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Fosfolipasas y Lipasas
José Luis Cárdenas LópezEnzimas de productos marinos
Fosfolípidos
�Esqueleto de Glicerol�2 grupos sustituyentes de ác. grasos �Tercer grupo derivado de fosfato
O
C
II.A.i.-2
C
C
OO
O
O
O P
O
O
X -
E.g. X = - (CH2)2 - N - CH3
CH3
CH3
+
fosfatidilcolina
Propiedades de Fosfolipidos
� fosfatido “Cabeza” es polar, cargado�hidrofílico
�Ác graso “cola” es no polar�hidrofóbico
P
aire
agua
II.A.i.-3
�hidrofóbico
�Molécula tiene un carácter dual �anfifílico
•Moléculas son surfo activas
–Se colocan entre fases hidrofilicas e hidrofobicas
PX
aceite
agua
PX
agua
Lípidos
�Fuente de energía metabólica�Componente esencial de membranas celulares
Enzimas lipolíticasEnzima Fuente Tejido
Lipasa Raya Pancreas
Trucha Pancreas
Bacalao Tracto digestivo
Langosta Jugo gástrico
Trucha Músculo
Bacalao Músculo
Fosfolipasa Bacalao Músculo
Trucha Músculo
Lenguado Músculo
Abadejo Músculo
Fosfolipasas
�La hidrólisis de fosfolípidos es importante en pescado congelado, en la fase lipídica con baja Aw
�En pescado congelado, la hidrólisis por �En pescado congelado, la hidrólisis por fosfolipasas, puede ocurrir mas rápido arriba del punto de congelación
Hidrólisis de fosfolípidos en carpa
0.20.30.40.50.60.7
glic
erilf
osfa
tilco
lina
mm
ol/1
0g/d
ia
00.10.2
-15 -10 -5 0
Temp de almacenamiento ( oC)
glic
erilf
osfa
tilco
lina
mm
ol/1
0g/d
ia
Tipos de fosfolipasas
O
O
R
R
(I)
(II)
A1
A2
B
O
O P
O
O-
O XO
R(II)
C
D
X=colina, serina, inositol, etc.
R(I) y R(II)=cadena alquilo
�Productos de la hidrólisis de las FL A2: ácidos grasos libres (AGL) lisofosfatidilcolina (LPC)
�Lisofosfolipasas, actúan sobre LPC�Lisofosfolipasas, actúan sobre LPC�más activas que las fosfolipasas
lisofosfolipasas
O
O
R(I)
(II)
lisofosfolipasa
O P
O
O-
O X
OH
(II)
X=colina, serina, inositol, etc.
Fosfolipasa A2 causa deterioro en surimi de bacalao en congelación, AGL� desnaturalización de proteína
80
100
120
140A
G li
bres
mg/
100
g
0
20
40
60
80
0 50 100 150
Solubilidad de proteina mg/g
AG
libr
es m
g/10
0 g
Endurecimiento
�AGL interacción hidrofóbica con actina y causa entrecruzamiento a través del puente con Ca++
� Actina----RCOO------Ca2+-----OOCR-----Actina
Interacción entre la acción de fosfolipasas y la oxidación de lípidos� Durante el congelamiento se solubilizan de los
lisosomas� La oxidación de lípidos en los microsomas
activa la fosfolipasa A2 de la trucha� La hidrólisis de fosfolípidos se ha relacionado � La hidrólisis de fosfolípidos se ha relacionado
con la fragilidad del retículo sarcoplásmico en músculo de carpa
� Las lipasas son mas activas en músculo rojo que en blanco
Propiedades de algunas fosfolipasas
PollockP. Virens
Red Sea bream (dorada)
Bacalao Trucha Carpa
Musculo Saco pilorico
HP D1
HP D2
lisosomal higado HP HP
PM (KDa)
13 14 13.5
13.5
>50 73(KDa) 5 5
pH opt 8.5-9 8-9 10 8-9
4 8-8.5 5 4-7
Temp opt 37-42 40 35-45 30-40
Ca2+ req si si si si no max max
EDTAinhibicion
si si no no no no no
FOSFOLIPASA A2 PANCREATICA DE BOVINO
Lipasas
�LPL lipasas de lipoproteínas�HL lipasas hepáticas�PL lipasas pancreáticas�GL lipasas gástricas�GL lipasas gástricas�BAL lipasas activadas por sales biliares
�Derivan del mismo gen ancestral en vertebrados
Mecanismo de reacción
CH3O
O
CH3O
O
CH3O
O
*
OHLipasa
TAG
Tripalmitina
(AG 16:0)(AG 16:0)
C
CH3O
O
CH3O
O
CH3O
O
*
O
C
CH3
O
*
OOH
CH3O
O
CH3O
O
OH2
C
CH3
OHO
*
OH
C
CH3
OH
*
O
O-
Propiedades bioquímicas de lipasas de pescado
Red sea bream
Bacalao Tiburon Leopardo
Tiburon Perro
Trucha Sardina
origen HP Saco Pilorico
Pancreas Tejido pancreas
HP
PM 60 54-57PM 60 54-57
pH optimo 8-9 6.5-7.5 8.5 8
Temp opt 25 36 35 37
Dependencia de sales biliares
Taurocolato de Na
abs abs si si
Enzimas relacionadas con oxidación de lípidos
José Luis Cárdenas LópezEnzimas de productos marinos
Oxidación de lípidos
� Iniciación LH� L* + H*�Propagación L* + O2 � LOO*
LOO*+LH� LOOH+L* LOOH LO*+ *OH
RADICALES LIBRES
PERÓXIDOS
HIDROPERÓXIDOSLOOH� LO*+ *OH
�Terminación L*+LOO*�LOOLL*+L* � LL
HIDROPERÓXIDOS
ALCOXI
NO MAS O2
Oxidación enzimática de lípidos
�Se ha enfatizado la ox de lípidos por rx no enzimáticas, pero
�rx catalizadas por enzimas del ciclo redox del Fe y la lipoxigenasa pueden ser del Fe y la lipoxigenasa pueden ser importantes en pescado
Formación de superóxido y radical hidroxi libre
�Rx FentonFe+2 + O2 � Fe+3 + O2
-
2 O2- + 2 H+ � H2O2 + O2
Fe+2 + H O � Fe+3 + OH- + *OHFe+2 + H2O2 � Fe+3 + OH- + *OH�Rx Haber Weiss
Fe+3 + O2- � Fe+2 + O2
Fe+2 + H2O2�Fe+2 + OH- + *OH
Radicales
e- e- e- e-�O2 � O2
- � H2O2 � *OH � H2O2H H H2H+ H+ H+
�el *OH, o un radical oxígeno (O2- )
relacionado es el responsable de la oxidación de lípidos en tejidos biológicos
�El sistema microsomal de oxidación de lípidos es altamente activo en congelación
�Los microsomas pueden reducir el Fe3+ a Fe2+ usando electrones del NADHFe2+ usando electrones del NADH
�Diferencias en tipo de músculo:�Los microsomas de músculo rojo contienen 3-4
mas actividad que en el blanco
Lipoxigenasa
� Puede causar decoloración de carotenoides � Ha sido identificada en la piel de numerosos
peces marinos y recientemente en la sangre y los tejidos intersticiales de pescado y moluscos los tejidos intersticiales de pescado y moluscos bivalvos
� Causa la formación de hidroperóxidos específicos que pueden ser precursores de sust farmacológicamente activas, aromas de frescura y contribuir a la ox. de lípidos en pescado
Volátiles asociados a lipoxigenasa
Organismo Compuestos
Trucha 2,5-octadien-1-ol, 1-octen-3-ol,5-octen-1-ol, (2Z)-octen-1-ol, (2E)-pentenal, (2E,6Z)-nonadienal, 1-octen-3-ona, (1,5Z)-octadienal, octen-3-ona, (1,5Z)-octadienal, (1,3E,5Z)-undecatrieno
Camarón cocinado
5,8,11-tetradecatrien-2-ona
Ayu 1-octen-3-ol, (E)-2-nonenal, (E,Z)-2,6-nonadienal, 3, 6-nonadien-1-ol
� La piel del pescado contiene lipoxigenasa, pero no se encuentra en el tejido muscular, salvo algunos pocos casos como en Herring (arenque)
Enzimas protectoras�Superóxido dismutasa (SOD), catalasa,
glutation peroxidasas se han estudiado en mamíferos por su efecto inhibidor de la etapa de iniciación de la ox. lípidos
�En animales acuáticos no se han �En animales acuáticos no se han estudiado lo suficiente,
�Algunos ejemplos:�SOD en la sangre de trucha�SOD en eritrocitos de salmón�SOD en camarón Litopenaeus vannamei
Superóxido dismutasa (SOD)
�Mecanismo complejo que involucra coordinados con metales (Cu, Mn, Fe, Zn o Ni) que actúan como cofactores
�Cataliza la “dismutación” de O - a O�Cataliza la “dismutación” de O2- a O2
�Por lo que “protege” de este superóxido actuando como antioxidante
Dismutación
� El O es el aceptor de electrones en la respiración, pero algunas de sus especies son peligrosas�El superóxidoproduce mutaciones en el DNA y otras cosas peores
� Rx especial � La SOD toma dos moléculas de superóxido, a una le � La SOD toma dos moléculas de superóxido, a una le
quita el electrón extra y se lo pasa al otro� Así uno será oxígeno normal y el otro tiene un electrón
extra que rápidamente busca 2 H y forma H2O2
� El H2O2 también es peligroso, por lo que las células deben usar la catalasa para detoxificarlo
Mieloperoxidasa
�Los leucocitos de la sangre de peces son fuente de mieloperoxidasa que puede producir radical Cl*
�Se puede añadir a un doble enlace o �Se puede añadir a un doble enlace o abstraer un protón formando radicales de ácidos grasos
Cl* + --C=C--C—C*
Cl
H HH H
Cl* + --C--C=C--
H H H
--C--C=C-- + H+ +Cl-
H H H
*
H
Ferroxidasa
�Pueden jugar un papel protector importante al oxidar el ión ferroso
4Fe+2 + 4 H+ + O2 � 4Fe+3 + H2O4Fe+2 + 4 H+ + O2 � 4Fe+3 + H2Oferroxidasa
Glutation peroxidasa (EC 1.11.1.9)
Nakano, 2006 y Nagai, 2001
� Músculo y piel de diversas especies de pescado � pH óptimo 8.0 salmon, 8.5 carpa y 7.0 sea bass � glutation reducido (GSH) incrementó la estabilidad de la
enzima en salmon� Pero decreció con hidroperóxido ter-butil � Pero decreció con hidroperóxido ter-butil � En filetes de salmón almacenados a -50°C, se
incrementó la actividad gradualmente� La GSH-Px de pescado tiene potencial para prevenir
deterioro oxidativo en músculo almacenado y en el proceso
Áreas que requieren investigación en fosfolipasas de organismos marinos
�Métodos de aislamiento y purificación�Secuencias y estructura terciaria de FL �Enzimología de la lipolisis digestiva�FL de músculo�Composición y suceptibilidad a la
oxidación�Cambios FQ que ocurren durante el
congelamiento y su relación con la act de FL, hidrólisis de Flípidos y oxidación
Profundizar…
�Seafood Enzymes (2000), Haard y Simpson. Marcel Dekker