Fundamento PCR-ISSR

Ademas de los minisatelites existe otro tipo de ADN repetitivo al que se denomina SSRs (Simple Sequense Repeats)

Al igual que los minisatélites, estas regiones están formadas por la repetición en tán- dem de secuencias de ADN; pero en este caso son de menos de 100 pb de longitud y las unidades que se repiten más cortas

(1 a 10 pb).

• El termino de microsatélite fue introducido por Litt & Luty (1989) para describir un nuevo marcador que permite analizar estas regiones mediante una PCR.

• Para esto fue necesario diseñar dos cebadores de más de 20 nucleótidos igualmente para que sean complementarios a las sequencias que flanquean la región SSR que se quiere amplificar.

• Las condiciones de amplificación son mas restrictivas que las empleadas en las técnicas RAPD, así la temperatura de unión al cebador esta por encima de los 45°C.

La técnica consta de las siguientes etapas;

Extracción de ADN

Marcaje de uno de los cebadores con

33P

Amplificación de el ADN mediante PCR

Separación de los segmentos de ADN por

electroforesis en geles de poliacrilamida

Visualización mediante

autoradiografía

El uso de la radioactividad se puede eliminar usando cebadores sin marcar o bien cebadores marcados con sustancias fluoresentes.

• El polimorfismo que se detecta mediante esta técnica se debe a diferencias en la longitud de los fragmentos amplificados que se corresponden con variaciones en el número de repeticiones de la uni- dad básica del microsatélite en los distintos individuos analizados. Cada longitud representa un alelo en ese locus microsatélite.

• Las ventajas;• 1.- la cantidad de ADN que se necesita para la amplificación es

pequeña (550 ng por reacción).• 2.- Los Loci microsatélite son muy abundantes en el genoma.• 3.- son hipervariables por lo que es frecuente encontrar 4-5 o mas

alelos por locus. Esta proporciona un elevado poliformismo y pemite distinguir muchos individuos analizando muy pocos loci • 4.-son marcadores codominantes• 5.-los resultados pueden ser intercambiados entre laboratorios ya que

la tecnica es altamente reproducible• 6.-puede automatizarse todo el proceso

• El principal inconveniente es la localización y caracterización de microsatélites útiles, así como el diseño de cebadores adecuados. Una vez que se dispone de los cebadores, el ensayo es sencillo y rápi- do. Lo más habitual es que los cebadores utilizados para analizar un microsatélite en una determinada especie no sean utilizables en otras especies aunque sean cercanas 1997; et al. 1997).

• Otro de los inconvenientes es la imposibilidad de diferenciar entre individuos heterocigotos y hornocigotos cuando existen nulos debido a alguna mutación en el lugar de unión del cebador.