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Fitopatología 2007
VIRUS Y VIROIDES FITOPATOGENOS
II
Ing. Agr. Elisa Silvera Pérez
2
Virus y viroides fitopatógenos
w Introducción w Características generalesw Características biológicasw Taxonomía w Desarrollo de la enfermedad w Influencia del ambientew Criterio de manejow Diagnóstico
3
Criterio de manejo
w No se disponen métodos directos de control w Medidas de manejo
indirectas: disminuir fuente de inóculolimitar la dispersión
4
Desarrollo de la enfermedad
Fuente de inóculo
DiseminaciónInoculación
Penetración
Transmisión
Colonización
Síntomas
Material de propagación
Plantas
2
5
Medidas tendientes a reducir inóculo inicial
w Material de propagación sano Semillas:
embrión: Lettuce mosaic potyvirus(LMV); Squash mosaic comovirus (SqMV)(cucurbitáceas). Plantas sanas, producidas en cutivos aisaldos
envolturas: Tomato mosaic tobamovirus (ToMV) (tomate) 72 h, 70ºC /24 h, 80 ºC; Cucumber green mottle mosaic tobamovirus (CGMMV) (pepino) 72 h, 70 ºC
6
Medidas tendientes a reducir inóculo inicial
w Material de propagación sano:Multiplicación vegetativa (tubérculos, bulbos, estacas)Termoterapia (agua/aire caliente)Cultivo de meristemas Microinjerto
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Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Termoterapia
w Consiste en la aplicación de altas temperaturas a las plantas completas o partes aisladas:
40 ºC, 7 días - erradicación de Alfalfa mosaic virus(AlMV)
40 ºC, 9 días - erradicación de Cucumber mosaic cucumovirus (CMV)
(Walkey, 1976)
8
Porcentajes de plantas que resultaron negativas al virus Grapevine rootstock stem lesion-associated virus (GRSLaV) mediantepruebas DAS-ELISA según el período de termoterapia (37ºC) y posteriorcultivo in vitro
0 a1080
10Plantas saneadas
0 a10100
10 a1060
80 b1040
10 a1020
0 a100
Negativas (DAS-ELISA) (%)
RepeticionesTratamientos (días)
Camacho, 2005 Universidad de Chile, Faculta de Ciencias Agronómicas
3
9
Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Producción de plantas a partir
de cultivo de meristema
w El proceso de cultivo in vitro incluye varias etapas:a. I. Establecimiento del cultivo aséptico. b. II. Propagación de propágulos sanos (subcultivos). c. III. Enraizamiento de los propágulos obtenidos. d. IV. Transplante a suelo y acondicionamiento a
invernadero
10
Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Cultivos de tejidos in vitro y
termoterapia
Ali, 1997
11
Obtención de ajos libres de virus mediante termoterapia y cultivo in vitro. Alicia, B; Muñoz, C.; Escaff, M.INIA, Est. Exp. La Platina, Chile. II Congreso Nacional de Fitopatología, 1993.
Los tipos de ajos blancos y rosados cultivados en Chile se han encontrado afectados por el virus del Enamismo Amarillo de la Cebolla (Onion yellow dwarf potyvirus = OYDV). Con el objeto de producir semilla de ajo libre de virus se efectuaron estudios de termoterapia y de cultivo de meristemas apicales. En un primer experimento, ajos Rosado-INIA fueron sometidos a aire caliente a 30°C por una semana, seguido por 36°C por 2 semanas y luego a 38°C por 3 semanas. Las plantas testigos se mantuvieron a 20°C por todo el período (45 días). A continuación de la termoterapia se efectuó la extracción de los meristemas apicales de alrededor de 0,5 a 0,8 mm de largo, los que se colocaron en medio de cultivo B5 modificado. A los 90 días los explantes se transplantaron a invernadero donde se realizó el Test de ELISA para determinar la condición sanitaria de las plantas tratadas.Con cultivo in vitro se logró un 55 a 70% de plantas sanas y con la combinación de termoterapia y cultivo invitro se obtuvo un 100% de plantas sanas. Los controles resultaron con 100% de infección con OYDV.
12
Eliminar fuentes de inoculo
w Malezasw Cultivos infectados w Plantas espontáneas w Plantas del cultivo
4
13
Medidas tendientes a limitar la dispersión
w Control de los vectoresInsecticidasUso de barrera físicaw Cambio en la fecha de siembra o plantaciónw Aislamiento de las plantacionesw Densidad de plantación w Destrucción de partes aéreas de las plantas
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Control de vectores: insecticida
Gray et al. Insecticidal control of cereal aphids and its impact on the epidemilology of the barley yellow dwarf luteoviruses. Crop Protection 15(8):687-697. 1996
Porcentaje de plántulas de avena tratadas conimidacloprid o sin tratar inoculadas con BYDV-PAV por Rhopalosiphum padi o Sitobion avenae, a los 10 o 24 días después de la emergencia
Incidencia Barley yellow dwarf luteovirus en trigo de invierno en siembra tempranas y tardías
28/10/94
2/5/95
9/9/94 4/10/94
15
Control de vectores: barrera de plantas
Hooks & Fereres. Protecting crops from non-persistently aphid-transmitted viruses: A review on the use of barrier plants as a management.Virus Research 120: 1-16. 2006. 16
Control de vectores: Progreso de la infección por CMV en parcelas
protegidas por cultivos barrera
Cultivos barrera (maíz y girasol) en el momento de transplante del pimiento
Avilla et al. Cultivos barreras como método de control de virus no persistente en pimiento. Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996
5
17
Control de vectores: Progreso de la infección por CMV en parcelas
protegidas por cultivos barrera
Avilla et al. Cultivos barreras como método de control de virus no persistente en pimiento. Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996
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Número de pulgones capturados a lo largo del tiempo en trampas verdes localizadasen parcelas de pimiento protegido por cultivos barrera. 1995
Avilla et al., 1996Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996
19Fuente: Cañedo, 1997
Aislamiento de las plantaciones
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Medidas tendientes a limitar la dispersión: Higiene
w Virus transmisión mecánica o contacto* Tobacco mosaic tobamovirus (TMV); ToMV; Pepper mildmottle tobamovirus (PMMV), suelo con restos de plantas infectadas (Desinfección de suelo con vapor de agua 90 ºC 15 m ToMV)Estructuras de invernaderos, lavado con desinfectanteDesinfección de manos y herramientas de trabajo fosfato sódico y alcohol SqMV cucurbitáceas (Lecoq et al., 1988)Lavar manos con fosfato sódico (3%), jabón y agua. Herramientas desinfección con fosfato sódico (3%), ToMV tomate (Broadbent, 1976)
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Protección cruzada
w Se basa en la atenuación o supresión de los síntomas causados por una cepa severa de un virus si la planta ha sido infectada previamente por una cepa atenuada relacionada con la anterior
w Citrus tristeza closterovirus (CTV); ToMV w Limitante
- virulencia de cepas varía entre especies y variedades- posibles efectos sinérgicos del virus protector con otros virus
o patógenos- variabilidad cepa atenuada cepa severa
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Protección cruzada
Firibourg & Fernández-Northcote, 1972Fitopatología 7 (1-2):23-29. 1972
Hoja de Capsicum pendulum var. escabeche inoculada con aislamiento A2 de TMV(1) Mitad inoculada con aislamiento A1 antes de inocular la hoja con A2(2) Mitad sin inocular
(1) (2)
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Resistencia genética y tolerancia
Términos de resistencia relacionado a la producción de síntomas y multiplicación del virus
Walkey, 1991
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Resistencia genética y tolerancia
w Inmunidad: cebada, Barley yellow mosaic virus(BaYMV) w Resistencia: pepino CMV; lechuga
LMV; morrón PMMV; papa Potato leaf rollluteovirus (PLRV), Potato X potexvirus (PVX), Potato Y potyvirus (PVY); soja Soybean mosaicpotyvirus (SMV); remolacha Beet western yellowluteovirus (BWYV); tomate ToMV, Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV); duraznero y ciruelo PPV
7
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Resistencia al vector
w Resistencia a insectosCaracterísticas fenotípicas o fisiológicas de las plantas (exudados pegajosos, pubescencias de las hojas hojas, caract. estructurales del tejido que dificulte acceso del insecto al floema)Plantas de melón: resistencia a CMV por la no preferencia de Aphis gossypii
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Resistencia por ingeniería genética
w Plantas trangénicasPlantas transformadas con secuencias de ac. nucleicos de virus (secuencia de la proteína de la cápsida viral, secuencias relacionadas con la replicasavirales)Resistencia a la infección o atenúan los síntomas de la enfermedadActúa en fases iniciales de la infección, replicación del virus, dispersión en la planta o desarrollo de síntomas
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Resistencia por ingeniería genética: Plantas con secuencias de la proteína de la cápside viral (PC)
w Plantas transformadasAlMV / tabaco, tomate, alfalfa CMV/ tabaco, calabacínPVX / papa, tabacoPVY / papaTMV / tabaco, tomateTSWV / tabaco
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Resistencia por ingeniería genética: Plantas con secuencias de la proteína
de la cápside viral (PC)
w Efectos infección viral Disminución del nº de sitios de infección en hojas inoculadasSíntomas sistémicos demoran o no se manifiestanMenor acumulación de virus en las hojas inoculadas w Mecanismo de resistencia
Bloqueo del ensamblaje del virus infectivo por expresión trangénica PC
8
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Porcentajes de plantas de tomate con síntomas del “virus de la peste negra del tomate” (TSWV) en 6 ambientes de evaluación.Tipos de cultivares evaluados:
R= Resistentes, T = Tolerantes o S = Susceptibles.
< 0,1 %
< 1 %
< 5 %
Adecuado
Adecuado
Temprana
< 15 %< 5 %< 5 %< 5 %Resistente
> 60 %< 10 %< 10 %< 5 %Tolerante
> 90 %> 70 %> 40 %< 5 %Susceptible
Inadecuado o nulo
Adecuado 2 aplicaciones en todo el ciclo
Adecuado2 aplicaciones/ sem. hasta 60 d. post-transplante
AdecuadoControl del vector
Inadecuado o nulo
AdecuadoAdecuadoAdecuadoControl de maleza
Tardía Tardía Tardía TempranaMomento de implantación
Mitidieri.http://www.inta.gov.ar/sanpedro/info/doc/pdf/mmitidieri_mi.pdf.
30
Ciclo del Mosaico enanizante del Maíz causado por Maize dwarf mosaic potyvirus (MDMV)
Fuente: Instituto de Fitopatología y Fisiología Vegetal INTA-JICA, 1999
Medidas de manejo:• Usar materiales tolerantes y/o resistente al
virus• Control del sorgo de alepo y malezas dentro
de los cultivos
31
Diagnóstico
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Diagnóstico
w Dificultades: Pequeño tamañoPoca diversidad morfologica Síntomas similares Síntomas variables: n cultivar n condiciones ambientales
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Postulados de Koch modificado por Bos (1981)
1. El virus debe encontrarse siempre asociado a la enfermedad
2. Debe ser aislado de la planta enferma (separarlo de otros patógenos, multiplicarlo en un hospedero, purificarlo, determinar sus propiedades intrínsecas)
3. Reproducir los síntomas en planta sana inoculada4. Demostrar que el virus se encuentra en la planta
inoculada y debe ser re-aislado
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Diagnósticow Planta con síntomas w Distribución de los síntomas en la plantaw Distribución de los síntomas en el campow Análisis de otros datos w Transmisión: Ensayos de infectividad/ Forma de
transmisiónw Estudio de inclusiones celularesw Observaciones de partículas virales al microscopio
electrónicow Serologíaw Técnicas moleculares
Consulta
bibliográfica
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Síntomas
36
Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO
Enanismo en planta de papa infectada con PVY
Reducción en el crecimiento
10
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Mosaico
Mosaico en hojas de tabaco, TMV
Foto: http://www.apsnet.org/education/LessonsPlantPath/Top.html38
Arabescos
Foto: Moreno en Llácer et al. Patología vegetal. 1996
Arabescos y anillos cloróticos en hoja de rosal, Prunus necrotic ringspot ilarvirus (PNRSV)
39
Clorosis localizadas
Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO
Anillos cloróticos en hoja de morrón
40
Necrosis
Foto: Moreno, en Maruchi, Instituto de Investigaciones Tropical
Desecación en tronco de naranjo dulce, Psorosis A
11
41
Necrosis
Anillos necróticos en frutos de tomate, TSWV
Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO
42
Necrosis
Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO
Planta de lechuga con amarillamiento y necrosis foliar, TSWV
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Deformaciones
(a) Raiz normal (b) raíz con (CVY) Carrot virus Y Foto: Lindrea et al. Research, 100 (1): 89-99. 2004
a
b
Acanaladuras y sobrecimiento en troncos de viníferas, Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV)Foto: Barcelos. http://www.cnpuv.embrapa.br/publica/sprod/UvasViniferasRegioesClimaTemperado/virus.htm
44
Distribución de los síntomas en el campo
w Generalizada
Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO
Cultivo en invernáculo con plantas de lechuga afectadas por TSWV
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45
Distribución de los síntomas en el campo
w Parcial: bordes,fila manchones al azar
Plantas sanas Plantas Enfermas46
Distribución síntomas en el campo
Silva-Vera et al. Agrociencia 35 (4). 2001http://www.colpos.mx/agrocien/Bimestral/2001/jul-ago/art-8.pdf
Esquema de la distribución de plantas infectadascon CTV
47
Ensayos de infectividad
w Misma espéciew Plantas indicadoras: Nicotiana, Solanum,
Chenopodium, Cucumis, Phaseolus, Vicia, Brassica
Sin síntomas
Lesiones locales Lesiones sistémicasFuente: Unidad de Fitopatología, FAGRO
48
Bioensayos con plantas indicadoras
Ortega et al. INCI 32(3) 2007
13
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Plantas indicadoras de virus y viroides cítricos
Planta Indicadoras
Patógeno Indicador
Tristeza Limón criollo
Psorosis Naranja dulce Hamlin, mandarina común o naranja agria
Petrificación Grapefruit, proveniente de semilla
ExocortisCidra Ethrog Arizona 861-5-1 injertado sobreCitrus volkameriana Gynura aurantiaca, Petunia spp.
Ortega. Método de detección virus y viroides en cítricas. FONAIAP-Divulga, 22. 1986
50
Forma de transmisión
w Mecánica
w Injerto
w Vectores
51
Forma de transmisión: Mecánica
Agrios, 199552
Forma de transmisión:Injerto
Agrios, 1995
14
53
Forma de transmisión: Injerto
Agrios, 1995
54
Estudio de las inclusiones celulares
Inclusiones en forma de “pinwheel” en células de plantas infectadas por un potyvirus, microscópio electrónico
Foto: Gergerich & Dolja, 2006 APSnet
55
Estudio de las inclusiones celulares
Inclusiones granulares de un geminivirus afectando la pared celular de células floemáticasen plantas de tomate, microscopio óptico. (Foto: Villalba) http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/images/galileo4.jpg 56
Observación de partículas virales al microscopio electrónico
w Extractos brutos o parcialmente purificados w Estudio de partículas e inclusiones en secciones
ultrafinas de los tejidos enfermos w Forma y tamaño partícula viral
Limitantes:Concentración baja del virusTejidos infectados con dos o más virus de morfología similar o diferente pero se distribuyen irregularmente (Inmuno-Microscopía electrónica)
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Observación de partículas virales al microscopio electrónico
Partículas virales de un geminivirus (Foto: R. Lastra) http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/nbusta-3.htm
58
Observación de partículas virales al microscopio electrónico
Observación bajo el microscopio electrónico de transmisión de muestras de plantas de cebadas afectadas con síntomas de estrías negras en las hojas. Típica partícula encontrada en plantas infectadas (30.000x). Foto: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0365-28072001000300003&script=sci_arttext
59
Observación de partículas virales al microscopio electrónico
Partículas de TSWVFoto: http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/refs.htm
60
Serología
Reacción antígeno - anticuerpo
w Inmunodifusón en gel (reacción precipitina)w ELISA (cambio de color de sustrato
degradado por la enzima)w Kits comerciales
16
61
Inmunodisfusión en gel
Teste inmuno-difusión con antisuero producido de conejo inmunizado con extracto de plantas con Cowpea severe mosaic comovirus (CSMV) y Papaya lethal yellowing virus (PLYV) A: Antisuero CSMV; B: Antisuero PLYV; Cp: extracto de planta con CSMV; Pl: esxtracto de plantas con PLYV; H: extracto planta sin CSMV y PLYV
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ELISA (Enzyme-Linked InmunoSorbent Assays)
Representación esquemática de la técnica de DAS-ELISA doble sandwich de anticuerpos para detección indirecta de un virus con anticuerpos monoclonales
Microplaca de la técnica de DAS-ELISA después de la adición del sustrato de la enzima, cavidades con coloración amarilla de la enzima indicando reacción antígeno-anticuerpo y la intensidad la concentración
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Kit comercial
Fabricante: Loewe Biochemica GmbH
64
Sensibilidad aproximada de diferentes técnicas de detección de virus
Walkey, 1991
17
65
Técnicas moleculares
w Electroforesis w Hibridación de ácido nucleicow Reacción de polimerasa en cadena (PCR)
Trascripción inversa- PCR (RT-PCR)
66
Electroforesis
w Separación de moléculas cuando migran en un campo eléctricow Posición de las bandas depende del tamaño de las
moléculas y la carga a que se trabaja
Partícula entera Proteína del virusÁcido nucleico
67http://www.scielo.br/img/revistas/pab/v40n2/23828f1.jpg
68
Hibridación de ácidos nucleicos
w Dotblotw Squashblot
Esquema de la técnica de hibridaciónFuente: Llácer, 1996
18
69
Hibridación de ácidos nucleicos:Dotblot
Detección de un geminivirus mediante hibridación molecular. Los círculos negros indican la presencia del virus en la muestra analizada. (Foto: Rivas).
http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/nbusta-3.htm
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RT-PCR
Diagrama de RT-PCR usado para la detección de virus y viroides. RNA primero trascripción inversa para ADNc usando oligonucleotídeosiniciadores antisenso, luego inicia amplificación exponencial por multiplos ciclos de PCR usando oligonucleotídeos sense y antisenso
Fuente: Pallás et al. Options Méditerranéennes, Série B/19
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Electroforesis en gel de agarosa del producto obtenido del RT-PCR de muestras de campo para detectar presencia del Hop stunt viroid (HSVd). Linea 1, marcador de PM; Linea 2, muestra de durazno infectado con HSVd; Lineas 3-6, muestras de diferentes árboles apricot. Muestras 3-5 infectadas con HSVd mientras que la 6 está libre del viroide.
Fuente: Pallás et al. Options Méditerranéennes, Série B/19 72
¿Sensibilidad entre las técnicas DAS-ELISA y RT- PCR?
Camacho, 2005 Universidad de Chile, Faculta de Ciencias Agronómicas
19
73
Selección de técnicas
w Detectar un virus conocido en una o muchas plantas
w Diagnóstico de virus: conocido o nuevo
w Tipo de agente (virus o viroide)
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Características de la técnica
w Precisow Reproducible w Sensibilidadw Tiempow Costow Complejidad
75
Selección de técnicas
w Diagnóstico de una enfermedad causada por un nuevo virus
w Diagnóstico de una enfermedad causada por un viroide conocido
w Detección de un virus de material propagativo vegetativo
76
Bibliografía
w Agrios, G.N. Fitopatología. México, Noriega. 1995. w Gepp, V. Virus y viroides fitopatógenos. Dpto. de
Publicaciones de la Facultad de Agronomía, Montevideo, Uruguay. 27 p. 1996.
w Gergerich, R.C.& Dolja, V.V. Introduction to Plant Viruses,the Invisible Foe. The Plant Health Instructor. <http://www.apsnet.org/education/IntroPlantPath/PathogenGroups/plantViruses/default.htm>. 2006.
w ICTVdB, Descriptions. International committee on taxonomy of viruses, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/>