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Revista Mexicana de Ciencias FarmacuticasISSN:
[email protected] Farmacutica Mexicana,
A.C.Mxico
Gallardo C., Carlos ngel; Cano E., Edgar; Lpez G., Gabriel
Eduardo; Blas V., Vanessa; Olvera R.,Roxana; Franco C., Margarita;
Ortiz B., Roco
Las ficobiliprotenas de Spirulina maxima y Pseudanabaena tenuis
protegen contra el dao heptico yel estrs oxidativo ocasionado por
el Hg2+
Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, vol. 41, nm. 2,
abril-junio, 2010, pp. 30-35Asociacin Farmacutica Mexicana,
A.C.
Distrito Federal, Mxico
Disponible en:
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57914151005
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Volumen 41 Nmero 2 Abril - Junio 2010
30
Trabajo Cientfico
Las ficobiliprotenas de Spirulina maxima y Pseudanabaena tenuis
protegen contra el dao
heptico y el estrs oxidativo ocasionado por el
Hg2+Phycobiliproteins from Spirulina maxima and Pseudanabaena
tenuis protect
against hepatic damage and oxidative stress caused by Hg2+
Carlos ngel Gallardo C.1,2, Edgar Cano E.1, Gabriel Eduardo Lpez
G.1, Vanessa Blas V.1, Roxana Olvera R.4, Margarita Franco C.3,
Roco Ortiz B.1
1Lab. de Neurobiologa. Departamento de Fisiologa Mauricio Russek
Berman, Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN
2Academia de Biologa. CECyT No. 6 Miguel Othn de Mendizabal,
IPN3Lab. de Metabolismo I. Departamento de Fisiologa Mauricio
Russek Berman, ENCB, IPN
4Departamento de Botnica, ENCB, IPN
ResumenEl objetivo fue evaluar si las ficobiliprotenas de P.
tenuis y S. maxima, protegen contra el dao heptico y estrs
oxidativo que ocasiona el Hg2+. Se emplearon 42 ratones macho
adultos, divididos en: 1) control; 2) amortiguador de fosfatos (AF)
+ 5 mg/Kg de HgCl
2 (ip); 3) AF + extracto proteico (EP) con 100 mg/kg de
ficobiliprotenas de Spirulina maxima (ig); 4) AF + extracto
proteico
con 100 mg/kg de ficobiliprotenas de Pseudanabena tenuis (ig).
Los ratones se sacrificaron y se obtuvo el hgado. Se cuantific la
LP, EROS, la catalasa y la glutatin peroxidasa y se realiz el
anlisis histolgico. Se encontr que las ficobiliprotenas de ambas
cianobacterias evitan el incremento de EROS y LP, y aumenta la
actividad de la CAT y protegen el tejido heptico.
AbstractThe aim of this work was to evaluate if
phycobiliproteins of P. tenuis y S. maxima protect from the hepatic
damage and oxidative stress caused by Hg2+. There were used 42
adult male mice, divided in: 1) control; 2) buffer phosphates (BP)
+ 5 mg/Kg of HgCl
2 (ip);
3) BP + protean extract (PE) with 100 mg/kg of Spirulina maxima
phycobiliproteins (ig); 4) BP + protean extract with 100 mg/kg of
Pseudanabena tenuis phycobiliproteins (ig). The mice were
sacrificed and the liver was obtained. LP, ROS, catalase and
glutathione peroxidase were quantified, and histological analysis
was made. It was found that phycobiliproteins from two
cyanobacterias avoid the increase of LP and ROS, and they induced a
rise of catalase that protects hepatic tissue damage caused by
Hg2+.
Palabras clave: ficobiliprotenas, proteccin heptica, mercurio y
estrs oxidativo.
Keywords: phycobiliproteins, liver protection, mercuric ion and
oxidative stress.
CorrespondenciaRoco Ortiz ButrnEscuela Nacional de Ciencias
Biolgicas, IPNCarpio y Plan de Ayala, Mxico D.F., C.P. 11340,
MxicoTel. (525) 729 6300 / 62348 Fax: (525) 729 6206e-mail:
[email protected]
Fecha de recepcin: 21 de enero de 2010Fecha de recepcin de
modificaciones: 23 de marzo de 2010Fecha de aceptacin: 11 de mayo
de 2010
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IntroduccinEn la actualidad debido a la industrializacin, los
seres vivos estn expuestos a la intoxicacin por diferentes formas
qumicas de mercurio, este metal causa diferentes efectos txicos en
un gran nmero de tejidos y rganos, ya que es de difcil eliminacin y
se bioacumula. El grado de toxicidad depende del tiempo de
exposicin, de la concentracin del metal y de la forma qumica1.
Particularmente, la forma inorgnica de este metal con valencia 2+
participa en la reaccin de Fenton donde el in mercrico (Hg2+)
reacciona con el perxido de hidrgeno produciendo radical hidroxilo,
in hidrxido y la especie metlica se reduce, lo que provoca estrs
oxidativo y dao celular2.
Los estudios de toxicidad en roedores han demostrado que el Hg2+
daa al hgado , ya que se presenta un aumento de la produccin de
especies reactivas del oxgeno (EROS) y peroxidacin de lpidos
(LP)3.
Por otro lado, se ha demostrado que la ingesta de cianobacterias
del gnero Spirulina protege contra la citotoxidad inducida por
Hg2+, CCl4, doxorrubicina, 4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina,
entre otros4,5. El mecanismo protector de la ingesta de
cianobacterias se debe a que contienen vitaminas, cidos grasos
polinsaturados, y otros fitoqumicos como las clorofilas y sus
pigmentos accesorios llamados f icobiliprotenas 6. Particularmente
en Spirulina se encontr que produce tres ficobiliprotenas,
aloficocianina, la ficoeritrina y en particular ms del 50% de sus
ficobiliprotenas las constituyen el pigmento azul ficocianina.
De hecho, se ha demostrado que los extractos proteicos ricos en
ficobiliprotenas de Spirulina tienen un poder antioxidante y
citoprotector7, y estudios recientes han demostrado que el extracto
proteico de Pseudanabena tenuis la cual es altamente productora de
ficoeritrina, protege contra el dao renal que provoca el Hg2+8. Por
lo mencionado anteriormente, fu de nuestro inters evaluar y
comparar las diferentes proporciones de ficobiliprotenas de
Spirulina maxima y de Pseudanabena tenuis ante el dao heptico
provocado por el Hg2+.
Material y mtodosObtencin del extracto de ficobiliprotenasSe
parti de la cepas Spirulina maxima y Pseudanabena tenuis, que
fueron proporcionadas por el laboratorio de Fisiologa Vegetal del
Departamento de Botnica de la ENCB. Dichas cepas fueron
identificadas por la Dra. Roxana Olvera Ramrez, del departamento de
Botnica de la ENCB.
Los cultivos se escalaron hasta tener cultivos de lote continuo
de 20 L mantenidos en medio mineral a temperatura de 24
2 C, con flujo de aire continuo proporcionado por bombas de aire
MAXIMA (Hagen) para 113.6 L, iluminacin constante (180 E / m2s) de
lmparas de halgeno (luz blanca) con ciclo de luz-oscuridad 10:14 h,
la luz encienda a las 7:00 a.m.
Para obtener el extracto de ficobiliprotenas se recuperaron 10
gramos de biomasa por filtrado al alto vaco, posteriormente se
coloc en regulador de fosfatos 100 mM pH 7.4 (RF), para darle 5
ciclos de congelacin y descongelacin. El extracto se centrifug a
3000 rpm por 30 minutos y se colect el sobrenadante para
caracterizarlo por espectrofotometra9. El extracto proteico rico en
ficobiliprotenas de Spirulina maxima, contenan 47 % de ficocianina,
37 % de aloficocianina y 16 % de ficoeritrina mientras que el de
Pseudanabena tenuis contena 2% de ficocianina, 9% de aloficocianina
y 89% de ficoeritrina.
Tratamiento de los animalesSe emplearon 42 ratones macho de la
cepa NIH que se encontraban en un peso de entre 25 y 30 gramos, los
cuales se separaron aleatoriamente en cuatro grupos: 1) control que
recibi una solucin 100 mM de amortiguador de fosfatos (AF)(ig) +
solucin salina 0.9% (ip); 2) AF + 5 mg/Kg de HgCl
2
(ip); 3) AF + extracto proteico (EP) que contena 100 mg/kg de
ficobiliproteinas de Spirulina maxima (ig); 4) AF + extracto
proteico (EP) que contena 100 mg/kg de ficobiliproteinas de
Pseudanabena tenuis (ig).
La administracin del EP o AF se realiz 30 min. antes de la
administracin de solucin salina o HgCl
2 y diariamente
durante 5 das.
Los ratones se mantuvieron en cmaras de temperatura y humedad
controlada, en cajas de acrlico de 40x40 con acceso libre a agua y
alimento, despus de 5 das de la administracin del HgCl
2 y/o solucin salina, se sacrificaron por dislocacin
cervical. Inmediatamente despus de haber realizado el
sacrificio, se obtuvo el hgado, de cada animal. La mitad del hgado
se emple para cuantificar la peroxidacin de lpidos, la formacin de
EROS, as como la actividad de enzimas antioxidantes (catalasa y
glutatin peroxidasa). Mientras que la otra mitad del hgado se emple
para realizar el anlisis histolgico por la tcnica de
hematoxilina-eosina. Todos los procedimientos experimentales se
realizaron de acuerdo a la normativa mexicana para la produccin,
cuidado y tratamiento de animales de laboratorio
NOM-082-ZOO-1999.
Anlisis bioqumicoTodos los hgados utilizados en las pruebas
bioqumicas fueron homogenizados en 3 mL de regulador de fosfatos 10
mM pH 7.4.
Evaluacin de la peroxidacin de lpidosCada muestra fue
homogeneizada en 2.2 mL de solucin salina 0.9 % para realizar la
tcnica descrita por Triss y
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Wilmore de 198410, la cual consiste en la determinacin de los
productos lipdicos de peroxidacin que son capaces de generar
fluorescencia. Para lo cual, se tomaron alcuotas de 1 mL de los
homogeneizados de cada muestra y se les adicion 4 mL de una mezcla
de cloroformo-metanol (2:1 vol/vol), despus se agitaron durante 30
segundos. Posteriormente, para permitir la separacin de las fases
acuosa y la orgnica, dichas muestras se mantuvieron a 4 C durante
30 minutos siempre protegidas de la luz. Transcurrido dicho tiempo,
la fase acuosa (fase superior) fue aspirada y desechada con una
bomba de vaco.
La fluorescencia de cada muestra se determin con ayuda de un
espectrofotmetro de f luorescencia Perkin-Elmer LS5, a longitudes
de onda de 370 nm de excitacin y 430 nm de emisin. La sensibilidad
del aparato se ajust a 140 unidades de fluorescencia con una
solucin de quinina a una concentracin de 0.001 mg/mL. Los
resultados se expresan como unidades relativas de fluorescencia
(URF)/mg de protena.
Cuantificacin de las especies reactivas del oxgenoLas EROS se
determinaron usando el diacetato de 2,7-diclorof luorescina
(DCFH-DA), el cual es desesterificado por la presencia de perxido
de hidrgeno produciendo una molcula ms oxidada (2 ,7
-diclorofluorescena o DCF), la cual es capaz de fluorescer11. El
DCF posee como propiedades una longitud de excitacin a 488 nm y una
longitud de emisin de fluorescencia mxima a los 525 nm. Para ello,
se tomaron 10 L del homogeneizado utilizado para la tcnica de
peroxidacin de lpidos y se colocaron en 1950 L de regulador
TRIS:HEPES (18:1). La fraccin diluida se incub con 50 L de DCFH-DA
por 1 hora a 37 C en agitacin constante. La reaccin se detuvo
colocando las muestras en hielo. Inmediatamente se comenz la
lectura de la fluorescencia en un espectrofotmetro Perkin-Elmer
LS5, a longitudes de onda de 488 nm de excitacin y 525 nm de
emisin, los resultados se expresan como DCF formada/h/mg de
protenas totales.
Actividad de la Glutatin peroxidasa (GPX)La actividad de la GPX
fue determinada por el mtodo de Hafeman de 197412 modificado por
Cano-Europa 200813 el cual se basa en medir en Glutatin reducido
remanente que utiliza la enzima como cofactor. Se agregaron
diecisis mL del homogeneizado a 2 mL de regulador de fosfatos 100
mM que contena EDTA 0.4 mM, Azida de sodio (NaN
3) y 2 mM de
GSH. La reaccin se incub a 37C y posteriormente se agreg 1 mL de
H
2O
2 1.25 mM. Se tom una muestra a los 5 min y
otra a los 10 min y se les agreg 1.2 mL de cido metafosfrico al
1.6%. A la ltima mezcla se le realiz una dilucin 1:2 con regulador
de fosfatos 400 mM. Finalmente, se revel la reaccin agregando 250 L
de cido 5.5-dinitrobis-2-nitrobenzoico y se ley la absorbancia a
412 nm. Los resultados se muestran en g de GSH consumido/mg de
protena/min.
Actividad de la CatalasaLa actividad de la catalasa fue medida
por medio de la tcnica de Aebi de 198414 la cual se basa en la
desaparicin del H
2O
2 a
240 nm. Se colocaron 5 L de del homogenizado en 3 mL de
regulador de fosfatos 100 mM pH 7.4 que contena H
2O
2 30
mM. Se midi la absorbancia a los 15 y 30 segundos. Los datos se
presentan como k/mg de protenas.
Estudio histolgicoLos hgados fueron fijados durante 12 horas,
para posteriormente incluirlos en parafina. Se obtuvieron 8 cortes
coronales de 7 m de cada rgano y posteriormente fueron teidos por
la tcnica de hematoxilina-eosina. El estudio microscpico se realiz
a doble ciego, analizndose 20 secciones de tejido para cada uno de
los rganos evaluados15.
Nota: Todos los reactivos empleados para las determinaciones de
fluorescencia son marca SIGMA calidad grado HPLC. Mientras que
aquellos utilizados en la determinacin enzimtica e histologa son
SIGMA calidad analtica.
Anlisis estadsticoEn las grficas de peroxidacin de lpidos, las
EROS y las actividades de la catalasa y la GPX se muestran como
valores de la media el error estndar EE. Estas variables se
analizaron utilizando un anlisis de ANOVA de una va, seguida de la
prueba de Dunnett post hoc contra el control. Los valores de P<
0.05 se consideraron estadsticamente significativos.
Resultados y discusinEl mercurio es un contaminante industrial,
que produce una serie de alteraciones en tejidos tanto de plantas
como animales. Uno de los rganos blanco de este metal es el hgado,
donde induce dao tisular, principalmente cuando se encuentra en su
forma catinica de valencia 2+, en la que es absorbido y
acumulado16. El objetivo de nuestra investigacin fue demostrar, que
los pigmentos accesorios llamados ficobiliprotenas de las
cianobacterias Spirulina maxima y Pseudanabena tenuis previenen el
estrs oxidativo causado por mercurio, as como el dao celular.
Nuestros resultados demostraron que las ficobiliprotenas
independientemente de la cianobacteria que se trate mantienen la
citoarquitectura normal del parnquima heptico (Figura 1) y evita
que se eleven los marcadores de estrs oxidativo LP y EROS (Figura
2) por lo que se sugiere que todas las ficobiliprotenas tienen las
mismas propiedades antioxidantes y citoprotectoras.
El mercurio en su forma Hg2+ causa estrs oxidativo porque tiene
gran afinidad por las protenas intracelulares que contienen grupos
sulfidrilo16.
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Los conjugados de mercurio cambian el ambiente REDOX provocando
que sea ms oxidante. El ambiente oxidante promueve reacciones
oxidativas entre las EROS y las biomolculas, como los lpidos, los
carbohidratos o los cidos nucleicos17.
En este trabajo se demostr que el mercurio incrementa las
concentraciones de lipoperxidos y de EROS. El estado oxidado es
incrementado porque el Hg2+ interfiere con la cadena respiratoria
mitocondrial aumentando la produccin de H
2O
218.
Por otra parte, se sabe que las cianobacterias del gnero
Spirulina tienen potencial nutracutico y farmacolgico debido a sus
componentes; entre ellos se encuentran algunos antioxidantes que
previenen el dao celular en diferentes modelos toxicolgicos sin
embargo, estos estudios solo involucran este gnero, por lo tanto es
importante explorar nuevas cianobacterias con diferente potencial
farmacolgico.
Hemos mostrado con este trabajo que las ficobiliprotenas de
Spirulina maxima y las ficobiliprotenas, ricas en ficoeritrina de
Pseudanabaena tenuis, son un potente antioxidante contra el estrs
oxidativo causado por mercurio as como contra el dao celular en el
hgado. En trabajos previos se encontr que la
Figura 1. Fotomicrografas del tejido heptico. a Grupo control. b
Grupo tratado con Hg2+. c Ficobiliproteinas de S maxima 100mg/kg +
s.s. d Ficobiliproteinas de P tenuis 100mg/kg + ss. e
Ficobiliproteinas de S maxima 100mg/kg + Hg2+. f Ficobiliproteinas
de P tenuis 100 mg/kg + Hg2+ . El tratamiento con Hg2+ ocasion
atrofia, prdida de los cordones de hepatocitos, vasocongestin y
prdida de los ncleos. (Flechas en b). Las alteraciones histolgicas
no se presentaron en los grupos tratados con ficobiliprotenas de
ambas cianobacterias (e y f).
Figura 2. Cuantificacin de la peroxidacin de lpidos (a),
especies reactivas del oxgeno (b), y la actividades de las
peroxidasas: catalasa (c) y GPX (d). Se representa la media EE.
*P< vs. Control.
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dosis que mantiene un ambiente REDOX es la de 100mg/Kg de
ficobiliprotenas y mantiene la citoarquietectura del rin8, la cual
tambin protege totalmente al hgado.
Se proponen tres mecanismos por los cuales las ficobiliproteinas
ejercen un efecto protector, el primero involucra la reduccin de
marcadores oxidativos debido a su propia estructura qumica de
tetrapirroles lineales ya que pueden actuar como potentes
nuclefilos pudiendo neutralizar a las especias reactivas derivadas
del oxgeno y nitrgeno evitando dao oxidativo. Esta hiptesis fue
demostrada tanto in vitro19 como in vivo20.
El segundo mecanismo protector de las ficobiliprotenas pudiera
deberse a sus propiedades quelantes, ya que se sabe que estos
pigmentos son usados para concentrar metales pesados21. El tercer
mecanismo involucra el incremento del sistema enzimtico
antioxidante. Este ltimo puede observarse por el aumento de la
actividad destoxificadora de la catalasa (Figura 2) que produce una
disminucin de la cantidad de H
2O
2. Es posible
que los tetrapirroles lineales de las ficobiliprotenas mimeticen
los efectos de dicha enzima8.
ConclusionesPodemos concluir que las ficobiliprotenas de las
cianobacterias son potentes sustancias antioxidantes y
hepatoprotectoras independientemente de la cianobacteria de la que
provengan.
AgradecimientosEste estudio fue parcialmente f inanciado por el
proyecto 20090485 SIP-IPN. O-B, R. es becaria EDI, COFFA y SNI.
G-C, C.A. y L-G, G. E; B-V, V. son becarios CONACyT.
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