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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Facultad de Química “DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA CON
MICROFOTOCOLORÍMETROS DE MÍNIMA INSTRUMENTACIÓN (MIMC) DE BAJO COSTO”
Programa de Estancias Cortas
Elaborado por:
Patlan Velazquez Luis Fernando
Química de Alimentos
4to. semestre
Teléfono casa: 53-83-10-47
Correo electrónico: [email protected]
Investigador titular: Dr. José Alejandro Baeza Reyes
Lugar donde se desarrollo la estancia: Edificio A, Laboratorio 3 E/F
Facultad de Química UNAM
_______________________ ______________________
Luis Fernando Dr. José Alejandro Patlan Velazquez Baeza Reyes
Opinión Esta estancia corta me enseño que existe una opción para poder realizar experimentos sin gastar mucho y con resultados muy similares a los originales utilizando la microquímica analítica. También cabe mencionar que gracias a la estancia pude relacionar dos partes de mi carrera, la química de alimentos y la analítica, que de otra manera no habría sido capaz de unir en un mismo proyecto, confirmando así la flexibilidad de la química analítica y, por lo mismo, el gran peso que puede tener en mi área de trabajo. Las estancias cortas de la facultad me parecen excelente porque en ellas he aprendido cosas que en las aulas de clase probablemente jamás hubiera visto, además de que dan una muy buena idea de cómo es la vida una vez que uno se titula de la carrera.
“DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA CON MICROFOTOCOLORÍMETROS DE MÍNIMA INSTRUMENTACIÓN
(MIMC) DE BAJO COSTO”
Química de Alimentos Resumen Los métodos en química microanalítica permiten el obtener resultados bastante similares a los obtenidos utilizando los métodos tradicionales, con la ventaja de que estos nuevos métodos no solo permiten un ahorro significativo en cuanto a la instrumentación, sino que también requieren menos reactivos para el análisis y, por lo mismo, producen menos desechos después del dicho análisis. Una aplicación de las técnicas a microescala total se puede dar en el ámbito del análisis de alimentos, particularmente en el análisis de proteínas, ya que este tipo de análisis además de ser uno de los más importantes, también es uno de los más costosos en cuanto a los reactivos se refiere. En este trabajo se explora la posibilidad de utilizar técnicas microanaliticas para determinar la cantidad de proteína en diversas muestras, de las cuales la mayoría son alimentos. Para cumplir este objetivo se utilizo un microfotocolorímetro de mínima instrumentación, con el cuál se analizaron muestras de huevo, harina de soya, semillas de papaya y saliva. Los resultados obtenidos mostraron que, si bien la cantidad de proteína calculada con el MIMC era menor a la calculada con un espectrofotómetro, la diferencia no fue significativa, por lo que el microfotocolorímetro puede considerarse como un instrumento útil para el análisis cuantitativo de proteína.
Planteamiento del problema Debido a que los equipos para determinar la cantidad de proteína en diversas muestras es caro, además de que en ellos se gasta una cantidad significativa de la misma, es importante el desarrollar métodos que permitan determinar estas cantidades con equipo de menor precio y gastando la mínima cantidad de proteína posible, sin perder la precisión y exactitud durante el proceso. Objetivos El objetivo del presente trabajo fue utilizar un prototipo de microfotocolorímetro para la cuantificación de proteína en diversas muestras biológicas por medio de curvas de calibración con soluciones estándar. También se busco demostrar que no hay diferencias significativas entre los resultados obtenidos con el MIMC y un espectrofotómetro comercial Justificación Este trabajo tiene el fin de proveer un método alternativo de bajo costo para la determinación de proteína en diversas muestras biológicas y de alimentos; además de comprobar que este método no difiere en gran medida de otros métodos más caros, como el uso del espectrofotómetro comercial. Hipótesis Los MIMC’s han mostrado ser útiles para la cuantificación de analitos, por ejemplo el ácido acetilsalicílico en tabletas de aspirina, sin mostrar diferencias significativas entre los resultados obtenidos con este método y el que emplea un espectrofotómetro comercial. En base a lo anterior, debería de ser posible el usar un MIMC para cuantificar proteína en diversas muestras de alimentos y biológicas. Introducción Ley Límite de Lambert-Beer-Bouger [1] Al hacer incidir un haz de luz monocromática de intensidad incidente I0 a través de una disolución que contiene un i-ésimo analito de concentración [i], durante una longitud de paso óptico l, la intensidad de la luz en cualquier punto del paso óptico de la disolución es una función de [I] y de l, y dicha función tiene la forma de una diferencial total:
Para De acuerdo a la ley de Lambert:
y de acuerdo a la ley de Beer y de Bouger:
Sustituyendo las respectivas proporcionalidades de Lambert-Beer-Bouger en la primera ecuación diferencial y multiplicando por -1 ambos lados de la ecuación:
(2)
Si la ecuación (2) se divide entre I:
(3)
Esta ecuación se integra desde l = 0, [i] = 0 cuando I = I0, hasta desde l = l, [i] = [i] cuando I = I:
(4)
El término de la derecha de la ecuación 4 es una integral lineal que, de acuerdo al teorema de Green, se reduce a:
(5)
Si kl y k[i] son funciones lineales de [i] y de l, respectivamente, la ecuación anterior se convierte en:
(6)
Donde k1 y k2 son constantes definidas por dkl / dk[i] y dk[i] / dkl, respectivamente. Resolviendo la integral y rearreglando (k1-k2) = K, entonces se obtiene la conocida ley de Lambert-Beer-Bouger:
Determinación experimental de I/I0 y del pT [1] La relación I/I0 se puede determinar experimentalmente si se mide la respuesta de un detector sensible a la luz. Los fotodetectores usados en fotocolorimetría proporcionan una
respuesta en forma de diferencia de potencial eléctrico que puede medirse con un voltímetro. Se busca que el detector responda de acuerdo a la siguiente ecuación:
R =Rr + kI; Iu <I <Isat
donde Rr es la respuesta residual, es decir la respuesta del detector a la poca luz que se filtra conocida como luz parásita; k es una constante que representa la rapidez de respuesta lineal del detector, dR/dI; Iu es la intensidad umbral, esto es, la mínima cantidad de luz que genera una respuesta lineal del detector; Isat es la intensidad de saturación, es decir, la máxima cantidad de luz que proporciona una respuesta lineal y se caracteriza por (dR/dI) tiende a cero. Un detector adecuado para fotocolorimetría o para espectrofotometría es aquel cuyas características fueran:
La determinación del cociente I/I0, conocido como transmitancia, T, puede efectuarse experimentalmente si se determina Rr (la respuesta con la luz apagada), R0 (la respuesta de la disolución blanco o medio reaccional) y Ri (la respuesta de la disolución del analito absorbente de concentración molar [I]), ya que: para el blanco:
para la disolución de analito absorbente:
entonces es posible determinar el parámetro adimensional T, conocido como transmitancia, por medio de la medición de la respuesta R del detector, de la siguiente manera:
Con esta última ecuación se puede calcular un segundo parámetro adimensional conocido como absorbancia:
A = -log T = pT = -log ( )
La absorbancia o pT se asocia a los valores de concentración de disoluciones estándar para obtener una gráfica llamada curva de calibración (pT = f(C)), la cual puede usarse para calcular, por interpolación, la concentración del analito absorbente en muestras de concentración desconocida, al determinar también el parámetro adimensional pT de dicha muestra. Fundamentos de espectrofotometría [2] La espectroscopia UV-Visible estudia el fenómeno de adsorción de la radiación UV visible de moléculas orgánicas e inorgánicas. La región visible, a la que es sensible el ojo humano, se localiza entre los 380 y 780 nm.
La absorción de la radiación ultravioleta o visible por moléculas orgánicas e inorgánicas, generalmente se produce por la excitación de los electrones de enlace, por lo tanto, la longitud de onda de los máximos de absorción se puede relacionar con los enlaces de las especies absorbentes.
Los métodos espectroscópicos se basan en la capacidad de las sustancias de absorber (o emitir) radiación electromagnética. Éstos se pueden emplear para determinar la concentración de un reactivo o producto durante una reacción.
La figura 1 muestra los componentes básicos de un espectrofotómetro.
El aparato detecta la cantidad de luz transmitida o absorbida a través de la solución
en la celda y la compara con la que se transmite o absorbe a través de una solución de referencia denominada “blanco”. La lectura en la escala ya está convertida en absorbancia.
La transmitancia de la muestra se define como la relación de la radiación transmitida y la incidente (T= I / I0). La disminución de la intensidad de la radiación depende de la concentración del absorbente y de la longitud del camino recorrido por el haz. Estas relaciones se recogen en la Ley de Lambert-Beer-Bouger:
A = -log T
A = log (I / I0) = (ε x b) x c ABSORBANCIA = (ε × b) × c que establece una relación lineal entre la absorbancia y la concentración, donde: ε.- Es la constante de proporcionalidad llamada coeficiente de absorción molar, absortividad molar o coeficiente de extinción (M-1 cm-1). Es la característica de una sustancia que nos dice cuánta luz absorbe a una longitud de onda determinada. b.- Es el paso óptico, anchura de la celda que contiene la muestra (cm). c.- Es la concentración de la especie de la cual estamos midiendo la absorbancia (M).
La ecuación mencionada es el fundamento de la espectrofotometría. La ley de Lambert-Beer Bouger se cumple para una radiación monocromática que atraviesa una disolución diluida (≤ 0.01M), cuando la especie absorbente no participa en un equilibrio que dependa de su concentración. Todo espectrofotómetro cuenta con los siguientes elementos: • Fuente de luz: un filamento de tungsteno que funciona mediante una fuente de alimentación estabilizada proporcionando una radiación de intensidad constante el tiempo suficiente para asegurar una buena reproducibilidad de las lecturas de absorbancia. • Selector de longitud de onda: se trata de una sencilla red de difracción, que permite separar la longitud de onda. Tras seleccionar la longitud de onda la radiación pasa a través de un controlador de luz, que consiste en una abertura en forma de V que se introduce o saca del haz para controlar la intensidad de luz que incide en la fotocelda. • Celda: Que contiene a la solución generalmente hecha de un material transparente que no absorbe la luz. Su longitud y capacidad varía según el equipo y diseño. Las hay de paredes cilíndricas o planas. • Detector: a éste llega la radiación tras pasar por un filtro y por la muestra. Se trata de un foto-tubo de medida. Se basa en el efecto fotoeléctrico de los metales que al irradiarlos generan electrones. • Escala de medida: La señal eléctrica del detector una vez amplificada se registra bien en una escala analógica o en una pantalla digital que proporcionan los valores de Transmitancia y/o Absorbancia. Circulo cromático [4] Se denomina círculo cromático al resultante de distribuir alrededor de un círculo los colores que conforman el segmento de la luz visible del espectro solar, manteniendo el orden correlativo.
En el círculo cromático se puede observar que hay pares de colores ubicados diametralmente opuestos en la circunferencia, unidos por el diámetro de la misma; a estos pares de colores se les suele llamar "colores complementarios" o "colores opuestos", ya que al superponer uno de estos colores sobre un fondo de su color opuesto, complementan el espectro visible, el contraste que se logra es máximo. Esto se denomina "armonía de contraste de opuestos o complementarios".
Reacción de Biuret [3]
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra Proteínas del huevo [3]
El huevo de gallina ha formado parte de la alimentación humana por miles de años, siendo una de las mejores fuentes de proteína que existen. Está constituido por 10.5% de cáscara, en tanto la parte comestible está formada por 58.5% de albumen o clara y 31.0% de yema, cuyos componentes son proteínas y lípidos principalmente.
El perfil de aminoácidos es similar al de las proteínas del suero de leche, siendo los más importantes de estos:
Ovoalbúmina o Constituye alrededor de 54% del albumen, es de fácil desnaturalización y
tiene cuatro enlaces S-H. Es la proteína de mayor valor biológico ya que tiene muchos de los ocho aminoácidos esenciales.
Conalbúmina o Conforma más o menos el 13% de la clara del huevo.
Ovomucoide o El porcentaje de esta en el albumen es de 11.
Proteína de la saliva [5]
La saliva es un líquido de la cavidad bucal, producido por las glándulas salivales, transparente, de viscosidad variable, compuesto principalmente por agua, sales minerales y algunas proteínas. Entre estas proteínas resalta la enzima amilasa.
La amilasa, denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene un pH de 7. Cuando uno de estas glándulas se inflama aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre.
Proteína de la harina de soya [3]
La soja o soya (Glycine max) es una planta de la familia de las leguminosas fabáceas, cultivada por sus semillas, legumbre de alto valor proteico, utilizadas en alimentación y para la producción de aceite.
Las harinas son la forma menos refinada de la soya; se pueden fabricar con toda su grasa o totalmente desgrasadas, ya sea como hojuelas, gránulos o polvo; contienen un mínimo de 40% de proteínas, y durante su manufactura se someten a un calentamiento con vapor para eliminar el residuo del disolvente usado para la extracción del aceite.
Proteína de las semillas de papaya [6] La papaina es una enzima hidrolasa cisteína proteasa que se encuentra presente en la papaya. Consiste de 212 aminoácidos estabilizados por tres puentes disulfuro. Su estructura 3D consiste en 2 dominios estructurales distintos con una hendidura entre ellos. Esta hendidura contiene el sitio activo, que contiene una tríada catalítica que se ha comparado a la de la quimotripsina. Su tríada catalítica se compone de 3 aminoácidos - cisteína-25 (de cuál consigue a su clasificación), histidina-159, y asparagina-158.
La cualidad principal de la papaína es el uso como mejorador de las carnes, (ablandamiento y aclaramiento), y en el aclaramiento y para evitar la sedimentación en las cervezas por su acción en los enlaces de las proteínas.
Metodología aplicada Elaboración del reactivo de biuret (necesario para el análisis de proteínas)
1) Se colocan 9g de tartrato de sodio y potasio en un matraz volumétrico de 1000mL y se disuelve en aproximadamente 400mL de hidróxido de sodio 0.2N.
2) Posteriormente, se disuelven sucesivamente 3g de sulfato de cobre y 5g de yoduro
de potasio en la disolución anterior.
3) Finalmente, se afora con hidróxido de sodio 0.2N y la dilución anterior se almacena en una botella de propileno.
Ensayos preliminares De acuerdo a lo que se informa en la literatura [6], el Cu2+ en medio amoniacal forma un complejo de color azul intenso [Cu (NH3)4
+] conocido como tetra-amincobre. En base a esta cualidad del catión divalente del cobre, se preparan disoluciones de nitrato de cobre en medio amoniacal de diferente concentración, a las cuales se les determinará su absorbancia en el MIMC. Como filtros de absorción se utilizaron una solución de NaOH con fenoftaleina (color rosa), y un colorante rojo. Se elaboran dos tipos de disoluciones: las tipo I, que contienen agua destilada, nitrato de cobre y amoniaco, y las tipo II, que solo contienen nitrato de cobre y amoniaco. Las proporciones de las distintas soluciones se muestran a continuación: Muestras tipo I:
No muestra Cantidad de Cu2+ [0.1 M] NH3 H2O 0 (blanco) 0 400µL 600µL
1 20µL 380µL 600µL 2 40µL 360µL 600µL 3 60µL 340µL 600µL 4 80µL 320µL 600µL 5 100µL 300µL 600µL
Muestras tipo II:
No muestra Cantidad de Cu2+ 0.1 M NH3 0 (blanco) 0 1000µL
1 20µL 980µL 2 40µL 960µL 3 60µL 940µL 4 80µL 920µL 5 100µL 900µL
Una vez que se tienen las muestras, se sigue el siguiente procedimiento:
1) El multímetro se programa como ohmetro y se conecta al microfotocolorímetro.
2) Se mide la respuesta residual (con la luz apagada), Rr, del microfotocolorímetro
3) El blanco se coloca en la celda de absorción
4) La celda se coloca en el microfotocolorímetro.
5) El microfotocolorímetro se cubre, y se conecta la fuente de luz a la fuente de
energía.
6) Se mide la resistencia del blanco (R0) con el multímetro.
7) El blanco se saca de la celda, y se repiten los pasos 3-6 con las demás muestras del
mismo tipo, siempre en orden creciente de concentración, midiendo la resistencia de
cada una (Ri).
8) Los pasos anteriores se repiten con el otro tipo de muestra.
Con los datos de cada muestra se calcula la respectiva transmitancia de cada muestra con la ecuación mencionada anteriormente:
T = [(Ri-Rr) / (R0-RR)]
Posteriormente se calcula la absorbancia de cada una con la relación: A = -logT
Se grafican la absorbancia contra la concentración de cada muestra de cada tipo para comparar los mismos mediante su coeficiente de correlación, y posteriormente, se repiten los pasos 1-7 con el tipo de muestra que haya presentado mejores resultados, pero cambiando el filtro utilizado (si se uso el rosa, ahora se usa el rojo y viceversa) Elaboración de la curva de calibración utilizada para todas las muestras de proteína Se elabora una solución consistente de 25 mg de la enzima hidrogeno-peróxido oxidoreductasa disuelta en 1mL de agua destilada. A partir de esta solución se elaboran 5 muestras con la siguiente proporción:
No muestra Cantidad de la solución de enzima
Solución de Biuret
H2O
0 (blanco) 0 400µL 600µL 1 20µL 380µL 600µL 2 40µL 360µL 600µL 3 60µL 340µL 600µL 4 80µL 320µL 600µL 5 100µL 300µL 600µL
Con las muestras anteriores se llevo a cabo el mismo procedimiento que se llevo a cabo con las muestras de cobre para obtener curvas de calibración variando los filtros de nuevo, primero se usa verde de bromocresol y luego una disolución de dicromato de potasio (color naranja), para decidir cual filtro se utilizara en la medición del resto de las proteínas. Determinación de proteína en diversas muestras Con base a la curva de calibración de la enzima, se determina la cantidad de proteína en:
- Huevo o Distintas marcas
- Saliva
o Distintas personas
- Harina de soya
- Semillas de papaya
Para estas determinaciones, en cada caso se elaboran muestras con la siguiente proporción:
Ø 100µL de producto
Ø 300µL de solución de Biuret
Ø 600µL de agua destilada
Para medir cada muestra se elaboro un blanco con la misma proporción que el utilizado en la elaboración de la curva de calibración.
Comparación entre el microfotocolorímetro y el espectrofotómetro Para llevar a cabo esto se elaboro una curva de calibración en el espectrofotómetro, lo cuál requiere que este sea calibrado antes de medir la absorbancia de las muestras. La calibración se lleva a cabo con el siguiente procedimiento (este varia en cada aparato):
1) Se enciende el aparato y se espera alrededor de media hora
2) Se ajusta el aparato en absorbancia
3) Se verifica que la transmitancia este en cero.
4) Se ajusta la longitud de onda en el espectrofotómetro en 400nm.
5) Se escoge una muestra de las que se van a utilizar para elaborar la curva de calibración (de preferencia la más concentrada) y se coloca en el espectrofotómetro.
6) Se registra la absorbancia obtenida
7) Se repite el procedimiento anterior desde el paso 3 con la misma muestra, pero con la longitud de onda en 420nm.
8) Se continua repitiendo el proceso con la misma muestra aumentando la longitud de
onda 20nm cada vez hasta llegar a 700nm
9) Se grafican la absorbancia contra la longitud de onda para determinar la longitud de onda a utilizar en la elaboración de la curva de calibración.
Para medir la absorbancia en el espectrofotómetro se siguen los siguientes pasos:
I. Se ajusta el aparato con la longitud de onda seleccionada en la calibración.
II. Se coloca el blanco en el aparato, y se ajusta la absorbancia a cero.
III. Se procede a medir la absorbancia de las muestras.
Con los datos anteriores se elabora la curva de calibración correspondiente al
espectrofotómetro. Posteriormente se mide la muestra a comparar siguiendo el mismo procedimiento con el que se midieron las muestras para la curva.
Desarrollo Semana Actividad 1ra. Aprendizaje de uso del microfotocolorímetro usando soluciones de
Cu2+ Para aprender y practicar el uso del microfotocolorímetro se elaboraron muestras de dos tipos para elaborar sus curvas de calibración
2da. Elaboración de curva de calibración de proteína Se elaboro una solución consistente de 25 mg de la enzima hidrogeno-peróxido oxidoreductasa disuelta en 1mL de agua destilada.
3ra. Determinación de proteína en distintas marcas de huevo, saliva, harina de soya y semillas de papaya:
4ta. Comparación entre el espectrofotómetro y el microfotocolorímetro para determinar la relación entre ambos aparatos.
Utilizando un mismo microfotocolorímetro, se midieron las resistencias de ambas muestras, utilizando una solución de NaOH con fenoftaleina como filtro (color rosa) y a partir de estas resistencias se calculo la absorbancia de cada una. Lo anterior se repitió dos veces mas con cada tipo de muestra, dando un total de tres ensayos. El objetivo principal de este experimento fue el aprender el manejo del microfotocolorímetro, así como la elaboración de curvas de calibración con el mismo.
Después, en base a los resultados obtenidos anteriores se dedujo que era mejor utilizar soluciones diluidas con agua como muestra. A continuación se cambio el filtro rosa por uno de color rojo y se llevaron a cabo tres ensayos más utilizando este filtro. Esto confirmo que para el caso del cobre era mejor el utilizar el filtro rosa que el rojo.
Continuando, se elaboro la curva de calibración que se uso para calcular la cantidad
de proteína en cada muestra. Se probó utilizando un filtro de verde de bromocresol, solución de biuret y una disolución de dicromato de potasio, decidiéndose usar el filtro de dicromato de potasio.
Posteriormente, se calculo la cantidad de proteína en diversas marcas de huevo,
saliva proveniente de distintos individuos, semillas de papaya y harina de soya. Utilizando distintos métodos:
v En el caso de la saliva y la clara de huevo, al ser muestras en estado líquido, no tuvo que hacerse ningún procedimiento.
v Al tratar la harina de soya, primero se disolvieron 500mg de harina en agua
destilada, y luego se procedió a centrifugar la muestra por 15 minutos para obtener el extracto.
v Con las semillas de papaya, primero se molieron 2g de las mismas y se disolvieron
en un poco de agua destilada. Posteriormente se centrifugo la mezcla por 10 minutos para separar el extracto.
Finalmente, se calculo la cantidad de proteína en la harina de soya utilizando el
espectrofotómetro, y luego se compararon los resultados obtenidos con los que se obtuvieron del microfotocolorímetro para determinar la relación entre ellos.
Resultados Gráficas obtenidas con las soluciones diluida y saturada de Cu2+
Curva de Cu2+ con NH3 dil. :1R2 = 0.9929
00.0005
0.0010.0015
0.0020.0025
0.003
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
Curva de Cu2+ con NH3 dil. :2R2 = 0.8416
-0.0020
0.0020.0040.0060.008
0.01
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
Curva de Cu2+ con NH3 dil. :3R2 = 0.9509
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
Curva de Cu2+ con NH3 :1 R2 = 0.973
00.0020.0040.0060.0080.01
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
C (M)
A
Curva de Cu2+ con NH3 :2 R2 = 0.8586
00.0020.0040.0060.008
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
C (M)
A
Curva de Cu2+ con NH3 :3R2 = 0.9178
00.0020.0040.0060.008
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
Graficas elaboradas con los datos medidos de disoluciones de cobre diluidas utilizando un filtro de color rojo en lugar del rojo utilizado en las mediciones anteriores.
Curva de Cu2+ con NH3 c/rojo :1R2 = 0.9723
00.005
0.010.015
0.02
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
Curva de Cu2+ con NH3 c/rojo :2R2 = 0.8858
00.005
0.010.015
0.020.025
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
Curva de Cu2+ con NH3 c/rojo :3
R2 = 0.8721
0
0.01
0.02
0.03
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
A continuación se muestran las graficas que corresponden a las muestras de enzima utilizando como filtro una disolución de verde de bromocresol
Curva de calibración c/verde :1R2 = 0.9439
0
0.002
0.004
0.006
0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003
C (M)
A
Curva de calibración c/verde :2R2 = 0.8886
0
0.002
0.004
0.006
0 0.001 0.002 0.003
C (M)
A
Curva de calibración c/verde :3R2 = 0.9693
0
0.002
0.004
0.006
0 0.001 0.002 0.003
C (M)
A
Después de analizar las gráficas anteriores se decidió repetir el experimento usando ahora como filtro una disolución de dicromato de potasio, dando como resultado los datos usados para la siguiente gráfica
Curva de enzima-1y = 0.3727x + 0.0005R2 = 0.9794
00.0020.0040.006
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
C (M)
A
Curva de enzima-2R2 = 0.9847
y = 0.2891x - 0.0003R2 = 0.9847
0
0.001
0.002
0.003
0 0.005 0.01 0.015
C (M)
A
Curva de enzima-3 R2 = 0.9616
00.00050.001
0.00150.002
0.0025
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
C (M)
A
Con las gráficas anteriores se escogió una curva de calibración para calcular la cantidad de proteína en las diversas muestras: a) Proteína en huevo
Marca o tipo de huevo Cantidad de proteína por gramo de clara
Doble yema blanco 0.067402143g Bachocco rojo 0.076871584g Capilla blanco 0.071791195g San Juan rojo 0.081740204g
San Juan blanco 0.074430279g b) Proteína en saliva
Sujeto Cantidad de proteína por mililitro de saliva
Yo 20.7mg Alejandro 22.8mg
Catálina 6.93mg Eliah 7.7mg
Guillermo 28.7mg c) Proteína en semillas de papaya
Se concluyo que hay aproximadamente 0.011g de proteína por gramo de semilla de papaya.
d) Proteína en harina de soya
Se concluyo que hay alrededor de 0.12g de proteína por gramo de harina. A continuación, para la comparación entre el espectrofotómetro y el microfotocolorímetro, primero se elaboro una grafica comparando distintas longitudes de onda y sus absorbancias respectivas de una misma muestra:
Espectro de la solución
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 200 400 600 800λ (nm)
A
Después, con la longitud obtenida, se elaboro una curva de calibración con el espectrofotómetro
Curva de calibración en espectrofotómetro y = 156x + 0.024
R2 = 0.9961
0
0.2
0.4
0.6
0 0.001 0.002 0.003
C (M)
A
Utilizando esta curva de calibración se determino la concentración de tres muestras de harina de soya, utilizando tanto el espectrofotómetro como el microfotocolorímetro. Se encontró la siguiente proporción: Ensayo 1: Cmicrofotocolorímetro/ Cespectrofotómetro = 3 Ensayo 2: Cmicrofotocolorímetro/ Cespectrofotómetro = 2 Ensayo 3: Cmicrofotocolorímetro/ Cespectrofotómetro = 2
Análisis de resultados De la primera serie de gráficas se observo que la mejor correlación estaba presente en las muestras de cobre diluidas con agua destilada. A continuación se repitió el experimento utilizando como filtro un colorante rojo para ver si este afectaba los resultados, pero las graficas obtenidas mostraron una menor correlación, por lo que se decidió usar el colorante rosa para las muestras de cobre.
Para elaborar la curva de calibración de la proteína, utilizando como referencia los resultados obtenidos con el cobre, se decido utilizar muestras diluidas de la enzima. Al inicio se utilizo el colorante verde de bromocresol, y posteriormente una disolución de dicromato de potasio, como filtro. Los experimentos mostraron que el uso del dicromato como filtro originaba una mejor correlación.
Teniendo la curva de calibración elaborada, se procedió a calcular las cantidades de proteína en distintas muestras. En el caso del huevo, se observo que, como era esperado, la cantidad de proteína en el huevo de doble yema fue la menor de las muestras; también destaco que el huevo de color rojo presento una cantidad de proteína mayor a la de su contraparte blanca, incluso en el caso de una misma marca. El caso de la saliva presenta variaciones notables, pero estas pueden ser debidas a los sujetos de estudio, y a las condiciones de la muestra. Las semillas de papaya y la harina de soya no presentaron una gran variación, aunque en el caso de la harina, su contenido proteínico es menor al indicado en la literatura.
Para finalizar se determino la relación entre la cantidad de proteína en harina de soya calculada con un instrumento comercial, el espectrofotómetro, y el aparato que se utilizo, el MIMC. Los resultados mostraron que la cantidad de proteína utilizando el espectrofotómetro es mas cercana a la informada en la literatura que la que se calculo inicialmente, dando una relación de aproximadamente 2 entre ambas cantidades.
Conclusiones La estancia cumplió sus objetivos, pues se aprendió un método alternativo para cuantificar la cantidad de proteína en distintos alimentos y otras muestras biológicas, además de que este método no mostró una diferencia muy significativa contra el método comercial, que es mucho más costoso tanto en equipos como en cantidad de muestra. Una conclusión no esperada fue el hecho de que aparentemente el huevo con cascarón de coloración roja presenta un mayor contenido proteínico en su clara, lo cuál es bastante interesante ya que la literatura menciona que la diferencia entre ambos no debería de ser muy significativa. También, con respecto al huevo, es interesante que el que más resulto tener proteína fue el comprando en una tienda de abarrotes, teniendo más que el adquirido en un centro comercial. Bibliografía [1]Alejandro Baeza: http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/PresentacionCLASE:_LEY_BEER_Microfotocolorimetria_2218.pdf [2] Fisicoquímica, Castellan G. W., Addison Wesley Longman, 2ª Edición, 1987. [3] Fennema, O. R., Food Chemistry, 3rd Ed., New York, Marcel Dekker. 1996. [4] http://www.pitt.edu/~n3lsk/colorabsproc.html [5] http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2008/MB_cgi?mode=&term=Saliva [6] http://www.vitamins-supplements.org/digestive-enzymes/papain.php
