinó la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los

sitios para las variables DAC2*H y DAC, no así para la altura. Finalmente, se comprobó la

no existencia de interacción clon-sitio -para las tres variables- y la no existencia de

diferencias significativas entre los efectos de los clones para las tres variables analizadas.

En el ensayo Voipir, el clon RB3-57-77-7 es el que lidera en ranking para las tres

variables. Para el ensayo Natalhue, los clones que se encuentran al inicio del ranking

pertenecen al Condado de Humboldt RB2-238-19 para DAC2*H y DAC, y RB2-238-18

para la altura.

A nivel molecular, se identificaron marcadores moleculares RAPDs -Random Amplified

Polymorphic DNA o amplificación del DNA al azar- y se establecieron relaciones de

similitud entre las 10 procedencias con mejor rendimiento luego de la primera medición -

año 2003-. Los partidores que entregaron patrones de bandas polimórficas para secoya

son los correspondientes a las series BG04, BF07, BF12, BF13 y BF14.

Palabras claves: Sequoia sempervirens, Secuoya, ensayos de procedencia, marcadores

RAPDs.

8

SUMMARY

In this study, two provenance trials located in regions IX and X Chile were genetically

evaluated three years after being established. The first trial -Voipir- is made up of 34

provenances and the second trial -Natalhue- is made up of 88.

In both trials the existence of differences between the effects of provenances was

measured. This was carried out using the mean value of growth for the 2003-2005 period

on the DAC2*H, DAC and height variables.

Also, as both trials share 4 provenances, the existence of provenance-site interaction was

evaluated. Differences between the sites themselves were also evaluated.

In the Voipir trial the design used was that of completely random blocks, using a mixed

model. On the other hand, in the Natalhue trial a completely random design was used with

a random effect model. Finally, to evaluate the provenance-site interaction and the site

differences, a completely random bifactorial block design was used.

Results obtained by ANOVA, show the existence of significant differences between the

effects of the three variables on the provenances from the Voipir trial.Similarly, in the

Natalhue trial significant differences for the three variables were found, when the trials

were made to the clones belonging to the Humboldt County.

Also, the existence of significant differences between the effect of the site for the DAC2*h

and DAC variables were found, but not for the height variable. In the same way, the non

existence of provenance-site interaction -for all three variables- and the non existence of

significant differences between the effects of provenances on the three variables in

evaluation was proven.

In the Voipir trial the RB3-57-77-7 provenance leads the ranking on all three variables. In

the Natalhue trial, the leading provenances belonging to the Humboldt County were RB2-

238-19 for the DAC2*H and DAC variables, and RB2-238-18 for the height variable.

On a molecular level, molecular markers RAPDs were identified. Relationships of similarity

were established between the 10 provenances with best results after the first

measurement -2003-.

The primers that revealed patterns of polymorphic bands for Redwood correspond to the

BG04, BF07, BF12, BF13 y BF14 series, all belonging to Operon Technologies.

Keys Words: Sequoia sempervirens, redwood, provenance trials, RAPDs markers.

9

TABLA DE CONTENIDOS

1 INTRODUCCIÓN ____________________________________________________ 1

2 OBJETIVOS ________________________________________________________ 2

2.1 Objetivo general___________________________________ ______________ 2

2.2 Objetivos específicos ______________________________ ______________ 2

3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA _____________________________ ______________ 3

3.1 Antecedentes generales de Sequoia sempervirens ____________________ 3

3.1.1 Descripción botánica y taxonómica _______________________________ 3

3.1.2 Distribución de la especie_______________________________________ 3

3.1.3 Características generales del árbol _______________________________ 3

3.1.4 Características del hábitat de la especie ___________________________ 4

3.2 Variación genética _________________________________ ______________ 4

3.3 Ensayos de procedencias____________________________ _____________ 5

3.4 Técnicas moleculares _______________________________ _____________ 5

3.4.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) _______________________ 5

3.4.2 Marcadores moleculares aplicados a especies forestales ______________ 6

3.4.3 Marcadores moleculares RAPDs _________________________________ 7

4 MATERIAL Y MÉTODO __________________________________ _____________ 9

4.1 Material ___________________________________________ _____________ 9

4.1.1 Ubicación de los ensayos _______________________________________ 9

4.1.2 Caracterización del material genético_____________________________ 10

4.1.3 Muestras para el análisis molecular______________________________ 11

4.1.4 Reactivos químicos___________________________________________ 12

4.2 Método _____________________________________________ __________ 12

4.2.1 Evaluación del comportamiento de los clones ______________________ 12

4.2.2 Jerarquización de los clones____________________________________ 21

4.2.3 Procesamiento de los datos ____________________________________ 22

4.2.4 Identificación de marcadores moleculares RAPDs __________________ 22

5 RESULTADOS _____________________________________________________ 25

10

5.1 Ensayo Voipir ______________________________________ ____________ 25

5.1.1 Valores medios por clon _______________________________________ 25

5.1.2 Análisis de los incrementos medios para la muestra aleatoria__________ 30

5.1.3 Análisis de los incrementos medios para la selección de los 10 clones con

mejor rendimiento para cada una de las variables __________________________ 33

5.2 Ensayo Natalhue ____________________________________ ___________ 37

5.2.1 Valores medios por clon _______________________________________ 37

5.2.2 Análisis de los incrementos medios para la muestra aleatoria, donde cada

condado está representado por un clon.__________________________________ 45

5.2.3 Análisis de los incrementos medios para la muestra aleatoria de los clones

que pertenecen al condado de Humboldt. ________________________________ 49

5.2.4 Análisis de los incrementos medios para la selección de los 10 clones con

mejor rendimiento para cada una de las variables __________________________ 54

5.3 Evaluación de la interacción entre sitios__________ __________________ 58

5.4 Selección y evaluación de partidores para los marca dores RAPDs______ 63

6 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES_______________________________________ 69

7 BIBLIOGRAFÍA _______________________________________ _____________ 72

8 APÉNDICES _______________________________________________________ 78

8.1 Apéndice 1. Distribución de los bloques y parcelas en terreno para cada

ensayo _____________________________________________ ________________ 78

8.2 Apéndice 2. Distribución aleatoria de los clones en el ensayo Voipir, con

códigos de terreno _________________________________ __________________ 79

8.3 Apéndice 3. Distribución aleatoria de los clones en el ensayo Natalhue, con

códigos de terreno _________________________________ __________________ 80

8.4 Apéndice 4. Protocolo de extracción de DNA para sec uoya ____________ 82

8.5 Apéndice 5. Tablas ANDEVA para la muestra aleatoria , ensayo Voipir ___ 83

8.6 Apéndice 6. Tablas ANDEVA de la selección de los 10 clones con mejor

rendimiento, ensayo Voipir _________________________ ___________________ 84

8.7 Apéndice 7. Tablas ANDEVA para la muestra aleatoria de los condados de

California, ensayo Natalhue________________________ ____________________ 85

8.8 Apéndice 8. Tablas ANDEVA para la muestra aleatoria en el condado

Humboldt (California, EE.UU.), ensayo Natalhue_____ ______________________ 86

8.9 Apéndice 9. Tablas ANDEVA de la selección de los 10 clones con mejor

rendimiento, ensayo Natalhue_______________________ ___________________ 87

11

8.10 Apéndice 10. Intervalos de confianza para la media del incremento

producido en el periodo 2003-2005, ensayo Natalhue _ _____________________ 88





8.13 Apéndice 13. Tablas ANDEVA, evaluación entre los en sayos Voipir y

Natalhue___________________________________________ _________________ 91

8.14 Apéndice 14. Tamaño de fragmentos amplificados medi ante RAPDs,

utilizando los 5 partidores seleccionados __________ ______________________ 92

8.15 Apéndice 15. Datos selección de clones para el anál isis molecular____ 93

8.16 Apéndice 16. Datos de Terreno, ensayo Voipir _______ ______________ 94

8.17 Apéndice 17. Datos de Terreno, ensayo Natalhue _____ _____________ 95

8.18 Apéndice 18. Fotografías en terreno de cada una de las etapas de la

evaluación, desde establecimiento hasta la toma de datos. _________________ 97

9 ANEXOS _________________________________________________________ 102

9.1 Ubicación geográfica de los clones probados en el e nsayo Voipir._____ 102

9.2 Anexo 2. Ubicación geográfica de los clones probado s en el ensayo

Natalhue. __________________________________________ ________________ 103

9.3 Anexo 3. Material genético por Localidad, Reproducc ión y Fecha de

recolección ________________________________________ ________________ 104

1 INTRODUCCIÓN

En la actualidad, el sector forestal está consolidado como el segundo rubro exportador

más importante en el ámbito nacional. El éxito de este desarrollo, se debe casi

exclusivamente al cultivo de Pinus radiata y Eucalyptus globulus. Esta situación -de

escasa diversidad- es la que hace notar la importancia de diversificar la masa forestal

existente en Chile.

Bajo esta perspectiva, el PROYECTO FONDEF D01 I 1008 “Silvicultura y Manejo de la

Sequoia en Chile y fomento de su plantación forestal sustentable”, tiene como objetivo

central la introducción de esta especie, contribuyendo así a romper con el monocultivo,

que actualmente se realiza en el país.

Para ello, es fundamental considerar toda la información actual y potencial del desempeño

de esta especie en Chile, abarcando el ciclo económico forestal en forma integral, esto es,

desde el mejoramiento genético hasta la venta de productos terminados.

En este contexto, dentro de un plan de mejoramiento genético forestal, se encuentran las

pruebas de procedencia, que evalúan el comportamiento de éstas en base a su

información fenotípica. Además, en sus resultados entregan información referente a qué

fuente de semilla utilizar en las siguientes generaciones de mejora, para así, facilitar la

toma de decisiones en una planificación estratégica.

Complementando lo anterior, se debe destacar la reciente tendencia a nivel mundial de

utilizar la biotecnología dentro de la investigación forestal tradicional.

Entre las líneas de acción de la biotecnología, se encuentra la aplicación de marcadores

moleculares como lo es la amplificación del DNA al azar, marcadores RADPs -Random

Amplified Polymorphic DNA- basados en la técnica de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa -PCR, Polymerase Chain Reaction- la cual consiste en la amplificación,

mediante enzimas, de secuencias específicas del genoma.

El objetivo general de esta memoria de título, corresponde a la evaluación genética de

dos ensayos de procedencia -a tres años del establecimiento- ubicados en la IX y X

regiones.

2

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

Evaluar ensayos de procedencias en Sequoia sempervirens (D. Don) Endl. y marcadores

RAPDs, en la IX y X regiones, a tres años del establecimiento.

2.2 Objetivos específicos

i. Evaluar el comportamiento en terreno de las distintas procedencias probadas

en los dos ensayos.

ii. Jerarquizar las procedencias en base a sus valores promedios por familia, para

las características de DAC2*H, DAC -Diámetro a la Altura del Cuello- y altura.

iii. Identificar marcadores moleculares RAPDs para secuoya.

iv. Evaluar el valor de los marcadores RAPDs para establecer relaciones de

similitud en una submuestra.

3

3 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

3.1 Antecedentes generales de Sequoia sempervirens

3.1.1 Descripción botánica y taxonómica

Sequoia sempervirens (D. Don) Endl. es una Gymnosperma de la Familia Taxodiaceae y

es la única especie que conforma el género Sequoia (INFOR, 1998).

Su nombre común en español corresponde a secuoya, sequoia, sequoia roja; en inglés a

californian redwood, coast redwood, entre otros. En Chile se le conoce como alerce

americano (INFOR, 1998; Peterson, 2003).

Secuoya se reproduce tanto por semillas como por rebrotes y esquejes, es decir, sexual y

asexualmente. Un ejemplar maduro puede producir una gran cantidad de semillas, pero

con una baja capacidad germinativa, debido a la gran cantidad de semillas vanas (Grosse

y Kannegiesser, 1989). Es por esto que la reproducción vegetativa cumple un rol

determinante en la preservación de la especie, ya que es la forma más común y exitosa

de reproducción (Brinegar, 2003). Es probable que los gigantescos ejemplares que se

encuentran dentro de los Parques Estatales del National Park Service posean idéntica

información genética que sus ancestros.

3.1.2 Distribución de la especie

Actualmente, secuoya se encuentra restringida a una franja de 720 km de largo y 56 km

de ancho, la cual se distribuye desde el extremo sur oeste del estado de Oregón hasta las

montañas de Santa Lucía -Monterrey, California- (Ramírez, 2002; Brinegar, 2003).

Altitudinalmente se localiza entre los 30 y 800 msnm (INFOR, 1990; Olson et al., 1990).

En Chile, secuoya se presenta en plantaciones puras y mixtas -con pino oregón-, las que

se distribuyen desde la IX hasta la X región, predominando en las provincias de Valdivia y

Cautín (INFOR, 1998).

3.1.3 Características generales del árbol

Secuoya es un árbol perennifolio y monoico, alcanza alturas que fluctúan entre los 60 y

110 m, diámetros de 3 a 5 m, con edades que pueden llegar incluso a los 2000 años

(USDA Forest Service, 2003; Álvarez, 2004; Sloan y Boe, 2004).

Los mejores rendimientos en Chile corresponden a plantaciones entre la VII y X región,

donde se ha estimado una rotación de 40-50 años (Kannegiesser, 1990).

4

Secuoya al ser dominante, crece en rodales puros, pese a esto, cuando se encuentra en

rodales mixtos se asocia a los géneros Picea, Abies y Tsuga (INFOR, 1990).

3.1.4 Características del hábitat de la especie

El clima donde se distribuye secuoya corresponde a templado superhúmedo o húmedo

con influencia oceánica. Las temperaturas medias anuales oscilan entre los 10 y 16 °C. El

período libre de heladas varía entre 6 a 11 meses (Fowells, 1965; Kuser, 1981).

La precipitación anual varía entre 630 y 3.100 mm, y se distribuye principalmente en

invierno, siendo el mes más húmedo enero y agosto el más seco -hemisferio Norte-

(Fowells, 1965; Sloan Y Boe, 2004).

Los suelos en que crece secuoya son profundos, permeables de buen drenaje, de color

gris claro a suavemente rojizos, con pHs que fluctúan entre 5,0 y 7,5. La textura abarca el

rango que va desde areno-limoso hasta arcillo-limoso (Kannegiesser, 1990).

3.2 Variación genética

El fenotipo de un individuo se puede describir mediante la relación:

EGP +=

donde P, representa el fenotipo, es decir, el valor observado; G representa el genotipo,

que se refiere a todos los genes que posee el individuo y E representa el ambiente, que

se puede definir como todas las circunstancias no genéticas que influyen en el valor

fenotípico (Falconer, 1970; Zobel y Talbert, 1994; Stansfield, 1992).

De lo anterior se desprende que el fenotipo es el resultado de las interacciones genéticas

que se manifiestan en un ambiente dado (Stansfield, 1992).

A nivel poblacional, la relación anterior se debe entender como la variación en esa

población (Falconer, 1970; Zobel y Talbert, 1994; Ocampo, 2001):

222EGP σσσ +=

donde,

σP2 = Varianza fenotípica; σG

2 = Varianza genotípica; σE2 = Varianza ambiental

La varianza genotípica tiene componentes aditivos y no aditivos:

222NAAG σσσ +=

σA2 = Varianza genética aditiva; σNA

2 = Varianza genética no aditiva

5

Por lo tanto, el modelo inicial, a nivel poblacional queda expresado de la siguiente

manera:

2222ENAAP σσσσ +++=

σP2 = Varianza fenotípica; σA

2 = Varianza genética aditiva; σNA2 = Varianza genética no

aditiva; σE2 = Varianza ambiental

3.3 Ensayos de procedencias

Las pruebas de procedencia son plantaciones diseñadas para evaluar el comportamiento

de distintas fuentes de semillas y así poder seleccionar las que presenten mejor

comportamiento en las áreas de prueba (Zobel y Talbert, 1994).

Las mayores ganancias en cualquier programa de mejoramiento genético forestal se

obtienen utilizando la especie y fuente de semilla adecuados (Zobel y Talbert, 1994).

La selección de las procedencias con mejor aptitud, mayor rendimiento y cualidades,

permitirá en el futuro establecer masas mejor adaptadas para objetivos más concretos

(Zobel y Talbert, 1994).

Los resultados de la evaluación de pruebas genéticas permiten realizar un “ranking” de los

individuos en estudio e incluirlos en la población de mejora (Zobel y Talbert, 1994;

Ocampo, 2001).

3.4 Técnicas moleculares

3.4.1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La técnica de PCR fue desarrollada a mediados de los 80 por Kary Mullis y consiste en la

amplificación in vitro de regiones específicas del genoma (Saiki et al., 1985; Mullis et al.,

1986). La PCR utiliza las propiedades de la replicación del DNA, donde la DNA

polimerasa requiere un oligonucleótido como partidor y un templado1 de hebra simple para

iniciar la síntesis de la hebra complementaria. Los partidores son diseñados de manera

que flanquean la región del DNA que se amplificará tal que la nueva hebra sintetizada

comenzará en cada partidor y se extenderá hasta la posición del partidor en la hebra

opuesta.

1 Templado: Molde.

6

El proceso de amplificación se consigue mediante un ciclo térmico que considera una

denaturación del DNA generalmente entre 95-98 ºC. Luego, a menor temperatura (50 °C),

se produce la unión de cada partidor con el templado para comenzar con la reacción de

extensión (70 °C) donde una DNA polimerasa agrega l os nucleótidos al primer2. Este ciclo

térmico se repite n veces, obteniéndose teóricamente 2n moléculas de DNA doble hebra

correspondiente a un segmento específico del genoma con una secuencia idéntica al DNA

blanco (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986).

Los productos de amplificación son detectados finalmente, mediante diversas técnicas,

siendo las más comunes la electroforesis en geles de Agarosa o Poliacrilamida

(Stansfield, 1992).

La técnica de PCR es una poderosa herramienta para el estudio de regiones específicas

del genoma, ya que (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986; Welsh et al., 1991):

i. no se requiere construir una biblioteca genómica,

ii. se puede utilizar una cantidad pequeña de DNA,

iii. es una técnica rápida de aplicar al estudio de polimorfismos genéticos

mediante marcadores moleculares como RAPD o el análisis de polimorfismos

en el largo de fragmentos de restricción -RFLP, Restriction Fragment Length

Polymorphism- entre otros, y

iv. no requiere el uso de isótopos radiactivos.

3.4.2 Marcadores moleculares aplicados a especies f orestales

La investigación forestal tradicional se ha basado en las mediciones y análisis de las

características fenotípicas; es decir, las características mensurables que a simple vista

presenta la población en estudio, lo que conlleva a una serie de deficiencias en la calidad

de la información, ya que la expresión o no de un patrón puede tener distintos orígenes

causales -medioambientales o genéticos- (Hinrichsen, 1995; Campos de Quiroz et al.,

2002).

2 Primer: fragmento específico de DNA, del cual se conoce su secuencia -y se desconoce su

función- y que sirve de inicio de la síntesis de DNA.

7

En este sentido, los marcadores moleculares son un importante complemento a la

aproximación tradicional, principalmente porque ellos permiten identificar directamente las

diferencias genéticas entre individuos, obteniéndose un "perfil molecular" o "fingerprinting"

característico para cada variedad e independiente de las condiciones de crecimiento de

las plantas (Morell et al., 1995; Campos de Quiroz, 1995). Se consideran marcadores

moleculares a las biomoléculas tales como proteínas (antígenos e isoenzimas) o DNA -

genes conocidos o secuencias de DNA con función desconocida- (Campos de Quiroz,

1995; Staub et al., 1996).

En el ámbito nacional, los trabajos con marcadores moleculares se han desarrollado

principalmente en especies de importancia agrícola (Ojeda et al., 1998; Hinrichsen, 1995).

Los marcadores moleculares pueden ser usados como herramienta para describir la

variación genética en poblaciones forestales (Herrera et al., 2000), como también se

pueden aplicar al desarrollo de nuevas variedades (mejoramiento asistido), hasta la

identificación y marcaje de variedades específicas para su explotación comercial

(Hinrichsen, 1995).

La principal ventaja del uso de marcadores moleculares RAPDs versus alternativas como

el uso de isoenzimas, es que en los primeros se puede analizar la totalidad del genoma

de una especie forestal, mientras que para los segundos sólo se puede analizar una

porción limitada del mismo genoma (Campos de Quiroz et al., 2002).

3.4.3 Marcadores moleculares RAPDs

Los marcadores RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) están basados en el uso

de un solo partidor corto (10 bp de longitud) de secuencia al azar. Si un par de partidores

encuentran regiones complementarias en el genoma e hibridan en una dirección

apropiada y, separados por unos pocos cientos de bp, se podrá amplificar un fragmento

de un tamaño molecular correspondiente a la distancia entre los dos partidores. El

número y localización de estos sitios de iniciación -priming- dan cuenta de variaciones

intra e interespecíficas, las cuales se visualizan por el tamaño de los fragmentos

amplificados con cada uno de los partidores que se ensayan. La separación de estos

productos de amplificación mediante electroforesis produce un patrón de bandas -huella

digital o fingerprinting- específico (Williams et al., 1990; Hinrichsen, 1995; Hinrichsen et

al., 1996).

8

Una importante ventaja de los marcadores RAPD es que no requieren de información de

las secuencias del genoma del organismo en estudio (Williams et al., 1990; Hinrichsen,

1995).

La utilización de la técnica PCR-RAPD tiene además la ventaja de ser un método rápido y

fácil de aplicar, de bajo costo en relación a la amplificación de fragmentos genómicos

digeridos por enzimas de restricción -AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism-

(Vos et al., 1995) y el material biológico requerido es muy pequeño (Steinger et al., 1996;

Gugerli et al., 1999). Entre las desventajas de los RAPDs se puede mencionar que son

marcadores dominantes, por lo que no se puede discernir sobre la heterocigocidad de los

loci en estudio. Además para conseguir la reproducibilidad se deben establecer

rigurosamente las condiciones del ensayo, ya que la reacción es muy sensible a las

condiciones de amplificación (calidad y concentración del DNA, DNA polimerasa, etc.)

(Hinrichsen et al., 1996).

Dentro de las aplicaciones de los marcadores RAPDs, se puede mencionar la

identificación de las relaciones genéticas entre individuos (Van Heusden y Bach-mann,

1992), como también proporcionar estimaciones de la variabilidad genética intraespecífica

(Dawson et al., 1995; Ayres y Ryan, 1999; Fisher et al., 2000), la caracterización de

colecciones de germoplasma, y finalmente para realizar fingerprint o huella digital en

numerosas especies vegetales (Won y Sun, 1999; Campos de Quiroz, 1995).

En el ámbito forestal, las técnicas moleculares se suman a la investigación tradicional y el

uso de marcadores RAPDs se han aplicado con éxito en estudios de variaciones

genéticas de poblaciones de especies raras (e.g., Fischer y Matthies, 1997), como

también para cuantificar la diversidad genética intra e inter poblacional en Pinus,

Eucalyptus, Acacia, Amentotaxus, Picea, Nothofagus (Becerra et al., 2003), Salix

(Campos de Quiroz, 1995) y, Populus (Herrera et al., 2000), Pseudotsuga (Carlson et al.,

1991; Jermstad et al., 1994) entre otros, y para verificar el origen de híbridos naturales

(Padgett et al., 1998).

9

4 MATERIAL Y MÉTODO

4.1 Material

En este trabajo se analizan dos ensayos establecidos en julio del año 2002 por el

PROYECTO FONDEF D01 I 1008 “Silvicultura y Manejo de la Sequoia en Chile y fomento

de su plantación forestal sustentable”, en la zona Sur del país.

4.1.1 Ubicación de los ensayos

El primer ensayo fue establecido en terrenos de Forestal Voipir, comuna de Villarrica, IX

región, tal como se aprecia en la figura 4.1.1.1.

Figura 4.1.1.1. Mapa de ubicación del ensayo Voipir, comuna de Villarrica, región de la

Araucanía.

Fuente: Confección personal. Datos del Laboratorio de Incendios Forestales, Facultad de

Ciencias Forestales, Universidad de Chile.

10

El segundo ensayo, se encuentra en terrenos de Forestal Natalhue, comuna de Lanco, X

región. La figura 4.1.1.2 muestra un mapa con la ubicación de este ensayo.

Figura 4.1.1.2. Mapa de ubicación del ensayo Natalhue, comuna de Lanco, región de los

lagos.

Fuente: Confección personal. Datos del Laboratorio de Incendios Forestales, Facultad de

Ciencias Forestales, Universidad de Chile.

4.1.2 Caracterización del material genético

El material utilizado pertenece a la colección Kuser. La colección completa comprende

180 clones que representan 90 lugares de procedencia de secuoya (Kuser et al., 1995), la

que se está probando en EE.UU., Francia, España, Gran Bretaña y Nueva Zelanda.

Para este estudio se utilizaron 118 clones que se distribuyen en los condados de

Humboldt, Napa, Mendocino, Sonoma, Monterrey, Del Norte y Santa Cruz, todos del

11

estado de California, Estados Unidos. En los anexos 9.1 y 9.2 se presentan los mapas

con la distribución natural de secuoya en el estado de California y la ubicación de los

clones y sus respectivos lugares de procedencia.

Esta colección se obtuvo principalmente por semillas, mientras que una menor proporción

corresponde a reproducción por estacas y cultivo de tejidos. La información completa y

detallada se presenta en el anexo 9.3.

4.1.3 Muestras para el análisis molecular

Con el fin de obtener una huella o perfil genético, se seleccionaron 10 clones distintos de

la colección que se probó en el ensayo Voipir. La colecta se realizó en terreno, en el mes

de noviembre de 2003.

Para establecer un criterio de selección apropiado, se determinó priorizar aquellas clones

con mejores características fenotípicas hasta la fecha de colecta. El criterio utilizado se

presenta a continuación:

• porcentaje de plantas con mejor % de enraizamiento en vivero,

• presencia de ápice líder en terreno -con datos de la primera medición- ; y

• supervivencia en terreno -con datos de la primera medición-.

El porcentaje de plantas con enraizamiento en vivero, se refiere a datos obtenidos en el

vivero de Isla de Maipo y corresponden al porcentaje de plantas vivas, una vez

establecido el “cutting”. En tanto la presencia de ápice líder y supervivencia corresponden

al porcentaje de plantas que presentan ápice líder claramente definido y las que están

vivas luego del establecimiento. Esta jerarquización se estableció con datos de la primera

medición realizada en los meses de marzo y abril de 2003. El detalle de la selección se

presenta en la tabla 4.3.1.1.

12

Tabla 4.3.1.1. Material genético -probado en el ensayo Voipir- seleccionado para el

análisis molecular.

Clones Código Clon Terreno Código Clon Laboratorio

PLUS B P2 S1A-S1B

COMERCIAL S S2A-S2B

RB54-225-17 T54 S3A-S3B

PLUS C P3 S4A-S4B

RB2-238-16 T44 S5A-S5B

RB3-57-77-7 T47 S6A-S6B

RB-236-10 T45 S7A-S7B

RB54-225-14 T51 S8A-S8B

RB54-225-19 T55 S9A-S9B

RB2-236-18 T43 S10A-S10B

La selección presentada en la tabla anterior se construyó en base a los datos entregados

en el apéndice 8.15.

4.1.4 Reactivos químicos

Los siguientes reactivos se adquirieron como se indica:

A Merck Química: EDTA, CTAB (Nombre genérico de N-Cetil-Trimetil-amoniobromuro).

A Operon Technologies: los partidores de la serie BF, BG y BH

A GibcoBRL: Agarosa, Tris, dNTP, Taq polimerasa, marcador de peso molecular 100 bp.

4.2 Método

Para realizar la evaluación del ensayo de clones y procedencia de Sequoia sempervirens

(D. Don) Endl, se realizó la toma de datos en los meses de abril de 2003, 2004 y 2005.

4.2.1 Evaluación del comportamiento de los clones

Para el ensayo Voipir se utilizó un diseño de bloques completamente al azar. El modelo

para este ensayo está compuesto por 34 clones que corresponden a los tratamientos. La

unidad muestral comprende a una hilera de 5 plantas con igual tratamiento.

13

Los clones se distribuyeron en 10 bloques, que actúan como repeticiones. La tabla 4.2.1.1

muestra la información detallada de los clones probados para este ensayo.

Tabla 4.2.1.1. Material genético por localidad, probado en el ensayo Voipir.

Clones Localidad Clones Localidad

RB2-238-17 Humboldt Co., Ca. RB54-225-11 Humboldt Co., Ca.


RB2-236-14 Humboldt Co., Ca. RC5 Humboldt Co., Ca.


RC18L-109-7 Humboldt Co., Ca. RB19 Humboldt Co., Ca.



RB18L-109-2 Humboldt Co., Ca. RB54-225-19 Humboldt Co., Ca.



RB31L-38-19 Humboldt Co., Ca. RB54 Humboldt Co., Ca.



RB2-238-16 Humboldt Co., Ca. PLUS A Humboldt Co., Ca.

RB-236-10 Humboldt Co., Ca. PLUS B Humboldt Co., Ca.

RB12-28-12 Humboldt Co., Ca. PLUS C Humboldt Co., Ca.

RB3-57-77-7 Humboldt Co., Ca. COMERCIAL Humboldt Co., Ca.

Fuente: Base de datos Forestal Simpson -Korbel-Arcata-California, 2002.

Por su parte, el diseño experimental para el ensayo Natalhue corresponde a uno

completamente al azar. El modelo utilizado en este ensayo está compuesto por 88 clones

(que representan 40 lugares de procedencia) que cumplen el rol de tratamientos.

La unidad muestral comprende a una hilera de 5 plantas con igual tratamiento distribuidas

en 10 parcelas, las que no pueden considerarse bloques, ya que en algunas de ellas no

están presentes los 88 clones-esto debido a la gran mortandad en terreno producto de

efectos negativos, principalmente plagas y el mal manejo-. En la tabla 4.2.1.2 se muestran

los clones probados en este ensayo.

14

Tabla 4.2.1.2. Material genético por localidad, probado en el ensayo Natalhue.


D-03-5 Del Norte Co., Ca. French Hill Rd. M-12-1 Mendocino Co., Ca. Willitts

D-04-6 Del Norte Co., Ca. Cresent City N-02-2 Napa Co., Ca. Ink Grade

H-02-5 Humboldt Co., Ca. Cappel Creek S-03-1 Sonoma Co., Ca. Warm S. Cr.

H-08-1 Humboldt Co., Ca. Tall Trees, Rw. Cr S-05-1 Sonoma Co., Ca. Cloverdale.

H-08-3 Humboldt Co., Ca. Tall trees, Rw. Cr H-16-2 Humboldt Co., Ca. Bull Creek

H-09-4 Humboldt Co., Ca. Mad River, S. Fk. M-15-1 Mendocino Co., Ca. Branscom.

H-11-3 Humboldt Co., Ca. Freshwater M-18-1 Mendocino Co., Ca. M. View

M-06-2 Mendocino Co., Ca. Navarro River RB17RB9-012 Humboldt Co., Ca.

M-07-1 Mendocino Co., Ca. Hendy S. P. RB54-7 Humboldt Co. Ca.

M-08-2 Mendocino Co., Ca. Gualala Peak Y-05-4 Monterrey Co., Ca. Redwood

M-17-2 Mendocino Co., Ca. Comptche PLUS A Humboldt Co., Ca.

N-02-1 Napa Co., Ca. Ink Grade PLUS B Humboldt Co., Ca.

N-03-2 Napa Co., Ca. Napa (W) Blue Clone PLUS C Humboldt Co., Ca.

N-05-2 Napa Co., Ca. Napa (E) Blue Clone COMER-CIAL Humboldt Co., Ca.

RB19-6 Humboldt Co., Ca. RB12-26 Humboldt Co., Ca.

RB22RB2-007 Humboldt Co., Ca. RB31L-26 Humboldt Co., Ca.

S-03-2 Sonoma Co., Ca. Warm Springs Cr. RB31L-14-6 Humboldt Co., Ca.

Y-03-4 Monterrey Co., Ca. Nacimiento Rd. RB75-58-6 Humboldt Co., Ca.

Y-08-1 Monterrey Co., Ca. P. Colorado Rd. RB-14-5 Humboldt Co., Ca.

D-04-6 Del Norte Co., Ca Crescent City RB12-27-9 Humboldt Co., Ca.

H-02-3 Humboldt Co., Ca. P-1-M Rd.Pecwan RB-12-28-18 Humboldt Co., Ca.

H-10-4 Humboldt Co., Ca. The Basin RB18L-109-9 Humboldt Co., Ca.

H-11-5 Humboldt Co., Ca. Kneeland RB19-148-18 Humboldt Co., Ca.

M-06-1 Humboldt Co., Ca. Navarro River RB3-31-21 Humboldt Co., Ca.

RB17RB9-011 Humboldt Co., Ca. RB12-28-5 Humboldt Co., Ca.



Y-01-2 Monterrey Co., Ca. J. Pfeiffer Burns RB31L-38-20 Humboldt Co., Ca.

Y-08-2 Monterrey Co., Ca. P. Colorado Rd. RB19-148-20 Humboldt Co., Ca.

H-06-4 Humboldt Co., Ca. RB75-58-16 Humboldt Co., Ca.

H-07-3 Humboldt Co., Ca. RB54-215-7 Humboldt Co., Ca.

N-03-4 Napa Co., Ca. Lokoya RB75-58-26 Humboldt Co., Ca.

H-09-5 Humboldt Co., Ca. Mad River, S. Fk. RB19-148-19 Humboldt Co., Ca.

H-13-3 Humboldt Co., Ca. Grizzly Creek RB75-58-24 Humboldt Co., Ca.

H-17-2 Humboldt Co., Ca RB19-148-9 Humboldt Co., Ca.

H-20-1 Humboldt Co., Ca. Lawrence Creek RB54-215-3 Humboldt Co., Ca.

M-19-1 Mendocino Co., Ca. Gualala Peak RB54-225-24 Humboldt Co., Ca.

15


RB22RB2-010 Humboldt Co. Ca. RC18L-109-8 Humboldt Co., Ca.

S-01-1 Sonoma Co., Ca. Kruse Rhodo. Res. RB2-238-13 Humboldt Co., Ca.

S-01-2 Sonoma Co., Ca. Kruse Rhodo. Res. RB54-214-30 Humboldt Co., Ca.

S-04-2 Sonoma Co., Ca. Bodega RB54-225-3 Humboldt Co., Ca.

Y-06-3 Monterrey Co., Ca. Big Sur RB31L-28-11 Humboldt Co., Ca.

Y-06-4 Monterrey Co., Ca. Big Sur RB54-214-28 Humboldt Co., Ca.

Z-02-6 Santa Cruz Co., Ca. U. C. Campus RB2-238-19 Humboldt Co., Ca.


Ambos ensayos -Voipir y Natalhue- fueron diseñados con cuatro clones comunes (tabla

4.2.1.3). Este hecho permite realizar evaluaciones y comparaciones entre sitios. El

análisis estadístico se realizó bajo el enfoque de un diseño bifactorial en bloques, donde

los factores corresponden a sitio, clon y la interacción entre ambos.

Tabla 4.2.1.3. Material genético por localidad, comunes en el ensayo Voipir y Natalhue.

Clones Localidad

PLUS A Humboldt Co., Ca.

PLUS B Humboldt Co., Ca.

PLUS C Humboldt Co., Ca.

COMERCIAL Humboldt Co., Ca.


16

4.2.1.1 Modelo de los ensayos

El ensayo ubicado en Forestal Voipir consta de 10 bloques. Cada bloque tiene una

superficie de 1.462,5 m2. En cada bloque se distribuyeron los clones en hileras de cinco

plantas. La distribución de los clones dentro de cada bloque se realizó en forma aleatoria.

La figura 4.2.1.1.1 muestra un diagrama de la distribución de los clones en los bloques del

ensayo Voipir. El ejemplo muestra la distribución de los clones en el bloque 1 del ensayo

Voipir.

Figura 4.2.1.1.1. Diagrama de la distribución de los clones en los bloques del ensayo

Vopir. Bloque 1 del ensayo Voipir, con una doble hilera de borde.

2.5 m Espaciamiento entre plantas

2.5 m

RB54-225-19

(Clon 34)

Plus A

(Clon 1)

Unidad muestral: hilera de 5

plantas con igual tratamiento

Planta Planta Planta Planta Planta 1 2 3 4 5

17

El ensayo ubicado en Forestal Natalhue esta compuesto por 10 parcelas. Cada parcela

posee una superficie de 3.337,5 m2.

Figura 4.2.1.1.2. Diagrama de la distribución de los clones en las parcelas. Parcela 1 del

ensayo Natalhue, con una doble hilera de borde.

El espaciamiento aplicado a ambos ensayos es de 2,5 m X 2,5 m. Además tanto los

bloque como las parcelas cuentan con una doble hilera de plantas periféricas para

eliminar el efecto borde.

En el apéndice 8.1 se entrega un croquis de la distribución de los bloques en terreno para

el ensayo Voipir y las parcelas para el ensayo Natalhue.

4.2.1.2 Distribución de los tratamientos (clones)

La distribución de los clones en los bloques y parcelas se realizó en forma aleatoria, con

lo que se consigue que los clones sean expuestos a toda la gama de ambientes dentro

del área de prueba (Zobel y Talbert, 1994). En el momento del establecimiento se verificó

2.5 m Espaciamiento entre plantas

2.5 m

COMERCIAL

(Clon 88)

D-03-5

(Clon 1)

Unidad muestral: hilera de 5

plantas con igual tratamiento

Planta Planta Planta Planta Planta 1 2 3 4 5

18

en terreno la correcta distribución de los clones en los 10 bloques del ensayo Voipir y en

las 10 parcelas del ensayo Natalhue.

En los apéndices 8.3 y 8.4 se muestra la distribución de los clones en cada bloque o

parcela, según corresponda, para cada uno de los ensayos.

4.2.1.3 Mediciones

Luego de realizado el establecimiento -julio del año 2002- se realizaron tres mediciones,

en los meses de abril de 2003, 2004 y 2005, donde se midieron los parámetros de

crecimiento:

Diámetro a la altura del cuello (DAC): esta medición se realizó con un pie de metro en la

base del cuello de la planta, la unidad de medición utilizada es el centímetro.

Altura de la planta (H): esta medición se efectuó con una regla graduada, desde la base

de la planta hasta su ápice principal, la unidad utilizada es el centímetro.

4.2.1.4 Modelo estadístico

La metodología de Análisis de Varianza para comparaciones múltiples de medias, es una

potente herramienta cuando se trabaja con un máximo de 10 tratamientos. A medida que

este valor se excede comienza a disminuir la capacidad discriminante y por ende la

confiabilidad en los resultados3.

Por esta razón, para el ensayo Voipir, se extrajo una muestra aleatoria de 10 clones con

la cual se inferirán conclusiones para población total de 34 procedencias.

La evaluación se realizó utilizando el incremento producido para cada variable (DAC2*H,

DAC y altura) entre la primera y última medición, es decir, entre los años 2003 y 2005.

Además se realizó una selección de los 10 clones que presentaron los mejores

rendimientos para cada una de las variables en estudio y se les aplicó igual evaluación.

Para cumplir con los dos análisis anteriores se utilizó un diseño de bloques

completamente al azar, con un Modelo de efectos mixtos, siendo los bloques fijos y los

tratamientos de efectos aleatorios (Canavos, 1988; Montgomery, 1991; Ostle, 1965). El

modelo estadístico de este diseño se presenta a continuación:

3 Comunicación personal Sergio Mora O. Profesor de Estado en Matemáticas. Facultad de

Ciencias Forestales. Universidad de Chile.

19

101

101

,...,j

,...,i

ετβµY ijjiij

==

+++=

)σ (0, N ~ v.a.i.i.d.:

)σ (0, N ~ v.a.i.i.d.:

0β:ctes:βµ,

2ij

2τj

10

1i ii

ε

τ

=∑ =

donde Yij es la observación en el bloque i del clon j, µ corresponde al promedio total, βi al

efecto del i-ésimo bloque, τj al efecto del j-ésimo clon y εij al componente del error aleatorio

en la unidad experimental ubicada en el bloque i del clon j.

Se desea probar si existen diferencias significativas entre los efectos de los clones, es

decir, la hipótesis a probar es:

0 1

)10,...,1( 0:0

jτ:H

versus

jjH

≠

==τ

En el ensayo Natalhue se probaron 88 clones -representando 40 por procedencias- que

están distribuidos en siete condados. Por la razón expuesta al inicio de este subcapítulo,

se extrajo una muestra aleatoria de siete clones con lo que cada condado del estado de

California, quedó representado por uno.

Paralelamente se extrajo una muestra aleatoria de 10 clones del condado de Humboldt,

estado de California. Finalmente, se realizó la evaluación para los 10 clones que

presentaron el mejor rendimiento por variable.

Se trabajó con el incremento medio producido para cada variable (DAC2*H, DAC y altura)

entre la primera y última medición.

Para cumplir con los tres análisis anteriores se utilizó un diseño completamente al azar,

con un Modelo de efectos aleatorios (Canavos, 1988; Montgomery, 1991; Ostle, 1965). El

modelo estadístico de este diseño se presenta a continuación:

Ambas son variables aleatorias incorrelacionadas

No existe diferencia entre los efectos de los tratamientos

(Al menos unos de los tratamientos tiene efecto no nulo)

Existe diferencia entre los efectos de los tratamientos

20

nj: número de observaciones presentes del tratamiento j

en las evaluaciones realizadas en los clones del condado de Humboldt y en los 10

mejores rendimiento , y

;1

71

j,...,ni

,...,j

==

nj: número de observaciones presentes del tratamiento j

en la evaluación realizada en la muestra aleatoria de los condados del estado de

California.

)σ (0, N ~ v.a.i.i.d.:

)σ (0, N ~ v.a.i.i.d.:2

ij

2τj

ε

τ

donde Yij es la i-ésima observación del j-ésimo tratamiento, µ corresponde al promedio

total, τj al efecto del j-ésimo tratamiento y εij al componente del error aleatorio en la i-ésima

unidad experimental que recibe el tratamiento j.

Se desea probar si existen diferencias significativas entre los efectos de los clones, por lo

que, la hipótesis a probar corresponde a:

jτ:H

versus

ijH

0 1

)10,...,1( 0:0

≠

==τ

Finalmente, para evaluar comportamiento de los cuatro clones que son comunes en

ambos ensayos, se utilizó un diseño de bloques completamente al azar, bifactorial (4X2)

de efectos fijos. Por lo que el modelo estadístico para este diseño corresponde a:

Ambas son variables aleatorias incorrelacionadas

;1

101

j,...,ni

,...,j

ijεjτµijY

==

++=

No existe diferencia entre los efectos de los tratamientos (Al menos unos de los tratamientos tiene efecto no nulo) Existe diferencia entre los efectos de los tratamientos

21

( )

101

21

41

,..., k

, j

,..., i

; ijkε ijαβkρjβiαµijkY

===

+++++=

)2σ N(0, v.a.i.i.d.:ijkε

021 )(4

1i )(101k

21j

41i :ctes :kρ,jβ,iα µ, =∑ =∑ = ==∑ ==∑ ==∑ = j ijijkji αβαβρβα

donde Yijk corresponde a la observación del clon i en el sitio j y bloque k, µ al promedio

total, αi al efecto del i-ésimo clon, βj al efecto del j-ésimo sitio, ρk al efecto del k-ésimo

bloque, (αβ)ij a la interacción clon-sitio y εijk al componente del error aleatorio en la unidad

experimental del clon i, en el sitio j y ubicado en el bloque k.

Se desea probar si existen diferencias significativas entre los clones, entre los sitios y si

existe interacción clon-sitio, por lo que, las hipótesis a probar son las siguientes:

0)12141(0

012100

014100

≠==

≠==

≠==

ij:(α H) v/s ,);(j,..., (iij):H

j:β H) v/s , (jj:βH

i:α H) v/s ,..., (ii:αH

βαβ

4.2.2 Jerarquización de los clones

Para jerarquizar los clones probados en cada ensayo, se ordenaron de mayor a menor los

valores medios del incremento producido entre los años 2003-2005, para cada variable

(DAC2*H, DAC y altura), con lo que se obtuvo un ranking para cada una de las variables

en evaluación y para cada uno de los ensayos probados.

(Al menos unos de los tratamientos tiene efecto no nulo) (Al menos unos de los sitios tiene efecto no nulo) (Al menos una de las interacciones sitio-tratamiento es significativa)

22

4.2.3 Procesamiento de los datos

Los datos procesados corresponden al promedio del incremento obtenido por unidad

muestral en el período 2003-2005, esto es; la media aritmética obtenida por unidad

muestral.

El análisis de varianza se realizó por medio de SPSS, versión estándar 11.5, a través del

procedimiento GLM (General Linear Model Procedure - Procedimiento del Modelo Lineal

General) para las variables DAC2*H, DAC y altura.

4.2.4 Identificación de marcadores moleculares RAP Ds

4.2.4.1 Colección de muestras

Para la identificación de marcadores de moleculares RAPD se colectaron hojas del último

período de crecimiento de 10 individuos del ensayo Voipir, en el mes de noviembre de

2003, las que fueron mantenidas en frío durante su transporte y almacenadas a -20°C

hasta su procesamiento.

4.2.4.2 Extracción de DNA

El DNA total de la muestra se purificó con un protocolo CTAB modificado (Tsumina et al.,

1995) que se presenta en el apéndice 8.4.

Se utilizaron 300 mg de tejido vegetal (hojas), al cual se le añadieron 900 ul de Buffer

TENC (100 mM de Tris, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% de CTAB, 0,3% mercaptoetanol)

precalentado a 60°C con PVP al 1%, se incubó a 60°C por 1 hora. Luego se agregó 500 ul

de cloroformo-octanol (24:1), se mezcló por inversión, se centrifugó a 6000 rpm por 5

minutos. Se extrae la fase acuosa y se precipita agregando 1/10 volúmenes de acetato de

sodio 3M y 2 volúmenes de etanol 95% a –20°C. Se de jó a –20°C por una hora y se

centrifugó a 13.000 rpm por 5 minutos. El precipitado se secó y resuspendió en 200 ul de

TE (Tris 10mM EDTA 1mM pH 8) durante 15 minutos a 37°C. A cada tubo se le agregó

300 ul de cloroformo- alcohol isoamílico, se homogeneizó con Vortex y se centrifugó a

13.000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se colectó y se agregó un 1/10 volumen de

acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol a 95%. Se dejó –20 °C por 1 hora.

Centrifugar a 13.000 rpm por 10 minutos. El precipitado se lavó con etanol al 70%. El DNA

se resuspendió en TE (Tris 10mM EDTA 1mM pH 8) e incubó con RNAsa a 37°C por 1

hora.

23

Finalmente, se le aplicó un tratamiento con LiCl 8M, en el cual el DNA resuspendido en

300 ul de TE (Tris 10mM EDTA 1mM pH 8) se incubó durante una hora a 60°C. Se añadió

½ Vol de LiCl 8M. Luego se dejó una hora a temperatura ambiente, se precipitó con 1

volumen de etanol 95% a –20°C, se dejó a –20°C dur ante 30 minutos. La mezcla se

centrifugó por 20 minutos a 13000 rpm, se dejó secar y resuspendió en 50ul de TE (Tris

10mM EDTA 1mM pH 8).

4.2.4.3 Amplificación por PCR

Los ensayos de PCR se realizaron utilizando partidores al azar de 10 mer (OPERON

Technologies, Alameda, CA). Se amplificaron entre 30-50 ng de DNA cromosómico, la

reacción de amplificación contenía 2,0 mM MgCl2, 0,1 mM dNTP, 0,4 uM del partidor, 2,5

U de Taq polimerasa (GibcoBRL) y BSA en buffer PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,8 y 50 mM

KCl), con un volumen final de reacción de 25 ul.

La reacción de amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp PCR 2400 Perkin

Elmer con el siguiente ciclo térmico: una denaturación inicial 94°C durante 5 min y luego

45 ciclos con una denaturación a 92°C por 1 min, un a hibridación a 36°C por 1,5 min y

una extensión a 72°C por 1 min. La extensión final se realizó a 72°C durante 5 min.

Los productos de amplificación se detectaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,2

% (p/v) en buffer TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA pH 8), teñidos con bromuro de

etidio.

4.2.4.4 Análisis de datos

Las bandas obtenidas para cada procedencia con los partidores seleccionados fueron

identificadas y ordenadas manualmente de acuerdo a su peso molecular, considerando

como el primero, al de mayor tamaño.

El patrón de bandas obtenido se tradujo a una matriz binaria de 0s y 1s, donde el 0

corresponde a la ausencia y el 1 a la presencia de ese tamaño de fragmento. El grado de

similitud entre los clones se obtuvo mediante el índice de Jaccard (Jaccard, 1908) el cual

considera el número de bandas compartidas sobre el total de bandas que se comparan,

como se muestra a continuación

24

cba

aJ

++=

donde,

J = Índice de Jaccard

a = Nº de caracteres donde ambas muestras coinciden en el “1”

b = Nº de caracteres donde la primera muestra tiene un “1” y la otra un “0”

c = Nº de caracteres donde la primera muestra tiene un “0” y la otra un “1”

La suma de estos tres últimos valores dará el total de caracteres medidos.

El dendrograma se construyó mediante un análisis de agrupamiento usando el algoritmo

de UPGMA -Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic mean o Método no

ponderado de agrupación de medias ariméticas- (Sneath y Sokal, 1973) con el programa

MSVP -Multi Variate Statistical Package o Paquete Estadístico Multivariante- (Kovach,

1999).

25

5 RESULTADOS

En el ensayo Voipir -ubicado en la comuna de Villarrica, región de la Araucanía- se

realizaron los siguientes análisis:

i. Análisis gráfico y jerarquización de los 34 clones probados;

ii. evaluación de la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los

clones en una muestra aleatoria de 10 clones;

iii. evaluación de la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los

clones para la selección de los 10 clones con mejor rendimiento para cada una de

las variables respuesta analizadas -DAC2*H, DAC, H-.

Por su parte, en el ensayo Natalhue -ubicado en la comuna de Lanco, región de los

Lagos- se realizaron los siguientes análisis:

i. Análisis gráfico y jerarquización de los 88 clones probados;

ii. evaluación de la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los

clones en una muestra aleatoria de 7 clones, donde cada uno de los condados

quedó representado por un clon;

iii. debido a que en el condado de Humboldt se distribuyen un 44% de las

procedencias probadas, se evaluó la existencia de diferencias significativas entre

los efectos de los clones, en una muestra aleatoria de 10 que pertenecen a éste

condado;

iv. evaluación de la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los

clones para la selección de los 10 clones con mejor rendimiento para cada una de

las variables respuesta -DAC2*H, DAC, H-;

5.1 Ensayo Voipir

Todos los clones probados en el ensayo Voipir pertenecen al condado de Humboldt,

estado de California, estados Unidos.

5.1.1 Valores medios por clon

Con los datos obtenidos en terreno se calculó el incremento medio por clon para cada

variable en evaluación, luego se graficó el rendimiento de la totalidad de los clones

probados en el ensayo Voipir. En la figura 5.1.1.1 se muestra la distribución de la variable

DAC2*H, donde los clones están dispuestos de norte a sur (en la figura de izquierda a

26

derecha) considerando los lugares de procedencia en el estado de California, Estados

Unidos.

Figura 5.1.1.1. Incremento medio en Índice de Biomasa (DAC2*H) en el período 2003-

2005, de los clones en el ensayo Voipir. La distribución de los clones representa un

gradiente latitudinal (de norte a sur).

En la figura anterior se observa que el mayor valor de incremento medio en DAC2*H, lo

presenta el clon RB3-57-77-7 (982 cm3), seguido a gran distancia por el clon RB54-225-12

(713 cm3).

El menor valor de incremento medio lo presentan los clones RB54-225-13 (77 cm3) y RB2-

236-15 (57 cm3), no existiendo gran diferencia entre sus valores medios.

De acuerdo a la distribución que presentan los clones en la figura, se observa una muy

leve tendencia en aumento del Índice de Biomasa en los clones ubicados hacia el sur del

condado de Humboldt.

27

Por su parte, la figura 5.1.1.2 muestra la distribución del incremento medio del período

comprendido entre los años 2003 y 2005 para la variable DAC en los clones evaluados en

el ensayo Voipir. En esta figura, los clones se ordenan de norte a sur (en el gráfico de

izquierda a derecha).

Figura 5.1.1.2. Incremento medio en Diámetro a la Altura del Cuello (DAC) en el período

2003-2005, de los clones en el ensayo Voipir.

El mayor incremento medio para esta variable lo presentan los clones RB3-57-77-7 (1,46

cm) y RB54-225-12 (1,31 cm). Por su parte, los clones RC18L-109-7, RB54-225-13, RB2-

236-15 son los que presentan los menores valores no superando la barrera de los 0,60

cm.

De acuerdo a la distribución que presentan los clones en la figura, y al igual que para el

DAC2*H, presentan una leve tendencia en aumento en DAC por parte de los clones del

más al sur del condado de Humboldt.

Finalmente, en la gráfica de la figura 5.1.1.3 se muestra cómo se distribuyen los valores

medios de las observaciones para la variable altura en el ensayo Voipir. Los clones en

esta figura fueron ordenados de norte a sur, y de izquierda a derecha en el gráfico.

28

Los clones que presentan los mayores incrementos medios para esta variable

corresponden a RB3-57-77-7, RC5, RB19, RB54-225-12; todos superando los 70 cm.

Figura 5.1.1.3. Incremento medio en altura en el período 2003-2005, de los clones en el

ensayo Voipir.

Por su parte los clones RB54-225-13 y RB2-236-15 son los que presentan los menores

incrementos medios en altura, sin poder superar los 25 cm en promedio.

Finalmente, de acuerdo como se distribuyen los clones en la figura, se repite la leve

tendencia de aumento -al igual que para el DAC2*H y DAC- en los clones que se

encuentran más hacia el sur del condado de Humboldt.

Una vez obtenidas las medias de los incrementos por clon, se jerarquizaron en orden

descendente, con lo que se estableció un “ranking” entre los clones por variable. El

resultado se presenta en la tabla 5.1.1.1.

29

Tabla 5.1.1.1. “Ranking” con valores de incrementos medios (*) por clon y variable en el

ensayo Voipir.

Clones DAC 2*H (cm 3) Clones DAC (cm) Clones Altura (cm)

RB3-57-77-7 983 RB3-57-77-7 1,46 RB3-57-77-7 79,2 RB54-225-12 713 RB54-225-12 1,31 RC5 74,0

RB19 623 RB19 1,26 RB19 70,5 RB19-148-26 558 RB19-148-24 1,20 RB54-225-12 70,4 RB54-225-18 543 RB19-148-26 1,20 RB54-225-18 68,7 RB54-225-17 520 RB54-225-17 1,18 RB19-148-26 66,2

RC5 517 RB54-224-27 1,17 RB54-224-27 64,1 RB19-148-24 496 RB54-225-18 1,14 RB54-225-10 63,0 RB54-224-27 446 RB54-225-10 1,06 RB54-225-14 60,7 RB54-225-14 435 RB54-225-14 1,06 RB19-148-24 60,3 RB54-225-10 404 RC5 1,03 RB54-225-17 59,9 RB12-28-23 378 RB2-236-18 1,01 RB12-28-23 56,4

RB54-214-29 342 RB-236-10 0,99 RB54 55,8 RB54 313 RB2-238-16 0,99 RB54-214-29 55,8

RB54-225-19 308 RB12-28-23 0,96 RB2-238-16 53,3 RB2-236-14 306 RB2-238-17 0,96 RB2-236-14 53,0 RB2-238-16 300 RB2-236-14 0,95 COMERCIAL 52,7 RB2-236-18 300 RB54 0,95 RB54-225-11 51,6 RB-236-10 284 RB54-214-29 0,94 PLUS A 50,7

PLUS A 259 RB54-225-19 0,93 RB54-225-19 50,3 RB54-225-11 258 RB2-238-18 0,88 RB-236-10 48,2 COMERCIAL 250 PLUS A 0,82 RB2-236-18 45,9 RB2-238-17 248 COMERCIAL 0,79 PLUS B 45,8

PLUS B 243 PLUS B 0,79 RC18L-109-7 45,6 RB2-238-18 223 RB75-58-14 0,79 RB2-238-17 44,7

RB31L-38-19 196 RB31L-38-19 0,75 PLUS C 43,0 RB75-58-14 178 RB54-225-11 0,74 RB2-238-18 42,5 RB12-28-12 173 RB12-28-12 0,73 RB18L-109-2 41,8

PLUS C 160 PLUS C 0,66 RB31L-38-19 40,4 RC18L-109-7 116 RB19-148-23 0,63 RB75-58-14 40,4 RB18L-109-2 108 RB18L-109-2 0,61 RB12-28-12 40,1 RB19-148-23 96 RC18L-109-7 0,60 RB19-148-23 38,1 RB54-225-13 78 RB54-225-13 0,60 RB54-225-13 24,8

RB2-236-15 58 RB2-236-15 0,46 RB2-236-15 24,5 (*) Los valores de incremento medio por clon corresponden al promedio de los valores medios obtenidos por

unidad muestral (hilera de 5 plantas con igual tratamiento) en las 10 repeticiones (bloques).

De acuerdo al “ranking” establecido en el ensayo Voipir, el clon RB3-57-77-7 es el que

lidera la jerarquización de los clones en las tres variables analizadas. Lo sigue el clon

RB54-225-12 que presenta el primer lugar en el ranking para las variables DAC2*H y DAC,

no así en la variable altura donde presenta el cuarto lugar. Finalmente, el tercer lugar para

las tres variables le pertenece al clon RB19.

30

5.1.2 Análisis de los incrementos medios para la mu estra aleatoria

De la totalidad de los clones presentes en el ensayo Voipir, se extrajo una muestra

aleatoria de 10 clones. El resultado del sorteo se muestra en la tabla 5.1.2.1. Además, se

entregan los valores medios para cada una de las variables analizadas.

Tabla 5.1.2.1. Incremento medios por clon, en el período 2003-2005. Muestra aleatoria,

ensayo Voipir.

Clones Incremento en DAC2*H (cm 3) Incremento en DAC (cm) Incremento en Altura

(cm)

PLUS A 259 0,82 50,7

COMERCIAL 250 0,79 52,7

RB12-28-23 378 0,96 56,4

RB18L-109-2 108 0,61 41,8

RB31L-38-19 196 0,75 40,4

RB2-236-18 300 0,99 53,3

RC5 517 1,03 74,0

RB19 623 1,26 70,5

RB54-225-19 543 1,14 68,7

RB54 313 0,95 55,8

La distribución de los incrementos medios en DAC2*H, en el período 2003-2005, para los

clones seleccionados en la muestra aleatoria, se muestra en la figura 5.1.2.1, donde el

punto en el gráfico señala la media aritmética y el intervalo corresponde a dos veces la

desviación estándar.

El clon RB19, es el que presenta mayor promedio en el incremento en dicho período (623

cm3), seguido por el clon RB54-225-19 con un valor promedio de 542 cm3.

En la parte inferior del gráfico se observan los clones RB31L-38-19 y RB18L-109-2 con

196 cm3 y 107cm3 de incremento promedio para el período.

Una leve tendencia indica que los clones que presentan mayor incremento medio en el

período son a su vez, los que presentan las mayores desviaciones sobre el promedio.

Asimismo, los clones con menores incrementos medios, son los que tienen menores

desviaciones sobre el promedio.

31


2005, en la muestra aleatoria del ensayo Voipir.

Se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) para verificar la existencia de diferencias

significativas entre los efectos de los clones probados para la variable DAC2*H. Los

resultados revelaron la existencia de diferencias, lo que indica que esta variable se podría

considerar como un factor discriminante en un eventual proceso de selección de

procedencias en un programa de mejoramiento genético para secuoya.

En el apéndice 8.5 se entregan las tablas del ANDEVA correspondiente a esta variable.

Por su parte, en la figura 5.1.2.2 se muestra la distribución de los incrementos medios de

la variable DAC para los 10 clones que conforman la muestra aleatoria para el ensayo

Voipir.

32


2003-2005, en la muestra aleatoria del ensayo Voipir.

Para evaluar la existencia de diferencias significativas entre los clones, se realizó un

ANDEVA. Éste entregó como resultado la existencia de diferencias entre los efectos de

los clones probados para la variable DAC. La tabla del respectivo ANDEVA se presenta

en el apéndice 8.5.

Al igual que para la variable DAC2*H, los clones que presentan los mayores valores para

la variable DAC corresponden a RB19 y RB54-225-19, además son éstos los que

presentan la mayor variabilidad por sobre el promedio.

La variable DAC, además de compartir los valores superiores de incrementos medios con

la variable DAC2*H, comparte los valores inferiores. Esto se debe principalmente a la

directa relación que existe entre estas variables, esto, ya que el DAC pondera

cuadráticamente al DAC2*H.

Finalmente, se graficaron los incrementos medios para la variable altura, en los clones

que conforman la muestra aleatoria para el ensayo Voipir. La distribución de las

observaciones se muestra en la figura 5.1.2.3.

33

Figura 5.1.2.3. Incremento medio en altura en el período 2003-2005, en la muestra

aleatoria del ensayo Voipir.

Los dos clones que presentan mejor rendimiento para esta variable corresponden a RC5 y

RB19. El clon RB54 se encuentra en la tercera posición con un valor de incremento medio

de 68,7 cm, bajo los 74 y 70,5 cm que presentan los dos primeros. Los valores inferiores

siguen siendo los clones RB31L-38-19 y RB18L-109-2.

Se realizó un ANDEVA para evaluar la existencia de diferencias significativas entre los

efectos de los clones. El resultado señaló que existen diferencias significativas entre los

efectos de los clones para esta variable. En el apéndice 8.5 se entregan las tablas

ANDEVA correspondiente a la variable altura.

5.1.3 Análisis de los incrementos medios para la se lección de los 10 clones con

mejor rendimiento para cada una de las variables

Se seleccionaron los 10 clones con mejor rendimiento para las variables DAC2*H, DAC y

altura. El resultado se entrega en la tabla 5.1.3.1, la que además incluye los valores

medios por clon para cada variable.

34

Tabla 5.1.3.1. Incremento medio por clon, en el período 2003-2005. Selección de los 10

mejores rendimientos por variable, ensayo Voipir.

Clones Incremento en DAC 2*H

(cm 3)

Clones

Incremento en DAC

(cm)

Clones

Incremento en Altura

(cm)

RB3-57-77-7 983 RB3-57-77-7 1,5 RB3-57-77-7 79,2

RB54-225-12 713 RB54-225-12 1,3 RC5 74,0

RB19 623 RB19 1,3 RB19 70,5

RB19-148-26 558 RB19-148-24 1,2 RB54-225-12 70,4

RB54-225-19 543 RB19-148-26 1,2 RB54-225-19 68,7

RB54-225-17 520 RB54-225-17 1,2 RB19-148-26 66,2

RC5 517 RB54-224-27 1,2 RB54-224-27 64,1

RB19-148-24 496 RB54-225-19 1,1 RB54-225-10 63,0

RB54-224-27 446 RB54-225-10 1,1 RB54-225-14 60,7

RB54-225-14 435 RB54-225-14 1,1 RB19-148-24 60,3

En la figura 5.1.3.1, se presenta la gráfica de los 10 clones con mayor incremento medio

en DAC2*H para el período 2003-2005. En la figura, el punto señala la media aritmética y

el intervalo indica dos veces la desviación estándar o desviación típica.

Figura 5.1.3.1. Incremento medio en Índice de Biomasa (DAC2*H) en el período 2003-2005,

para los 10 mejores rendimientos del ensayo Voipir.

35

Además, para comprobar la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los

clones para esta variable, se realizó un ANDEVA. El resultado indicó la existencia de

diferencias significativas entre los 10 clones seleccionados con mejor rendimiento para la

variable DAC2*H. Las respectivas tablas del ANDEVA se presentan en el apéndice 8.6.

El clon RB3-57-77-7 es el que presenta el mayor valor de incremento medio, además

presenta la mayor desviación de los datos sobre la media. Por su parte, el clon RB54-225-

14 es el que presentó el menor valor de incremento medio, presentando también una de

las menores desviaciones por sobre la media.

La figura 5.1.3.2, muestra el incremento medio de los 10 clones que presentaron el mejor

rendimiento para la variable DAC. En el gráfico, el punto señala la media y el intervalo,

dos veces la desviación típica.


2003-2005, para los 10 mejores rendimientos del ensayo Voipir.


efectos para la variable DAC en el incremento medio. El resultado indicó que no existían

diferencias significativas entre los 10 clones seleccionados con mejor rendimiento. Lo que

36

significa que entre los 10 mejores clones no existen mayores diferencias, para esta

variable. La tabla ANDEVA se presenta en el apéndice 8.6.

Al igual que para el caso del DAC2*H, el clon RB3-57-77-7 es el que presenta el mayor

valor de media para la variable DAC, con una de las mayores desviaciones sobre la

media. El valor mínimo para esta variable la presenta el clon Rb54-225-14, con una de las

menores desviaciones por sobre la media.

Finalmente, se graficó los valores medios del incremento del período 2003-2005 para la

variable altura (figura 5.1.3.3), donde se destacan los valores de los clones RB3-57-77-7

y RC5.

Figura 5.1.3.3. Incremento medio en Altura en el período 2003-2005, para los 10 mejores

rendimientos del ensayo Voipir.

Para verificar la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los clones se

aplicó un ANDEVA. Los resultados revelaron la no existencia de diferencias significativas

para la variable altura, en la selección de los 10 clones con mejor rendimiento para esta

variable. En el apéndice 8.6 se presenta la tabla ANDEVA para esta variable.

Este resultado, al igual que para la variable DAC, era lógico esperarlo, ya que entre los 10

mejores clones no necesariamente deben existir diferencias significativas. Por lo tanto, la

37

conclusión anterior aquí también es aplicable, es decir, no se recomienda discriminar

utilizando sólo los resultados de esta variable en una eventual selección una población de

mejora.

La distribución de las observaciones es bastante homogénea. El mejor rendimiento lo

presentó el clon RB3-57-77-7 (al igual que para las variables DAC2*H y DAC).

En el ensayo Voipir se puede destacar que el clon RB3-57-77-7 es la que lideró el

“ranking” para las tres variables en estudio.

5.2 Ensayo Natalhue

Los clones probados en el ensayo Natalhue -que corresponden a 40 procedencias-,

pertenecen a los condados Del Norte, Mendocino, Napa, Humboldt, Sonoma, Monterrey y

Santa Cruz, todos del estado de California, Estados Unidos.

5.2.1 Valores medios por clon

En base a los valores observados en terreno se calculó la media del incremento en

DAC2*H para la totalidad de los clones probados en el ensayo Natalhue, el resultado se

presenta en la figura 5.2.1.1., donde los clones se encuentran dispuestos de norte a sur

de acuerdo a sus localidades de procedencias, y en la figura de izquierda a derecha.

Los valores medios de incremento en DAC2*H se encuentran entre los 150 y 1800 cm3.

38


2005 por clon del ensayo Natalhue. Los clones se distribuyen de norte a sur -izquierda a

derecha-de acuerdo a sus lugares de procedencia en el estado de California.

39

Los mayores valores para esta variable, la presentaron los clones RB2-238-19 y RB2-238-

13. Los valores más bajos correspondieron a los clones M-06-1 y N-02-1.

De acuerdo a la distribución que presentaron los clones en la figura, se aprecia que existió

tendencia de aumento en DAC2*H en las procedencias correspondientes al condado de

Humboldt, lo que concuerda con lo reportado por Rocuant (1999), que señala a este

condado -además del Condado del Norte- como el más adecuado para proveer de

material para la introducción en chile.

A su vez, se graficó los valores medios del incremento producido en el período 2003 -

2005 para la variable DAC, el resultado se muestra en la figura 5.2.1.2. En la figura los

clones fueron ordenados de norte a sur -en el gráfico de izquierda a derecha-.

Las gráficas del DAC2*H y DAC presentaron similitudes, las que se ven acentuadas en los

valores mínimos y máximos. Esto era bastante esperable, ya que el DAC2*H está

relacionado cuadráticamente (segundo grado) con la variable DAC, por lo que cualquier

valor alto para el DAC se presenta al cuadrado en el DAC2*H generando un alto valor

también. Idéntica situación sucede en los valores muy pequeños de DAC.

40

Figura 5.2.1.2. Incremento medio en DAC, en el período 2003-2005 por clon del ensayo

Natalhue. Los clones se distribuyen de norte a sur -izquierda a derecha-de acuerdo a sus

lugares de procedencia en el estado de California.

41

Los clones RB2-238-19 y RB54-214-28 son los que presentaron los mayores valores para

esta variable. Por su parte, los menores rendimientos lo presentaron los clones M-06-1 y

N-02-1.

De acuerdo a lo observado en la figura, se aprecia una distribución levemente más

homogénea que la distribución del DAC2*H. Sin embargo, los mejores rendimientos para

el DAC, se siguen presentando en las procedencias que se distribuyen en el condado de

Humboldt, y en algunas que pertenecen al condado de Mendocino, que se encuentra más

al sur.

Esto, si es contrastado con lo señalado por Rocuant (1999), en su informe técnico de

producción de plantas de secuoya, coincide con lo concluido en el condado de Humboldt,

pero sus conclusiones se contraponen a los resultados obtenidos en esta memoria para el

condado de Mendocino.

Finalmente, la figura 5.2.1.3 muestra la gráfica de los rendimientos del incremento medio

de la variable altura en el período 2003-2005, donde se destacan los clones RB19-148-18

y RB19-148-9 con valores de 103,4 y 97,5 cm. En la figura, los clones fueron distribuidos

de norte a sur, de acuerdo a los lugares de procedencia en el estado de California.

Por su parte, los menores rendimientos correspondieron a los clones RB-14-5 y D-06-4

con 33,6 y 31,8 cm respectivamente.

Esta gráfica difiere de la que corresponde a las variables DAC2*H y DAC, ya que si bien,

la altura participa en la obtención de la variable DAC2*H, la pondera como término simple

y no cuadrático como el DAC.

De acuerdo a la figura, los mejores rendimientos lo presentaron las procedencias que se

encuentran en el condado de Humboldt, lo que coincide con los valores máximos de los

rendimientos de las variables DAC2*H y DAC. Además, se observan valores con buen

rendimiento en el condado de Monterrey -que coincide con la distribución natural de Pinus

radiata-. Esto último no concuerda plenamente con el informe técnico de Forestal

Simpson, que señala a los condados de Humboldt y Del Norte como a los más apropiados

en cuanto a material genético para introducir en Chile (Rocuant, 1999).

42

Figura 5.2.1.3. Incremento medio en altura en el período 2003-2005, por clon del ensayo

Natalhue. Los clones se distribuyen de norte a sur -izquierda a derecha-de acuerdo a sus

lugares de procedencia en el estado de California.

43

Con los valores medios del incremento por variable en el período 2003-2005, se

jerarquizaron en orden descendente los valores medios por clon. El resultado se presenta

en la tabla 5.2.1.1.

Tabla 5.2.1.1. “Ranking” con valores de incrementos medios (*) por clon de cada variable,

en el ensayo Natalhue.

Clon DAC2*H (cm 3) Clon

DAC

(cm) Clon

Altura

(cm)

RB2-238-19 1.780 RB2-238-19 2,50 RB19-148-18 103,4

RB2-238-13 1.686 RB54-214-28 2,48 RB19-148-9 97,5

RB54-214-28 1.680 RB2-238-13 2,15 RB19-6 91,9

RB19-148-18 1.565 RB54-215-3 2,08 RB54-214-28 87,8

RB54-215-3 1.417 H-10-4 2,04 N-03-2 85,7

RB19-148-9 1.342 H-13-3 2,04 RB54-215-3 85,3

RB19-148-20 1.199 RB54-225-3 2,03 RB19-148-20 85,0

RB54-225-24 1.173 Y-08-2 2,00 RB2-238-19 83,1

RB37RB5-000 1.161 RB19-148-18 1,99 H-13-3 82,9

RB54-225-3 1.121 RB54-215-6 1,95 RB37RB5-000 81,3

RB19-6 1.083 RB19-6 1,92 Y-06-4 81,2

Y-08-1 1.062 RB54-225-24 1,92 RB54-215-6 80,5

H-13-3 1.038 N-05-2 1,88 RB2-238-13 79,8

RB54-215-6 1.020 RB54-214-30 1,88 RB41RB46-020 78,1

Y-08-2 975 H-20-1 1,87 RB54-214-30 77,6

RB54-214-30 973 M-17-2 1,85 RB19-148-19 77,0

H-10-4 962 RB19-148-9 1,84 RB54-225-3 75,6

PLUS B 959 M-15-1 1,80 H-20-1 74,8

N-05-2 925 RB19-148-19 1,80 RB54-225-24 74,5

RB19-148-19 912 RB19-148-20 1,80 Y-08-2 73,4

M-17-2 872 PLUS B 1,78 RB18L-109-9 71,0

RB54-215-7 787 RB37RB5-000 1,72 M-17-2 70,7

PLUS C 757 Y-08-1 1,70 RB31L-28-11 70,7

H-20-1 744 RB41RB46-020 1,62 RB54-7 69,7

Y-06-4 701 H-16-2 1,61 Y-03-4 69,2

RB75-58-16 676 RB75-58-16 1,60 H-16-2 69,2

M-15-1 648 RB54-215-7 1,59 H-08-3 68,6

H-16-2 641 RB17RB9-011 1,59 RB54-215-7 68,1

H-09-5 622 Y-06-4 1,58 RB3-56-9 67,0

H-07-3 617 N-03-2 1,54 Y-06-3 65,3

N-03-2 614 PLUS C 1,54 H-10-4 65,2

H-09-4 569 H-09-4 1,52 D-04-6 65,2

44


DAC

(cm) Clon

Altura

(cm)

RB41RB46-020 567 Y-05-4 1,51 RB75-58-16 64,6

Y-06-3 562 S-04-2 1,49 H-11-5 63,9

RB18L-109-9 553 M-18-1 1,49 S-04-2 62,4

S-04-2 550 Y-06-3 1,48 H-06-4 62,2

RB54-7 549 RB31L-38-20 1,47 RB31L-38-20 61,5

H-06-4 542 H-07-3 1,44 H-07-3 61,4

M-07-1 516 H-06-4 1,43 H-09-5 60,2

RB3-56-9 507 H-11-5 1,43 D-03-5 60,0

H-08-3 505 H-09-5 1,41 M-07-1 60,0

Y-03-4 504 RB22RB2-010 1,40 N-02-2 59,8

RB17RB9-011 503 D-03-5 1,39 RB3-31-21 59,0

RB22RB2-007 490 N-02-2 1,39 H-09-4 58,7

H-11-5 489 Y-03-4 1,38 RB22RB2-007 58,2

Y-05-4 488 RB54-7 1,36 RB12-27-9 57,8

RB31L-28-11 485 RB3-56-9 1,34 RB22RB2-010 57,6

RB31L-38-20 484 RB-14-5 1,32 RB75-58-26 56,9

M-18-1 482 RB22RB2-007 1,30 H-11-3 56,7

N-02-2 465 COMERCIAL 1,26 RB31L-26 56,7

PLUS A 464 S-01-2 1,24 M-15-1 56,0

RB22RB2-010 429 RB18L-109-9 1,23 M-08-2 55,7

D-03-5 412 RB31L-28-11 1,23 S-05-1 55,0

RB-14-5 407 RB12-28-5 1,23 H-17-2 54,8

M-06-2 387 D-04-6 1,23 Z-02-6 54,5

H-17-2 386 Z-02-6 1,23 M-19-1 53,8

D-04-6 373 PLUS A 1,22 RB31L-14-6 53,5

H-11-3 372 H-08-3 1,22 N-05-2 52,8

S-01-2 366 RB75-58-24 1,21 Y-08-1 52,1

COMERCIAL 362 RB31L-14-6 1,20 RB75-58-24 51,7

RC18L-109-8 355 H-17-2 1,19 PLUS B 50,8

RB75-58-24 348 M-06-2 1,19 N-03-4 49,9

H-02-3 336 S-05-1 1,17 COMERCIAL 49,9

M-19-1 330 RB75-58-26 1,16 RB12-26 49,8

RB12-28-5 318 M-07-1 1,14 PLUS A 49,7

RB31L-14-6 310 M-19-1 1,14 RB17RB9-011 49,5

Z-02-6 308 H-02-3 1,13 M-06-2 49,2

S-05-1 308 S-01-1 1,11 S-01-2 48,9

RB75-58-26 289 RB75-58-6 1,08 Y-01-2 47,5

S-01-1 280 N-03-4 1,08 M-12-1 46,1

45


DAC

(cm) Clon

Altura

(cm)

N-03-4 270 H-08-1 1,07 S-03-2 46,1

H-08-1 268 M-08-2 1,06 S-01-1 45,9

RB3-31-21 268 H-11-3 1,06 PLUS C 45,8

M-08-2 250 RC18L-109-8 1,02 RB12-28-5 45,1

RB12-27-9 250 S-03-2 1,00 H-08-1 44,6

RB31L-26 249 RB3-31-21 0,96 M-18-1 44,2

RB-12-28-18 248 H-02-5 0,95 RC18L-109-8 43,1

RB75-58-6 241 M-12-1 0,93 Y-05-4 42,9

RB12-26 235 RB31L-26 0,91 H-02-3 42,7

S-03-2 206 RB-12-28-18 0,90 RB75-58-6 41,4

M-12-1 204 RB12-26 0,90 M-06-1 41,3

RB17RB9-012 192 RB12-27-9 0,90 N-02-1 40,1

Y-01-2 186 S-03-1 0,90 H-02-5 39,5

H-02-5 182 RB17RB9-012 0,87 RB17RB9-012 38,4

D-06-4 172 D-06-4 0,83 RB-12-28-18 36,1

S-03-1 171 Y-01-2 0,80 S-03-1 33,6

N-02-1 160 M-06-1 0,77 RB-14-5 33,3

M-06-1 150 N-02-1 0,72 D-06-4 31,8

(*) Los valores de incrementos medios por clon corresponden al promedio de los valores medios obtenidos por unidad muestral en las 10 parcelas.

5.2.2 Análisis de los incrementos medios para la mu estra aleatoria, donde cada

condado está representado por un clon.

Los clones probados en el ensayo Natalhue se distribuyen en siete condados del estado

de California -Del Norte, Mendocino, Napa, Humboldt, Sonoma, Santa Cruz y Monterrey-.

Se extrajo una muestra aleatoria de un clon en cada condado, por lo que cada condado

quedó representado por un clon.

La tabla 5.2.2.1 muestra el resultado del sorteo y los valores medios del incremento para

el período 2003-2005. El apéndice 8.10 entrega el intervalo de confianza al 95% para la

media del incremento del período 2003-2005, para cada una de las variables.

46

Tabla 5.2.2.1. Incremento medio por clon, en el período 2003-2005. Muestra aleatoria,

criterio condados del estado de California, ensayo Natalhue.

Clon Condado Incremento Medio en

DAC2*H (cm 3)

Incremento Medio en DAC

(cm)

Incremento Medio en Altura

(cm)

D-04-6 Del Norte 373 1,23 65,2

M-07-1 Mendocino 516 1,14 60,0

N-02-1 Napa 160 0,72 40,1

RB-12-28-18 Humboldt 248 0,90 36,1

S-05-1 Sonoma 308 1,17 55,0

Y-03-4 Monterrey 504 1,38 69,2

Z-02-6 Santa Cruz 308 1,23 54,5

El clon que presenta el mejor rendimiento para las variables DAC y altura, corresponde a

Y-03-4 que pertenece al condado de Monterrey (lugar de distribución natural de Pinus

radiata).

Por su parte, para la variable DAC2*H es el clon M-07-1, perteneciente al condado de

Mendocino, el que presenta el mejor rendimiento.

Los límites de confiabilidad al 95% para la media de los incrementos para la variable

DAC2*H, se muestran en la figura 5.2.2.1.

47

Figura 5.2.2.1. Incremento medio en Índice de Biomasa (DAC2*H) en el período 2003-2005,

para la muestra aleatoria, donde cada condado es representado por un clon, ensayo Natalhue.

Para verificar la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los clones para

la variable DAC2*H se realizó un ANDEVA. El resultado indica que no existen diferencias

significativas entre los efectos de los clones. Por lo que no sería apropiado seleccionar

clones utilizando sólo la variable DAC2*H en una eventual selección de población de

mejora para secuoya.

Los dos condados que presentaron mejor rendimiento para la variable DAC2*H

corresponden Monterrey (distribuido desde los 35°48 ’ a los 36°55° N) y Mendocino (40°00’

– 38°46’ N), si esta información es contrastada con la ubicación de los ensayos en Chile

(39° a 40° S) se puede apreciar que es el condado d e Mendocino el que se acerca más a

la distribución de los ensayos en el sur de Chile.

Por su parte, la figura 5.2.2.2 muestra los límites confidenciales para la media del

incremento en DAC ocurrido entre los años 2003 y 2005.

48


2003-2005, para la muestra aleatoria, donde cada condado es representado por un clon,

ensayo Natalhue.

Se evaluó la existencia de diferencias significativas entre el incremento medio en DAC

para las variables probadas. De acuerdo a los resultados obtenidos en el ANDEVA se

concluye que no existían diferencias significativas entre los efectos de los clones.

No obstante lo anterior, son los clones de los condados de Monterrey y Santa Cruz los

que presentaron los mejores resultados, lo que sigue marcando la tendencia de liderazgo

de los condados del Sur de California.

49

Figura 5.2.2.3. Incremento medio en altura en el período 2003-2005, para la muestra

aleatoria, donde cada condado es representado por un clon, ensayo Natalhue.

Finalmente, se realizó un ANDEVA para evaluar la existencia de diferencias significativas

entre los efectos del incremento medio para la variable altura. El resultado señaló que no

existieron diferencias significativas entre los efectos de los clones.

Para esta variable se mantiene la situación de liderazgo que se ha observado en el

condado de Monterrey.

5.2.3 Análisis de los incrementos medios para la mu estra aleatoria de los clones

que pertenecen al condado de Humboldt.

En el condado de Humboldt se concentra un 44% de los clones probados en el ensayo

Natalhue. Es por esto, que se extrajo una muestra aleatoria de diez clones de este

condado y se evaluó la existencia de diferencias significativas entre los efectos ellos para

las variables DAC2*H, DAC y altura, mediante ANDEVAs.

La tabla 5.2.3.1 muestra el resultado del sorteo y los valores medios del incremento para

el período 2003-2005. En el apéndice 8.11 se entrega el intervalo de confianza al 95%

para la media del incremento para cada una de las variables.

50

Tabla 5.2.3.1. Incremento medio por clon, en el período 2003-2005. Muestra aleatoria,

condado de Humboldt, ensayo Natalhue.

Clon Incremento en

DAC2*H (cm 3)

Incremento en

DAC (cm)

Incremento en

Altura (cm)

H-07-3 617,3 1,44 61,4

H-08-1 268,3 1,07 44,6

RB-12-28-18 247,5 0,90 36,1

RB-14-5 406,9 1,32 33,3

RB12-28-5 318,4 1,23 45,1

RB2-238-19 1779,7 2,50 83,1

RB22RB2-007 490,0 1,30 58,2

RB54-215-3 1416,8 2,08 85,3

RB75-58-26 289,1 1,16 56,9

RB75-58-6 240,9 1,08 41,4

En la figura 5.2.3.1 se graficaron las medias del incremento de la variable DAC2*H. En la

figura, los puntos corresponden a la media del incremento y el intervalo al límite de

confianza al 95% para la media.

El mejor rendimiento de la muestra extraída de la población en análisis corresponde al

clon RB2-238-19 (presenta un liderazgo amplio por sobre los que lo siguen). En segundo

lugar, se encuentra RB54-215-3. Por su parte, los clones RB-12-28-18 y RB75-58-6 los

que presentaron los menores incrementos.

51


2005, muestra aleatoria, condado de Humboldt. Ensayo Natalhue.

Para evaluar la existencia de diferencias significativas entre los efectos del incremento

medio para la variable DAC2*H se realizó un ANDEVA. Los resultados indicaron la

existencia de diferencias significativas entre los efectos de los clones. La tabla ANDEVA

para esta variable se entrega en el apéndice 8.8.

Se mantiene el liderazgo del clon RB2-238-19 que corresponde a las procedencias que se

distribuyen al sur del condado de Humboldt.

Se graficaron los valores medios del incremento producido en el período 2003-2005 de la

variable DAC en la muestra aleatoria del condado de Humboldt, el resultado se muestra

en la figura 5.2.3.2.

En el gráfico, el punto señala la media y el intervalo el límite confidencial para la media al

95%. Los valores de los límites confidenciales detallados se entregan en el apéndice 8.11.

52


2003-2005, muestra aleatoria, condado de Humboldt. Ensayo Natalhue.

Los efectos de las medias del incremento en DAC de los clones se evaluaron mediante un

ANDEVA. El resultado reveló la existencia de diferencias significativas entre los efectos

de los clones, para la variable DAC, lo que indica que la variable DAC permitiría realizar

una selección entre los clones probados.

En el apéndice 8.8 se entrega la tabla ANDEVA para esta variable.

Se mantiene el liderazgo de RB2-238-19, esta vez seguido de cerca por RB54-215-3.

Ambos clones se encuentran ubicados cerca del límite sur de Humboldt.

Finalmente, se graficaron las medias de los incrementos en altura en el período 2003-

2005 de la variable altura para la muestra aleatoria del condado de Humboldt.

En el gráfico, el punto señala la media y el intervalo el límite confidencial para la media al

95%. Los valores de los límites confidenciales detallados se entregan el apéndice 8.11.

53

Figura 5.2.3.3. Incremento medio en altura en el período 2003-2005, muestra aleatoria,

condado de Humboldt. Ensayo Natalhue.


clones probados para la variable altura. El resultado reveló la existencia de diferencias

significativas entre los efectos para esta variable al igual que para DAC2*H y DAC, por lo

que se concluye que la variable altura en conjunto con el DAC2*H y DAC serían variables

que permitirían discriminar en la selección de una eventual selección de mejora.

En el apéndice 8.8 se entrega la tabla ANDEVA para esta variable.

54

5.2.4 Análisis de los incrementos medios para la se lección de los 10 clones con

mejor rendimiento para cada una de las variables

Se seleccionaron los 10 clones con mejor rendimiento para cada una de las variables

analizadas, es decir, DAC2*H, DAC y altura.

El resultado de la selección se presenta en la tabla 5.2.4.1, donde se entregan los clones

con sus respectivas medias. En el apéndice 8.12 se entregan los límites de confiabilidad

al 95% para la media del incremento de cada variable.

Tabla 5.2.4.1. Incremento medio por clon, en el período 2003-2005. Selección de los 10

mejores rendimientos por variable, ensayo Natalhue.

Clon Incremento en DAC2*H

(cm 3) Clon

Incremento en DAC

(cm) Clon

Incremento en Altura

(cm)

RB2-238-19 1.779,7 RB2-238-19 2,50 RB19-148-18 103,4

RB2-238-13 1.685,5 RB54-214-28 2,48 RB19-148-9 97,5

RB54-214-28 1.679,9 RB2-238-13 2,15 RB19-6 91,9

RB19-148-18 1.565,4 RB54-215-3 2,08 RB54-214-28 87,8

RB54-215-3 1.416,8 H-10-4 2,04 N-03-2 85,7

RB19-148-9 1.341,9 H-13-3 2,04 RB54-215-3 85,3

RB19-148-20 1.198,6 RB54-225-3 2,03 RB19-148-20 85

RB54-225-24 1.172,9 Y-08-2 2,00 RB2-238-19 83,1

RB37RB5-000 1.160,6 RB19-148-18 1,99 H-13-3 82,9

RB54-225-3 1.121,1 RB54-215-6 1,95 RB37RB5-000 81,3

Los 10 clones con mayor incremento en DAC2*H en el periodo 2003-2005 corresponden al

condado de Humboldt. Para el DAC, salvo por el clon Y-08-2 perteneciente al condado de

Monterrey, todos pertenecen al condado de Humboldt. Finalmente, para la variable altura

todos pertenecen al condado de Humboldt, salvo el clon N-03-2 que corresponde al

condado de Napa.

La figura 5.2.4.1 muestra la gráfica de la media del incremento en DAC2*H ocurrido en el

período comprendido entre 2003 y 2005. En el gráfico, los puntos señalan los valores

medios y los intervalos el límite de confiabilidad para la media al 95%.

55


2005, para los 10 mejores clones del ensayo Natalhue.

Para verificar la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los 10 clones

seleccionados con mejor rendimiento para la variable DAC2*H, se realizó un ANDEVA, el

cual entregó como resultado la no existencia de diferencias significativas entre los efectos

de los clones seleccionados para esta variable. En el apéndice 8.9 se entrega la tabla

ANDEVA para esta variable.

El resultado anterior confirma que, entre los clones con mejor rendimiento, no existen

mayores diferencias. Por lo que no sería aconsejable utilizar a la variable DAC2*H por sí

sola en una selección de individuos para una población de mejora.

Se graficó el incremento medio en DAC ocurrido en el período 2003-2005 en los 10 clones

con mejor rendimiento. El resultado anterior se entrega en la figura 5.2.4.2, donde el punto

muestra la media y el intervalo el límite de confidencialidad de la media al 95%.

56


2003-2005, para los 10 mejores clones del ensayo Natalhue.

Los resultados del ANDEVA realizado para evaluar la existencia de diferencias

significativas entre los efectos de los clones seleccionados con mejor rendimiento para la

variable DAC, señalan que no existen diferencias entre los efectos de los clones. En el

apéndice 8.9 se entrega la tabla ANDEVA para esta variable.

Este resultado indica que no existen mayores diferencias entre los 10 clones con mejor

rendimiento para la variable DAC, por lo que no se puede aconsejar en la toma de

decisión en una eventual selección de mejora para secuoya.

Finalmente, se graficó el incremento medio en altura ocurrido en el período 2003-2005,

para los 10 mejores rendimientos. El resultado se muestra en la figura 5.5.4.3.

57

Figura 5.2.4.3. Incremento medio en altura en el período 2003-2005, para los 10 mejores

clones del ensayo Natalhue.

Para comprobar la existencia de diferencias significativas entre los efectos de los clones

se realizó un ANDEVA, el cual entregó como resultado la no existencia de diferencias

significativas para la variable Altura. En el apéndice 8.9 se entrega la tabla ANDEVA para

esta variable.

Este resultado confirma que no se puede discriminar entre los 10 clones con mejor

incremento medio en altura para una eventual selección de población de mejora.

58

5.3 Evaluación de la interacción entre sitios

El ensayo Voipir y el ensayo Natalhue fueron diseñados con cuatro clones en común

(Comercial, Plus A, Plus B, Plus, C), con el fin de determinar la existencia de diferencias

significativas entre clones, entre sitios y para verificar si existe interacción clon-sitio.

Se graficaron los valores medios por clon para cada variable y en cada uno de los

ensayos (Voipir y Natalhue), los resultados para la variable DAC2*H se muestran en la

figura 5.3.1.

Figura 5.3.1. Incremento medio en Índice de Biomasa (DAC2*H) en el período 2003-2005,

en ambos ensayos, para los clones: Comercial, Plus A, Plus B y Plus C.

Lo resultados del ANDEVA realizado reveló la no existencia de interacción clon-sitio, la no

existencia de diferencias significativas entre los efectos de los clones, pero que si existen

diferencias significativas entre sitios -el apéndice 8.13 muestra las tablas del ANDEVA

realizado para esta variable-.

59

El análisis gráfico confirmó lo anterior, muestra el rendimiento presentado en el ensayo

Natalhue es mayor que el observado en el ensayo Voipir, para los cuatro clones,

acentuándose esta diferencia en los clones Plus B y Plus C.

Para complementar el análisis anterior se graficó el cambio en la jerarquización que se

observa al probar los clones comunes en ambos ensayos, para la variable DAC2*H (figura

5.3.2).

Ensayo Voipir Ensayo Natalhue

Plus A Plus B

Comercial Plus C

Plus B Plus A

Clones

Plus C Comercial

Figura 5.3.2. Cambio en la jerarquización de los clones comunes en ambos ensayos,

para la variable DAC2*H.

Los clones Plus B y Plus C, presentaron mejor el rendimiento en el ensayo Natalhue. Por

su parte los clones Plus A y Comercial, lideraron en el ensayo Voipir.

El incremento medio en DAC en ambos sitios y por clon se muestra en la figura 5.3.3,

donde se aprecia, al igual que para la variable DAC2*H, que el ensayo Natalhue presentó

los mejores resultados para los clones probados.

60

Figura 5.3.3. Incremento medio en Diámetro a la Altura del Cuello (DAC) en el período

2003-2005, en ambos ensayos, para los clones: Comercial, Plus A, Plus B, Plus C.

De acuerdo a los resultados arrojados por el ANDEVA para la variable DAC, se concluyó

que no existe interacción clon-sitio, no existieron diferencias significativas entre los

efectos de los clones, y que existieron diferencias significativas entre los efectos de los

sitios -los resultados del ANDEVA se muestran en el apéndice 8.13-.

Cabe destacar que los clones Plus B y Plus C, son los que presentaron la mayor

diferencia de rendimiento entre sitios, seguidas por Comercial y Plus A.

La figura 5.3.4 muestra el cambio en la jerarquía en los clones, para la variable DAC.

61


Plus A Plus B

Comercial Plus C

Plus B Comercial

Clones

Plus C Plus A


para la variable DAC.

Al igual que para la variable DAC2*H se puede observar que los Clones Plus B y Plus C

presentan mejor rendimiento en el ensayo Natalhue, mientras que los clones Plus A y

Comercial lo hacen en el ensayo Voipir.

Por último, el incremento medio observado para la variable Altura, en ambos sitios para

los clones comunes a los ensayos se presenta en la figura 5.3.5.

62

Figura 5.3.5. Incremento medio en altura en el período 2003-2005, en ambos ensayos,

para los clones: Comercial, Plus A, Plus B, Plus C.

De acuerdo al ANDEVA realizado se determinó que no existe interacción clon-sitio; no

existen diferencias significativas entre los efectos de los clones y lo mismo ocurre con los

efectos de los sitios -los resultados del ANDEVA se presentan en el apéndice 8.13-.

El análisis gráfico de la figura 5.3.5 confirma que el patrón de dominancia que presenta el

ensayo Natalhue por sobre el ensayo Voipir se mantuvo para los clones Plus B y Plus C,

pero que se invierte para los Plus A y Comercial.

La mayor diferencia entre clones la presentó Plus B, seguida por Plus C. Por su parte Plus

A y Comercial son los que presentaron menor variación.

Para el ensayo Voipir los clones ordenan, de acuerdo a la variable Altura, tal como sigue:

Comercial, Plus A, Plus, B, Plus C. Por su parte en el ensayo Natalhue se ordenan: Plus

A, Comercial, Plus B, Plus C (figura 5.3.6).

Destaca el posicionamiento del clon Plus C, que a diferencia de los casos anteriores, no

presentó variación entre sitios. No así los clones Plus A y Plus B que presentaron mejor

63

rendimiento en el ensayo Natalhue. Por su parte el clon Comercial se desarrolla mejor en

el ensayo Voipir.


Comercial Plus B

Plus A Comercial

Plus B Plus A

Clones

Plus C Plus C


para la variable Altura.

Al igual que para la variable DAC2*H y DAC los clones Plus A y Comercial, lideran en el

ensayo Voipir, y el clon Plus B presenta mejor el rendimiento en el ensayo Natalhue.

5.4 Selección y evaluación de partidores para los m arcadores RAPDs

La reacción de amplificación por PCR del DNA cromosómico de Sequoia sempervirens

(D. Don) Endl. se probó con 60 partidores correspondientes a las series BF, BG y BH

(Operon Technologies, Alameda, CA). La tabla 5.4.1 muestra la secuencia 5’-3’ de los

partidores probados.

64

Tabla 5.4.1. Propiedades de los partidores evaluados

Partidor Secuencia

Partidor

5’ – 3’

Partidor

Secuencia Partidor

5’ – 3’

Partidor

Secuencia Partidor

5’ – 3’

OPBG - 01 GTGGCTCTCC OPBH - 01 CCGACTCTGG OPBF - 01 GGAGCTGACT

OPBG - 02 GGAAAGCCCA OPBH - 02 GTAAGCCGAG OPBF - 02 GACACACTCC

OPBG - 03 GTGCCACTTC OPBH - 03 GGAGCAGCAA OPBF - 03 TCCCTTGACC

OPBG - 04 GTTCCCGACA OPBH - 04 ACCTGCCAAC OPBF - 04 GACAGGTTGG

OPBG - 05 CAAGCCGTGA OPBH - 05 GTAGGTCGCA OPBF - 05 CACCCCGAAA

OPBG - 06 GTGGATCGTC OPBH - 06 TCGTGGCACA OPBF - 06 TCCACGGGCA

OPBG - 07 CAGAGGTTCC OPBH - 07 TGTACGGCAC OPBF - 07 CACCATCGTG

OPBG - 08 GACCAGAGGT OPBH - 08 ACGGAGGCAG OPBF - 08 CCTGGGTCCA

OPBG - 09 GGCTCTGGGT OPBH - 09 GTCTTCCGTC OPBF - 09 ACCCAGGTTG

OPBG - 10 GGGATAAGGG OPBH - 10 GTGTGCCTGG OPBF - 10 GTGACCAGAG

OPBG - 11 ACGGCAATGG OPBH - 11 AGCCCAAAGG OPBF - 11 GACGACCGCA

OPBG - 12 CCCGAGAAAC OPBH - 12 TCGCCTTGTC OPBF - 12 CTTCGCTGTC

OPBG - 13 GGTTGGGCCA OPBH - 13 AGTTGGGCAG OPBF - 13 CCGCCGGTAA

OPBG - 14 GACCAGCCCA OPBH - 14 ACCGTGGGTG OPBF - 14 CCGCGTTGAG

OPBG - 15 ACGGGAGAGA OPBH - 15 GAGAACGCTG OPBF - 15 ACGCGAACCT

OPBG - 16 TGCTTGGGTG OPBH - 16 CTGCGGGTTC OPBF - 16 AGGGTCCGTG

OPBG - 17 TCCGGGACTC OPBH - 17 CTCTTACGGG OPBF - 17 CAAGCTCGTG

OPBG - 18 TGGCGCTGGT OPBH - 18 GACGCTTGTC OPBF - 18 AGCCAAGGAC

OPBG - 19 GGTCTCGCTC OPBH - 19 GTCGTGCGGA OPBF - 19 TTCCCGCACT

OPBG - 20 TGGTACCTGG OPBH - 20 CACCGACATC OPBF - 20 ACCCTGAGGA

Del conjunto de partidores ensayados se seleccionaron cinco que dieron una reacción

positiva reproducible y con bandas polimórficas. Las propiedades de los partidores

seleccionados y el número de bandas amplificadas se muestran en la tabla 5.4.2. Con

estos partidores se obtuvo un total de 252 bandas de las cuales 49 correspondieron a

bandas polimórficas.

65

Tabla 5.4.2. Propiedades de los partidores seleccionados.

Partidor Secuencia Partidor

5’ – 3’ Nº Bandas

amplificadas Nº Bandas

Polimórficas

BG 04 GTTCCCGACA 38 8

BF 07 CACCATCGTG 27 6

BF 12 CTTCGCTGTC 71 10

BF 13 CCGCCGGTAA 64 16

BF 14 CCGCGTTGAG 52 9

Total 252 49

En la figura 5.4.1 se muestra, a modo de ejemplo, los marcadores RAPDs obtenidos con

el partidor BF14 en la reacción de PCR. Los fragmentos amplificados con los distintos

partidores se distribuyeron entre 350 y 2300 bp. El detalle del tamaño de cada fragmento

amplificado con los cinco partidores y para todos los clones estudiados se entrega en el

apéndice 8.14.

Figura 5.4.1. Marcadores RAPDs obtenidos con el partidor BF14 con los 10 clones

seleccionados de Sequoia sempervirens (D. Don.) Endl. Los productos de la amplificación obtenidos en la reacción de PCR se resolvieron por electroforesis en geles de agarosa al 1.2% y se tiñeron con bromuro de etidio. C corresponde al control negativo y 100 bp al marcador de tamaño molecular.

66

Los resultados muestran que los marcadores RAPDs -bandas polimórficas- obtenidos con

los partidores seleccionados producen un patrón de bandas único para cada clon

ensayado, permitiendo su identificación.

El grado de similitud entre clones se obtuvo mediante la comparación de sus patrones de

bandas. Para ello se construyó una matriz de presencia/ausencia de bandas para el total

de los fragmentos amplificados. La matriz obtenida se sometió a un análisis de

agrupamiento UPGMA utilizando el coeficiente de similitud de Jaccard.

En la tabla 5.4.3 se entregan los valores del índice de similitud de Jaccard obtenido para

los distintos pares que se comparan. Este índice va entre cero y uno. El valor uno indica

un 100% de similitud entre los patrones.

Tabla 5.4.3. Matriz de similitud genética para pares de combinaciones de clones de

Sequoia sempervirens (D. Don) Endl., utilizando el Índice de Jaccard.

Clones

PLU

S B

CO

ME

RC

IAL

RB

54-2

25-1

7

PLU

S C

RB

2-23

8-16

RB

3-57

-77-

7

RB

-236

-10

RB

54-2

25-1

4

RB

54-2

25-1

9

RB

2-23

6-18

PLUS B 1

COMERCIAL 0,371 1

RB54-225-17 0,559 0,514 1

PLUS C 0,306 0,469 0,529 1

RB2-238-16 0,486 0,576 0,629 0,645 1

RB3-57-77-7 0,419 0,333 0,4 0,387 0,371 1

RB-236-10 0,457 0,594 0,556 0,563 0,719 0,424 1

RB54-225-14 0,441 0,485 0,588 0,6 0,606 0,5 0,576 1

RB54-225-19 0,378 0,457 0,647 0,613 0,618 0,382 0,588 0,677 1

RB2-236-18 0,316 0,515 0,447 0,531 0,5 0,353 0,514 0,545 0,432 1

A partir de la matriz de similitud se construyó un dendrograma mediante un análisis de

agrupamiento UPGMA utilizando el Programa MSVP (Kovach, 1999) (Figura 5.4.2)

67

Figura 5.4.2. Dendrograma obtenido mediante análisis de cluster UPGMA de los

marcadores RAPDs, utilizando el coeficiente de Jaccard.

: Valor crítico de similitud (Montecarlo)

La significancia de los grupos se evaluó mediante los valores críticos de similitud

estimados a partir de la distribución esperada por azar de los índices de Jaccard. Para

ello, se hizo un remuestreo con 1000 iteraciones usando la prueba de Montecarlo (Manly,

1991). El valor de similitud crítico esperado por azar se estimó como el percentil 95% de

la distribución de frecuencias. Este valor fue de 0.48, por lo tanto los nodos sobre este

valor son significativos y no son esperables por azar.

De los agrupamientos graficados en el dendrograma, se observa que los genotipos

RB236-10 y RB2-238-16 son los que presentan el mayor grado de similitud (cercano a un

72%) y están relacionados con el clon PLUS C, lo que sigue claramente un patrón de

agrupamiento geográfico.

Otro grupo está formado por los genotipos RB-54-225-19, RB 54-225-14 y RB54-225-17

que presentan similitudes superiores al 60%. De acuerdo a los antecedentes existentes

68

este grupo reúne clones muy similares geográficamente. Ambos grupos están más

relacionados entre sí que con cualquiera de los otros clones ensayados, los cuales

presentan menores grados de similitud entre ellos y con los dos grupos mencionados

anteriormente.

Estas agrupaciones obtenidas con RAPDs sugieren que los marcadores permiten revelar

no sólo la heterogeneidad genética de cada clon sino que revelan el grado de similitud

entre clones de la misma procedencia (localidad geográfica).

Resultados obtenidos con Salix, Pinus, Nothofagus, Eucalyptus, Castanea, Tsuga,

Acacia, entre otros, revelan que los marcadores RAPDS son útiles en la caracterización

de clones y en la determinación de su origen geográfico (Paredes et al., 2002a; Paredes

et al., 2002b; Campos de Quiroz et al., 2002; Becerra et al., 2003).

69

6 DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Tal como se ha planteado, esta memoria de título, evalúa la respuesta de distintas

procedencias -representadas por 118 clones- en dos situaciones de sitios que se

encuentran ubicadas dentro de las zonas potenciales de establecimiento de primera

prioridad (Toral y Castillo, 2005).

Al mismo tiempo, la evaluación se ha realizado sólo a los tres años de establecidos los

ensayos, utilizando para ésta, los incrementos medios de las variables respuesta DAC2*H,

DAC y altura.

Dado lo anterior y considerando la edad de los ensayos, no es posible concluir cual de

todas las procedencias es mejor, ya que a lo menos se tendrá que esperar 15-20 años

para tomar una decisión adecuada al respecto -por lo que ésta corresponde a una

evaluación temprana del ensayo-.

Por lo tanto, sólo se ha pretendido en esta memoria de título dar un seguimiento del

ensayo establecido, evaluado en términos estadísticos el comportamiento de cada clon

con el fin de visualizar y explicar a futuro el comportamiento de cada procedencia. Por lo

que esta memoria sólo sienta las bases para continuar con las mediciones de las

variables respuesta evaluadas hasta la fecha.

Tanto Forestal Natalhue como Forestal Voipir se han comprometido a mantener y evaluar

estos ensayos en el transcurso del tiempo.

Por otro lado, con esta memoria se ha logrado poner a punto toda una metodología en

relación a los marcadores RAPDs para secuoya.

En consecuencia con lo anterior las conclusiones que a continuación se exponen sólo son

válidas dentro de este contexto.

En el ensayo Voipir, se evaluó un ensayo de clones utilizando el método ANDEVA. En

base a los resultados obtenidos, se puede concluir que:

i. Existen diferencias entre los efectos del incremento de DAC2*H, DAC y altura, en

la muestra aleatoria de 10 clones. Esto significa que el “ranking” que entregó la

muestra analizada, puede ser muy útil al momento de tomar una decisión en una

población de mejora.

ii. Existen diferencias entre el efecto del incremento en DAC2*H de los 10 mejores

rendimientos de los clones seleccionados, resultado que indica que entre los 10

70

clones con mejor rendimiento en DAC2*H se podría discriminar en una eventual

selección de mejora.

iii. No existen diferencias entre el efecto del incremento en DAC y altura de los 10

clones con mejor rendimiento. Este resultado sólo indica que entre los mejores

rendimientos para las variables DAC y altura no se puede discriminar en una

selección de la población base de mejora en un programa de mejoramiento

genético.

En el ensayo Natalhue:

i. Existen diferencias entre el incremento medio para las tres variables -DAC2*H,

DAC y altura- en la muestra aleatoria de 10 clones del condado de Humboldt. Por

tanto, la información en la jerarquía que entrega esta muestra puede ser muy útil al

momento de planificar una selección para una población de mejora para secuoya.

ii. No existen de diferencias entre el incremento medio en DAC2*H, DAC y la altura,

en la muestra aleatoria de siete clones, donde cada condado está representado

por un clon. Además se puede agregar que los condados que presentan el mejor

rendimiento corresponden a Monterrey y Mendocino, siendo el último el que

presenta condiciones climáticas y edáficas similares con los ensayos probados.

iii. No existen diferencias entre el incremento medio en DAC2*H, DAC y la altura,

para la selección de los 10 clones con mejor rendimiento por variable. Ello significa

que, entre los 10 mejores, no existe mayor diferencia y por lo tanto no se puede

discriminar entre sus efectos.

Cuando se compararon ambos ensayos -evaluación entre sitios- con cuatro clones

comunes:

i. Existen diferencias entre los efectos de los sitios para las variables DAC2*H y

DAC, no así para la altura. Esto quiere decir que los resultados para estas

variables, variaron significativamente entre los ensayos de Voipir y Natalhue,

obteniéndose los mejores resultados en el ensayo Natalhue. Lo anterior no

sucedió con la variable altura.

ii. Finalmente, se comprobó la no existencia de interacción clon-sitio (para las tres

variables) como tampoco la existencia de diferencias entre los efectos de los

clones comunes en ambos ensayos.

71

iii. El cambio en la jerarquización se produce de la siguiente manera:

a. Plus A y Comercial presentaron mejor rendimiento en el ensayo Voipir,

para las tres variables.

b. Plus B presentó mejor rendimiento en el ensayo Natalhue, para las tres

variables

c. Plus C presentó mejor rendimiento en el ensayo Natalhue, para el DAC2*H

y DAC, en altura, permaneció indiferente.

A nivel molecular, se identificaron marcadores moleculares RAPDs y se establecieron

relaciones de similitud entre los 10 clones con mejor rendimiento luego de la primera

medición en el ensayo Voipir (año 2003).

Los partidores que entregaron patrones de bandas polimórficas para secuoya son los

correspondientes a las series BG04, BF07, BF12, BF13 y BF14, todos de Operon

Technologies.

Aplicando metodología estadística de conglomerados se pudo determinar que los

marcadores RAPDs, permiten caracterizar y detectar diferencias y/o similitudes entre los

clones evaluados.

Y finalmente, el agrupamiento de los clones por grado de similitud entre ellos está

relacionado con el origen de geográfico, lo que concuerda con lo reportado por Paredes et

al., 2002a; Paredes et al., 2002b; Campos de Quiroz et al., 2002 y Becerra et al., 2003,

entre otros.

72

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78

8 APÉNDICES

8.1 Apéndice 1. Distribución de los bloques y parce las en terreno para cada

ensayo

Distribución de los bloques en Forestal Voipir

Distribución de las parcelas en Forestal Natalhue

79

8.2 Apéndice 2. Distribución aleatoria de los clone s en el ensayo Voipir, con

códigos de terreno

BLOQUES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

T31 T32 T59 T47 P2 T57 T53 T34 T31 P1

T32 T38 T41 T43 T32 T39 T58 T45 T32 S

T33 T31 T45 T53 T43 T59 T39 T31 T33 T50

T34 T46 T35 T38 T45 T44 T34 T48 T34 T47

T35 T56 T52 T54 T38 P1 T36 P2 T35 T53

T36 T41 T54 T33 T49 P2 T57 T46 T36 T56

T37 T58 T34 P3 T59 T33 T54 T55 T37 T55

T38 T54 T51 T51 T54 S T52 T47 T38 T51

T39 T34 T43 T31 T33 T55 T56 T33 T39 P3

T40 P2 T42 T55 T58 T43 T45 T36 T40 P2

T41 P3 T56 S P1 T42 P1 S T41 T45

T42 T50 T46 T59 T36 T60 T43 T58 T42 T46

T43 T55 T44 T58 T41 T36 T60 T49 T43 T40

T44 T49 T53 T56 T34 T50 T37 T32 T44 T59

T45 T44 T33 T39 T60 T49 S T60 T45 T34

T46 T43 T32 T57 T44 T46 T55 T44 T46 T60

T47 T37 T49 T36 T55 T54 P3 T38 T47 T44

T48 T42 T39 P2 T35 T41 T38 T59 T48 T36

T49 T51 P1 T37 T57 T32 T50 T43 T49 T52

T50 T53 P3 T49 P3 T52 T59 T50 T50 T54 PR

OC

ED

EN

CIA

S

T51 T57 T50 T50 T42 T47 T33 T40 T51 T49

T52 P1 T55 T42 T56 T51 T44 T41 T52 T35

T53 T47 S T34 T37 T45 T48 T37 T53 T43

T54 T39 T38 T40 T48 T31 P2 T42 T54 T37

T55 T52 T58 P1 T40 T38 T32 P1 T55 T31

T56 T48 T47 T46 T31 T56 T47 T35 T56 T58

T57 T36 T37 T32 T50 T53 T42 P3 T57 T41

T58 T59 T57 T48 T51 T40 T31 T52 T58 T38

T59 S T31 T44 S P3 T46 T54 T59 T42

T60 T45 T48 T35 T52 T37 T35 T51 T60 T57

P1 T60 P2 T45 T46 T48 T51 T56 P1 T32

P2 T35 T40 T52 T53 T58 T41 T53 P2 T39

P3 T40 T36 T41 T39 T34 T40 T39 P3 T33

S T33 T60 T60 T47 T35 T49 T57 S T48

80

8.3 Apéndice 3. Distribución aleatoria de los clone s en el ensayo Natalhue, con

códigos de terreno

PARCELAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

C1 C3 C37 C43 T24 T4 T26 C28 T21 C10

C2 C37 C6 T8 C20 C20 C6 T3 C2 C23

C3 T19 C1 T21 C43 T7 T29 C21 C45 T4

C4 C29 T24 T29 T1 C38 C13 T10 C5 T12

C5 T25 T15 C1 C34 C44 C39 C47 T24 C38

C6 C36 C48 C17 C19 C46 C36 C46 C7 T5

C7 T5 C28 T7 C4 C17 C18 C20 T28 T10

C8 C7 T25 P1 T27 C36 C7 C8 T8 C30

C9 T15 T6 C36 C45 C43 C29 T1 T15 C53

C10 C51 C50 C28 C53 C14 C22 C44 C8 C27

C11 C27 T1 C4 T3 T20 C40 C12 T22 T22

C12 T17 C39 S C21 C31 C35 C33 C30 C20

C13 T21 C43 C53 C5 T1 T10 C16 T29 T23

C14 T2 C16 C8 C13 C34 T16 T6 C33 C15

C15 C45 C34 T2 C50 C12 T30 C19 C4 C1

C16 T10 C8 C31 T6 C41 C8 C11 C21 C52

C17 C46 C45 T16 T7 T26 C43 P1 C10 C29

C18 C13 C54 C45 C25 C1 C49 T25 C28 C37

C19 T24 P3 C50 C18 T2 C9 C7 T10 C28

C20 T12 C51 T19 S C23 C24 T29 C6 C7

CLO

NE

S

C21 C41 C31 C7 C3 C16 C31 C14 T7 T16

C22 T23 C40 C14 C52 P2 T19 C50 C38 C5

C23 P3 T21 C15 C6 T25 P3 C39 T1 P3

C24 C42 T28 T6 T20 C8 T7 T13 C51 T3

C25 C30 C4 C48 T21 C5 C23 T2 C48 C8

C26 P1 C42 C2 T9 T19 T21 C26 C15 T19

C27 C6 C32 T24 T28 T28 C15 C49 C39 T21

C28 C22 T30 C26 C15 C40 T17 T23 C32 T1

C29 C48 T29 C37 P1 C6 C37 T21 T5 T9

C30 T30 T12 T14 C9 C29 C26 C48 C1 C14

C31 T22 P1 T15 C30 T29 C44 C54 C16 C41

C32 C47 T17 C35 C33 C52 C25 C10 C27 T8

C33 T27 C53 T9 P2 C24 C45 C4 C23 C32

C34 T28 C20 C39 T15 T9 T27 C1 C37 C45 C35 C44 T7 T27 C35 T24 P1 C29 C25 C49 C36 C49 C9 T1 T26 C39 T15 T22 C13 C35 C37 S C15 T28 C24 T5 C42 P2 P2 C46 C38 T18 T3 C3 C7 C19 C46 C9 T14 T14 C39 T14 C7 C52 C27 C35 T2 T28 T27 T7 C40 C10 T11 T5 T22 C49 T22 C53 C34 C12 C41 C32 C33 C40 C40 C33 C50 T7 T20 T30 C42 C23 C36 C42 C48 T21 C38 T16 T4 T26 C43 C26 T10 T26 T30 T13 C33 C17 T6 C19 C44 C14 C23 T22 T8 C25 C20 C41 C49 C43 C45 C19 T20 C46 C1 C11 C28 C3 C19 C16 C46 C38 C12 C16 C26 C48 C14 T14 C26 C13 C47 T3 T9 C54 C8 C42 C30 C31 C41 C11 C48 C34 T5 C38 T16 T3 C19 T30 C29 C42 C49 C24 T2 C21 C14 T12 C16 C42 P1 T11 C50 C11 T22 C20 C16 C10 C2 C52 T9 T24 C51 C12 T8 T20 C10 C51 C17 T8 C53 C33 C52 C1 C35 T3 C28 T15 T14 C22 S C39 C53 C43 C30 T23 C11 C45 C11 C25 C54 C2

81

PARCELAS (continuación) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

C54 T26 C52 T13 T4 C37 T24 C23 C20 P2 T1 C21 C22 T4 T19 C21 C5 C40 C31 C47 T2 C5 C41 C12 C37 T17 C12 C51 C50 T28 T3 C20 P2 T12 T2 C27 C32 C2 T13 T27 T4 C52 T23 C33 T12 C4 T3 C37 C18 C34 T5 C16 C24 T17 C23 C2 T23 C6 C43 C9 T6 C39 C17 C23 T13 C32 C51 C24 C9 C50 T7 T13 C29 C11 T11 C53 T9 T17 C24 C31 T8 T6 C14 C34 C29 T30 C53 T9 C42 C25 T9 C25 C10 T30 C49 C9 T5 P3 P3 C24 T10 C28 C38 T11 P3 C7 C34 C38 C14 C22

T11 T29 C26 C24 T14 T11 C21 T20 T3 P1 T12 T8 C25 C9 T17 C50 C54 C34 C22 T6 T13 T1 T27 C29 C46 T22 C3 C30 C44 C36 T14 T20 C13 C44 C32 C22 C47 C43 T11 C51 T15 T7 T19 C27 C36 C13 C10 T26 C40 C18 T16 C8 C46 C18 C12 C15 P2 C35 C46 T29 T17 P2 C49 C19 C17 C30 S S C35 C21 T18 C9 C47 C22 C44 T6 T1 T24 T2 C54 T19 C17 T4 C30 T29 C3 C1 C36 T18 S

CLO

NE

S

T20 C2 C5 C25 T23 P3 C4 C45 T25 C26 T21 C18 C27 C5 C47 T18 T28 T12 T23 C17 T22 T4 T14 C10 T18 T8 T25 T4 C3 C3 T23 C53 C18 P2 T25 C18 T6 C15 T17 T13 T24 C15 C11 C47 C39 C54 T4 C27 T26 C6 T25 C31 T13 C41 C22 S T11 C5 C36 C44 T26 C4 T18 T25 C31 C47 C41 C13 T16 T17 T27 T9 T16 C6 C2 T10 T12 C32 T19 T18 T28 C33 C3 P3 C41 P1 C48 C18 C12 C4 T29 C40 C21 T18 C42 T27 T8 T19 T30 T15 T30 C35 C2 T10 C54 C26 T13 T5 C11 T20 P1 T11 C19 C51 C51 T23 C27 T15 C17 T25 P2 T16 S C32 T5 T14 T20 T27 T12 T2 P3 C50 T26 C49 C38 C28 T18 T11 C52 C40 S C54 C44 C13 T10 T16 C52 T18 C47 C48

82

8.4 Apéndice 4. Protocolo de extracción de DNA para secuoya

i. Pesar aproximadamente 300 mg de tejido vegetal (hojas).

ii. Añadir 900 ul de Buffer TENC (100 mM de Tris, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% de CTAB, 0,3% mercaptoetanol) precalentado a 60°C con PVP al 1%.

iii. Incubar a 60°C por 1 hora, mezclar por inversi ón a los 30 min.

iv. Remover del baño, enfriar a TA y añadir 500 ul de cloroformo-octanol (24:1), mezclar por inversión.

v. Centrifugar a 6.000 rpm por 5 minutos.

vi. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.

vii. Agregar 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3M. Mezclar y agregar 2 volúmenes de etanol 95% a –20°C, mezclar por inversión. Dejar a –20°C por una hora.

viii. Centrifugar a 3.000 rpm por 5 minutos.

ix. Vaciar el sobrenadante.

x. Dejar secar el pellet, disolver el DNA en 200 ul de TE (Tris 10mM EDTA 1mM pH 8), resuspender 15 minutos a 37°C.

xi. Agregar 300 ul de cloroformo- alcohol isoamílico a cada tubo. Dar Vortex brevemente para homogenizar.

xii. Centrifugar a 10.000 rpm por 10 minutos. Colectar la capa superior y colocarla en un tubo nuevo.

xiii. Agregar 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol a 95%. Colocar a –20 °C por 1 hora.

xiv. Centrifugar a 13.000 rpm por 10 minutos. Desechar el etanol y lavar el pellet con etanol al 70%, dejar secar.

xv. Resuspender en TE.

xvi. Incubar con RNAsa a 37°C por 1 hora.

TRATAMIENTO CON LiCl 8M

a. Calentar los DNAs resuspendidos en 300 ul de TE, durante una hora a 60°C.

b. Sacar del baño y añadir ½ Vol de LiCl 8M.

c. Dejar una hora a TA.

d. Añadir 1 volumen de etanol 95% a –20°C.

e. Dejar a –20°C durante 30 minutos.

f. Centrifugar 20 minutos a 13.000 rpm.

g. Dejar secar y resuspender en 50ul de TE.

83

8.5 Apéndice 5. Tablas ANDEVA para la muestra aleat oria, ensayo Voipir

Índice de Biomasa -DAC2*H-

Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 2.449.474,03 9 272.163,781 5,578 0,00001

Bloques 1.316.193,47 9 146.243,719

Error 3.951.941,27 81 48.789,398

Total 7.717.608,77 99

Diámetro a la Altura del Cuello (DAC)


Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 3,36 9 0,373 6,14 0,000002

Bloques 2,51 9 0,279

Error 4,92 81 0,061

Total 10,79 99

Altura


Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 11.853,76 9 1.317,084 5,300 0,000011

Bloques 14.300,20 9 1.588,911

Error 20.127,91 81 248,493

Total 46.281,86 99

84

8.6 Apéndice 6. Tablas ANDEVA de la selección de lo s 10 clones con mejor

rendimiento, ensayo Voipir



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 2.369.800,97 9 263.311,21 2,339 0,02128

Bloques 3.753.631,69 9 417.070,18

Error 9.118.051,66 81 112.568,53

Total 15.241.484,32 99



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 1,27 9 0,141 1,549 0,14497

Bloques 5,54 9 0,616

Error 7,35 81 0,091

Total 14,16 99

Altura


Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 3.317,81 9 368,645 1,066 0,39650

Bloques 27.579,11 9 3.064,345

Error 28.003,10 81 345,717

Total 58.900,02 99

85

8.7 Apéndice 7. Tablas ANDEVA para la muestra aleat oria de los condados de

California, ensayo Natalhue



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 672.709 6 112.118 1,56 0,183341

Error 3.021.996 42 71.952

Total 3.694.705 48



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 1,75 6 0,291 1,423 0,22863

Error 8,60 42 0,205

Total 10,35 48

Altura


Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 5.863,09 6 977.181 1,226 0,31256

Error 33.483,60 42 797.229

Total 39.346,69 48

86

8.8 Apéndice 8. Tablas ANDEVA para la muestra aleat oria en el condado

Humboldt (California, EE.UU.), ensayo Natalhue



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 21.158.926 9 2.350.992 6,96 0,000001

Error 20.596.443 61 337.647

Total 41.755.369



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 17,75 9 1,97 4,08 0,000391

Error 29,51 61 0,48

Total 47,26

Altura


Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 22.985 9 2.554 3,44 0,002

Error 45.276 61 742

Total 68.261

87

8.9 Apéndice 9. Tablas ANDEVA de la selección de lo s 10 clones con mejor

rendimiento, ensayo Natalhue



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 4.954.444 9 550.494 0,41 0,926264

Error 108.707.296 81 1.342.065

Total 113.661.740 90



Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 3,13 9 0,348 0,595 0,79729

Error 44,98 77 0,584

Total 48,11 86

Altura


Suma de cuadrados

Grados de libertad

Media cuadrados

F Significación

Tratamientos 3.948,01 9 438,66 0,455 0,89984

Error 72.302,68 75 964,03

Total 76.250,69 84

88

8.10 Apéndice 10. Intervalos de confianza para la m edia del incremento producido

en el periodo 2003-2005, ensayo Natalhue

Muestra aleatoria de siete clones, donde cada condado está representado por un clon,

ensayo Natalhue.

Índice de Biomasa -DAC2H- (cm 3)

Intervalo de confianza al 95%. Clon Media Error Típico

Límite inferior Límite superior

D-04-6 372,6 94,8 181,2 564,0

M-07-1 516,2 89,4 335,7 696,6

N-02-1 159,5 120,0 - 82,6 401,6

RB-12-28-18 247,5 101,4 42,9 452,1

S-05-1 307,9 109,5 86,9 528,9

Y-03-4 504,4 109,5 283,4 725,4

Z-02-6 308,3 94,8 116,9 499,7

Diámetro a la altura del Cuello -DAC- (cm)



D-04-6 1,23 0,16 0,90 1,55

M-07-1 1,14 0,15 0,84 1,45

N-02-1 0,72 0,20 0,31 1,13

RB-12-28-18 0,90 0,17 0,55 1,25

S-05-1 1,17 0,18 0,79 1,54

Y-03-4 1,38 0,18 1,01 1,76

Z-02-6 1,23 0,16 0,90 1,55

Altura (cm)



D-04-6 65,2 10,0 45,0 85,3

M-07-1 60,0 9,4 41,0 79,0

N-02-1 40,1 12,6 14,6 65,6

RB-12-28-18 36,1 10,7 14,6 57,6

S-05-1 55,0 11,5 31,8 78,3

Y-03-4 69,2 11,5 45,9 92,4

Z-02-6 54,5 10,0 34,3 74,6

89



Muestra aleatoria de 10 clones del condado de Humboldt, ensayo Natalhue.

Índice de Biomasa -DAC2H- (cm 3)


Límite inferior Límite superior H-07-3 617 220 178 1056 H-08-1 268 220 -171 708

RB-12-28-18 248 220 -192 687 RB-14-5 407 260 -113 927

RB12-28-5 318 220 -121 758 RB2-238-19 1780 205 1369 2191

RB22RB2-007 490 194 103 877 RB54-215-3 1417 184 1049 1784 RB75-58-26 289 260 -230 809 RB75-58-6 241 237 -233 715



Límite inferior Límite superior H-07-3 1,44 0,26 0,92 1,97 H-08-1 1,07 0,26 0,55 1,60

RB-12-28-18 0,90 0,26 0,37 1,43 RB-14-5 1,32 0,31 0,70 1,94

RB12-28-5 1,23 0,26 0,70 1,75 RB2-238-19 2,50 0,25 2,01 2,99

RB22RB2-007 1,30 0,23 0,84 1,76 RB54-215-3 2,08 0,22 1,64 2,52 RB75-58-26 1,16 0,31 0,54 1,78 RB75-58-6 1,08 0,28 0,52 1,65

Altura (cm)


Límite inferior Límite superior H-07-3 61.4 10.3 40.8 82.0 H-08-1 44.6 10.3 24.1 65.2

RB-12-28-18 36.1 10.3 15.5 56.7 RB-14-5 33.3 12.2 8.9 57.7

RB12-28-5 45.1 10.3 24.5 65.7 RB2-238-19 83.1 9.6 63.8 102.4

RB22RB2-007 58.2 9.1 40.0 76.3 RB54-215-3 85.3 8.6 68.1 102.5 RB75-58-26 56.9 12.2 32.5 81.2 RB75-58-6 41.4 11.1 19.1 63.6

90



Selección de los 10 mejores resultados por variable, ensayo Natalhue.

Índice de Biomasa –DAC2H- (cm3)


Límite inferior Límite superior RB19-148-18 1.565,4 386,2 797,1 2.333,8 RB19-148-20 1.198,6 386,2 430,3 1.966,9 RB19-148-9 1.341,9 366,3 613,0 2.070,8 RB2-238-13 1.685,5 366,3 956,5 2.414,4 RB2-238-19 1.779,7 409,6 964,8 2.594,6

RB37RB5-000 1.160,6 472,9 219,6 2.101,6 RB54-214-28 1.679,9 366,3 950,9 2.408,8 RB54-215-3 1.416,8 366,3 687,9 2.145,7

RB54-225-24 1.172,9 386,2 404,5 1.941,2 RB54-225-3 1.121,1 366,3 392,2 1.850,0


Intervalo de confianza al 95%. Clon Media Error Típico Límite inferior Límite superior

H-10-4 2,04 0,29 1,47 2,62 H-13-3 2,04 0,29 1,47 2,62

RB19-148-18 1,99 0,25 1,48 2,50 RB2-238-13 2,15 0,24 1,67 2,63 RB2-238-19 2,50 0,27 1,96 3,04

RB54-214-28 2,48 0,24 2,00 2,96 RB54-215-3 2,08 0,24 1,60 2,56 RB54-215-6 1,95 0,27 1,41 2,49 RB54-225-3 2,03 0,24 1,55 2,51

Y-08-2 2,00 0,27 1,46 2,54

Altura (cm)

Intervalo de confianza al 95%. Clon Media Error Típico Límite inferior Límite superior

H-13-3 82,9 11,7 59,5 106,2 N-03-2 85,7 11,7 62,3 109,0

RB19-148-18 103,4 10,3 82,8 124,0 RB19-148-20 85,0 10,3 64,3 105,6 RB19-148-9 97,5 9,8 78,0 117,1

RB19-6 91,9 10,3 71,2 112,5 RB2-238-19 83,1 11,0 61,2 105,0

RB37RB5-000 81,3 12,7 56,0 106,5 RB54-214-28 87,8 9,8 68,3 107,4 RB54-215-3 85,3 9,8 65,7 104,8

91

8.13 Apéndice 13. Tablas ANDEVA, evaluación entre l os ensayos Voipir y Natalhue


Fuente de variación Suma de cuadrados

Grados de libertad Media cuadrados F

Bloques 2.312.297 9 256.921

Tratamientos

Clon 974.937 3 324.979 1,34

Sitios 3.368.021 1 3.368.021 13,93

Interacción

Clon-Sitio 1.267.869 3 422.623 1,75

Error 15.230.523 63 241.754

Total 23.153.649 79




Bloques 2,46 9 0,27 0,81

Tratamientos

Clon 0,95 3 0,32 0,93

Sitios 9,48 1 9,48 27,98

Interacción

Clon-Sitio 1,28 3 0,43 1,26

Error 21,34 63 0,34

Total 35,51 79

Altura



Bloques 3.233 9 359 0,553

Tratamientos

Clon 556 3 185 0,285

Sitios 20 1 20 0,031

Interacción

Clon-Sitio 189 3 63 0,097

Error 40.966 63 650

Total 44.964 79

92

8.14 Apéndice 14. Tamaño de fragmentos amplificado s mediante RAPDs,

utilizando los 5 partidores seleccionados

Partidores

Código de laboratorio

BF07 (bp) BF13 (bp) BF12 (bp) BF14 (bp) BG04 (bp)

S1 650 2300-1900-1700-1400-1300-1100-

950-850-650

1400-1300- 1200-1031-

800-700

1500-1100- 1031-950- 850-700

1300-1200

S2 1500-950- 650

2300-1400- 1200-950-

850-700-650

1600-1400-1300-1200-1100-950-

800-700

1500-1300- 1031-800

950-850

S3 1500-1200- 950

2300-1400-1300-1100-950-850-750-700-650

1600-1300- 1200-1100-

1031-800-700

1500-1300- 1100-1031-

900-850-700

1300-1200- 850

S4 1500-1200- 950

2300-1400-1200-850-750-450

1600-1400- 1300-1200-

800-700

1300-900- 850-700

1200-950- 850-550

S5 1500-1200- 950-500

2300-1400-1300-1200-1100-

950-850

1600-1400- 1300-1200-

950-800-700

1500-1300- 1031-850-

700

1300-1200- 950-850-

550

S6 1500-700-650 2300-1700- 1400-1200

1300-1100- 800-700-

600

1500-1100- 900-850-

700

1300-1200- 950

S7 1500-950 2300-1900- 1500-1200-

950-850

1600-1400- 1300-1200-

950-800-700

1500-1300- 1100-1031-

850-700

1300-1200- 950-850-

550

S8 1500-950 2300-1700- 1400-1200- 1100-750

1600-1400-1300-1200-1100-1031-

950-800-700

1031-900- 850-700

1300-1200- 950-850

S9 1500-1200- 950

1200-1100-750-650-550

1600-1400-1300-1200-1100-1031-

800-700

1500-1300- 1031-900- 850-700

1300-1200- 950-850-

550

S10 1500-950- 700

2300-1400- 1200-850-

350

1600-1400-1300-1200-1100-950-

800-700

1300-1031- 950-900-

700

1700-1200- 850-700-

450

93

8.15 Apéndice 15. Datos selección de clones para el análisis molecular

Clones Enraizamiento,

en vivero (%)

Clones

Ápice líder, en terreno

(%)

Clones Supervivencia,

en terreno (%)

PLUS C 65 PLUS B 100 PLUS B 100 COMERCIAL 57 RB19-148-26 100 RB19-148-26 100

PLUS A 47 RB12-28-23 100 RB2-238-18 100 PLUS B 37 RB54-224-27 100 RB2-238-16 100

RB-236-10 35 RB31L-38-19 100 RB54-225-14 100 RB2-238-16 35 RB2-238-18 100 RB19 100 RB2-236-15 34 RB2-236-18 100 RB54-225-17 100 RB2-236-18 25 RB2-238-16 100 RB54-225-19 100 RB19-148-24 22 RB-236-10 100 RB54 100 RB3-57-77-7 20 RB3-57-77-7 100 PLUS C 98 RB2-238-18 19 RB19-148-24 100 RB18L-109-2 98 RB54-225-14 18 RB54-225-14 100 RB54-225-10 98 RB2-238-17 18 RB19 100 RB31L-38-19 98 RB54-225-17 13 RB54-225-17 100 RB2-236-18 98 RB54-225-10 12 RB54-225-19 100 RB3-57-77-7 98 RB19-148-23 12 RB54-225-12 100 RB54-225-11 98 RB54-225-19 12 RB54 100 RB19-148-24 98

RC5 11 RB54-225-19 100 RC5 98 RB54-224-27 10 PLUS A 98 RB54-225-12 98 RB54-214-29 10 PLUS C 98 RB2-238-17 96 RB19-148-26 6 COMERCIAL 98 RB2-236-14 96

RB19 4 RB2-238-17 98 RB12-28-23 96 RB54-225-12 4 RB18L-109-2 98 RB54-224-27 96 RB12-28-23 3 RB54-225-10 98 RB-236-10 96 RB18L-109-2 3 RB54-225-11 98 RB54-225-19 96 RC18L-109-7 3 RC5 98 PLUS A 94 RB54-225-11 1 RB2-236-14 96 COMERCIAL 94 RB2-236-14 1 RB54-214-29 96 RC18L-109-7 94 RB12-28-12 - RB75-58-14 96 RB54-214-29 94 RB54-225-13 - RC18L-109-7 94 RB75-58-14 94

RB54 - RB12-28-12 94 RB12-28-12 94 RB54-225-19 - RB54-225-13 90 RB54-225-13 74 RB31L-38-19 - RB2-236-15 88 RB2-236-15 74

RB75-58-14 - RB19-148-23 86 RB19-148-23 64

94

8.16 Apéndice 16. Datos de Terreno, ensayo Voipir

Año 2003

BLOQUE 1 Planta 1 Planta 2 Planta 3 Planta 4 Planta 5

Clones Dac Alt Dac Alt Dac Alt Dac Alt Dac Alt

Plus A 0,98 83 0,6 52 0,49 33 0,71 74 0,97 70 Plus B 1,06 86 0,51 39 0,84 48 0,9 64 0,39 36 Plus C 0,6 28 0,34 34 0,49 26 0,59 41 0,85 40

COMERCIAL 0,66 32 0,41 29 0,46 44 0,6 55 0,84 67 RB2-238-17 0,41 30 0,66 16 0,62 27 0,61 15 0,65 19

RB19-148-26 0,81 39 0,81 42 0,97 30 0,86 50 0,81 40 RB2-236-14 0,65 15 0,81 40 0,62 36 0,5 39 0,44 37 RB12-28-23 0,52 30 0,7 35 0,58 37 0,57 36 1,03 56

RC18L-109-7 0,45 32 0,47 10 0,68 33 0,51 42 0,5 27 RB54-214-29 0,49 19 0,68 23 0,44 30 0,64 66 0,67 20 RB75-58-14 0,56 20 0,52 46 0,52 33 0,61 15 0,77 47

RB18L-109-2 0,62 28 0,41 15 0,44 21 0,84 42 0,69 31 RB54-224-27 0,8 40 0,69 51 0,63 40 0,68 49 0,88 50 RB54-225-10 0,64 36 0,77 47 0,76 50 0,68 35 0,77 22 RB31L-38-19 0,51 28 0,6 25 0,61 36 0,47 20 0,63 29 RB2-238-18 0,72 39 0,76 25 0,98 47 0,6 35 0,81 43 RB2-236-18 0,61 31 0,6 27 0,62 35 0,61 48 0,62 38 RB2-238-16 0,4 20 0,37 14 0,48 21 0,58 36 0,48 36 RB-236-10 0,62 19 0,67 19 0,61 40 0,8 42 0,69 42

RB12-28-12 0,45 13 0,61 20 0,43 17 0,53 35 0,5 25 RB3-57-77-7 1,23 42 0,83 63 0,81 57 1,08 66 1,12 17 RB54-225-11 1,06 45 1,82 46 0,86 52 0,74 42 0,68 37 RB19-148-24 0,71 38 0,53 24 0,55 18 0,64 28 0,64 28

RC5 0,61 58 1,16 50 0,99 76 0,86 29 0,96 20 RB54-225-14 0,96 16 0,79 40 0,67 25 0,84 38 0,59 40

RB19 0,73 40 0,95 48 0,7 45 0,87 43 0,76 54 RB19-148-23 0,37 16 0,39 20 0,61 26 0,25 14 0,5 10 RB54-225-17 0,79 52 0,85 20 0,57 45 0,92 64 1,08 60 RB54-225-19 0,86 44 0,68 20 0,75 58 0,8 18 0,7 52 RB54-225-13 0,47 6 0,46 25 0,32 12 0,5 14 0,46 14 RB54-225-12 1,38 100 1,2 62 1,11 75 0,94 48 1,03 58

RB54 0,8 50 0,7 66 0,72 50 0,92 60 0,82 66 RB2-236-15 0,71 25 0,62 16 0,34 52 0,59 27 0,4 22

RB54-225-19 0,73 35 0,55 45 0,94 72 1,27 76 0,68 50

Esta tabla muestra sólo un bloque de la primera medición en el año 2003. La información

completa se encuentra disponible con el director del proyecto FONDEF D01 I 1008, Sr.

Manuel Toral I.

95

8.17 Apéndice 17. Datos de Terreno, ensayo Natalhue

Año 2003

Parcela 1 Planta 1 Planta 2 Planta 3 Planta 4 Planta 5

Procedencia Dac Alt Dac Alt Dac Alt Dac Alt Dac Alt

D-03-5 1,04 38 0,64 8 0,67 47 0,95 49 0,6 51

M-08-2 0.23 29 0.19 23 0.1 20 0.26 20 0.3 33 M-17-2 0.57 70 X X 0.47 47 0.61 63 X X N-02-1 0.5 47 0.36 33 0.32 30 0.19 13 X X N-03-2 X X X X X X 0.42 31 0.39 24 N-05-2 X X 0.53 54 0.57 62 X X 0.5 69 RB19-6 0.39 47 0.55 34 0.43 45 0.28 29 0.43 35

RB22RB2-007 0.78 83 X X 0.8 58 0.31 22 X X S-03-2 0.17 11 0.2 18 0.2 19 X X 0.17 10 Y-03-4 0.39 19 0.4 14 X X X X 0.53 49 Y-08-1 X X 0.36 41 0.4 58 0.2 13 X X D-06-4 0.73 35 0.76 28 0.61 40 0.9 22 0.72 50 D-04-6 0.74 70 0.34 27 0.21 17 0.22 22 X X H-02-3 0.55 51 X X 0.29 25 0.36 41 0.36 47 H-10-4 0.2 15 0.25 19 0.47 50 0.27 23 0.2 14 H-11-5 X X 0.28 15 X X 0.32 29 X X M-06-1 X X X X 0.28 13 0.47 28 0,32 20

RB17RB9-011 0,12 16 0,26 33 0,4 55 0,35 47 0,68 5 RB37RB5-000 0,19 9 0,16 13 0,22 34 0,18 9 0,13 18

RB41RB46-020 0,2 22 X X 0,49 59 X X 0,13 12 Y-01-2 0,25 13 0,35 31 0,18 19 0,29 42 0,2 23 Y-08-2 0,41 47 0,39 11 0,51 42 0,3 35 0,24 26 H-02-5 0,5 23 0,39 34 0,45 18 0,83 5 X X H-06-4 0,55 44 0,56 52 0,72 69 X X 0,16 15 H-07-3 0,12 12 0,33 44 0,25 28 X X 0,14 15 N-03-4 0,44 50 0,32 33 0,48 38 0,19 5 0,21 19 H-09-5 0,3 19 0,19 14 0,24 14 0,15 8 0,16 16 H-13-3 0,22 6 0,55 59 0,5 57 0,3 34 0,58 61 H-17-2 0,59 55 0,35 49 0,2 16 0,54 57 0,32 43 H-20-1 0,25 30 0,5 47 0,34 43 0,22 17 0,18 8 M-19-1 0,31 16 0,2 23 X X 0,19 9 0,55 55

RB22RB2-010 0,22 18 0,34 18 0,16 14 0,32 16 0,23 12 S-01-1 0,33 33 0,49 52 X X 0,42 40 0,46 45 H-08-1 0,66 22 0,47 14 0,56 33 0,54 7 0,48 9 S-01-2 0,31 43 0,25 23 0,4 43 0,3 43 0,43 51 S-04-2 0,46 57 0,7 74 0,55 65 0,26 20 0,4 45 Y-03-6 0,39 43 0,4 49 0,85 61 0,36 58 0,2 15 Y-06-4 0,47 46 0,55 48 0,65 68 0,4 40 0,2 28 Z-02-6 0,52 40 0,1 18 0,57 53 0,23 21 0,21 21 M-12-1 0,4 37 0,7 54 0,46 47 0,58 20 0,26 31 N-02-2 0,71 48 0,31 40 0,43 43 0,47 65 0,47 33 S-03-1 0,46 41 0,31 26 0,41 32 0,59 21 0,49 42 S-05-1 0,76 17 0,37 20 0,16 30 0,45 49 0,6 36 H-16-2 0,74 24 0,28 50 0,9 35 0,38 50 0,46 53 H-08-3 0,66 67 X X 0,54 22 0,21 17 0,55 20

96

Parcela 1 (continuación) Planta 1 Planta 2 Planta 3 Planta 4 Planta 5

Procedencia Dac Alt Dac Alt Dac Alt Dac Alt Dac Alt

M-15-1 0,57 42 0,68 57 0,82 18 0,44 23 0,24 40 M-18-1 0,66 45 0,45 45 0,49 29 0,52 46 0,7 38

RB17RB9-012 0,53 37 0,64 30 0,53 52 0,55 34 0,44 15 RB54-7 0,55 33 0,71 39 0,64 48 0,52 45 0,73 65 Y-05-4 0,84 41 0,49 43 0,92 39 0,94 50 0,82 54 H-09-4 0,18 19 0,58 53 0,33 34 0,18 17 0,28 40 H-11-3 0,26 24 0,45 39 0,29 18 0,31 31 0,1 4 M-06-2 X X 0,25 23 0,44 5 0,2 43 0,37 20 M-07-1 0,79 9 X X 0,23 32 0,21 17 X X PLUS A 0,49 44 X X 0,61 22 0,5 21 0,41 22 PLUS B 0,68 38 0,74 58 0,64 40 0,52 15 0,56 43 PLUS C 0,72 47 0,53 57 0,98 76 0,94 17 0,74 43

COMERCIAL 0,48 44 0,44 9 0,44 28 0,6 58 0,45 24 RB12-26 X X 0,36 39 0,37 14 0,63 7 X X

RB3-31-21 0,66 25 0,4 9 0,5 44 0,55 37 0,42 20 RB12-28-5 0,45 33 0,48 18 0,6 26 0,4 17 0,55 19 RB3-56-9 0,64 22 0,41 12 0,68 51 0,62 27 0,45 13

RB54-215-6 0,78 53 0,58 60 0,57 25 0,45 37 0,55 26 RB31L-38-20 0,8 38 0,64 24 0,55 30 0,66 64 0,58 52 RB19-148-20 0,42 12 X X 0,79 35 0,83 50 0,53 53 RB75-58-16 0,72 52 0,74 43 0,48 10 0,67 50 0,48 45 RB54-215-7 0,79 74 0,64 60 0,54 47 0,51 31 0,1 70 RB75-58-26 0,44 44 0,46 8 0,63 34 0,44 29 0,45 26 RB19-148-19 0,99 35 0,79 57 0,8 60 0,49 49 0,82 51

RB31L-26 0,49 47 0,4 36 0,38 10 X X 0,46 8 RB75-58-24 0,45 37 0,65 32 0,31 33 0,53 28 0,49 14 RB19-148-9 0,7 50 0,57 40 0,59 47 0,72 40 0,98 71 RB54-215-3 0,8 74 0,79 69 0,73 16 0,74 66 0,78 39 RB54-225-24 0,72 65 0,63 64 0,74 68 0,71 64 0,79 46 RC18L-109-8 1,2 7 0,8 40 0,8 68 0,55 48 X X RB2-238-13 0,58 14 0,59 44 0,61 74 0,39 54 0,58 20 RB54-214-30 0,76 52 0,39 14 0,62 20 0,32 37 0,69 21 RB54-225-3 0,66 63 0,53 22 0,62 75 0,71 69 0,54 56 RB31L-28-11 0,58 43 0,6 8 0,61 7 0,8 27 X X RB54-214-28 X X X X 0,69 43 0,53 30 0,69 34 RB31L-14-6 0,37 30 0,42 18 0,44 21 0,31 32 0,15 14 RB2-238-19 0,63 23 0,94 21 0,54 36 0,97 29 0,7 29 RB75-58-6 0,55 26 X X X X X X 0,41 10 RB-14-5 0,5 32 0,27 32 0,71 28 0,54 34 0,39 11

RB12-27-9 0,42 15 0,44 51 0,41 16 0,46 10 X X RB-12-28-18 0,5 30 0,5 33 0,42 45 0,49 37 0,29 27 RB18L-109-9 0,48 14 0,82 45 0,64 57 0,58 48 0,69 29

RB19-148-18 0,59 54 0,76 34 0,72 15 0,57 45 0,44 39

X: planta muerta.

Esta tabla muestra sólo una parcela de la primera medición. La información completa se

encuentra disponible con el director del proyecto FONDEF D01 I 1008, Sr. Manuel Toral I.

97

8.18 Apéndice 18. Fotografías en terreno de cada un a de las etapas de la

evaluación, desde establecimiento hasta la toma de datos.

(a)

(b)

(c)

Figura 8.18.1. (a) Etiquetado de plantas (b) Descargue de plantas en terreno -julio

2002-. (c) Disposición de las plantas en hoyadura para establecimiento.

98

(a)

(b)

Figura 8.18.2. Hoyadura ensayo Natalhue, Julio 2002. (a) sector plano. (b) sector con

pendiente.

99

(a)

(b)

Figura 8.18.3. Ensayo Natalhue. (a) Hoyadura terminada -julio 2002-. (b) Plantación a

los tres años -marzo 2005-.

100

(a)

(b)

Figura 8.18.4. Ensayo Voipir. (a) Hoyadura terminada -julio 2002-. (b) Plantación a

los tres años -marzo 2005-.

101

(a)

(b)

Figura 8.18.5. Medición de ensayos. (a) Medición de altura -con huincha graduada-.

(b) Medición de altura y Diámetro a la Altura del Cuello -con pie de metro-.

102

9 ANEXOS

9.1 Ubicación geográfica de los clones probados en el ensayo Voipir.

Fuente: Confección personal. Con datos de Forestal Simpson -Korbel-Arcata-California,

2002.

103

9.2 Anexo 2. Ubicación geográfica de los clones pro bados en el ensayo Natalhue.

Fuente: Confección personal. Con datos de Forestal Simpson -Korbel-Arcata-California,

2002.

104

9.3 Anexo 3. Material genético por Localidad, Repr oducción y Fecha de

recolección

Código Terreno

Código Original Clon Localidad Latitud Nº,

(HN) Longitud O°, (HN)

Altitud (m) Origen Recolectado

por Fecha de Colecta

C1 D-03-5 Del Norte Co., Ca French Hill Rd. 41º49' 123º56' 686 Semillas J. Kuser 04-12-

1984

C2 D-04-6 Del Norte Co., Ca Cresent City 41°43’ 124°07’ 183 Semillas J. Kuser 12-04-

1984

C3 H-02-5 Humboldt Co., Ca. Cappel Creek 41º17' 123º49' 91 Cultivo

de tejido J. Kuser y M.

Bacca, Simpson 11-02-1984

C4 H-08-1 Humboldt Co., Ca. Tall Trees, Redw. Cr 41º13' 123º01' 30 Cultivo

de tejido J. Kuser y J.

Lenihan, NPS 01-02-1984

C5 H-08-3 Humboldt Co., Ca. Tall trees, redw. Cr

41º15' 123º59' 579 Semillas J. Kuser y J. Lenihan, NPS

01-02-1984

C6 H-09-4 Humboldt Co., Ca. Mad River, S. Fk. 40º51' 123º57' 122 Semillas

J. Kuser y A. Skauset, Simpson

22-06-1984

C7 H-11-3 Humboldt Co., Ca. Freshwater 40º45' 124º03' 30 Semillas J. Kuser 30-01-

1984

C8 M-06-2 Mendocino Co., Ca. Navarro River 39º10' 123º39' 18 Semillas J. Kuser 24-03-

1984

C9 M-07-1 Mendocino Co., Ca. Hendy S. P. 39º05' 123º29' 91 Semillas J. Kuser 24-03-

1984

C10 M-08-2 Mendocino Co., Ca. Gualala Peak 38º51' 123º30' 427 Semillas J. Kuser 24-03-

1984

C11 M-17-2 Mendocino Co., Ca. Comptche 39º15' 123º33' 244 Semillas J. Kuser 07-06-

1984

C12 N-02-1 Napa Co., Ca. Ink Grade 38º36' 122º27' 488 Semillas A. Franclet, AFOCEL

11-84

C13 N-03-2 Napa Co., Ca. Napa (W) Blue Clone 38º19' 122º21' 85 Semillas J. Kuser, W.

Lobby y L. Krch 05-04-1984

C14 N-05-2 Napa Co., Ca. Napa (E) Blue Clone 38º21' 122º14' 140 Semillas J. Kuser y Pete

Imboden 01-06-1984

C15 RB19-6 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984

C16 RB22RB2-007 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984

C17 S-03-2 Sonoma Co., Ca. Warm Springs Cr. 38º41' 123º07’ 305 Semillas J. Kuser 23-03-

1984

C18 Y-03-4 Monterrey Co., Ca. Nacimiento Rd.

36º00' 121º29' 518 Semillas J. Kuser y Bliss, USFS

10-03-1984

C19 Y-08-1 Monterrey Co., Ca. Palo Colorado Rd. 36º23' 121º52' 274 Semillas J. Kuser 09-05-

1984

C20 D-04-6 Del Norte Co., Ca Crescent City 41º43' 124º07' 183 Semillas J. Kuser 12-04-

1984

C21 H-02-3 Humboldt Co., Ca. P-1-M Rd., Pecwan 41º23' 123º51 762 Cultivo

de tejido J. Kuser y M.


C22 H-10-4 Humboldt Co., Ca. The Basin 40º58' 123º57' 244 Semillas

J. Kuser y J. Rydelius, Simpson

17-06-1984

C23 H-11-5 Humboldt Co., Ca. Kneeland 40º45 123º58' 684 Semillas J. Kuser 03-04-

1984

C24 M-06-1 Mendocino Co., Ca. Navarro River 39º10' 123º39' 18 Semillas J. Kuser 24-03-

1984




C28 Y-01-2 Monterrey Co., Ca. J. Pfeiffer Burns S. P. 36º08' 121º39 116 Cultivo

de tejido J. Kuser 13-06-1984

C29 Y-08-2 Monterrey Co., Ca. Palo Colorado Rd. 36º23' 121º52 274 Semillas J. Kuser 09-05-

1984

C30 H-06-4 Humboldt Co., Ca 40º01' 123º49' 91-140 - - -

C31 H-07-3 Humboldt Co., Ca 40º01' 123º49' 91-140 - - 1984

C32 N-03-4 Napa Co., Ca. Lokoya 38º22' 122º25' 518 Cultivo de tejido J. Kuser 30-05-

1984

105

Código Terreno





C33 H-09-5 Humboldt Co., Ca. Mad River, S. Fk. 40º51' 123º57' 122 Semillas

J. Kuser y A. Skauqset, Simpson

22-06-1984

C34 H-13-3 Humboldt Co., Ca. Grizzly Creek 40º29' 123º55' 137 Semillas J. Kuser 03-04-

1984

C35 H-17-2 Humboldt Co., Ca 40º01' 123º49' 91-140 - - 1984

C36 H-20-1 Humboldt Co., Ca. Lawrence Creek 40º39' 123º59' 356 Semillas J. Kuser y M.


C37 M-19-1 Mendocino Co., Ca. Gualala Peak 38º51' 123º30' 654 Semillas J. Kuser 24-03-

1984


C39 S-01-1 Sonoma Co., Ca. Kruse Rhodo. Res. 38º36' 123º19' 183 Semillas J. Kuser 23-03-

1984

C40 S-01-2 Sonoma Co., Ca. Kruse Rhodo. Res. 38º36' 123º19' 183 Semillas J. Kuser 23-03-

1984

C41 S-04-2 Sonoma Co., Ca. Bodega 38º22' 122º58' 122 Semillas J. Kuser 23-03-1984

C42 Y-06-3 Monterrey Co., Ca. Big Sur 36º16' 121º48' 30 Semillas J. Kuser 13-06-1984

C43 Y-06-4 Monterrey Co., Ca. Big Sur 36º16' 121º48' 30 Semillas J. Kuser 13-06-1984

C44 Z-02-6 Santa Cruz Co., Ca. U. C. Campus 37º00' 122º03' 213 Semillas J. Kuser y Patti

Ponzini 12-06-1984

C45 M-12-1 Mendocino Co., Ca. Willitts 39º23' 123º29' 457 Semillas J. Kuser 25-03-1984

C46 N-02-2 Napa Co., Ca. Ink Grade 38º36' 122º27' 488 Semillas A. Franclet, AFOCEL 11-81

C47 S-03-1 Sonoma Co., Ca. Warm Springs Cr.

38º41' 123º07' 305 Semillas J. Kuser 23-03-1984

C48 S-05-1 Sonoma Co., Ca. Cloverdale. 38º48' 123º02' 213 Semillas J. Kuser 23-03-

1984

C49 H-16-2 Humboldt Co., Ca. Bull Creek 40º21' 124º00' 91 Semillas J. Kuser 06-02-

1984

C50 M-15-1 Mendocino Co., Ca. Branscomb 39º39' 123º37' 482 Semillas J. Kuser 22-05-

1984

C51 M-18-1 Mendocino Co., Ca. Mountain View 38º58' 123º29' 634 Semillas J. Kuser 07-06-

1984


C53 RB54-7 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984

C54 Y-05-4 Monterrey Co., Ca. Redwood Gulch 35º50' 121º23' 159 Semillas J. Kuser y W.

Bliss, USFS 11-03-1984

P1 PLUS A Humboldt Co. Ca. 41º22' 123º56' 91-140 Semillas - 1984

P2 PLUS B Humboldt Co. Ca. 41º08' 123º58' 91-140 Semillas - 1984

P3 PLUS C Humboldt Co. Ca. 40º55' 123º58' 91-140 Semillas - 1984

S COMER-CIAL Humboldt Co. Ca. 40º45' 123º56' 91-140 Semillas - 1984

T1 RB12-26 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984

T2 RB31L-26 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984

T3 RB31L-14-6 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984

T4 RB75-58-6 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984

T5 RB-14-5 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984


T7 RB-12-28-18 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984





106

Código Terreno

















T24 RC18L-109-8 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984











T35 RC18L-109-7 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984










T45 RB-236-10 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984


T47 RB3-57-77-7 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984



T50 RC5 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984


T52 RB19 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984


107

Código Terreno









T58 RB54 Humboldt Co. Ca. 40º01' 123º49' 91-140 Semillas - 1984



- : Sin información


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