formación de colonias en tres líneas celulares diferentes ... · En esta parte del trabajo, se presentan experimentos que por primera vez asocian la ... Montpellier, France) e incubados

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formación de colonias en tres líneas celulares diferentes que no expresan la SLC5A8, pero no

en tres líneas celulares que sí expresan SLC5A8. Por lo tanto, los autores propusieron a

SLC5A8 como un gen supresor de tumores en cáncer de colon, pero no aportaron ninguna

explicación al efecto supresivo, pero observaron una alta concentración de sodio intracelular

en ovocitos de X. laevis que expresan la SLC5A8 (Li et al., 2003).

Varias publicaciones en 2004, reportaron que en ovocitos de X. laevis que expresan la SLC5A8

se observan corrientes inducidas por monocarboxilatos en condiciones de Voltage-Clamp

(Coady et al., 2004; Gopal et al., 2004; Miyauchi et al., 2004). Los monocarboxilatos (entre

ellos lactato, piruvato, acetato, propionato, butirato y nicotinato) serían sustratos de SLC5A8.

Como era de esperarse para un transportador pasivo de yodo, ninguna corriente inducida

por el yodo fue observada en estos experimentos. Un aumento en la captación de

monocarboxilatos fue observada en ovocitos que expresan la SLC5A8, en comparación con

los ovocitos control. En consecuencia, se propuso que el rol fisiológico de SLC5A8 es el

transporte acoplado al sodio de lactato en el riñón y de butirato en el colon.

Por décadas, se ha observado que la fibra en la dieta reduce el riesgo de cáncer de colon. En

el lumen del colon, monocarboxilatos (como el butirato) son producidos por fermentación

bacteriana, y se ha propuesto que estos podrían ser responsables del efecto supresor de

tumores de la fibra. Adicionalmente, se ha mostrado que el butirato es un inhibidor de las

deacetilasas de histonas (HDACs). La inhibición de las HDACs promueve la diferenciación en

las células epiteliales de colon, pero induce apoptosis en las células tumorales. Así, se

propuso que SLC5A8 puede funcionar como un cotransportador sodio/monocarboxilatos

(butirato, propionato y piruvato), y que el efecto supresor de tumores de la proteína estaría

relacionado con la inhibición de las HDACs inducida por el aumento en la concentración de

estos monocarboxilatos, mediada por su captación a través de SLC5A8. Para soportar esta

hipótesis, realizaron experimentos en los que muestran que la expresión de genes

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involucrados en la apoptosis o en la sobrevida celular es modificada (Ganapathy et al., 2008),

y que la expresión de SLC5A8 induce muerte celular en células de la línea MCF-7 (células

tumorales de seno) en presencia de piruvato (Thangaraju et al., 2006), o en células de la línea

SW480 (células de cáncer de colon) en presencia de butirato (Thangaraju et al., 2008) o

piruvato (Thangaraju et al., 2009). Sin embargo, esta hipótesis no explica el rol fisiológico de

SLC5A8 en la tiroides.

Los primeros análisis realizados sobre un ratón invalidado para la proteína SLC5A8 han sido

muy informativos (Frank et al., 2008). Primero, la pérdida de la expresión de SLC5A8 no

incrementa la susceptibilidad a la formación de tumores en el colon. Adicionalmente, no se

observaron diferencias en el transporte de butirato o propionato en el colon, lo que es

explicado por los autores por una captación predominante de estos monocarboxilatos por

otros transportadores o por una difusión facilitada. Sin embargo, la pérdida de la expresión

de SLC5A8 alteró la reabsorción de lactato en el riñón y en las glándulas salivares, y la

captación dependiente de sodio de lactato en el colon. Estos resultados confirman una

relación entre el transporte de monocarboxilatos y la expresión de SLC5A8, pero sugieren

que esta actividad de transporte no está directamente relacionada con la función supresora

de tumores a través de la inhibición de HDACs. Además, no se encontró ninguna disfunción

en la tiroides en los ratones invalidados para SLC5A8, indicando que esta proteína no es

indispensable para el normal funcionamiento de la tiroides.

Los resultados obtenidos con el ratón invalidado para SLC5A8 sugieren que la pérdida de la

expresión de esta proteína no es importante en la inducción de tumores. Sin embargo, es

extraño el creciente número de publicaciones que reportan el silenciamiento por metilación

del gen que codifica para SLC5A8 en cáncer en diferentes órganos: colon (Li et al., 2003),

recto (Dong et al., 2005), estómago (Ueno et al., 2004), tiroides (Lacroix et al., 2004, Porra et

al., 2005), cerebro (Hong et al., 2005), próstata (Park et al., 2007), páncreas (Park et al.,

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2008), cabeza y cuello (Bennett et al., 2008), y en sangre (Whitman et al., 2008). Por lo tanto,

se requiere una mejor comprensión de la función de SLC5A8 y su efecto supresor de

tumores.

En esta parte del trabajo, se presentan experimentos que por primera vez asocian la

expresión de SLC5A8 con una actividad tipo canal implicada en la regulación de la glándula

tiroides por el yodo. Dicha actividad tipo canal podría también explicar el efecto

antiproliferativo de la expresión de SLC5A8 y su función supresora de tumores.

A. 1. MATERIALES Y MÉTODOS

a. Plásmidos

La región codante del gen que codifica para la proteína hSLC5A8 fue subclonada en un

plásmido pcDNA3.1 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) como ha sido descrito previamente

(Rodriguez et al., 2002). Para el seguimiento de la transfección transitoria de SLC5A8 en

células de mamífero, el ADNc de SLC5A8 fue subclonado en un plásmido pIRES-EGFP

(Clontech, St-Quentin-en-Yvelines, France). De igual forma, se construyó un plásmido

derivado con ADNc que codifica una proteína SLC5A8 fusionada por el extremo C-terminal a

una proteína Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP).

b. Cultivo celular

Se cultivaron células de la línea HEK-293 (Human Embryonic Kidney), o HeLa (derivada de

cáncer de cérvix) en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino,

10 mM L-glutamina y 0.01 mg/mL de gentamicina, en una atmósfera húmeda con 5% de CO2.

78

Todos los medios de cultivo, suplementos y reactivos se obtuvieron de Invitrogen (Cergy

Pontoise, France).

c. Transfecciones

Las células HEK fueron sembradas en cajas de cultivo de 35 mm de diámetro cubiertas con 10

mg/mL de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), a una densidad de 3 x

106 células/75 cm². En general, las transfecciones se realizaron al día siguiente, a

aproximadamente 40% o menos de confluencia, utilizando el reactive FuGENE 6 (Roche,

Meylan, France), siguiendo el protocolo propuesto por el fabricante. Para cada experimento,

la eficiencia de transfección fue estimada utilizando un ensayo de fluorescencia con la

proteína EGFP. Usualmente, entre el 30 y el 50% del total de las células expresaron la

proteína SLC5A8.

d. Medidas electrofisiológicas en células transfectadas de mamífero

Las células transfectadas expresaron la proteína EGFP, tomando una coloración verde bajo

una luz ultravioleta en un microscopio de fluorescencia Nikon. Células individuales

transfectadas fueron estudiadas utilizando la técnica de Patch-Clamp. La solución externa

contenía 150 mM de NaCl, 1mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 y 10 mM de HEPES, y se ajustó el

pH a 7.4 con NaOH. La solución interna (o solución de pipeta) contenía 150 mM de KCl, 3 mM

de MgCl2, 5 mM de EGTA y 10 mM de HEPES, y se ajustó el pH a 7.2 con KOH. La célula bajo

estudio fue constantemente perfundida con ayuda de un sistema de microperfusión (0.01

mL/min) a temperatura ambiente, y el potencial de reposo fue fijado a -60 mV. Las células

fueron perfundidas con soluciones 0.1 mM de diferentes monocarboxilatos (butirato,

propionato, piruvato, nicotinato y lactato; Sigma-Aldrich), de ácidos hipohalosos 1 µM (ver

abajo), y soluciones de yodo oxidado 1 µM. La corriente requerida para mantener el

79

potencial fijado fue registrada con ayuda de un Multi Clamp 700A from Axon Instruments

(Molecular Devices, Sunnyvale, USA).

e. Preparación de los ácidos hipohalosos

Una solución stock de HOCl se preparó por dilución de una solución concentrada de NaOCl

(Sigma-Aldrich) en agua, hasta una concentración final de 30 mM. Esta solución stock fue

diluida en la solución externa, antes de adicionarla a las células. El HOI/I2 se preparó

mezclando volúmenes iguales de NaI 35 mM (Sigma-Aldrich) y HOCl 30 mM durante 60

minutos.

f. Preparación del ARNc de SLC5A8 y aislamiento e inyección de ovocitos de X. laevis

El ARNc de SLC5A8 fue sintetizado a partir de un vector de clonación pcDNA3.1 (ver arriba)

con el mMessage mMachine T7 Ultra kit (Ambion, Applied Biosystems, Courtaboeuf, France),

siguiendo las recomendaciones del fabricante. Partes de los lóbulos de ovarios fueron

removidos de hembras de X. laevis anestesiadas (compradas en el Centre d’Elevage du CNRS,

Montpellier, France) e incubados durante 4 horas a 18 °C en una solución de Ringer libre de

calcio (Ori) que contenía 2 mg/ml de colagenasa (tipo A, (Sigma-Aldrich)), 1 mg/ml de

inhibidor de tripsina (Sigma-Aldrich) and 0.1 mg/ml de gentamicina (Invitrogen)). Los

ovocitos en etapa de desarrollo V-VI fueron microinyectados (microinyector Nanoject II,

Drummond, Broomall, PA, USA) con 23 ng de ARNc de SLC5A8 y conservados en solución Ori

a 18°C hasta el momento de ser utilizados en los experimentos. La composición de la solución

Ori fue: 110mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 y 5 mM de HEPES

(pH 7.5).

80

g. Medidas electrofisiológicas de ovocitos de X. laevis inyectados

Para estudiar las corrientes asociadas a la SLC5A8 clonada en los ovocitos, se utilizó la técnica

de Voltage Clamp convencional de dos microelectrodos. Todos los experimentos fueron

realizados con los ovocitos de 4 a 6 días después de la inyección del ARNc de SLC5A8. El

potencial de reposo de los ovocitos se fijó a -40 mV y la corriente necesaria para mantener

dicho potencial fue medida (Dagan TEV-200A Two Electrode Voltage Clamp). Durante los

experimentos, cada ovocito se mantuvo bajo perfusión constante (con un flujo de

aproximadamente 1.5 mL/min) con una solución experimental (TpNa) que contenía: 100 mM

de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2 y 10 mM de HEPES (pH 7.5),

suplementado con monocarboxilatos o yodo, según lo indicado. La solución de pipeta

contenía KCl 3 M.

h. Medidas de la concentración de hormonas en el suero

La concentración de las hormonas T3 y T4 en el suero fue medida por RIAs, por duplicado, en

el suero de ratones invalidados para el gen que codifica la proteína SLC5A8. Estos ratones

fueron previamente desarrollados en la Unidad TIRO (Trabajo en publicación).

i. Ensayos de proliferación celular in vitro

Las células de la línea HEK-293 fueron sembradas en cajas de cultivo de 12 pozos cubiertas

con 10 mg/mL de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France), a una densidad

de 1 x 106 células/75 cm². En general, las transfecciones se realizaron al día siguiente, a

aproximadamente 30% o menos de confluencia, utilizando el reactivo FuGENE 6 (Roche,

Meylan, France), siguiendo el protocolo propuesto por el fabricante. Las células fueron

81

cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% SFB en tres condiciones experimentales:

1) Medio control, 2) medio sin piruvato y 3) medio suplementado con 0.1 mM de una forma

no metabolizable de vitamina C (ácido D-ascórbico; Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier,

France). Se prepararon tres pozos para cada condición experimental y 9 imágenes,

correspondientes al mismo campo (determinado por marcas en la caja de cultivo) fueron

tomadas por pozo, para cada día. La adquisición de imágenes se realizó 1, 2 y 3 días después

de la transfección, utilizando un microscopio Zeiss Axiovert 200M equipado con una cámara

CoolSnap CCD (Photometric) y el programa METAView (Roper Scientific, Evry, France). Las

células que expresaron la proteína SLC5A8 fusionada con la EGFP fueron contadas utilizando

una imagen de fluorescencia y las células totales utilizando una imagen de contraste de fase

del mismo campo.

j. Análisis estadístico

El Error Estándar de la Media (S.E.M por sus siglas en inglés) fue calculado para todos los

experimentos utilizando el programa Excel. Igualmente, se realizó una prueba t de Student

para determinar diferencias significativas, utilizando el programa SigmaStat (Systat Software

Inc., London, UK).

A. 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

a. La transfección transitoria de SLC5A8 en células de mamífero induce una conductancia de sodio

activada por monocarboxilatos y bajas concentraciones de yodo oxidado

Las Corrientes inducidas por monocarboxilatos ya han sido descritas en ovocitos de X. laevis

inyectados con el ARNc de SLC5A8, así como la captación de monocarboxilatos marcados

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radioactivamente en células de mamíferos que expresan la SLC5A8. Juntos, estos resultados

indicarían que la SLC5A8 es un cotransportador sodio/monocarboxilatos. En este trabajo se

investigó si las corrientes inducidas por los monocarboxilatos pueden ser observadas en

células de mamífero que expresen la SLC5A8. Células de la línea HEK-293 fueron

transfectadas de forma transitoria con el ADNc que codifica la proteína SLC5A8. Un primer

set de experimentos fue realizado con el ADNc que codifica para la proteína SLC5A8

fusionada a la proteína EGFP, lo que permitió verificar la expresión de esta proteína a nivel

de la membrana plasmática de las células. Los experimentos de Patch-Clamp fueron

realizados 48 horas después de la transfeccción. Como se ilustra en la Figura 10A con un

experimento típico, los monocarboxilatos estudiados (butirato, propionato, piruvato,

nicotinato y lactato) inducen una corriente de entrada en las células HEK que expresan

SLC5A8. Aunque la concentración de las soluciones de monocarboxilatos siempre fue la

misma (0.1 mM), de una célula a otra la amplitud de las corrientes fue variable. Esta variación

puede estar relacionada con diferencias en la expresión de proteínas de una célula a otra. En

general, para todas las células, los cinco monocarboxilatos estudiados indujeron corrientes

de la misma amplitud relativa, siendo las corrientes de mayor intensidad las de propionato y

nicotinato. Se observaron corrientes de menor intensidad con butirato y corrientes muy

pequeñas con lactato y piruvato. Ninguna corriente significativa fue observada en células

HEK-293 control (transfectadas sólo con la proteína EGFP).

En trabajos anteriores se postuló que la SLC5A8 puede catalizar una difusión facilitada de

yodo, siendo este un transporte no acoplado (Rodriguez et al., 2002). Sin embargo, ninguna

corriente asociada a la presencia de yodo fue observada en ovocitos de X. laevis que

expresan la SLC5A8 (Coady et al., 2004; Miyauchi et al., 2004). En este trabajo se investigó si

el yodo puede inducir corrientes en células de mamíferos que expresen la SLC5A8. Altas

concentraciones de yoduro no indujeron ninguna corriente significativa en células HEK

transfectadas con el ADNc de SLC5A8. Pero, sorpresivamente, soluciones no preparadas

recientemente de bajas concentraciones de yoduro indujeron corrientes en estas células. En

83

la Figura 10B se muestra un registro representativo obtenido con una solución 1 µM de yodo

que fue preparada al menos una semana antes de ser utilizada. Es sabido que el yodo en

solución a bajas concentraciones alcanza un equilibrio de diferentes especies, conocidas

como especies oxidadas de yodo (I2, HOI, OI-, IO3-, etc.), por lo que el sustrato inductor de las

corrientes observadas podría ser una de dichas especies oxidadas de yodo. Así, para verificar

esta hipótesis, se prepararon soluciones de HOI por oxidación de NaI en presencia de HOCl

que, a su vez, fue preparado por dilución de una solución de NaOCl. Una corriente

comparable a la obtenida con el yodo a baja concentración fue obtenida con esta solución

(marcada como HOI/I2; Figura 10B). Estas corrientes se encontraron con soluciones de HOI/I2

de 1 µM y 50 µM (Tabla 2). De igual forma, este mismo tipo de corrientes fueron observadas

con soluciones de Cl oxidado (HOCl).

Figura 10: Registros representativos de las Corrientes obtenidas en células HEK

(A) registro típico de las corrientes inducidas por monocarboxilatos. (B) Registros representativos de las

corrientes inducidas por el yodo oxidado. (C) Comparación de las corriente inducidas por yodo oxidado en

células HEK-293 transfectadas con el ADNc que codifica

SLC5A8 y EGFP de forma separada.

Como se muestra en la Figura

yodo oxidado varía fuertemente de un

amplitud observada de la corriente fue de entre 30 y 200 pA, que corresponde a

aproximadamente la misma amplitud

monocarboxilatos. Algunas veces la amplitud de las

84

Registros representativos de las Corrientes obtenidas en células HEK-293 que expresan la SLC5A8.

o típico de las corrientes inducidas por monocarboxilatos. (B) Registros representativos de las


con el ADNc que codifica la proteína de fusión SLC5A8/EGFP, o las proteínas

5A8 y EGFP de forma separada.

Figura 10B, la amplitud de las corrientes observadas

varía fuertemente de un experimento a otro. En la mayoría de experimentos, la


aproximadamente la misma amplitud que las corrientes observadas con los

monocarboxilatos. Algunas veces la amplitud de las corrientes fue menor (

293 que expresan la SLC5A8.

o típico de las corrientes inducidas por monocarboxilatos. (B) Registros representativos de las


SLC5A8/EGFP, o las proteínas

la amplitud de las corrientes observadas en presencia de

experimento a otro. En la mayoría de experimentos, la


las corrientes observadas con los

corrientes fue menor (Figura 10). En 49

85

de los 138 experimentos realizados, no se observó ninguna corriente asociada al yodo

oxidado, aunque las corrientes asociadas a los monocarboxilatos sí fueron observadas en la

misma célula (Tabla 2). En pocos experimentos se observó una amplitud de corriente

asociada al yodo oxidado superior a 4000 pA (Figura 10B). La razón de esta variabilidad no ha

sido completamente determinada. En el caso de las grandes amplitudes, podría deberse a la

presencia de complejos de unión entre las células HEK, lo que permitiría registrar la actividad

de membrana de varias células al hacer el registro electrofisiológico de una de ellas. De igual

forma, debe tenerse en cuenta que las especies de yodo oxidado son moléculas muy

inestables (Kessler y Hooge, 2007), y que la expresión de SLC5A8 es tóxica para las células

(Thangaraju et al., 2006).

Número de células parched con corriente inducida por

monocarboxylate

Proteína expresada Corrientes significativa inducida por HOI

Corriente no detectada inducida por HOI

Nativa SLC5A8 50 26

EGFP-fusionada SLC5A8 39 23

HOX Corrientes significativa inducida

por HOX Corriente no detectada inducida

por HOX

HOI/I2 1 µM 16 7

HOCl 1 µM 4 3

HOI/I2 50 µM 6 2

Tabla 2: Número de células HEK-293 que mostraron corrientes inducidas por monocarboxilatos, que también

mostraron Corrientes inducidas por especies oxidadas de yodo (HOI) o por moléculas oxidadas (HOX). Los experimentos se realizaron 48 después de la transfección transitoria de las células con SLC5A8. EGFP: Enhanced

Green Fluorescent Protein.

Teniendo en cuenta las bajas concentraciones de yodo utilizadas, la amplitud de las

corrientes observadas no puede relacionarse a una actividad de cotransporte. Las corrientes

observadas deben corresponder a una actividad tipo canal que es inducida por la presencia

del yodo oxidado. En las condiciones experimentales utilizadas en Patch-Clamp en estos

experimentos, estas corrientes de entrada deben corresponder a corrientes de entrada de

sodio.

86

Para verificar que la fusión al extremo C-terminal de una proteína EGFP no estuviese

modificando las propiedades funcionales de SLC5A8, un nuevo conjunto de experimentos fue

realizado utilizando células HEK transfectadas con un plásmido recombinante que codifica las

dos proteínas de forma separada (plásmido derivado de un pIRES-EGFP). Los resultados

obtenidos fueron comparados con los obtenidos con la proteína de fusión SLC5A8-EGFP.

Como se ilustra en la Figura 10C, las corrientes inducidas por los monocarboxilatos y por el

yodo fueron similares bajo las dos condiciones.

Al igual que otros grupos, no se observaron corrientes inducidas por el yodo (50 µM o 1 mM)

en ovocitos de X. laevis inyectados con el ARNc de SLC5A8. Tampoco se observaron

corrientes significativas con soluciones a baja concentración de yodo oxidado. Las corrientes

inducidas por los monocarboxilatos fueron observadas y registradas.

Finalmente, para verificar que las corrientes inducidas por el yodo no son específicas de las

células HEK-293 que expresan la SLC5A8, se realizaron experimentos en células de la línea

HeLa. Las corrientes asociadas al a presencia de SLC5A8 fueron más pequeñas en esta línea

celular, pero se observaron tanto las corrientes asociadas a monocarboxilatos como las

corrientes asociadas al yodo oxidado.

Reuniendo los resultados obtenidos, indican que SLC5A8 sería activado en presencia de

especies oxidadas de yodo, especialmente HOI, induciendo una corriente de entrada de

sodio. Este tipo de actividad sería consecuente con una función de sensor de formas oxidadas

de yodo para SLC5A8. Recientemente, el ácido hipoyodoso (HOI) ha sido postulado como la

molécula encargada de la organificación del yodo en la tiroglobulina, para la posterior

formación de las hormonas tiroides (Kessler et al., 2008). Una función sensor, que permita

controlar las concentraciones de esta molécula sería coherente para ejercer una regulación

de la producción de hormonas en la glándula.

87

b. Las corrientes relativas inducidas por los diferentes monocarboxilatos varían según el

tipo de célula que exprese SLC5A8

Cómo la expresión de SLC5A8 en células de mamífero tiene un efecto antiproliferativo, los

experimentos de Patch-clamp fueron realizados en células transfectadas de forma transitoria

con SLC5A8. En estas condiciones experimentales, las amplitudes de las corrientes

observadas puede variar según el tamaño de las células y el nivel de expresión de la proteína.

Como se menciona arriba, en células que expresan la LSC5A8, de una célula a otra la

amplitud de las corrientes inducidas por el yodo puede llegar a ser muy diferentes. Esto

puede estar relacionado con la inestabilidad del sustrato, yodo oxidado (Kessler y Hooge,

2007); y la expresión de SLC5A8. La corriente inducida por el yodo fue igualmente observada

en otras líneas celulares transfectadas de forma transitoria con el ADNc de SLC5A8, como la

HeLa, pero no en ovocitos de X. laevis inyectados con el ARNc de SLC5A8. La aparición de las

corrientes inducidas por los monocarboxilatos fue siempre utilizada como control positivo de

la expresión de SLC5A8 en la membrana de la célula. Así, tanto en las células que presentaron

una corriente inducida por el yodo como en las que no, existió siempre una corriente

inducida por monocarboxilatos. Esto puede sugerir que SLC5A8 no cataliza por sí misma la

corriente inducida por el yodo, o que requiere asociarse a otra proteína para hacerlo. Se ha

propuesto que SLC5A8 cataliza por sí mismo el transporte electrogénico de diferentes

monocarboxilatos (Ganapathy et al., 2005). Teniendo en cuenta la hipótesis de que SLC5A8

no cataliza por sí mismo las corrientes inducidas por el yodo, se buscó determinar si esta

proteína cataliza por sí misma las corrientes inducidas por los monocarboxilatos. Si es el caso,

la amplitud relativa de las corrientes inducidas por los diferentes monocarboxilatos a una

misma concentración debería ser independiente del tipo celular donde se exprese. Así, para

cada célula la intensidad de la corriente inducida por adición a la solución de perfusión de

butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato (a una concentración final de 100 µM

cada uno) fue medida. Como se ilustra en la 11A, en células HEK (ver también la Figura 10A) y

88

HeLa que expresan la SLC5A8, se encontraron corrientes de amplitud muy diferente. El

mismo tipo de experimento fue realizado en ovocitos de X. laevis que expresan SLC5A8. En la

11B, todas las corrientes inducidas por los monocarboxilatos fueron normalizadas para cada

célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato (fijada como 100%).

Se observaron varias diferencias: 1) la corriente inducida por el propionato fue mayor que la

inducida por el butirato en células HEK-293 (117 ± 16 %, n = 9), y menor en células HeLa (73 ±

3.5 %, n = 5) o en ovocitos de X. laevis (76 ± 3, n = 11); 2) la corriente inducida por el piruvato

fue ligeramente menor que la inducida por el butirato en ovocitos de X. laevis (69 ± 3 %), y

mucho menor en células HEK-293 (25 ± 4.9 %) y HeLa (23 ± 9 %); 3) la corriente inducida por

el nicotinato fue ligeramente mayor a la inducida por el butirato en células HEK-293 (114 ± 9

%), y menor en células HeLa (59 ± 19 %) y ovocitos de X. laevis (64.5 ± 3.5 %). De igual forma,

el mismo experimento fue realizado en células HEK-293 que expresan la SLC5A8 48 y 72

horas después de la transfección. Al comparar la amplitud de las corrientes inducidas por los

monocarboxilatos, se observó una disminución en la amplitud de las corrientes inducidas por

el butirato, propionato y lactato; y corrientes de una amplitud similar o superior para el

piruvato y superior para el nicotinato (Figura C). Al normalizar los experimentos para cada

célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato, las variaciones en el

tiempo de las corrientes inducidas por el piruvato y el nicotinato, comparadas con las de

butirato, propionato y lactato, se observan fácilmente (Figura D).

Figura 11: Variabilidad de la amplitud de las corrientes inducidas

celulares que expresan la SLC5A8. Células HEKperfundidos con soluciones 0.1 mM de butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato. La amplitud corrientes inducidas fue registrada por después de la transfección o inyecciónde las corrientes (B) inducidas registros representativos (C) y comparación de las corrientes inducidas después de la transfección. Todas las corrientes inducidas por los monocada célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato (fijada como 100%)

Los resultados obtenidos al comparar la amplitud de las corrientes inducidas por los

monocarboxilatos en diferentes t

laevis), indican un efecto del tipo celular sobre el comportamiento de la proteína SLC5A8.

ha sido descrito para SLC5A8 una alta variabilidad en la estequiometria del transporte

acoplado al sodio, que cambia dependiendo del monocarboxilato transportado

2004). Esta variabilidad explica la diferencia en la amplitud de la corriente inducida por cada

monocarboxilato en un mismo tipo celular. El cam

inducida por un monocarboxilato al cambiar el tipo celular donde la SLC5A8 es expresada

(Figura B), indicaría un cambio en la selectividad o la estequiometria del transpo

89

Variabilidad de la amplitud de las corrientes inducidas por monocarboxilatos en diferentes tipos

celulares que expresan la SLC5A8. Células HEK-293 y HeLa, y ovocitos de X. laevis que expresan la SLC5A8 fueron perfundidos con soluciones 0.1 mM de butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato. La amplitud corrientes inducidas fue registrada por Patch-clamp (HEK-293 y HeLa) o Voltage-Clamp

después de la transfección o inyección. En la figura se muestran registros representativos por los monocarboxilatos en células HEK-293, HeLa y ovocitos de

y comparación de las corrientes inducidas (D) en células HEKodas las corrientes inducidas por los monocarboxilatos fueron normalizadas para

cada célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato (fijada como 100%)


monocarboxilatos en diferentes tipos celulares (células HEK-293, HeLa y ovocitos de

), indican un efecto del tipo celular sobre el comportamiento de la proteína SLC5A8.


ue cambia dependiendo del monocarboxilato transportado

. Esta variabilidad explica la diferencia en la amplitud de la corriente inducida por cada

monocarboxilato en un mismo tipo celular. El cambio de la amplitud relativa de la corriente


B), indicaría un cambio en la selectividad o la estequiometria del transpo

por monocarboxilatos en diferentes tipos

expresan la SLC5A8 fueron perfundidos con soluciones 0.1 mM de butirato, propionato, piruvato, nicotinato y lactato. La amplitud de las

Clamp (ovocitos), dos días . En la figura se muestran registros representativos (A) y la comparación

293, HeLa y ovocitos de X. laevis; y en células HEK-293, 2 y 3 días

carboxilatos fueron normalizadas para cada célula con respecto a la amplitud de la corriente inducida por el butirato (fijada como 100%).


293, HeLa y ovocitos de X.

), indican un efecto del tipo celular sobre el comportamiento de la proteína SLC5A8. Ya


ue cambia dependiendo del monocarboxilato transportado (Gopal et al.,

. Esta variabilidad explica la diferencia en la amplitud de la corriente inducida por cada

bio de la amplitud relativa de la corriente


B), indicaría un cambio en la selectividad o la estequiometria del transporte realizado

90

por SLC5A8 para ese monocarboxilato en particular. Esto mostraría una regulación de la

función de SLC5A8 por proteínas endógenas en cada tipo celular, por interacción directa o

indirecta con SLC5A8. La presencia de un dominio PDZ ha sido reportado para SLC5A8 (Anzai

et al., 2007), aunque no se observa en la estructura putativa de la proteína, sugiriendo la

capacidad de esta proteína para interactuar, regular y/o ser regulada por otras proteínas.

Finalmente, no puede descartarse la posibilidad de que esta variabilidad en las características

funcionales de SLC5A8 dependiendo del tipo celular, esté relacionada con el cambio en el

microambiente lipídico con el que interactúa la proteína en la membrana. Este tipo de

comportamientos ya ha sido observado para otras proteínas de membrana (Locke y Harris,

2009). El cambio en las características funcionales de SLC5A8 dependiendo del tipo celular en

donde es expresada podría explicar la no aparición de la corriente inducida por el yodo

oxidado en los ovocitos de X. laevis.

c. Ratón invalidado para SLC5A8 presenta niveles de hormonas normales, pero no responde a

excesos de yodo como el ratón silvestre.

En los ratones invalidados para SLC5A8 la función de la tiroides fue aparentemente normal,

como ya había sido observado en otro ratón deficiente para SLC5A8 (Frank et al., 2008). Sin

embargo, los resultados obtenidos en Patch-Clamp indicarían una función putativa para

SLC5A8 como sensor de especies oxidadas de yodo en la membrana apical de los tirocitos. De

acuerdo a dicha hipótesis, es de esperarse que esta proteína juegue un rol en la regulación

de la tiroides por el yodo. Una alta administración de yodo induce una inhibición en la

tiroides conocida como el efecto Wolff-Chaikoff (Wolff y Chaikoff, 1948). Este efecto se

caracteriza por una disminución de la capacidad de captación de yodo y una disminución

transitoria de la secreción de hormonas (Eng et al., 1999). Para verificar si SLC5A8 está

implicado en la regulación de la tiroides por el yodo, se compararon las concentraciones de

hormonas tiroides en el plasma, después de la administración de una alta dosis de yodo,

entre los ratones invalidados para SLC5A8 y los ratones silvestres. Como se ilustra en la

Figura 11, uno y seis días después de la a

SLC5A8 (KO) no presentaron una disminución en la concentración de hormonas tiroides en el

plasma, como sí la presentaron los ratones silvestres (WT). Estos resultados indican que

SLC5A8 puede ser un senso

efecto Wolff-Chaikoff.

Figura 11: Medida de la concentración de las hormonas tiroideas T3 y T4 en ratones invalidados para el gen

que codifica la proteína SLC5A8 (KO

medida por RIA en el plasma de los ratones KO y WT inmediatamente, 1 día y 6 días después de la

administración de una alta dosis de yodo.

d. El efecto antiproliferativo de SLC5A8 es

Para determinar si el efecto

la entrada de sodio activada por moléculas oxidadas, se midió el efecto de la incubaci

antioxidantes en el medio de

expresan la SLC5A8. Células de la línea HEK91


, uno y seis días después de la administración del yodo los ratones invalidados para



SLC5A8 puede ser un sensor de especies oxidadas de yodo implicado en la fase inicial del

Medida de la concentración de las hormonas tiroideas T3 y T4 en ratones invalidados para el gen

que codifica la proteína SLC5A8 (KO) y ratones silvestres (WT). La concentración de las hormonas T3 y T4 fue


administración de una alta dosis de yodo.

d. El efecto antiproliferativo de SLC5A8 es inhibido en presencia de antioxidantes

Para determinar si el efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8 está relacionado con

la entrada de sodio activada por moléculas oxidadas, se midió el efecto de la incubaci

antioxidantes en el medio de cultivo sobre la proliferación de células

Células de la línea HEK-293, transfectadas de forma transitoria con el


dministración del yodo los ratones invalidados para



r de especies oxidadas de yodo implicado en la fase inicial del

Medida de la concentración de las hormonas tiroideas T3 y T4 en ratones invalidados para el gen

) y ratones silvestres (WT). La concentración de las hormonas T3 y T4 fue


inhibido en presencia de antioxidantes

antiproliferativo de la expresión de SLC5A8 está relacionado con

la entrada de sodio activada por moléculas oxidadas, se midió el efecto de la incubación con

sobre la proliferación de células de mamífero que

orma transitoria con el

ADNc que codifica una proteína de fusión

suplementado con 10% de SFB y: 1) 110 mg/mL de piruvato (condición control), 2) en

ausencia de piruvato (condición sin piruvato) y 3) 110 mg/mL de piruvato y 0.1 mM de ácido

D-ascórbico (condición con Vitamina

número de células que expresaron SLC5A8 (

células, 24, 48 y 72 horas después de realizada la transfección. Para cada condición de

cultivo, y para cada día, el número de células fue normalizado respecto al número de célul

presentes en la condición control a las 24 horas (que se tomó como el 100%).

Figura 12: Estudio del efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8. Células de la línea HEK

expresan la proteína de fusión SLC5A8/EGFPy: sin ácido D-ascórbico (DMEMimágenes obtenidas a las 24 y 72 horas posteriores a la transfección, por contraste defluorescencia (panel inferior).

92

ADNc que codifica una proteína de fusión SLC5A8/EGFP, fueron cultivadas en medio DMEM

de SFB y: 1) 110 mg/mL de piruvato (condición control), 2) en


ascórbico (condición con Vitamina C). La proliferación celular fue evaluada por conteo del

células que expresaron SLC5A8 (imagen de fluorescencia) y el número total de


cultivo, y para cada día, el número de células fue normalizado respecto al número de célul


Estudio del efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8. Células de la línea HEK

expresan la proteína de fusión SLC5A8/EGFP, fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10DMEM), y 0.1 mM de ácido D-ascórbico (DMEM + Vit C). En la figura se muestran las

imágenes obtenidas a las 24 y 72 horas posteriores a la transfección, por contraste de

fueron cultivadas en medio DMEM

de SFB y: 1) 110 mg/mL de piruvato (condición control), 2) en


C). La proliferación celular fue evaluada por conteo del

) y el número total de


cultivo, y para cada día, el número de células fue normalizado respecto al número de células


Estudio del efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8. Células de la línea HEK-293 que

, fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de SFB En la figura se muestran las

fases (panel superior) y

93

Según lo reportado por Ganapathy y colaboradores (2008), el efecto antiproliferativo de la

expresión de SLC5A8 estaría relacionado con la presencia de monocarboxilatos en el medio

de cultivo. Para verificar esta hipótesis, las células HEK-293 que expresan la SLC5A8 fueron

incubadas en un medio desprovisto de piruvato (monocarboxilato presente en la mayoría de

medios de cultivo). A las 24 horas después de la transfección, el número de células

fluorescentes al microscopio en la condición control indicaron un rendimiento de

transfección de aproximadamente 30% (ver primer panel de la Figura 12A). Aunque el

número de células que expresaron SLC5A8 fue ligeramente mayor en la condición sin

piruvato a las 24 horas que en el control, no se observaron diferencias estadísticamente

significativas entre estas dos condiciones (Figura 13A). De igual forma, no hubo diferencias

significativas en el número de células que expresaron SLC5A8 a las 48 y 72 horas entre estas

dos condiciones, aunque se observó una ligera diferencia en el número de células, siendo

menor para la condición sin piruvato (Figura 13A). Aunque no se observaron diferencias

significativas, esta disminución del número de células en la condición sin piruvato con

respecto a la condición control también se observó en las células HEK-293 que no expresan

SLC5A8 (Figura 13B), indicando un ligero efecto de la ausencia de piruvato en la proliferación

celular. Este efecto, sin embargo, sería independiente de la expresión de SLC5A8. En los

resultados obtenidos no se observa la relación de la presencia de monocarboxilatos en el

medio con el efecto antiproliferativo de SLC5A8 propuesta por el equipo de Ganapathy.

De igual modo, aunque el número de células que expresaron SLC5A8 fue ligeramente mayor

en la condición con vitamina C a las 24 horas que en el control, tampoco se observaron

diferencias estadísticamente significativas entre estas dos condiciones (Figura 13A). Sin

embargo, a las 48 y 72 horas después de la transfección, el número de células que expresan

SLC5A8 es significativamente mayor en la condición con vitamina C, al compararla con la

condición control (Figura 12 y Figura 13A). Aunque el número de células que no expresan

SLC5A8 es ligeramente mayor en la condición con vitamina C, en comparación con la

condición control, a las 48 y 72 horas, esta diferencia no es estadísticamente significativa, ni

es tan apreciable como la observada en células que sí expresan SLC5A8.

resultados indicarían una inhibición del efecto antiproliferativo de SLC5A8 en presencia de la

vitamina C. Teniendo en cuenta el efecto antioxidante de la vitamin

2005), los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de que el efecto antiproliferativo de la

expresión de SLC5A8 está rel

presencia de esta proteína. La desaparición de estas moléculas por interacción con la

vitamina C impediría la activación de la SLC5A8

antiproliferativo.

Figura 13: Estudio del efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8. C

expresan la proteína de fusión SLC5A8/EGFP, fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 1y: 1) 110 mg/mL de piruvato (control), 2) en ausencia de piruvato0.1 mM de ácido D-ascórbico (con Vitamina C).células que expresaron SLC5A8después de realizada la transfección. presentes en la condición control a las 24 horas (que se tomó como el 100%).

94


es tan apreciable como la observada en células que sí expresan SLC5A8.

una inhibición del efecto antiproliferativo de SLC5A8 en presencia de la

vitamina C. Teniendo en cuenta el efecto antioxidante de la vitamina C

los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de que el efecto antiproliferativo de la

expresión de SLC5A8 está relacionado con la corriente inducida por moléculas oxidadas en


diría la activación de la SLC5A8 y, por ende, la aparición de su efecto

Estudio del efecto antiproliferativo de la expresión de SLC5A8. Células de la línea HEK

SLC5A8/EGFP, fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 1iruvato (control), 2) en ausencia de piruvato (sin piruvato) y 3) 110 mg/mL de piruvato y

con Vitamina C). La proliferación celular fue evaluada por conteo del número de élulas que expresaron SLC5A8 (A) y el número de células que no expresan SLC5A8

después de realizada la transfección. El número de células fue normalizado respecto al número de células presentes en la condición control a las 24 horas (que se tomó como el 100%).


es tan apreciable como la observada en células que sí expresan SLC5A8. Juntos, estos

una inhibición del efecto antiproliferativo de SLC5A8 en presencia de la

a C (Duarte y Lunec

los resultados obtenidos apoyan la hipótesis de que el efecto antiproliferativo de la

acionado con la corriente inducida por moléculas oxidadas en


y, por ende, la aparición de su efecto

élulas de la línea HEK-293 que

SLC5A8/EGFP, fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de SFB sin piruvato) y 3) 110 mg/mL de piruvato y

La proliferación celular fue evaluada por conteo del número de que no expresan SLC5A8 (B), 24, 48 y 72 horas

número de células fue normalizado respecto al número de células

95

VI. CONCLUSIONES

1. De las diez moléculas estudiadas, cuatro moléculas inhibidoras de NIS fueron

identificadas como inhibidores rápidos y específicos de la actividad de NIS. Estas

moléculas representan una herramienta eficaz para el estudio funcional de NIS;

adicionalmente, puede tener aplicaciones médicas en el diagnóstico y tratamiento de

patologías tiroideas.

2. La proteína NIS no está sobre expresada en cáncer de tiroides y seno. En consecuencia,

para aumentar la efectividad del uso de yodo radioactivo en tratamientos de cáncer de

tiroides y en el diagnóstico y tratamiento de cáncer de seno, mejorar el direccionamiento

a la membrana de NIS no es suficiente. Aumentar la expresión de NIS debe ser el objetivo

principal en este campo.

3. Una regulación de la proteína NIS por la TSH y altas concentraciones de yodo fue

observada en folículos tiroideos en cultivo. Dicha regulación es coherente con la

observada en otros sistemas de cultivo. Sin embargo, un estudio más detallado debe ser

realizado.

4. La proteína SLC5A8 induce una corriente de sodio en activada por formas oxidadas de

yoduro. En la glándula tiroides, esta proteína podría tener una actividad sensor de

especies oxidadas de yoduro (principalmente HOI), y participaría en la regulación de la

etapa inicial del efecto Wolff-Chaikoff.

96

VII. AGRADECIMIENTOS Al programa ECOS-Nord/Colciencias/Icetex, a la División de Investigación (DIB) de la

Universidad Nacional de Colombia, al Comisariado de Energía Atómica (CEA), al Centro

Internacional de Física (CIF) y a la Facultad de Ciencias de la Universidad de Niza por su

participación en la financiación de este trabajo.

A Isabelle Peyrottes y demás miembros Departamento de Patología del Centro Antoine

Lacassagne, y a Nathalie Lecat-Guillet y demás miembros del Departamento de Química

Bioorgánica y Marcaje Isotópico del CEA, por su colaboración en la obtención de los

resultados de este trabajo.

A mis directores, Clara Spinel y Thierry Pourcher, por su constante apoyo, sus enseñanzas, su

paciencia y su sincera amistad.

A Sabine LIndenthal, Robert Marsault, George Roumey, Fanny Graslin, Julien Gugliemi, Anne

Vejux, Christophe LeSaint, Collette Ricoh y, en general, a todos los miembros de la Unidad

TIRO por su calurosa recepción y su desinteresado apoyo.

A Marcela Camacho, por su constante apoyo, y por sus siempre oportunos y pertinentes

aportes y comentarios.

A Eleonora Bernal, Margarita Victoria, Magnolia Herrera, Cristina Zapata, Jhon Rivera y, en

general, a todos los miembros del Laboratorio de Biofísica del CIF por su apoyo y amistad.

A María Cristina Plazas y Didier Paul, porque el largo camino que llevó a la realización de este

trabajo se inició gracias a su iniciativa y desinteresado apoyo.

A mi familia y amigos, porque siempre están a mi lado, en todo momento y a pesar de todo.

97

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