Función de la solución Tris buffer en la extracción de ADN

La solución Tris, o tri (hidroximetil) aminometano, es una solución buffer biológica común que se utiliza en todo el proceso de extracción de ADN, ya que este es sensible al pH de cualquier tipo de fuente durante dicho proceso. La solución Tris se utiliza durante la lisis celular, la eliminación y la precipitación de componentes celulares no deseados para mantener un pH estable. Además, desempeña un papel particularmente importante en la lisis celular.

La solución Tris como bufferComo el pH puede influir y ser influido por un número de factores celulares, mantener un pH estable es esencial para la ciencia experimental. Los buffers biológicos, como la solución Tris, son importantes porque pueden mantener un pH estable a pesar de las influencias que podrían modificar el pH. El Tri (hidroximetil) aminometano, con un pKa de 8,1, es una solución buffer eficaz con un pH de entre 7 y 9.Debido a su rango neutro, la solución Tris es una solución buffer comúnmente utilizada en los laboratorios biológicos. Sin embargo, la solución reguladora Tris es sensible a la temperatura y debe ser utilizada en la temperatura a la cual se logró el pH original para evitar inexactitudes.

Lisis de la célula La lisis, o ruptura de las células, es el primer paso para la extracción del ADN. Esto se logra mediante el uso de una solución buffer que contenga solución Tris y EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético). El EDTA se une a cationes divalentes tales como el calcio y el magnesio. Dado que estos iones ayudan a mantener la integridad de la membrana celular, la eliminación de estos con EDTA desestabiliza la membrana. La solución Tris es el principal componente buffer; su función principal es la de mantener el pH del buffer en un punto estable, por lo general 8,0. Además, la solución Tris interactúa con el LPS (lipopolisacárido) de la membrana, lo cual sirve para desestabilizar la membrana aún más.

La solución Tris protege al ADN de los cambios en el pHCuando las células se rompen, su ADN y contenido se vierten en el buffer. A menudo se incluyen además, la ARNasa (destruye el ARN), las proteasas (destruye las proteínas), y el SDS (dodecilsulfato sódico, solubiliza los fragmentos de membrana). En conjunto, este caldo de contenido celular y fragmentos de ARN y proteínas puede tener un gran impacto en el pH de la solución. Debido a que el ADN es sensible al pH, es importante que la solución Tris regule el caldo y mantenga el pH en un valor fijo.

Precipitación del ADNEn la etapa final de la extracción de ADN, se extrae el propio ADN de la solución. En este punto, el ADN es soluble en el buffer. Para extraer el ADN de la solución, este se hace insoluble mediante la adición de etanol o isopropanol (alcohol isopropílico). Al hacer esto, el ADN se hace visible en la solución como una sustancia blanca filiforme. A pesar de que cuando el ADN es insoluble se lo puede aislar de los componentes celulares restantes, no es "utilizable". Después de aislarlo, se elimina el alcohol, y el ADN debe ser devuelto a una solución buffer biológica, tal como la solución Tris, para ser utilizado.

FUNDAMENTO TEÓRICOEl proceso de extracción del DNA geonómico sigue ciertas pautas para su correcta purificación que son muy diferentes a los empleados en la purificación de proteínas, lo que refleja las diferencias básicas en la estructura de estos dos tipos de macromoléculas.

El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y distar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.

El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y proteínas. La desproteinización se logra en general agitando la mezcla con un volumen de fenol. El fenol (o alternativamente cloroformo) es un desnaturalizador activo de proteínas que suprime la solubilidad de las proteínas en la preparación y las precipita. Puesto que el fenol y la solución salina amortiguadora no se mezclan, solo se requiere centrifugar la suspensión para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solución dentro de la fase acuosa de arriba y la proteína presente como un precipitado concentrado en la interface.

La fase acuosa se retira y se somete a ciclos repetidos de agitación con fenol y centrifugación hasta agotar toda la proteína de la solución. Añadiendo etanol frío. El etanol frío forma una capa arriba de la solución acuosa del DNA, el cual, se aísla de las demás moléculas conforme sale de la solución.

En la interface el RNA sale de la solución salina.

En contraste, el RNA sale de la solución como precipitados. Luego de este primer paso de purificación, se disuelve el DNA y se trata con ribonucleasa mediante tratamiento con una proteasa.

Enseguida sale la proteasa por desproteinización con fenol y se vuelve a precipitar el DNA.

La electroforesis es una de las técnicas más empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, que difieren en tamaño, carga o conformación.

Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos o negativo (cátodo) de acuerdo a sus cargas.

Los fragmentos de DNA lineal migran a través del gel de agarosa con una movilidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situándose los más pequeños más cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado más o menos cada 23 pares de bases.

Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separación de los fragmentos está la concentración de agarosa.