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UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA
Docente: Martha A Mora García. Esp.Bacteriología lll –
Manejo de muestras biológicas.
CLASIFICACION TAXONOMICADominio: Bacteria
Filo: Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Suborden: Corynebacterineae
Familia: Mycobacteriaceae
Género: Mycobacterium.
Características GeneralesAerobias estrictas (excepto en estado latente)No móvilesPared celular rica en lípidosM. tuberculosis su único hospedero es el
humanoTiempo de replicación muy lento, 15-20 horasClasificación:
Complejo Tuberculoso: Niacina y nitritos positivos, catalasa a 68°C negativa
CARACTERISTICAS
PARED CELULAR
PECTIDOGLICANOPOLIMEROS DE ARABINOSA Y
GALACTOSA.ACIDOS MICOLICOSLIPIDOS SUPERFICIALES: Cord factor Micosidos
Sulfolipidos.
PARED CELULAR MICOBACTERIAS
Pared celular micobacterial: 1-lípidos externos, 2-ácido micólico, 3-polisacáridos (arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmática, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manosido, 8-pared celular.
Pared celular micobacterial: 1-lípidos externos, 2-ácido micólico, 3-polisacáridos (arabinogalactano), 4-peptidoglicano, 5-membrana plasmática, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-fosfatidilinositol manosido, 8-pared celular.
CARACTERISTICAS GENERALES
COMPLEJOS
TUBERCULOSIS
M. tuberculosisM. bovis
M. africanum
COMPLEJO LEPRA
M. LepraeM. Lepraeemurium
MICOBACTERIAS ATIPICAS
M. kansassi-intermedium-marinumScrofulaceum-xenopi-avium-IntracelularFortuitum y chelonei-gordonae-szulgai
GENEROS
Epidemiología
El método más efectivo de control de la TB es la búsqueda activa de casos bacilíferos y su tratamiento, ya que desde el punto de vista epidemiológico la infectividad del paciente disminuye en forma importante a las pocas semanas de iniciado un buen tratamiento, y por el contrario un paciente bacilífero infecta de
10 a 15 personas por año.
ANTIGENICIDAD
LIPIDOS Cord factorPROTEINAS TuberculinaMICOBACTINAS EXOQUELINAS
Determinantes de patogenicidad
Factor cordón: Adoptan la forma serpenteante constituido por bacilos que se disponen de manera paralela y compacta, el desarrollo en cordones puede correlacionarse con la presencia del glucolipido trehalosa 6,6’– dimicolato.
Sulfatados: Son glicolípidos localizados de forma periférica responsables de la reactividad al rojo neutro, aunque los sulfatados no son tóxicos pero cuando se administran de forma simultanea con el factor cordón potencia de manera sinérgica la toxicidad de este.
Intracelularidad: promover su propia supervivencia dentro del huésped actuando desde el interior de los fagosomas para prevenir la formación de los fago lisosomas con lo que evita su exposición a enzimas hidrolíticas ( lizosomicas).
MYCOBACTERIUM - TUBERCULOSO CUADRO CLINICO
Se establece en tres fases:INFLAMACIONFORMACION DEL TUBERCULOCACEIFICACION
CUADRO CLINICO
ESTADIOS
PRIMO-INFECCION REINFECCION
Ciclo de vida
PatogénesisDurante la fase de invasión tisular, el transporte de
microorganismos por el macrófago a través de la pared alveolar, permite el acceso del bacilo a la sangre a través de la vía linfática.
Este período de “micobacteremia” le proporciona al microorganismo el acceso y posibilidad de permanecer en el sistema mononuclear fagocítico y sitios que le proveen un medio ambiente favorable (alta presión de oxigeno) , como es el área apical de los pulmones y sitios con alto flujo sanguíneo como nodos linfáticos, riñones, epífisis de huesos largos, cuerpos vertebrales y áreas meníngeas.
La reactivación tardía de estos focos da origen a la tuberculosis extrapulmonar y a la forma pulmonar apical de más frecuente presentación.
Patogénesis
Las vías de entrada del bacilo tuberculoso al organismo son la inhalación, ingestión e inoculación directa. La más importante es la inhalación de partículas infectantes expulsadas por medio de la tos de un paciente bacilífero. Partículas mayores de 10 µm son filtradas en la nariz y menores de 5 µm evitan las barreras mecánicas y pueden penetrar y depositarse en la superficie respiratoria.
La respuesta inmune celular efectiva, cura la lesión primaria espontáneamente con calcificación del foco paren quimatoso (Foco de Gohn y nódulos hiliares) constituyendo el complejo de Ranke.
Patogénesis
Los linfocitos T, sensibilizados con antígenos del M. tuberculosis determinan la aparición del fenómeno de hipersensibilidad retardada medida a través de la prueba de tuberculina.
Los linfocitos (específicamente CD4) de individuos con fuerte hipersensibilidad retardada, son capaces de producir linfoquinas que activan la capacidad microbicida del macrófago y junto con el linfocito organizan el granuloma, el cual sirve para detener la infección, reducir el crecimiento del bacilo y restringir la movilidad de los macrófagos infectados, evitando la diseminación de la infección.
En individuos con inmunodeficiencia como la producida por infección por VIH,hay falta de formación de granuloma y no se restringe la movilización del macrófago infectado, resultando en la tuberculosis miliar o de diseminación hematógena.
Manifestaciones clínicas.
Debilidad Malestar generalPerdida de pesoPerdida del apetitoFiebre de predominio visceralSudoración nocturna El compromiso particular pulmonar
característicamente se asocia a tos hemoptoica (tos con expectoración y presencia de sangre) Dolor Toráxico
Formas Clínicas
La entrada del bacilo al organismo produce la PRIMO-INFECCION TUBERCULOSA, con lesiones generalmente limitadas, pero con persistencia de bacilos en forma latente, sin multiplicación, pero que se expresan en una prueba de tuberculina positiva en pacientes asintomáticos.
Estas lesiones pueden permanecer inactivas el resto de la vida, o sufrir reactivación posterior cuando el estado inmune del huésped lo permita.
La mayor parte de los casos de ENFERMEDAD
TUBERCULOSA son producidos por la reactivación endógena y menos frecuentemente por nueva infección o infección exógena, la cual puede ser reconocida por la caracterización del genotipo del M.tuberculosis.
Presentaciones clínicas
Tuberculosis pulmonar. Tuberculosis meníngea. Tuberculosis extra pulmonar. Tuberculosis milliar. Tuberculosis linfática. Tuberculosis genitourinaria. Tuberculosis
gastrointestinal.
Formas Clínicas
L a forma pulmonar es a mas frecuente, pero el compromiso extrapulmonar es la mas frecuente en pacientes con algún factor de inmunosupresión.
Las manifestaciones clínicas de la tuberculosis pueden ser:
Sistémicas relacionadas con la infección por sí misma (fiebre, malestar general, pérdida de peso, diaforesis nocturna, anorexia, adinamia, anemia, leucocitosis o leucopenia.
Locales determinadas por el órgano o sistema comprometido.
Metabólicas como hipona tremia por secreción inapropiada de hormona antidiurética y anormalidades neurosicoló gicas como depresión.
Patogénesis en Tuberculosis
10% de personas que se infectan con Tb y tienen un sistema inmune normal desarrollarán Tb en algún momento de su vida
Pacientes con HIV tienen el mayor riesgo de desarrollar Tb, 7-10% cada año
Otras patologías también incrementan el riesgo para que la infección progrese a enfermedad.
El Panorama Actual de la Tuberculosis en el Mundo
Un tercio de la población mundial está Un tercio de la población mundial está infectado con el baciloinfectado con el bacilo M. tuberculosis M. tuberculosis..
7.5 millones 7.5 millones de casos nuevos por año casos nuevos por año
Se presentan 2,8 millones de muertes por Se presentan 2,8 millones de muertes por añoaño
Problema ActualAumento en el número de casos
Fallas en los programas de salud pública que manejan la vigilancia de casos y controles
La no supervisión del tratamiento (TAS-DOTS)
Retardo en el diagnóstico tanto clínico como microbiológico
Aumento de la resistencia a medicamentos tradicionales
Disminución de las posibilidades terapéuticas
MDR - XDR
MDR: aislamiento resistente al menos a isoniazida y rifampicina
XDR: aislamiento MDR con resistencia a la quinolona ( ofloxacina, ciprofloxacina) y algunos de los inyectables: kanamicina, amikacín o capreomicina
Plan Nacional de Salud pública Plan Nacional de Salud pública Colombia 2007-2010Colombia 2007-2010
Estrategias para disminuir los riesgos para las enfermedades transmisibles y las zoonosis:
• Implementar el Plan Estratégico Colombia Libre de TB 2006-2015
Metas Mundiales y Adoptadas en los Niveles Nacionales
• 2005: – Diagnosticar al 70% de los casos TBP Bk+– Curar al 85% de los casos TBP Bk+
• 2015 (objetivos de desarrollo del milenio)– Disminuir de forma significativa la prevalencia y
mortalidad
• 2050– Eliminar la TB como un problema de salud
pública (<1 caso por 1 millón de habitantes)
Desafíos del Control de TBDesafíos del Control de TB
• Pobreza – Desnutrición
• Poblaciones vulnerables– Indígenas
– Desplazados
– Población carcelaria y penitenciaria
• Coinfección TB/VIH
• MDR- XDR TB
• Reformas del sector salud
Niveles de LaboratorioNivel I:
Recoge muestras y realiza baciloscopia y remite muestras a nivel superior.
Nivel II: Realiza baciloscopia Cultivos en medios a base de huevo Identifica M. tuberculosis Pruebas de sensibilidad a primera línea
Nivel III: Mismos procesos del nivel II mas: Métodos de cultivo diferentes a a LJ O OK Identificación de MNT Sensibilidad a medicamentos de primera y segunda línea
DIAGNOSTICO
PRUEBA DE TUBERCULINA
RADIOGRAFIA DETORAX
MICROBIOLOGIABaciloscopia
Cultivo Técnicas moleculares
Elementos en el Diagnóstico de Tuberculosis
SINTOMÁTICOS RESPIRATORIOS
Historia Clinica
Examen fisico
tuberculina
Estudios radiológicos
Baciloscopia: Examen directo con coloración para bacilos ácido alcohol resistentes
Cultivo
Proceso de la Muestra en el Laboratorio
+
CD MGIT
Centrifugación 4°C
Incubación
IdentificaciónFenotípica-Genotípica
MGIT LJAR
•PulmonaresDescontaminación:
NaOH 4%Mucolítico: N-acetyl cisteína
•Estériles siembra directa
Sedimento
Inocular
PulmonaresDecontaminación +
CDMGIT
Extra-pulmonares
MuestraCentrifugación
Incubación
Identificación
MGIT LJAR
AR
Proceso de las muestras
KY
Incubación 36°C
Adenosin Deaminasa (ADA)Citoquinas
Enzima producida por linfocitosEvaluada extensamente en tuberculosis pleural,
peritoneal, meningitis
Citoquinas: Interferon y TNFMétodos rápidos, simples, no invasivosPoca precisión si se utilizan como única prueba
PRUEBA DE TUBERCULINA
INYECCCION INTRADERMICA:SU POSITIVIDAD INDICA:Seguridad de protecciónVacunación previaRiesgo de desarrollar enfermedad por
reactivaciónINDURACION MAYOR DE 10 mm de diámetro,
con sintomatología – Enfermedad actual.
DIAGNOSTICO
POSITIVA +10 mmDUDOSO 5-9 mm
Tiempo deLectura 72 horas
MUESTRAS PARA INVESTIGAR Mycobacterium
ESPUTOLIQUIDO CEFALORRAQUIDEOORINABIOPSIASMUESTRAS DE PIELASPIRADOS BROCOALVEOLARESOTROS LIDQUIDOS ORGANICOSPIEL
MEDIOS DE CULTIVOINVESTIGACION DE MICOBATERIAS
LOWENSTEIN JENSENOGAWA KUDOHSTONENENBRINGMIDDLEBROOKAGAR y CALDOS 7H9 -7H10 Y 7H11.
Factor CordónM.tuberculosis
Agar CDFactor CordónM.tuberculosis
Colonia MTB en LJ
Colonia MTB en LJ
Niacina
+ -
Reducción de Nitratos
+ -+
Cat 68°CPirazinamidasa
Pruebas bioquímicas
Métodos para Detección Rápida de M. tuberculosis a partir de la MuestraAmplificación de ácidos
nucleícos Sistemas capaces de detectar
pequeñas cantidades de materia genético (secuencias de DNA
PCR (IS6110) Secuenciación (gen 16S rRNA) Sondas. Genes de resistencia (rpoB, Kat
G) Roche: Amplicor® Mycobacterium
tuberculosis test The Gen-Probe Amplified
Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD®)
The BD ProbeTec (multiplex strand displacement system)
INNO-LIPA PCR “casera” Otros genes de resistencia: MBP64,
rpob, hsp65
PCR sensibilidad en muestras Bk +: 90–100% y en muestras Bk-: 60–70%
TRATAMIENTO FARMACOS ISONIAZIDARIMFAMPICINAPIRAZINAMIDAESTREPTOMICINAETHAMBUTOL
Pruebas de Sensibilidad
• Método de las proporciones– Directa– Indirecta
• MGIT 960• Bactec 460*• Alamar Azul • Nitrato Reductasa• Dx Molecular• Genes de resitencia:
– Rpob: Rifampicina– KG: Isoniazida
Método Proporciones directasMétodo Proporciones directas M. tuberculosis, M. tuberculosis, INH (R), RIF (R),INH (R), RIF (R), 8 D8 Díasías
ACD+PNB
ACD+INH ACD+RIF
ACD
Proporciones Indirecto
Micobacteriófagos
Micobacteriófagos (D29) s una metodología rápida que puede ser aplicada
directamente a la muestra, no requiere de
infraestructura especial y su costo es bajo. Además ha sido aplicado con éxito
en la detección de resistencia, especialmente la resistencia a rifampicina
Nuevas Pruebas para el Diagnóstico de Tuberculosis Activa
Las limitaciones de la microscopía y el lento crecimiento en los medios tradicionales para hacer diagnóstico de infección por M. tuberculosis, ha hecho que todas las herramientas nuevas están enfocadas en buscar un a metodología ideal:
La prueba ideal sería aquella que permitiera una identificación temprana del bacilo y el diagnóstico rápido de su sensibilidad especialmente la identificación de los aislamientos MDR
PRESENCIA DE BAAR Y PMN
Métodos para Aislamiento de Micobacterias Coloración para BAARColoración para BAAR::
Auramina Rodamina (AR)Auramina Rodamina (AR) KinyounKinyoun
CultivoCultivo:: Lowenstein-Jensen (LJ)Lowenstein-Jensen (LJ) Middlebrook 7H11 Middlebrook 7H11
(capa delgada: CD)(capa delgada: CD) Sistema MGIT: Sistema MGIT: PositivosPositivos::
Subcultivos a CDSubcultivos a CD Coloración para BAARColoración para BAAR
32°C - 37°C
MICOBACTERIAS ATIPICASMYCOBACTERIAS
ATIPICAS
CARACTERISTICAs•MORFOLOGIA COLONIAS
•PRODUCCION DE PIGMENTO•VELOCIDAD DE CRECIMIENTO
CUADRO CLINICO•INFECCION PULMONAR•ADENITIS CERVICALES•INFECCIONES EN PIEL•INFECCIONES TEJIDOS
• BLANDOS
DIAGNOSTICO•CLINICO
•RADIOLOGICO•MICROBIOLOGICO
•MOLECULAR
PARAMETROS PARA CLASIFICACION
1. MORFOLOGIA DE COLONIAS2. PRODUCCION PIGMENTO FOTO Y ESCOTO
3. VELOCIDAD DE CRECIMIENTO
Grupos Establecidos
GRUPO I FotocromogenasGRUPO II EscotocromogenasGRUPO III No fotocromogenasGRUPO IV Crecedores rapidos Crecedores lentos.
Clasificación de Micobacterias según el riesgo de Clasificación de Micobacterias según el riesgo de infección en humanos*infección en humanos*Grupo Riesgo IGrupo Riesgo I M. gordonae M. tokaiense M. flavescens
M. smegmatis M. gastri, M. terrae M. mucogenicum M. chitae M. parafortuitum M. hassiacum M. triplex M. phlei M. hiberniae M. triviale M. obuense M. hodleri M. vaccae. M. confluentis. M. nonchromogenicum, M. porcinum ,M. cookii M. Interjectum M. branderi M. gilvum M. aurum M. madagascariense M. sphagni M. Moriokaense M. neoaurum . M.gadium
Grupo Riesgo IIGrupo Riesgo II M. celatum ,M. chelonae ,M. fortuitum ,M. avium, M. abscessus , M. xenopi, M. malmoense, M. intracellulare, M. haemophilum, M. kansasii M. paratuberculosis, M. genavenseM. marinum, M. ulcerans, M. peregrinum, M. scrofulaceum, M. szulgai
Grupo Riesgo IIIGrupo Riesgo III M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M leprae
•*Practical handbook for the phenotypic and genotypic identification of mycobacteria
Toma de MuestraMuestras recomendadas:
Biopsias En tubo tapa rosca y estéril (seco)
Material obtenido por punción Tubo tapa rosca y estéril
Muestras No recomendadasAplicadores de algodón
RecomendacionesConfirmar diagnóstico de infección por
MNT siempre con cultivos, con la identificación de la especie
Correlacionar los resultados del laboratorio con otros hallazgos (epidemiología, clínica, histopatología)
Realizar pruebas de sensibilidad Terapia con antibióticos específica +
drenaje y/o resección
ClasificaciónFenotípica: Fenotípica:
Tiempo de crecimientoCaracterísticas morfológicas
Producción de pigmento Morfología de colonia
Reacciones bioquímicas HPLC (perfil de ácidos micólicos)HPLC (perfil de ácidos micólicos)
Genotípica:Genotípica:Detección de regiones altamente conservadas dentro del
genomaDeleciones, inserciones que son especie específicas
Clasificación por secuenciación del gen 16S rRNA PCR del gen hsp 65 con Enzimas de restricción (PRAPRA)
Lesiones
Toma de Muestras
Microcolonias NT
Identificación Fenotípica
Mic
roco
lon
ias
M.fortuitum M.chelonae
M.tuberculosis
M.aviumM.tuberculosis
Cromatografía Líquida de Alta PresiónHPLC
HPLC analiza la composición de los
ácidos micólicos de la pared de la
micobacteria, cada especie tiene un perfil específico de ácidos
micólicos. Es un método con alta sensibilidad y
especificidad. Su limitación los altos costos del equipo y personal altamente
especializado.
Identificación inicial
Tiempo de crecimiento
No cromógeno: No produce pigmento
Fotocromógeno:Produce pigmento en presencia de luz
>7 días: LENTO< 7 días: RÁPIDO
Escotocromógeno:Produce pigmento en luz y oscuridad
Identificación FenotípicaArylsulfatasa
Positiva Negativa
R. Nitratos
Positivos Negativos
NaCl
Positivo Negativo
Manitol
Positivo negativo
M. peregrinum M. fortutitum
Positivo
M. chelonae
M. abscessus
Cto. 45°C
Positivo Negativo
M. smegmatis M. chitae
Cto. 32°C
Crecedores Rápidos-No pigmentados
Identificación FenotípicaNitratr Reduction
Positive Negative
UreaseGrow NaCl
Negative
M. gordonae
Positive
M. scrofulaceum
Grow 45°Cpositive
M. xenopi
Negative
Positive
M. flavescens*
M. szulgai
Crecedor Lento - Escotocromógeno
Identificación FenotípicaNitrate Reduction
Positive Negative
Urease
Positive Negative
M. asiaticumTween H
Positive Negative
M. marinum M. simiae
Tellurite R
Positive Negative
M. Szulgai* M. kansasii
Crecedor Lento - Fotocromógeno
Identificación Fenotípica
Cultivos Rápidos en Medio Líquido
Estos sistemas miden cambios en la presión de gases como la producción de dioxido de carbono, el consumo de oxigeno.
Hacen un monitoreo continuo del cultivoMultiples estudios han mostrado las ventajas de estos
sistemas en el aumento en el porcentaje de recuperación La disminución en el tiempo de crecimiento Disminución de el % de contaminación.
Septi-Chek MGIT 960 (Tubo Indicador de Crecimiento de Micobacterias) MGIT manual Bactec 460 * BACTEC 9000MB. MB/BacT
Métodos para Realizar Diagnóstico de Infección por MicobacteriasColoración para BAAR: (Se:45-70%)
ZN Kinyoun Auramina-Rodamina
Cultivos: Medios a base de huevo (LJ- OK) Medios con fórmula definida:
(Middlebrook: 7H9-7H10-7H11-7H12*)Sistemas automatizados
Bactec 460*- MGIT (Becton Dikison) Hemocultivos
HPLCMoleculares
Sondas PCR
GRACIAS POR SU ATENCION.