ftoxfitotoxicidad

7/21/2019 ftoxfitotoxicidad

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Introducción

Las plantas arvenses son todas aquellas plantas que conviven con los cultivos, existen arvenses muy

agresivas ( malezas) y otras que tienen poco desarrollo aéreo de follaje y poco desarrollo de la raíz

(arvenses nobles).

Las malezas representan un grave problema en los agroecosistemas, ya que generan pérdidas

agrícolas debido a que compiten con el cultivo por agua, luz, nutrientes y espacio; por esto se han

utilizado diversas herramientas como herbicidas pero estos tienen repercusiones hacia el medio

ambiente( Hernández, 2011).

La agricultura moderna alimenta a 6.000 millones de personas (Tilman et al ., 2002). La producción

mundial de cereales se ha duplicado en los últimos 40 años, principalmente debido al aumento de los

rendimientos de las cosechas, resultado de la aplicación de fertilizantes y pesticidas, la adecuada

irrigación, el cultivo de nuevas variedades mejoradas genéticamente y al uso de otras tecnologías de la

denominada ‘Revolución Verde’ (WHO, 1990; Tilman et al ., 2001). En el año 2050, la población

mundial se prevé que será un 50% mayor que en la actualidad y la demanda mundial de cereales se

duplicará (Alexandratos, 1999; Cassman, 1999). Por este motivo, duplicar la producción de alimentos

de nuevo y mantenerla en este nivel, son los principales retos (Alexandratos, 1999; Postel, 1999).

Actualmente la demanda mundial de productos agrícolas supera la oferta, por lo que se debe

gestionar su producción de manera más eficiente (Mahlein et al ., 2012).

Desde hace unos años, en los países desarrollados existe una gran preocupación por la calidad de los

sistemas productivos y por el impacto ambiental de los plaguicidas (Gobbi, 2000). La intensificación de

las técnicas de producción con la finalidad de lograr altos rendimientos, ha conducido al incremento

en el uso de fertilizantes a la vez que ha aumentado la presión de las plagas, lo que se ha traducido en

un aumento del uso de plaguicidas. Como consecuencia de esto, se han puesto de manifiesto graves

problemas ambientales y sociales tales como la contaminación de los suelos, la pérdida de calidad del

agua para consumo humano, y la destrucción de la fauna útil (Dehne y Schõnbeck, 1994).

Los plaguicidas no sólo son tóxicos para los organismos que se proponen combatir, también afectan a

otros seres vivos, entre ellos los trabajadores que los fabrican y aplican, e incluso a los consumidores

del producto final. Además, se acumulan en el suelo y en el agua, planteando crecientes peligros para

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el futuro, y su eficacia disminuye con el tiempo, ya que los organismos a que están dirigidos adquieren

resisitencia a su toxicidad, haciendo que el producto químico resulte inútil (Laborda, 2008).

En este sentido se puede destacar la importancia de la búsqueda de herbicidas naturales basándose

en los mecanismos de defensa propios de las plantas, no solo frente a depredadores herbívoros, sino

también frente a otras especies vegetales.

Marco teórico

El término alelopatía se deriva del griego allelon que significa uno al otro, y pafhosque significa sufrir,

y fue utilizado por primera vez por Molische en el año1 937 (www.angelfire.com) para referirse a la

capacidad que tienena lgunas plantas para ocasionar efectos benéficos o perjudiciales, directos o

indirectos sobre otras plantas, o de una planta sobre un microorganismo (hongos, bacterias), o de una

planta sobre un insecto,c omo resultado de la liberación al medio ambiente de sustancias o

compuestos químicos llamados alelopáticos que son producidos por las plantas y que actúan como

repelentes, atrayentes, estimulantes e inhibidores.Los compuestos alelopáticos son productos de

metabolismo secuandario derivados de las rutas del acetato mevalonato y ácido shikimico, estos

metabolitos secundarios pueden ser extraidos a partir de aceites esenciales.

Los aceites esenciales se obtienen fundamentalmente de las partes no leñosas de la planta, en

especial de las hojas, mediante arrastre por vapor de agua o hidrodestilación (Batish et al ., 2008). Son

una compleja mezcla, principalmente de ter-penoides, en particular monoterpenos y sesquiterpenos ,

y una variedad de compuestos aromáticos, óxidos, éteres, alcoholes, ésteres, aldehídos y cetonas, que

determinan el característico aroma y olor de la planta que lo produce (Batish et al ., 2008).

Los aceites esenciales han mostrado potencial como herbicidas. Uno de los inconvenientes que

presentan es que normalmente es necesario el empleo de surfac-tantes para su aplicación, y éstos

están limitados en la agricultura orgánica. La mayoría de aceites esenciales comercializados para el

control natural de arvenses son mezclas, por lo que es difícil recopilar las numerosas formulaciones

disponibles. Todos los aceites esenciales comercializados actúan como herbicidas de contacto no

selectivos, que pueden controlar las arvenses de forma adecuada pero transitoria. El uso de los aceites

esenciales para el control de arvenses parece prometedor en la agricultura orgánica, pero actúan muy

rápido y su actividad es limitada porque la mayoría se volatilizan rápidamente (Dayan et al , 2009). Se

están desarro-llando formulaciones alternativas, como la microencapsulación, para aumentar la

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duración de su efecto, reducir su volatilización, simplificar su manejo y ralentizar su degradación en el

medio ambiente (Scarfato et al ., 2007).

Los terpenos presentan reacciones de oxidación, reducción, emigración de dobles enlaces y

polimerización, con cierta frecuencia y facilidad.

La presencia de monoterpenos volátiles o de aceites esenciales en las plantas es una importante

estrategia de defensa, especialmente contra herbívoros, insectos perjudiciales u hongos patógenos

(Langenheim, 1994). Los terpenoides volátiles también juegan un importante rol en las interacciones

planta-planta y act-úan como atrayente de los insectos polinizadores (Tholl, 2006).

Los cineoles son monoterpenos volatiles que se encuentran comunmente como

componentes de aceites esenciales y plantas aromáticas.

En estudios de campo se identificó al 1-8 cineol (Figura 1) como uno de los más

potentes aleloquímicos.

Un metabolito primario comprende aquellos procesos químicos que cada

planta debe llevar a cabo para reproducirse y realizar sus actividades

metabólicas necesarias para vivir por ejemplo fotosíntesis, glicolisis, ciclo de

ácido cítrico, síntesis de aminoácidos, etc.

Los metabolitos secundarios comprenden aquellos procesos químicos que son

únicos para una planta dada y no son universales, poseen una función

extremadamente específica, estando a menudo relacionadas a una especie, o

solamente a algunas cepas de una especie.

No son necesarios para el crecimiento del organismo que los produce.

Thymus vulgaris ( tomillo) [Figura 2]

Familia: Lamiáceas

Habitat: Terrenos arcillosos, cálidos y soleados de regiones

montañosas.Habitual en la zona garriga abierta Mediterránea y

naturalizado en América. Ampliamente cultivado

Caraterísticas: Pequeño arbusto de tallos leñosos, tortuosos y

muy ramificados. Las hojas son brácteas pequeñas, ovaladas, con

los bordes vueltos hacia abajo y de color más claro que en el

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Figura 2 Thymus vulgaris (Tomada de

https://commons.wikimedia.org/wiki/

File:Thymus_vulgaris_001.JPG)



envés. Las flores bilabiadas son pequeñas, terminales y de color rosado o blanco. Es una planta muy

aromática.

Es una especie común en la vegetación de la. Es bien conocida su producción de metabolitos

secundarios (Ehlers y Thompson, 2004). Su aceite esencial ha sido empleado en la industria farmacéu-

tica y cosmética, y como aditivo aromático en alimentación (Senatore, 1996; Si-mon et al ., 1999;

Javanmardi et al ., 2002). Han sido descritas sus propiedades anti-sépticas, carminativas,

antimicrobianas y antioxidativas (Baranauskiene et al ., 2003; Lee et al ., 2005).

Se han llevado a cabo diversos ensayos sobre la actividad fitotóxica o alelopá-tica del aceite esencial

de T. vulgaris frente a la germinación y el crecimiento de arvenses, como Chenopodium album,

Portulaca oleracea y Echinochloa crus-galli y cultivos: Raphanus sativus, Capsicum annuum, Lactuca

sativa, Triticum aesti-vum, entre muchas otras especies, mostrando gran actividad (Dudai et al ., 1999;

Angelini et al ., 2003; Arminante et al., 2006; Rolim de Almeida et al ., 2010).

La composición química de los AEs se analizó mediante cromatografía de gasesacoplada a

espectrometría de masas (GC-MS).

Se identificaron un total de 61 componentes, de los cuales 23 presentaron una concentración relativa

superior al 1% en al menos una de las especies estudiadas. Estos últimos constituyentes (>1%)

representaron entre el 80-85% de la composición total del aceite (Tabla 1). Los compuestos

monoterpénicos (oxigenados e hidrocarbonados) constituyeron la fracción mayoritaria (alrededor del

70% del aceite) de acuerdo a lo descrito por Tripathi et al. (2009).

Tabla 1 Concentración (%) de los principales componentes (>1%) del aceite esencial de Thymus vulgaris de muestras

tomadas en España (Tomada de Santana ; Gimenez.. Pérfil químico y biológico de aceites esenciales de plantas

aromáticas de interés agro-industrial en Castilla- la mancha. España)

Clase química Concentración (%)

MH 37.42

α-pineno 2.32

β-pineno+mirceno 3.22

p-cimeno 23.73

Limoneno 1.41

γ-terpineno 6.74

MO 37.36

5



1-8 cineol 4.26

Linalol 7.93

Alcanfor 0.95

Borneol 1.25

Carvacrol 21.59Terpinen-4-ol 1.38

EM 3.06

Acetato de linalilo 3.06

SE 3.28

Trans-cariofileno 3.28

MH- monoterpenos hidrocarbonados

MO- monoterpenos oxigenados

EM- esteres monoterpenico

SE- sesquiterpenos

Los compuestos con mayor actividad fitotoxica son 1-8 cineol, alcanfor, carvacrol y linalol. Que estos

componentes se encuentren en cantidades importantes en el aceite escencial de thymus vulgaris

explica la potente actividad como herbicida, fungicida e insecticida.

La extracción es una de las operaciones básicas del laboratorio. Se define como la acción de separar

con un líquido una fracción específica de una muestra, dejando el resto lo más íntegro posible. Se

pueden realizar desde los tres estados de la materia, y se

llaman de la siguiente manera:

1) Extracción sólido – líquido

2) Extracción líquido – líquido

3) Extracción gas – líquido.

La primera es la más utilizada y es sobre la que trata este

escrito de la extracción con el equipo Soxhlet (Figura 3). Como

ejemplo se pueden citar todas las obtenciones de principios

activos de los tejidos vegetales. La segunda tiene usos

especialmente en química analítica cuando se extrae el

producto de una reacción efectuada en fase líquida con un

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Figura 3: Extracción continua equipo Soxhlet

(Tomada de

http://www.cenunez.com.ar/archivos/39-

extraccinconequiposoxhlet.pdf



solvente específico para separar uno o algunos de los componentes. Por último un ejemplo de la

tercera, gas – líquido, que ordinariamente se llama ‘lavado de gases, es el burbujeo por una fase

líquida de un gas que se quiere lavar o purificar.

El proceso de extracción de la mayoría de las sustancias tiene muy baja eficiencia, es decir una vez que

se agrega el solvente, lo que está en contacto íntimo con lo extraíble se satura enseguida, por lo que

hay que filtrar y volver a tratar con solvente fresco. Eso implica gran cantidad y mucha manipulación

del solvente aparte de la atención personalizada que la operación requiere. Como muchas veces lo

que se quiere recuperar es el extracto y no la muestra extraída, habrá que evaporar todo el solvente

para recuperarlo. Por otro lado estas tareas debieran realizarse en una campana espaciosa dado que

los solventes se suene utilizar calientes, es decir con una alta tensión de vapor.

Lo que hace el extractor Soxhlet es realizar un sinfin de

extracciones de manera automática, con el mismo solvente que

se evapora y condensa llegando siempre de manera pura al

material.

La extracción Soxhlet se fundamenta en las siguientes etapas:

1) Colocación del solvente en un balón.

2) Ebullición del solvente que se evapora hasta un condensador a

reflujo.

3) El condensado cae sobre un recipiente que contiene un

cartucho poroso con la muestra en su interior.

4) Ascenso del nivel del solvente cubriendo el cartucho hasta un

punto en que se produce el reflujo que vuelve el solvente con el

material extraído al balón.

5) Se vuelve a producir este proceso la cantidad de veces necesaria para que la muestra quede

agotada. Lo extraído se va concentrando en el balón del solvente.

Existen diferentes tipos de tratamientos para concentrar los aceites esenciales: extracción con fluidos

supercríticos SFE, destilación, tratamientos con disolventes selectivos, entre otros. La destilación se

aplica por lo general a la eliminación de terpenos más volátiles que los compuestos oxigenados y el

uso de disolventes por lo general se usa para eliminar los sesquiterpénos, de punto de ebullición más

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Figura 4: Tabla de puntos deebullición de diferentes solventes

(Tomada de

http://www.cenunez.com.ar/archivos

/39-extraccinconequiposoxhlet.pdf)



alto.Los procesos de extracción a alta presión para enriquecer los aceites esenciales son

recientemente reconocidos. Por ejemplo, el proceso para remover los terpenos de los aceites

esenciales de cítricos consiste en poner en contacto el aceite esencial con dióxido de carbono a una

presión de operación entre los 70 a 90bar y temperaturas cerca de los 55°C a 85°C en una columna

supercrítica a contracorriente. La extracción en contracorriente ayuda a obtener un alto

enriquecimiento del aceite, sin embargo, la selectividad del dióxido de carbono a los terpenos es

baja .El enriquecimiento de los aceites esenciales utilizando destilación fraccionada al vació, es similar

a la rectificación simple en una columna de destilación convencional. Suele fraccionar en cuatro

partes, la que hierve antes contiene los terpenos, la siguiente tiene la mayor parte de los

componentes oxigenados, la tercera, los sesquiterpénos y la ultima, las ceras y los alquitranes

formados durante el tratamiento. Las dos últimas partes no suelen separarse. Este proceso presenta la

desventaja de que los compuestos oxigenados se destilan entre los 90°C y 100°C, ocasionando la

descomposición de los mismos, afectando sus

características organolépticas y propiedades biológicas. Se recomienda realizar el arrastre a bajo vacío

y con alcohol diluido ya que este es insolubles en terpenos, pero no en compuestos oxigenados, de

forma que resulten dos fases líquidas procedentes del condensado, retornando a la columna la

fracción alcohólica hasta eliminar completamente los terpenos.

El solvente más utilizado para realizar la extracción de terpenos, es el alcohol etílico a 96°, donde los

sesquiterpenos son totalmente insolubles, en este proceso se recomienda dejar reposar la solución de

aceite y solvente durante cierto tiempo antes de proceder a la filtración, con el fin de dejar aglomerar

los precipitados que inicialmente son coloides, también se pueden formar emulsiones que se pueden

dividir con algo de éter de petróleo, finalmente se centrifugan los sedimentos [14]. La fracción

insoluble se trata nuevamente con solvente, hasta agotar los compuestos oxigenados y la solución

alcohólica se evapora a vacío. Otros solventes que pueden ser empleados son [4], los glicoles

etilénicos y propilénicos ligeramente hidratados, soluciones de cloruro de cálcico en metanol (método

de Gehrardt) o de salicilato sódico (método de Duyck), pero las soluciones de mayor eficacia son las de

timotato o de timoxiacetato sódico (métodos de Caujolle- Coututier y de Von Heyden) que disuelven a

los compuestos oxigenados pero no a los terpenos.

La viabilidad de un lote de semillas, no durmientes, hace referencia a su capacidad de germinar y de

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ariginar plántulas normales en condiciones ambientales favorables.

El ensayo con cloruro de tetrazolio es especialmente indicado para conocer la viabilidad de semillas

que presentan dormición, o con una velocidad de germinación muy baja. EI ensayo al tetrazolio

prescnta las ventajas de que puede realizarse rápidamente y no requiere un equipamiento muy

sofisticado.

Al colocar una semilla viable en contacto con una solución de tetrazolio, los electrones liberados, en

los tejidos del embrión, reducirán a las sales de tetrazolio, con lo que éstos adquirirán un color rojo

intenso (Figura 5); si la semilla no es viable, el embrión no cambiara de color.

A veces, los embriones se colorean parcialmente, lo que indica la existencia de áreas de tejidos

muertos, debido al deterioro de la semilla (Figura 6). En estos casos, la posición y el tamaño de las

áreas necióticas, y no necesariamente la intensidad del color, es el índice que se utiliza para clasificar a

las semillas como viables o no viables

Objetivos del trabajo• Preparar extracto hidroalcohólico de tomillo

• Concentras el extracto a presión reducida

• Realizar bioensayos para detectar la actividad alelopática

• Evaluar la actividad fitotóxica presente en thymus vulgaris

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Figura 6: Patrones de tinción de la prueba con

tetrazolio (Tomada de

http://servicios.educarm.es/templates/portal/fiche

ros/websDinamicas/20/conservaci%C3%B3n

%20semillas.pdf)

Figura 5 : Prueba de tetrazolio para viabilidad de

semillas (Tomada de

http://servicios.educarm.es/templates/portal/ficheros/

websDinamicas/20/conservaci%C3%B3n

%20semillas.pdf )



Protocolo experimental

Extracción del aceite esencial de thymus vulgaris (tomillo)

Materiales Reactivos

Equipo soxhlet con cámara de extracción y

refrigerante para agua con mangueras

Aproximadamente 100 g de tomillo seco y molido

(partes aereas de la planta)

Matraz bola de fondo plano 500 ml 300 ml de Alcohol etilico 96°

Parrilla de agitación y barra magnética

2 pinzas de 3 dedos con nuez

Se monta el equipo de extracción con Soxhlet mostrado en la (Figura 7). En un matraz bola de 500 mL

se colocan 300 mL de acetato de etilo y una barra magnética (si se usa parrilla). Se llena el dedal de

celulosa con el material que va a emplear, molido o cortado en pequeños trozos y se coloca en la

cámara de extracción. Se calienta cuidadosamente hasta ebullición del acetato de etilo, cuyos vapores

deberán condensarse en el refrigerante para caer sobre el material de extracción. En el momento en

que la cámara de extracción se llena con el disolvente y llega a la parte superior del sifón, el disolvente

drena hacia el matraz.

Este proceso se repite continuamente de tal manera que cada vez se extrae mayor cantidad del aceite

esencial. Al finalizar, se desmonta el equipo y se decanta, por medio de una destilación retire el

disolvente o en el rotaevaporador (Figura 8), dejando aproximadamente 5 mL de cola de destilación,

que es el extracto más concentrado.

Una vez obtenido

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Figura 7: Extracción continua en Soxhlet

(Tomada dehttp://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Manual

2016-1_31098.pdf)

Figura 8: Rotavapor (Tomada dehttp://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Man

ual2016-1_31098.pdf)



el extracto concentrado preparar 60 ml de disoliuciones acuosas a las concentraciones 5, 10 y 20

mg/ml.

Evaluación de la actividad fitotóxica presente en el aceite esencial de thymus vulgaris en la

germinación de semillas de Lactuca sativa.

Pruebas de viabilidad en semillas de latuca sativa


Cajas de petri Cloruro de tetrazolio 1%

350 semillas de Lactuca sativa

Colocar las 150 semillas en una caja de petri y remojar con agua durante 3 a 4 horas a una

temperatura de 30 °C; o de un día para otro a temperatura ambiente.Sumergir las semillas en la

solución de TZ. Seleccionar las semillas viables y apartarlas.Evaluación de la actividad fitotóxica del aceite esencial de thymus vulgaris


12 cajas de petri Semillas viables de Lactuca sativa

Algodón Soluciones acuosas de aceite esencial de Thymus

vulgaris a diferentes concentraciones

Papel filtro

En las cajas de petri colocar un círculo de papel filtro y sobre éste una cama de algódon, colocar 25

semillas viables por caja y se agregan aproximadamente 12ml de las soluciones a distinta

concetración de acuerdo a la siguiente tabla por triplicado.

Tratamiento Testigo I II III

Concentración 0 5mg/ml 10 mg/ml 20mg/ml

Poner los cultivos a incubación y contar las semillas germinadas a las 24, 48 y 72 horas en cada una de

las cajas.

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Bibliografía

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