FUNDAMENTOS DE BIOTECNOLOGAVOLUMEN I

VICTORIA ISABEL MEDINA DE P.

TRABAJO DE AO SABTICO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLN FACULTAD DE MINAS ESCUELA DE PROCESOS Y ENERGA

2004

TABLA DE CONTENIDO

Pgina VOLUMEN I viii NOMENCLATURA INTRODUCCIN CAPTULO 1 LA BIOTECNOLOGA Y SUS DESARROLLOS 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.1.2.4 1.1.2.5 1.1.2.6 1.1.2.7 1.1.3 1.1.4 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.3.6 1.3.7 1.3.8 1.4 1.4.1 1.4.2 CARACTERSTICAS DE LA BIOTENOLOGA Multidisciplinaria. Emplea diferentes tcnicas. ADN recombinante. Hibridomas. Fusin de protoplastos. Fermentacin y escalado de procesos. Tecnologa de enzimas. Cultivo de tejidos vegetales. Ingeniera de tejidos. Conviven diferentes estados de desarrollo. Multisectorial. DESARROLLO HISTRICO DE LA BIOTECNOLOGA PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS EN LOS DIFERENTES SECTORES Alimentos. Agropecuario. Farmacutico y salud. Qumico. Energa. Minera. Tratamiento de la contaminacin ambiental. Armas biolgicas OPERACIONES BIOTECNOLGICAS Eleccin del cultivo: seleccin, mejora, o en su caso creacin del organismo o la poblacin celular ms adecuada. Cultivos en masa. ii 2 2 2 2 2 4 4 5 5 5 6 6 7 ix

8 8 12 15 18 19 19 20 21 22 22 22

1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.5 1.6

Respuestas celulares. Operacin del proceso. Recuperacin de los productos. CONDICIONES DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO CENTROS Y EMPRESAS BIOTECNOLGICAS

22 22 23 24 27

CAPTULO 2 FUNDAMENTOS DE BIOQUMICA 2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.1.1 2.3.1.2 2.3.1.3 2.3.2 2.3.2.1 2.3.2.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.5.1 2.3.5.2 2.3.5.3 2.3.5.4 2.3.5.5 2.3.5.6 2.3.5.7 2.3.5.8 2.3.5.9 2.3.5.10 2.3.5.11 2.3.6 2.3.7 2.3.7.1 2.3.7.2 2.3.8 2.3.9 BIOELEMENTOS, BIOMOLCULAS Y CLULAS LAS BIOMOLCULAS EN EL AGUA CARBOHIDRATOS Clasificacin de los carbohidratos. Monosacridos. Oligosacridos. Polisacridos. Isomerismo. Ismeros estructurales. Esteroisomeros. Estructura cclica de los carbohidratos. Monosacridos y derivados importantes. Propiedades de los monosacridos. Mutarrotacin. Enolizacin (transformacin de Lobry de Bruyn von Ekenstein). Deshidratacin. Oxidacin-reduccin (azcares reductores). Reduccin de monosacridos. Oxidacin de azcares. Formacin de glucsidos. Metilacin de monosacridos. Acetilacin de monosacridos. Formacin de N-glucosilaminas. Formacin de osazonas. Oligosacridos. Polisacridos. Polisacridos de reserva. Polisacridos estructurales. Paredes celulares de las plantas. Paredes celulares bacterianas. 32 41 44 45 45 45 45 45 46 48 52 57 57 58 59 59 60 61 62 63 63 63 64 64 67 67 69 73 73 75 75 75 iii

2.4 LPIDOS 2.4.1 Clasificacin de los lpidos. 2.4.1.1 Lpidos complejos.

2.4.1.2 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7 2.4.8 2.5 2.5.1 2.5.1.1 2.5.1.2 2.5.1.3 2.5.2 2.5.3 2.5.3.1 2.5.3.2 2.5.3.3 2.5.3.4 2.5.3.5 2.6 2.6.1 2.6.1.1 2.6.1.2 2.6.1.3 2.6.2 2.6.3 2.6.3.1 2.6.3.2 2.6.3.3 2.6.4 2.6.5 2.7 2.7.1 2.7.2 2.7.3 2.7.3.1 2.7.3.2 2.7.3.3 2.7.3.4 2.7.4 2.7.4.1 2.7.4.2 2.7.4.3

Lpidos sencillos. cidos grasos. Acil glicridos. Ceras. Fosfolpidos. Esfingolpidos. Glucolpidos. Terpenoides y esteroles. AMINOCIDOS, PPTIDOS Y PROTENAS. Aminocidos. Clasificacin de los aminocidos. Propiedades generales de los aminocidos. Reacciones de los aminocidos. Pptidos. Protenas. Clasificacin de las protenas. Estructura proteica. Propiedades de las protenas. Desnaturalizacin de las protenas. Biomembranas. CIDOS NUCLEICOS Estructura de los nucletidos. Bases pirimidnicas y purnicas. Nuclesidos. Nucletidos. cido desoxirribonucleico (ADN). cido ribonucleico (ARN). ARN mensajero (ARNm). ARN de transferencia (ARNt). ARN ribosmico (ARNr). Propiedades de los cidos nucleicos. Traduccin. ENZIMAS Caractersticas de las enzimas como catalizadores. Clasificacin de las enzimas. Aplicaciones de las enzimas. Catalizadores en procesos industriales. En anlisis. En medicina. Otras aplicaciones. Propiedades de las enzimas. Estabilidad. Capacidad cataltica. Especificidad. iv

76 76 79 81 82 84 85 86 89 90 90 96 97 98 99 103 105 106 106 109 109 109 110 110 111 115 115 115 116 117 117 118 118 118 120 120 120 123 125 125 125 126 128

2.7.5 Actividad enzimtica y su medicin. 2.7.6 Produccin de enzimas. 2.7.6.1 Ventajas de los microorganismos como productores de enzimas. 2.7.6.2 Recuperacin de enzimas extracelulares e intracelulares. 2.7.6.2.1 Operaciones de separacin slido-lquido. 2.7.6.2.2 Operaciones de extraccin de enzimas intracelulares. 2.7.6.2.3 Concentracin del caldo de fermentacin. 2.7.6.2.4 Purificacin. 2.7.6.2.5 Formulacin de preparados enzimticos comerciales. 2.7.6.3 Enzimas inmovilizadas. 2.7.6.3.1 Matrices utilizadas como soporte de enzimas. 2.7.6.3.2 Seleccin de un soporte. 2.7.6.3.3 Tcnicas de inmovilizacin de enzimas. 2.7.6.3.4 Eleccin del mtodo de inmovilizacin. 2.7.6.4 Inmovilizacin de clulas. 2.7.7 Cintica enzimtica. 2.7.7.1 Cintica enzimtica en fase homognea. 2.7.7.2 Influencia del pH y la fuerza inica en la actividad enzimtica. 2.7.7.3 Influencia de la temperatura en la actividad enzimtica. 2.7.7.4 Inhibicin de las enzimas. 2.7.7.4.1 Inhibicin irreversible. 2.7.7.4.2 Inhibicin reversible.

129 130 130 131 132 133 134 137 139 140 141 142 143 145 146 146 146 148 148 148 148 149

CAPTULO 3 FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA 3.1 TAXONOMA 153 155 155 155 156 156 156 157 158 161 161 163 163 168 169 v

3.2 MTODOS EN MICROBIOLOGA 3.2.1 Microscopios y microscopa. 3.2.1.1 Microscopios pticos. 3.2.1.2 Microscopios electrnicos. 3.2.2 Preparaciones para el examen por microscopa ptica. 3.2.2.1 Tcnica del montaje en hmedo y de gota pendiente. 3.2.2.2 Tcnicas de tincin. 3.3 3.4 3.5 3.6 3.6.1 3.7 3.8 TCNICAS DE CULTIVO PURO MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN DE CULTIVOS PUROS TCNICAS DE CARACTERIZACIN BACTERIAS Caractersticas morfolgicas. CIANOBACTERIAS HONGOS

3.9 3.10 3.11 3.12 3.13

VIRUS NUTRICIN MICROBIANA MEDIOS DE CULTIVO CRECIMIENTO DE POBLACIONES EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

172 173 178 179

182 189

3.14

VOLUMEN II

CAPTULO 4 METABOLISMO CELULAR Y BIOENERGTICA 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3 METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS Gluclisis y fermentacin alcohlica. Ciclo del cido tricarboxlico o ciclo de cido ctrico (Ciclo de Krebs) Ciclo del glioxilato. Ciclo de las pentosas fosfato o va del fosfogluconato. Va de Entner-Doudoroff. Sntesis de la glucosa (glucognesis). METABOLISMO DE LOS LPIDOS Oxidacin de los cidos grasos. Metabolismo del glicerol. Sntesis de los cidos grasos. Biosntesis de los triacilgliceroles. TRANSPORTE DE ELECTRONES Y FOSFORILACIN OXIDATIVA METABOLISMO DE LAS PROTENAS Metabolismo de los aminocidos. Almacenamiento de nitrgeno. Ciclo de la rea. TRANSPORTE EN LA MEMBRANA Y CONSUMO DE ENERGA BIOENERGTICA Rendimiento energtico del metabolismo de los carbohidratos. vi 200 200 204 206 207 208 209 209 210 212 212 213

214 220 221 223 224 226 230 233

4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.5 4.6 4.6.1

4.6.2 4.7

Rendimiento energtico de la oxidacin de los cidos grasos. RELACIONES ENTRE LAS TRAYECTORIAS METABLICAS

234 236

CAPTULO 5 PROCESOS FERMENTATIVOS 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.2 5.2.1 5.2.2 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3 5.5.4 5.5.5 5.6 5.6.1 5.6.2 5.6.3 5.6.4 5.6.5 5.7 ETANOL Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del etanol. Proceso de produccin de etanol. Utilizacin del etanol. LA CERVEZA Materias primas. Fabricacin de la cerveza. CIDO CTRICO Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del cido ctrico. Proceso de produccin de cido ctrico. Utilizacin del cido ctrico. CIDO ACTICO. Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del cido actico. Proceso de produccin del cido actico. Utilizacin del cido actico. CIDO LCTICO Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del cido lctico. Proceso de produccin del cido lctico. Utilizacin del cido lctico. PROTENA UNICELULAR (PUC) Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica de la produccin de PUC. Proceso de produccin de PUC. Utilizacin de la protena unicelular. DIGESTIN ANAEROBIA (BIOGS) vii 240 241 242 244 244 247 247 248 252 260 260 261 262 263 265 266 266 268 269 270 274 274 275 279 281 282 282 284 286 290 291 293 297 298

5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.7.4 5.7.5 5.8 5.8.1 5.8.2 5.8.3 5.8.4

Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del biogs. Proceso de produccin de biogs. Utilizacin del biogs. TRATAMIENTO BIOLGICO DE AGUA RESIDUAL Agentes del tratamiento biolgico. Utilizacin del tratamiento biolgico. Bioqumica del proceso. Procesos de tratamiento biolgico.

298 299 301 302 308 308 309 310 311 311 316

BIBLIOGRAFA

viii

NOMENCLATURA

A: ADN: AN: ARN: ADP: AMP: ATP: ATT: C: CTP: CoQ: dAMP: dGTP: dUTP: 5GMP: G: GDP: GTP: 5IMP: FDA: FAD: FADH2: FMN: LAB: NAD: NADH: NADP: NADPH: PEP: PUC: T: TPP: SIDA: U: UTP: Vmax: VHB: 5XMP:

adenina cido desoxirribonucleico. cido nucleico. cido ribonucleico. adenina difosfato. adenina monofosfato. adenina trifosfato. enzima -antitripsina. citosina. citosina trifosfato. ubiquinona (benzoquinona). desoxiadenina monofosfato. desoxiguanosina trifosfato. desoxiuridina trifosfato. cido guanidlico. guanina. guanina difosfato. guanosina trifosfato. cido isocnico. oficina de alimentacin y farmacia. dinucletido de flavina y adenina (forma oxidada). dinucletido de flavina y adenina (forma reducida). mononucletido de flavina. bacterias acido lcticas. dinucletido de nicotinamida y adenina (forma oxidada). dinucletido de nicotinamida y adenina reducido (forma reducida). dinucletido fosfato de nicotidamina y adenina (forma oxidada) dinucletido fosfato de nicotidamina y adenina reducido (forma reducida). fosfoenol piruvato. protena unicelular. timina. pirofosfato de tiamina. sndrome de inmunodeficiencia adquirida. uracilo. uridina trifosfato. velocidad mxima. hepatitis B. cido xantlico.

INTRODUCCIN

La biotecnologa es de naturaleza multidisciplinaria y, por lo tanto, requiere aportes de la bioqumica, la microbiologa, la biologa molecular, la gentica, la qumica, la ingeniera qumica, entre otras. Al ser multidisciplinaria, es esencial la buena comunicacin y la transmisin rpida de conocimientos. Adems, la investigacin y los desarrollos en biotecnologa, son muy dinmicos en el mundo y cada vez es mayor la poblacin, no slo de cientficos e ingenieros, que advierte el potencial de la biotecnologa. Con el presente trabajo se pretende que el estudiante de ingeniera, especialmente el de ingeniera qumica, adquiera los conocimientos bsicos, mnimos, que le permita interactuar con personas de otras disciplinas y profesiones que laboran en el campo de la biotecnologa. Es as, como se empieza por definir la biotecnologa; se analizan sus caractersticas, su desarrollo histrico y sus aplicaciones en los diferentes sectores (alimentos, agropecuario, farmacutico y salud, qumico, energa, minera, ambiental y armas biolgicas). Adems, se discuten las etapas de un proceso tpico de fermentacin. Se dan a conocer las reas prioritarias y los temas especficos de investigaciones en desarrollo, de los pases latinoamericanos. Se mencionan algunos de los centros y empresas que trabajan en biotecnologa. A continuacin, se sintetizan los temas ms importantes de bioqumica, de microbiologa, de metabolismo celular y de bioenergtica, que como ya se dijo, le permitan al estudiante hablar el mismo lenguaje y poderse entender con las personas de otras disciplinas que trabajan en los diferentes sectores de la biotecnologa. Finalmente, se discuten algunos procesos fermentativos como son la produccin de: etanol, cerveza, cido ctrico, cido lctico, cido actico, protena unicelular, biogs. Adems, se analiza el tratamiento biolgico de aguas. Se espera que el trabajo, sirva como texto gua para el curso de Fundamentos de Biotecnologa, que corresponde a la primera asignatura de la Lnea de Profundizacin en Biotecnologa. Adems, que proporcione las bases acadmicas para las asignaturas: Ingeniera Bioqumica y Tratamiento Biolgico de Aguas, que se dictan a continuacin.

CAPTULO 1 LA BIOTECNOLOGA Y SUS DESARROLLOS

La biotecnologa no es, en s misma, una ciencia, es un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias. Como tal, la biotecnologa ha sido utilizada por el hombre desde los comienzos de la historia en actividades tales como la preparacin del pan y de bebidas alcohlicas o el mejoramiento de cultivos. Sin embargo, la biotecnologa en los ltimos aos ha cobrado gran importancia. Debido a que su aplicacin no es nueva, se identifican dos tipos de procesos y productos biotecnolgicos: aquellos en los que se utiliza la biotecnologa tradicional y los que emplean los logros generados con los descubrimientos cientficos, principalmente en biologa molecular, que conforman la biotecnologa moderna. La biotecnologa se ha definido de diversas formas, entre las que se tienen: La biotecnologa es la aplicacin controlada y deliberada de agentes biolgicos sencillos (clulas vivas o muertas, o componentes celulares) en operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de fabricacin de productos o como operaciones de servicio ( Bulock et al., 1991). La biotecnologa es el conjunto de tcnicas que permiten manipular a los seres vivos o parte de ellos para producir bienes y servicios. En esta definicin se incluyen desde los microorganismos hasta las plantas, clulas animales y humanas y animales superiores (Quintero, 1990). La biotecnologa es una actividad multidisciplinaria que se sustenta en el conocimiento de frontera generado en disciplinas tales como biologa molecular, bioqumica, bioingeniera, biologa vegetal, microbiologa, etc. y cuyo objetivo es la utilizacin de este conocimiento para el desarrollo de tecnologa limpia, que sea tcnica y econmicamente competitiva, y que permita, mediante el uso racional de los sistemas y organismos vivos, sus productos o sus partes, la solucin de problemas socioeconmicos relevantes (Quintero et al.., 1993). La biotecnologa moderna es la aplicacin comercial de organismos vivos o sus productos, la cual involucra la manipulacin deliberada de sus molculas de ADN (Colciencias, 2004). La definicin de biotecnologa moderna implica una serie de desarrollos en tcnicas de laboratorio (ADN recombinante, anticuerpos monoclonales, cultivo de clulas y tejidos, entre otras) que, durante las ltimas dcadas, han sido responsables del tremendo inters cientfico y comercial en biotecnologa, la creacin de nuevas empresas y la reorientacin

de investigaciones y de inversiones en compaas ya establecidas y en universidades. La posibilidad que ofrece la biotecnologa moderna es que presenta sistemas radicalmente novedosos para alterar o modificar las propiedades genticas de los organismos en una forma totalmente dirigida. Esta capacidad ha dependido de los descubrimientos y avances de las tcnicas de biologa molecular, del mayor conocimiento del ADN como material de la herencia, del cdigo gentico, de los mtodos de leer el mensaje gentico por secuenciacin de los genes, del uso de las enzimas de restriccin con las cuales es posible cortar y unir fragmentos de ADN, en una forma dirigida y deliberada. Los organismos utilizados hoy en da en biotecnologa pueden ser complejos como el ganado vacuno, o tan simples como las levaduras utilizadas para la produccin de cerveza o del pan (Colciencias, 2004).

1.1 CARACTERSTICAS DE LA BIOTECNOLOGA Se abordan estas caractersticas como metodologa que permita aclarar los alcances de la biotecnologa (Montoya, 1990): 1.1.1 Multidisciplinaria. Requiere de la interaccin de diversos especialistas con conocimientos adecuados para comunicarse y vincularse recprocamente y entender los razonamientos de la ciencia bsica para ser expertos en su aplicacin. Entre los especialistas se encuentran los genetistas, bioqumicos, microbilogos, bilogos, bilogos moleculares, bilogos celulares, botnicos, ingenieros agrnomos, virlogos, qumicos analticos, ingenieros bioqumicos, ingenieros qumicos, ingenieros controladores, ingenieros electrnicos e informticos. 1.1.2 Emplea diferentes tcnicas. Entre las tcnicas utilizadas estn: 1.1.2.1 ADN recombinante. Permite transferir genes de un organismo a otro, utilizando para ello vehculos (plsmidos, csmidos, fagos, etc.) que hacen posible introducir un gen extrao a un microorganismo y obligar a este a producir algo que normalmente no produce; en pocas palabras, se construye un nuevo microorganismo con caractersticas especiales (Figura 1.1) (Montoya, 1990). Mediante este mtodo es posible dar a un microorganismo (levadura, bacteria) la informacin gentica para producir protenas costosas como interfern, hormona de crecimiento, insulina, enzimas de utilidad industrial. Tambin es posible dar informacin nueva a clulas vegetales o animales (genes de fijacin de nitrgeno atmosfrico, transmitidos a una planta que se cultiva). (Gasser et al., 1992). En la Figura 1.2 se presenta un esquema de la ingeniera gentica vegetal. 1.1.2.2 Hibridomas. Esta tecnologa inventada por Kohler y Milstein, consiste en combinar la habilidad de las clulas sanguneas, linfocitos B, para producir anticuerpos, con la inmortalidad de las clulas cancerosas. A diferencia de las clulas normales, las clulas hbridas se pueden cultivar en el laboratorio en condiciones apropiadas para dividirse y crecer de manera indefinida. La clula hbrida tiene propiedades de ambas clulas originarias: produce anticuerpos monoclonales y crece indefinidamente. 2

Figura 1.1. Insercin de un gen en un plasmidio de Eschirichia coli y clonacin de este gen en las clulas del cobacilo (Montoya, 1990)

Figura 1.2. Ingeniera gentica vegetal con los plsmidos inductores de tumor de la Agrobacterium tumefaciens (Perea, 1990) 3

1.1.2.3 Fusin de protoplastos. Se emplea con clulas de origen vegetal. Se disuelve la pared celular y el material gentico de dos clulas se colocan en contacto; despus de la fusin el cultivo se induce a formar de nuevo la pared celular y las clulas fusionadas pueden generar embriones o plntulas que finalmente formarn una nueva planta. Para la eliminacin enzimtica de la pared celular se utiliza mezclas de preparados comerciales de celulasas, pectinasas y hemicelulasas fngicas en una solucin de elevado potencial osmtico. A travs de la fusin de protoplastos se recombinan los genes de dos especies que no se aparean. La fusin permite tambin mejorar la recombinacin entre cepas de un organismo como Streptomyces, que raramente se aparea. Cuando se realiza la fusin de protoplastos, se obtiene una clula con dos (o ms) ncleos. Si los protoplastos proceden de diferentes tipos de clulas parentales se denomina heterocariontes y s se originan de clulas genticamente iguales homocariontes. El trmino hbrido se utiliza una vez se ha producido en el heterocarionte la fusin de ncleos. Las clulas producidas que poseen el ncleo de un tipo de protoplasto y los orgnulos de otro diferente se denominan cbridos, para distinguirlos de los hbridos nucleares. Estas diferentes combinaciones de la informacin gentica se muestran esquemticamente en la Figura 1.3.

Figura 1.3. La fusin de dos protoplastos genticamente diferentes puede dar lugar a hbridos completos, hbridos parciales y cbridos 1.1.2.4 Fermentacin y escalado de procesos. Las fermentaciones son los procesos ms conocidos y consisten en poner microorganismos, clulas animales o vegetales, en un medio de cultivo adecuado, con condiciones controladas para que este organismo sintetice un producto esperado. Las fermentaciones representan el proceso biotecnolgico industrial ms importante. Los principales productos determinados por esta va son: etanol, protena unicelular, cidos orgnicos, aminocidos, jarabes fermentados, polisacridos de origen microbiano y antibiticos, entre otros. 4

Los procesos de recuperacin y purificacin del producto son generalmente costosos y requieren un alto desarrollo. El escalado de procesos biotecnolgicos es indispensable, ya que en el laboratorio las condiciones son fcilmente controlables, la calidad de las materias primas es definida y poseen alto grado de pureza. Esta situacin cambia notablemente cuando se pasa a la produccin industrial, por esto se requiere un paso intermedio a escala piloto. 1.1.2.5 Tecnologa de enzimas. Esta tcnica permite llevar a cabo reacciones catalizadas por enzimas, fuera de la clula, lo cual abre un amplio panorama de aplicacin en la industria de alimentos, mdica, analtica, entre otras. Por medio de procesos biotecnolgicos se producen las enzimas y se utilizan como biocatalizadores en operaciones continuas haciendo circular el sustrato a travs del reactor en donde se tiene inmovilizadas las enzimas (o clulas con actividad enzimtica). Existen varios mtodos de inmovilizacin de enzimas: atrapamiento (en geles de alginato clcico, agar o agarosa, en fibras y microencapsulacin), unin a un soporte (adsorcin fsica, enlace inico, quelacin o unin metlica, enlace covalente), entrecruzamiento, inmovilizacin de enzimas solubles (Medina, 1995). Entre las enzimas producidas por microorganismos estn: glucosa-isomerasa (jarabe fructosado), -amilasa y -gluconasa (degradar polmeros en el proceso de la cerveza), glucosa-oxidasa (evitar fenmenos de oxidacin), -galactosidasa (hidrlisis de la lactosa), renina (cuajada), proteasa (hidrlisis del gluten), lipasas (hidrolizar los triglicridos), celulasas (hidrlisis celulosa), invertasa (hidrlisis de la sacarosa), pectinasa (hidrlisis de la pectina), (Medina, 1995). La reduccin de la lactosa de la leche con - galactosidasa, antes de su ingestin, es una de las formas ms comunes de aliviar la indigestin de la lactosa (Rao et al., 1997). 1.1.2.6 Cultivo de tejidos vegetales. El cultivo de tejidos vegetales, permite aumentar el rendimiento de cosechas, fertilizantes, etc., al mejorar las especies vegetales e incrementar su resistencia a enfermedades y condiciones climticas adversas. Permite obtener poblaciones importantes en tiempos relativamente breves y espacios limitados. A partir del meristemo de una planta pueden producirse miles de descendientes por cultivo in vitro; tambin puede lograrse del meristemo de una planta infectada variedades libres de infeccin. El cultivo de tejidos de plantas se ha utilizado para la produccin de metabolitos secundarios, como las hormonas, la vainilla (saborizante), la serotonina (amina biognica), la nicotina (alcaloide) (Havkin-frenkel et al., 1997), la serpentina, la ajmalicina y la catharantina (alcaloides tipo indol) (Habeych et al., 2002). 1.1.2.7 Ingeniera de tejidos. Se han dado los primeros pasos hacia la creacin de rganos semisintticos que sirvan de recambio de los naturales. La creacin de tejidos u rganos artificiales, se conoce como neoformacin de rganos. Se esta trabajando en los neorganos fabricados con clulas y fibras plsticas. Un ingeniero de tejidos inyecta o deposita en una herida o un rgano que requiera regeneracin, una molcula, por ejemplo, un factor de crecimiento. Esta molcula moviliza las clulas del paciente hacia la herida e insta su transformacin en un tipo celular concreto, que regenere el tejido. Ms ambicioso es el transplante de clulas, del propio paciente o de un donante, cultivadas de antemano e 5

incorporadas en una urdimbre tridimensional de polmeros biodegradables, como los que se utilizan para hacer suturas resorbibles. La estructura entera, clulas y urdimbre, se transplanta a la herida, aqu, las clulas se dividen y reorganizan para formar tejido nuevo. Al mismo tiempo se van desintegrando los polmeros artificiales, hasta que slo queda formado un producto completamente natural, un neorgano. Como productos de la ingeniera de tejidos se incluyen piel, cartlago, hueso, ligamento y tendn artificiales. Tambin podran producirse hgados, riones, mamas o intestinos, rganos grandes y complejos, dotados cada uno, de diferentes tipos de clulas. Las clulas de cultivo derivadas de embriones humanos (clulas capaces de dar origen a distintos tejidos) en un estadio temprano del desarrollo podran destinarse a la fabricacin de tejido de recambio en rganos afectados, por ejemplo, el corazn. En algunas partes se expende, ya el primer producto comercial de ingeniera de tejidos, se trata de un tipo de piel artificial, sintetizada por el hombre (Mooney et al., 1999), (Pedersen, 1999), (Lysaght et al., 1999), (Langer et al., 1999), (Parenteau, 1999). La ingeniera de tejidos en el sistema nervioso constituye la ciencia de disear, crear y realizar sistemas donde las clulas neurales son organizadas de una manera controlada (Bellamkonda et al., 1994). 1.1.3 Conviven diferentes estados de desarrollo. Los procesos tradicionales son factibles de mejorar y de optimizar, mediante la aplicacin de modernas tcnicas biotecnolgicas. Es as, como pueden coexistir las biotecnologas de primera, segunda y tercera generacin. Se denomina biotecnologa de primera generacin, aquella que se origina en la fermentacin de alimentos y bebidas. Los productos de las biotecnologas determinadas de segunda generacin incluyen: antibiticos, cidos orgnicos, glicerol, aminocidos, protena unicelular, etc. En general las aplicaciones de los productos de primera y segunda generacin pertenecen a las industrias qumicas, farmacuticas y de alimentos. Se considera que los productos de primera y segunda generacin estn en una madurez tecnolgica, aunque algunas de las nuevas tcnicas pueden contribuir a mejorar los rendimientos en procesos tradicionales. La biotecnologa moderna de tercera generacin est determinada por tres hechos trascendentales: Los descubrimientos de Stanley Cohen y Helbert Boyer en 1973, quienes demostraron que mediante el uso de enzimas especiales se poda cortar (endonucleasas de restriccin) y pegar (ligasas) el ADN y fabricar as microorganismos con informacin gentica que antes no posea, para producir determinadas sustancias. En 1975 Kohler y Milstein demostraron, por su parte, la produccin de anticuerpos monoclonales, fusionando linfocitos y clulas cancerosas. El incremento de los precios del petrleo (1973 y 1974), provoc una reaccin de los pases industrializados, orientada a financiar desarrollos de fuentes alternas de energa, incluyendo lignocelulosa y, con esto, el apoyo a la moderna biotecnologa. 1.1.4 Multisectorial. La biotecnologa se est moviendo a esferas muy importantes y de gran impacto. Despus de salud y farmacutico (los principales sectores de aplicacin) y las aplicaciones subsiguientes en agricultura y sector alimenticio, la proteccin y restauracin del ambiente, pueden convertirse en un logro prioritario de las ciencias y tecnologas de la vida. La biotecnologa afecta adems el sector qumico, energtico y de la minera. 6

1.2 DESARROLLO HISTRICO DE LA BIOTECNOLOGA Los registros que se tienen se presentan a continuacin (Montoya, 1990), (Angarita, 1991), (Bud, 2001), (Valderas, 2002), (Cuesta et al., 2003): Ao 8000 a 6000 AC. 4000 AC. 2000 AC. 1800 AC. 1400 1869 1870 1876 1900 1916 Acontecimientos Obtencin de bebidas fermentadas de cereales (Babilonia y Egipto). Pan valindose de procesos fermentativos (Egipto) Vino, pan, fermentacin productos lcteos, fermentacin alcohlica. Rotacin en los campos agrcolas. Destilacin de los medios en que se cultivaba la levadura (China y/o Medio Oeste). Meischer descubri el ADN. Produccin de vacunas. Pasteur descubri los procesos microbianos de fermentacin en cerveza y en otros productos fermentados. cidos orgnicos. Se invent el trmino gene en el estudio de la herencia. Se estableci la primera gran planta de digestin anaerobia y se uso la fermentacin para producir glicerina y acetona. Trabajos preliminares de Fleming sobre la penicilina. Produccin industrial de penicilina por Florey. Antibiticos, vitaminas. Modelo de doble hlice para el ADN. Fabricacin de cido glutmico en el Japn. Fabricacin de lisina en Estados Unidos. Aminocidos, enzimas y vacunas. Clonacin del primer gene por ingeniera gentica. Primer anticuerpo monoclonal. Creacin primera empresa de Biotecnologa. Aprobacin del uso de anticuerpos monoclonales para diagnstico. Insulina humana. Transformacin de vegetales por ingeniera gentica. Nueve productos de uso teraputico humano, doscientos sistemas de diagnstico utilizando anticuerpos monoclonales. Pruebas de campo con especies vegetales modificadas genticamente. Se aprob la quimosina para la manufactura de quesos. La FDA autoriz la comercializacin del primer alimento transgnico Se clon el primer animal adulto (la oveja Dolly). Cien nuevos productos de uso teraputico humano, semillas de cultivos bsicos transformadas genticamente, nuevos agroqumicos, nuevos materiales y productos qumicos. Mapa del genoma humano. Por lo menos 200 sustancias llegarn a la fase de ensayo clnico.

1929-1932 1941 1950 1953 1956-1957 1957 1960 1973 1975 1976 1981 1983 1988

1990 1994 1997 1990 - 2000

2000 2002

7

1.3

PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS EN LOS DIFERENTES SECTORES

1.3.1 Alimentos. La biotecnologa puede utilizarse en dos formas en el campo de la industria de alimentos. En primer lugar usando microorganismos que transformen biomasa no comestible en alimentos para consumo humano o animal (protena unicelular, ensilajes) y en segundo lugar, usando microorganismos que permitan el procesamiento de alimentos, actuando directamente sobre stos (productos fermentados) o produciendo sustancias que puedan ser aadidas a los alimentos (aditivos, saborizantes, cuajo) (Angarita, 1991). El sector de los alimentos fue el primero en acoger las innovaciones biotecnolgicas a mediados de 1970. Al inicio de la dcada de 1990, las operaciones comerciales con aplicaciones de biotecnologa moderna, incluan: mtodos biotecnolgicos de pruebas y controles, bioconversin de almidn a productos endulzantes, saborizantes y productos para destacar el sabor, procesamiento de jugos de frutas, aminocidos y otros nutrientes especiales, pigmentos y vitaminas de microalgas, nuevos alimentos producto de la fermentacin, enzimas para produccin de quesos, productos lcteos libres de lactosa e hbridos de levadura. Ms recientemente se estn aplicando tcnicas moleculares muy exactas, sensibles y reproducibles para diagnstico y control de la calidad (Colciencias, 2004). Los microorganismos se han utilizado en la fabricacin de alimentos como el: Queso: el crecimiento de los mohos en los quesos genera los compuestos de aroma y sabor que distingue a cada tipo. La renina microbiana (antes cuajo obtenido del cuarto estmago de terneras destetadas), permite la formacin de la cuajada en la fabricacin del queso (Rose, 1981), (Garca et al., 1993). Yogur: leche entera fermentada con bacterias lcticas ( Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus). Desde hace muchos aos, se han atribuido a los productos lcteos fermentados, especialmente al yogur, algunas propiedades nutritivas, medicinales y teraputicas. Los microorganismos utilizados en la fermentacin del yogur tienen una accin beneficiosa sobre la flora intestinal (Amiot, 1991), (Garca et al., 1993), (Bourgeois et al., 1995). Kefir: leche entera o parcialmente desnatada fermentada con los granos de kefir durante 12 a 24 horas. El filtrado del producto de la fermentacin tiene un aspecto parecido al de la leche pero con burbujas y espuma como la cerveza. Adems, de bacterias lcticas contiene levaduras que fermentan el azcar, en una menor proporcin a alcohol y CO2 (Amiot, 1991), (Garca et al., 1993). Bebidas alcohlicas: obtenidas por la fermentacin de azcares por la S. cerevisiae. Las bebidas alcohlicas se dividen en tres categoras: vinos y cervezas, que se fabrican por fermentacin con levaduras de un zumo de fruta o de un extracto azucarado de un grano; vinos encabezados, en los que se aade brandy al vino y destilados, que se obtienen por destilacin de vinos o cervezas (Bourgeois et al., 1995).

8

En la fabricacin de cerveza se maltea la cebada, a fin de que el grano germine brevemente y produzca enzimas que catalicen la rotura o degradacin del almidn. La malta se tritura y mezcla con agua caliente, antes de depositarla en los tanques de fermentacin, se macera durante unas horas para que las enzimas rompan las largas cadenas de almidn en hidratos de carbono de molculas ms pequeas. El extracto acuoso (mosto) se cuece con lpulo para conferirle el sabor tpico a la cerveza. Se elimina el lpulo. Se pone a fermentar el mosto con Saccharomyces cerevisiae. Luego pasa a maduracin, pasteurizacin y embotellado. Pan: la levadura Saccharomyces cerevisiae, degrada los azcares de la masa originando una mezcla de alcohol y burbujas de CO2, la cual queda retenida en la masa. Cuando sta se hornea, despus del perodo de fermentacin, se elimina el alcohol; en cambio, las burbujas de CO2 permanecen y dan textura al pan (Rose, 1981), (Bourgeois et al., 1995). Alimentos fermentados. Tempeh: pastel compacto de un producto vegetal (soja, cacahuete, coco) completamente cubierto y atravesado por un micelio blanco de especies de mohos del gnero Rhizopus. Contiene un 40 % de protena, se consume ampliamente en Indonesia. Natto: soja fermentada por el moho Aspergillus oryzae, se come en el Japn. Sufu: fermentado de soja cuajada con una variedad de mohos, principalmente especies de Mucor; se consume en la China. Ang-kak: fermentado de arroz con el moho Monascus purpureus, no se altera el sabor del arroz sino que se colorea de rojo; se consume en la china. Salsa de soja, fermentado de soja. Koji: fermentado de una mezcla de salsa de soja y trigo con el moho Aspergillus oryzae. Moromi, fermentado de una mezcla de koji con una igual cantidad de solucin de sal (Rose, 1981), (Bourgeois et al., 1995). Conservacin de los vegetales por fermentacin. Col cida (sauerkraut o choucroute) por mtodo de salado en seco. Se genera una salmuera por el gradiente osmtico alcanzado por la interaccin de la sal y los fluidos naturales de la col. En la salmuera, las bacterias lcticas que proceden de la col fresca llegan predominar sobre la flora restante a lo largo de todo el proceso de fermentacin. Otros vegetales acidificados son: los pepinos y pepinillos, las judas verdes, las zanahorias, las cebollas, la remolacha, la coliflor, el apio, los esprragos, las aceitunas verdes y negras. (Arvalo, 1991). Las bacterias acidolcticas (LAB) se han utilizado en la conservacin de muchos alimentos, incluyendo frutas y vegetales y en el ensilado de piensos (forraje) (Rose, 1981), (Breidt et al., 1997), (Bourgeois et al., 1995). Protena unicelular (PUC).Una de las principales ventajas que conlleva el crecimiento microbiano en alimentos, tipo tempeh, es la de aumentar el contenido proteico. Extensin lgica de esta idea es el desarrollo, a gran escala, de microorganismos apropiados como fuente directa de alimentos para el hombre y de piensos para animales. Alemania durante la primera guerra mundial, debido a la escasez de vveres, produjeron S. cerevisiae a gran escala, reemplazando un 60 % de los alimentos que importaba antes del conflicto. La levadura se aada principalmente a sopas y embutidos. Durante la segunda guerra mundial varias fbricas se aprestaron a desarrollar cepas especiales de levaduras (Candida arborea y Candida utilis) para cubrir necesidades alimentarias. Ms 9

tarde en la dcada de los 60, esa estrategia ocupa un primer plano a la hora de idear recursos para los pases subdesarrollados; se disearon procesos para desarrollar cepas de Candida lipolytica, que obtenan el carbono y la energa para el crecimiento de los alcanos (molculas de hidrocarburos de cadena lineal) del petrleo. Fue entonces cuando se acuo el trmino protenas unicelulares para describir el nuevo campo de alimentos y piensos microbianos (Rose, 1981), (Phaff, 1981), (Medina et al., 1996), (Medina, 2003). Enzimas. La aplicacin de enzimas en la industria de alimentos es muy variada. Para la coagulacin enzimtica de la leche se usa el cuajo microbiolgico proveniente de los mohos Endothia parastica, Mucor pusillus y Mucor miehie (Angarita, 1992). Con el uso de enzimas pectolticas en la produccin de pulpas de fruta, se logra aumentar la produccin de pulpa, disminuir la viscosidad, mejorar la estabilidad del nctar, aumentar la eficiencia de evaporacin, etc. (Pinzn, 1991). Para la produccin de leche con lactosa hidrolizada se usa la -galactosidasa (lactasa) que hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa. Adems, la hidrlisis de la lactosa disminuye los riesgos de recristalizacin de sta en los productos lcteos y aumenta su poder endulzante (Angarita, 1992). Para la produccin de glucosa a partir de almidn se usan las amilasas y amiloglucosidasas. Tambin se ha utilizado la glucosa-isomerasa para la produccin de fructosa a partir de glucosa (Crueger et al., 1993). La invertasa al hidrolizar la sacarosa forma jarabes ms dulces, constituidos por monosacridos ms solubles que la sacarosa que no cristalizan al ser concentrados. Las amilasas que existen naturalmente en la levadura y la harina de trigo contribuyen principalmente a la produccin de dixido de carbono durante la fermentacin y coccin, los dos procesos responsables del desarrollo del sabor y la subida de la masa para obtener un pan suave y sabroso (Medina, 1995). Aminocidos. Los aminocidos tienen amplias aplicaciones industriales (alimentos, aditivos de piensos, medicina y cosmtica y como material de partida en la industria qumica). En la industria de alimentos los aminocidos se utilizan solos o en combinacin para aumentar el sabor. El glutamato sdico, el aspartato sdico y la D, L-alanina, se aaden a los jugos de frutas para mejorar el sabor y la glicocola se adiciona a los alimentos que contienen edulcorantes. La L-cistena mejora la calidad (textura) del pan durante el proceso de coccin y acta como un antioxidante en los jugos de frutas. El L-triptfano, combinado con L-histidina, acta tambin como antioxidante y se utiliza para evitar que la leche en polvo se enrancie. El aspartame (L-aspartil-L-fenilalanina metil ster) se utiliza como edulcorante de bajas caloras en las bebidas no alcohlicas. Las protenas de las plantas son frecuentemente deficientes en aminocidos esenciales como la L-lisina, la Lmetionina, la L-treonina o el L-triptfano, por lo tanto, algunos de stos son adicionados a los alimentos de humanos y de animales para aumentar su valor nutritivo (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). Potenciadores del sabor (nuclesidos, nucletidos y compuestos relacionados). Todos los ribonuclesidos 5- monofosfatos de purinas incrementan el sabor. En orden descendiente de efectividad es: cido guanidlico (5-GMP), cido isocnico (5- IMP) y cido xantlico (5- XMP). Cantidades pequeas de estos nucletidos (0,005 0,01 %) se usan para aumentar el sabor de las sopas y las salsas; adems, la adicin de stos ayuda a 10

eliminar propiedades indeseables, como el sabor metlico de las latas. En la produccin de estos nucletidos se utiliza la fermentacin o la degradacin hidroltica del ARN. Adems, de su uso en la industria de alimentos, estos compuestos estn siendo estudiados con propsitos teraputicos (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). Aromatizantes y saborizantes. Adems, de los estimuladores del sabor que ya se han mencionado (algunos aminocidos y 5nucletidos), se pueden producir por fermentacin un conjunto de agentes saborizantes especficos. Un ejemplo, es la produccin de ingredientes saborizantes complejos adecuados para la produccin de quesos. Las sustancias saborizantes ms importantes del queso son metil-cetonas (2-heptanona, 2nonanona, 2- pentanona), cidos grasos (cido butrico, cido propinico) y alcoholes secundarios con 5 11 tomos de carbono. Entre los productos aromticos especficos estn diacetilo (sabor a mantequilla en la mazada), acetaldehdo (aroma en naranjas y yogur), -decalactona (sabor a melocotn), ster (aroma a frutas), pirazina (aromas a nuez y a tostado), isotiocianato (olor picante en el rbano y la mostaza) (Crueger, et al., 1993). El cido butrico es el compuesto ms importante tanto en la intensidad como en las caractersticas del sabor de los quesos Romano y Provolone. Ciertas lipasas microbianas producidas por el Aspergillus niger pueden ser usadas para sintetizar steres de terpenos tales como propionatos, butiratos y caproatos de los alcoholes primarios de terpenos, geraniol y citronelol (Gatfield, 1988), (Garca et al., 1993), (Bourgeois et al., 1995), (Whitehead, 1998). Vitaminas. Los microorganismos pueden ser utilizados en la produccin comercial de ciertas vitaminas como la tiamina, la riboflavina, el cido flico, el cido pantotnico, el piridoxal, la vitamina B12 y la biotina. Los microorganismos tambin sintetizan caroteno, que es la provitamina A y el ergosterol (provitamina D2). A escala mundial slo tienen un valor econmico importante la produccin de vitamina B12, riboflavina y cido ascrbico. La mayor parte de la vitamina B12 que se produce se usa en la industria de alimentacin animal. Polisacridos extracelulares. Los polisacridos se usan comercialmente para obtener geles y para espesar y estabilizar los alimentos, las medicinas y los productos industriales. Entre los exopolisacridos microbianos ms importantes que se producen comercialmente, estn: el xantano, el dextrano, el alginato, el curdlano, el escleroglucano, el pululano (Phaff, 1981), (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). cidos orgnicos. El uso de compuestos acidulantes en la conservacin y mejora de propiedades organolpticas en alimentos es extenso. Estos cidos, genricamente denominados cidos orgnicos, son intermediarios o productos terminales de ciclos metablicos bsicos, por lo cual ocurre en una gran variedad de organismos vivientes. Tales compuestos incluyen los cidos ctrico, actico, lctico, mlico, tartrico, fumrico y glucnico. El cido ctrico se utiliza en la industria de alimentos y bebidas. El sabor de los jugos de frutas, extractos de jugos de fruta, caramelos, helados y mermeladas se aumenta o se preserva por adicin de cido ctrico (Phaff, 1981), (Bulock et al., 1991), (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). 11

Colorantes. El color es el atributo del primer impacto de los alimentos. La industria alimentaria dependi en el pasado de productos de sntesis qumica que poco a poco estn siendo desplazados por productos naturales. En el rea de alimentos, los colorantes se usan como aditivos. La obtencin de colorantes a partir de vas biotecnolgicas tiene una serie de ventajas, ya que la obtencin de los pigmentos se realiza sin problemas de espacio, su produccin no depende de las condiciones ambientales, sociales, culturales, etc; no presenta problemas en cuanto a la disponibilidad del producto o variabilidad, entre otros aspectos. Por esto se ha centrado el inters de investigadores e industriales en la produccin de colorantes naturales, fundamentalmente en tres estrategias biotecnolgicas: fermentacin, cultivo de tejidos y utilizacin de enzimas (Phaff, 1981), (Garca et al., 1993). Edulcorantes. Los azcares representan la forma ms comn y conocida de los edulcorantes, ampliamente distribuidos en la naturaleza. Se encuentran en frutas, vegetales, miel y leche. Son tambin las unidades de que estn constituidos los carbohidratos ms complejos (polisacridos) como el almidn, la celulosa, la pectina, el glucgeno, entre otros. Aparecen igualmente en molculas orgnicas simples y complejas como el ADN, los alcoholes, las glicoprotenas, etc. Los edulcorantes no calricos, cuyo consumo se ha incrementado considerablemente en los ltimos aos, responden a la necesidad de disminuir el consumo de edulcorantes calricos, sacarosa principalmente, por dietas controladas o bien por programas de prevencin de la carie dental, diversas enfermedades (diabetes), demanda en productos farmacuticos, etc. Los edulcorantes obtenidos por va biotecnolgica se producen mediante procesos enzimticos o fermentativos. Por proceso enzimtico se obtienen el azcar invertido, fructosa, jarabes fructosados (55 %), jarabes fructosados (90 %), jarabes maltosados (45 60 %), jarabes maltosados (70 85 %), xilitol, jarabes de glucosa (92 96 %), jarabes de suero de leche, alitamo, neoazcares. Por fermentacin se obtiene taumatina (protena), iso-maltulosa (palatinosa o lilosa) a partir de sacarosa y cido asprtico para la produccin de aspartamo. La palatinita es obtenida por hidrogenacin qumica de la iso-maltulosa. Por proceso enzimtico-qumico se puede obtener el maltitol por la hidrogenacin de la maltosa, el iso-maltitol por isomerizacin del maltitol y la maltulosa por isomerizacin qumica de la maltosa (Garca et al., 1993), (Botero et al., 1993), (Roberto et al., 1995), (Garca et al., 1997), (Oh et al, 1998), (Kim et al., 1999), (Agudelo et al., 2002) Existe tambin inters en la produccin de materias primas a partir de aguas residuales de plantas procesadoras de alimentos. Estas aguas poseen una alta demanda biolgica de oxgeno que involucra altos costos de disposicin, pudindose convertir microbiolgicamente a productos, tiles, como protena unicelular. As mismo, muchos de los residuos slidos que se producen en el procesamiento de los alimentos, pueden tratarse y modificarse para aprovecharlos como sustratos en la formulacin de alimentos para animales y de productos de mayor valor agregado (Roberto et al., 1995), (Medina et al., 1996), (Medina, 2003). 1.3.2 Agropecuario. La aplicacin de la biotecnologa al sector agrcola ha sido considerada desde los inicios de los aos ochenta como un rea de gran importancia e impacto, puesto que permite potencialmente aumentar la produccin primaria, disminuir el deterioro ambiental causado por el uso de agroqumicos y obtener variedades mejoradas en perodos ms cortos que si se aplicasen las tcnicas tradicionales (Quintero et al., 1993). La 12

biotecnologa crea plantas que resisten plagas y frutos que no se deterioran. La investigacin experimental confirma la inocuidad de las mismas para el ambiente y su rentabilidad (Gasser et al., 1992). En junio de 1992, el primer producto agrobiotecnolgico, tomate de madurez retardada, fue aprobado para consumo y comercializacin en Estados Unidos. A partir de este momento, cerca del centenar de vegetales con genes extraos insertados, se encuentran en distintas etapas de su comercializacin. Entre stos estn: la zanahoria, la coliflor, el apio, el algodn, el pepino, el lino, la alfalfa, el maz, la colza, el lamo, la papa, el centeno, el tomate, el tabaco, el trbol, el nogal, el caf, el meln, la uva (Quintero et al., 1993), (Cuesta et al., 2003). Una superficie cada vez mayor de cultivos transgnicos (algodn, canola, maz, soya y papa, entre otros) se esta cultivando para uso y consumo humano y animal. En 1997, el algodn transgnico representaba el 18 %, la soya transgnica el 13 % y el maz transgnico el 9 %, de la superficie cultivada en los Estados Unidos; mientras que el 25 % de la canola cultivada en Canada era transgnica (Colciencias, 2004). Las principales tendencias en investigacin y aplicacin de la biotecnologa agrcola son: Plantas transgnicas resistentes a plagas: virus, bacterias, hongos, insectos y herbicidas. Plantas transgnicas resistentes a factores abiticos: sequa, salinidad, calor y metales pesados. Plantas transgnicas con caractersticas mejoradas y/o nuevas: incremento del contenido de protena, aumento del contenido de almidn, modificacin del contenido de aceite, plantas con maduracin retardada, etc. Clulas y plantas transgnicas como sistemas de produccin de: metabolitos secundarios, protenas de uso teraputico, anticuerpos monoclonales, enzimas, plstico biodegradable, etc. Mapas genmicos de los principales cultivos con el propsito de hacer ms eficiente y rpido el fitomejoramiento tradicional. Reemplazo de agroqumicos por productos de origen biolgico: biofertilizantes, bioinsecticidas, bioherbicidas, control biolgico de plagas, etc.

Durante el crecimiento de la planta, sta interacta ntimamente con los microorganismos y su ambiente. Estas interacciones pueden ser beneficiosas, neutrales o perjudiciales dependiendo del tipo de planta y ambiente donde se desarrolla. Dentro de microorganismos beneficiosos existen tres tipos generales. La primera clase la forman aquellos microorganismos que pueden incrementar el suplemento de nutrientes minerales esenciales para el crecimiento tales como nitrgeno y fsforo; stos son los responsables de la biofertilizacin. La segunda clase de microorganismo comprende a aquellos que estimulan el crecimiento de las plantas de forma indirecta mediante la prevencin del crecimiento o accin de organismos patgenos a las plantas. Esta forma de prevencin de enfermedades es algunas veces llamada biocontrol, para diferenciarla del uso de pesticidas qumicos. La tercera clase de microorganismos beneficiosos para las plantas incluye aquellos que son responsables directamente del crecimiento biolgico de la planta, por ejemplo, por la produccin de fitohormonas (giberelinas, auxinas y citoquininas), reguladoras del crecimiento (Klibansky et al., 1996), (Colciencias, 2004). 13

Existen microorganismos del suelo de la familia Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium), los cuales forman una asociacin simbitica con distintas especies de plantas y durante la simbiosis son capaces de llevar a cabo la fijacin de nitrgeno molecular. En la simbiosis las bacterias se encuentran en las races de las plantas dentro de estructuras llamadas ndulos. Ni la planta, ni estas bacterias aisladamente, fijan el nitrgeno diatmico para convertirlo en amonio. La simbiosis es inhibida si existe un exceso de nitrato o amonio en el suelo. Dentro de los ndulos las bacterias se convierten en bacteriodes, clulas ms grandes que los Rhizobium, que se encuentran en el suelo y que llevan a cabo la fijacin de nitrgeno porque son capaces de producir la enzima nitrogenasa, que es la responsable de la conversin del nitrgeno molecular en amonio, en la simbiosis entre Rhizobium y leguminosas. Debido a esta simbiosis la planta recibe nitrgeno que puede utilizar para s misma, mientras que las bacterias utilizan molculas que les proporciona la planta (Bauer, 2003). La fijacin simbitica de nitrgeno no es exclusiva del gnero Rhizobium. Ni tampoco todas las bacterias fijadoras de nitrgeno tienen necesariamente que asociarse con las leguminosas (Brill, 1981), (Prez, et al., 2003). Con el fin de alcanzar mayor rendimiento en la fijacin biolgica del nitrgeno, se trabaja en la modificacin gentica de las cepas de Rhizobium (Matnez et al., 1998). Los hongos del suelo denominados micorrizas colonizan las races de las plantas, constituyendo una verdadera extensin o ampliacin del sistema radical. Consiguen fosfato asimilable para las plantas en suelos deficitarios de aquella sustancia, convirtiendo el fosfato en formas solubles y transportndolo hasta las races. Las micorrizas acarrean tambin agua hasta la planta desde puntos donde no llegan las races (Brill, 1981), (Klibansky et al., 1996), (Barca, 1998). La habilidad para transferir o insertar un nuevo ADN en clulas de plantas, existe ahora para la mayora de cultivos, incluyendo tomate, maz, soya, trigo, calabaza, papaya, papa, zanahoria, algodn, arroz, tabaco. Esta tecnologa permite obtener plantas con mayor resistencia a los insectos y virus, mayor tolerancia a los herbicidas, incremento en el rendimiento de las cosechas, mejora de la calidad nutricional, incremento en la produccin de aceites, carbohidratos y protenas, el control de la maduracin de frutas y el ablandamiento de los tomates (Wilkinson, 1997), (Estruch, 1998), (Ronald, 1998), (Nieto et al., 1999), (Barcel et al., 2001), (Messeguer et al., 2003), (Cuesta et al., 2003). Una estrategia para aumentar la produccin y calidad de los productos agrcolas y evitar un deterioro del medio ambiente, es la sustitucin de pesticidas qumicos por pesticidas de origen biolgico. Los biopesticidas estn compuestos por bacterias que producen toxinas y actan como insecticidas, virus utilizados para inducir enfermedades en los insectos nocivos y hongos empleados para infectar insectos nocivos. La bacteria Bacillus thuringiensis, que normalmente se encuentra en el suelo, al esporular produce una protena que al ser ingerida por larvas de diferentes tipos de insectos, causa la muerte de ellas. De ah su denominacin de bioinsecticida (Quintero et al., 1993), (Bravo et al., 1996). Se han obtenido plantas con propiedades insecticidas capaces de controlar especies muy dainas, mediante la introduccin de genes que cifran endotoxinas. La insercin de genes en determinados insectos puede cortar de raz la transmisin de ciertas enfermedades infecciosas, proteger las cosechas e incluso producir nuevos materiales ( OBrochta et al., 1999). 14

Patgenos naturales contra plagas, entre los que se encuentran bacterias, virus y hongos, se usan como agentes de control biolgico. Los hongos del gnero Trychoderma tienen un gran potencial como agentes contra hongos patgenos del suelo. Actualmente hay inters en el posible uso de las bacterias cido lcticas como agentes de biocontrol para garantizar la seguridad de alimentos refrigerados mnimamente procesados, los cuales no son acidificados, especialmente con frutas y vegetales (Quintero et al., 1993), (Breidt et al., 1997). Los mtodos usados con productos hortcolas estn basados en la manipulacin de la informacin gentica de las enzimas que producen etileno, el cual es el agente responsable de la sobremaduracin. Por medio de la transformacin gentica se producen plantas con frutos que no producen etileno o lo producen muy poco. La aplicacin de etileno exgeno restaura el patrn normal de maduracin. Esta estrategia es aplicable en potencia a cualquier fruto (Gmez-Lim, 1996). En el sector pecuario las aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas de diagnstico, nuevas vacunas y drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento. La biotecnologa ha contribuido a la generacin de animales transgnicos con un crecimiento ms acelerado, con incremento en el tamao (peces) o produccin de leche (vacas) y en la calidad de la carne (cerdos). Esto se ha logrado a travs de la utilizacin de hormonas del crecimiento o somatostatina. La biotecnologa ha permitido que se generen productos de alto valor agregado, como la hormona de crecimiento, en la leche de animales transgnicos. Recientemente, se ha reportado la produccin de hemoglobina humana en cerdos transgnicos (Quintero et al.., 1993). Los animales transgnicos como el ratn oncognico han sido muy tiles en trabajos de laboratorio para estudios de enfermedades humanas. El cultivo de clulas vegetales individuales o de grupo de ellas, en grandes fermentadores, constituye una forma de obtener productos vegetales (frmacos, pesticidas, edulcorantes, aromatizantes). Adems, las clulas vegetales individuales constituyen un medio muy apropiado y eficiente para desarrollar nuevas variedades de plantas. Para la introduccin de un ADN forneo en clulas vegetales, se puede aprovechar el proceso natural de infeccin llevado a cabo por la bacteria Agrobacterium tumefaciems. Esta bacteria porta un plsmido (fragmento de ADN separado del cromosoma bacteriano) que produce tumores (conocidos como agalla del cuello o agalla en corona o cncer vegetal) en la mayora de las plantas dicotiledneas. El mecanismo de la infeccin bacteriana se basa en la insercin de un gen extrao en el plsmido inductor del tumor, que se utiliza para infectar plantas y producir una agalla de corona. . Todas las clulas vegetales de la agalla contienen dicho plsmido con su fragmento de ADN extrao. Se cultivan las clulas del callo en el laboratorio hasta que originen plntulas, que al crecer se podrn plantar en el suelo. Puesto que cada planta se produce de una sola clula portadora del gen extrao, todas las clulas de la nueva planta adulta sern portadoras del gen. (Brill, 1981), (Perea, 1990), (Nieto, et al., 1999). 1.3.3 Farmacutico y salud. La biotecnologa y en particular los procesos fermentativos, se han usado en la produccin de principios activos farmacuticos, distinguindose entre ellos los antibiticos (penicilinas, cefalosporinas, bleomicinas, antraciclinas, tetraciclinas, eritromicinas, estreptomicinas, rifamicina, bacitracina), los alcaloides, drogas 15

antitumorales, las vacunas bacterianas, las vacunas virales, las vitaminas, las enzimas y algunos esteroides que son transformados biolgicamente durante su proceso de produccin. Estos productos son de gran valor mdico y comercial en el mundo, pero puede decirse que tanto los principios activos como los procesos de produccin se desarrollaron antes de los aos 70 y por lo tanto, los esfuerzos actuales se dirigen hacia un aumento de productividad y rendimiento con el objeto de disminuir costos de produccin. A pesar de que los antibiticos poseen una amplia variedad de estructuras qumicas y muy diversos lugares de accin, todos satisfacen el principio de toxicidad selectiva. Dicho principio mantiene que un agente quimioteraputico eficaz no debe afectar a los tejidos humanos y si ser txico para el agente infectante. Las penicilinas y cefalosporinas obstruyen la formacin de la pared celular bacteriana; las bleomicinas y antraciclinas interfieren la replicacin del ADN; las eritromicinas, tetraciclinas y estreptomicinas inutilizan el complejo ribosmico y las rifamicinas interrumpen la transcripcin de ADN en ARN mensajero (Aharonowitz et al., 1981). Las nuevas tecnologas biolgicas, establecidas a partir de 1973, particularmente la ingeniera gentica (o tecnologa de ADN recombinante) aun cuando existen otras tcnicas de gran uso y potencialidad, han permitido que el hombre pueda producir protenas humanas en otro tipo de seres como son las bacterias, levaduras y en algunos casos animales superiores. Una vez entendido como los seres vivos procesan la informacin gentica y como obtener de ella protena, slo falt que un grupo de investigadores y de empresarios pudiese percibir el valor teraputico y econmico, para iniciar la generacin de un grupo muy importante de nuevas protenas que hasta ese momento era muy difcil conseguir y en otros casos era prcticamente imposible obtenerlas. El conocimiento sobre el sistema inmunolgico humano ha permitido identificar un grupo muy importante de protenas y establecer nuevos sistemas de produccin. Entre estas protenas se encuentran los interferones, las interleukinas, los factores estimulantes de crecimiento, el factor de necrosis tumoral, etc. Adems, se han podido generar nuevas y mejores vacunas (viruela, poliomelitis, tifus, ttanos, sarampin, hepatitis A, hepatitis B, rotavirus y malaria) (Daz-Betancourt, 1996), (Rappuoli et al., 1997), (Weiner et al., 1999), (Langridge, 2000). Las principales tendencias en la investigacin y aplicacin de la biotecnologa en el sector salud, son: Produccin de protenas de inters teraputico. Desarrollo y produccin de vacunas. Desarrollo y produccin de sistemas de diagnstico. Diseo, produccin y mtodos de administracin de frmacos. Biologa molecular del genoma humano y medicina molecular.

Protenas recombinantes. Gracias a la biotecnologa se pueden fabricar protenas animales y humanas, para fines medicinales. Con la ayuda de los cultivos industriales de bacterias o de clulas superiores se pueden producir grandes cantidades de protenas. 16

Todos los seres vivos compartimos el mismo cdigo gentico, el lenguaje en el que se especifican las instrucciones precisas para la sntesis de protenas. Esto significa que se puede introducir material gentico forneo en una clula. Si se inserta el gen humano en el material gentico de una bacteria, sta fabricar la protena correspondiente, siempre y cuando la informacin fornea contenga tambin los elementos necesarios para la expresin del gen. La eleccin de una clula productora viene determinado no slo por criterios econmicos, sino tambin por las normas reguladoras de los pases. En la prctica slo son tres los organismos o clulas ms utilizadas en la sntesis de protenas teraputicas: Eschericchia coli, Saccharomyces cerevisiae y clulas de ovario de Hamster. Por recombinacin gentica se produce: insulina humana, los interferones, el activador del plasmingeno tisular, la albmina humana, la hormona del crecimiento o somatostatina, la hormona eritropoyetina (Ahatonowitz et al., 1981), (Stiegler et al., 1997). La mayora de los interferones se agrupan, de acuerdo con la secuencia aminocdica de sus estructuras proteicas en tres clases: alfa, beta y gama. Los interferones actan en primera lnea de defensa contra infecciones vricas y parasitarias. Hoy en da los interferones son el segundo producto biotecnolgico ms vendido en el mundo (Johnson et al., 1994), (Gil et al., 2001). Farmacia de granja. Una fuente alternativa de sntesis de protenas recombinantes con finalidad teraputica la ofrecen los animales y plantas transgnicas. Se han introducido genes humanos en embriones femeninos de cabras, cerdos, ovejas y vacas. Estos genes llevan asociado un interruptor que faculta nicamente a las clulas de las mamas para producir la molcula. El producto se recoge directamente de la leche del animal. De la farmacia de granja han salido la enzima -antitripsina (AAT), extrada en leche de oveja. Esta enzima facilita la respiracin en pacientes con enfisema pulmonar (Stiegler et al., 1997), (Wilmut, 1999). La protena C humana, el factor VIII y factor IX, el activador tisular del plasmingeno (Velander et al., 1997). La hormona de crecimiento humana a partir de leche de vacas transgnicas clonadas para el tratamiento contra el enanismo (BioPlanet-Breves, 2004). Anticuerpos monoclonales. Se estn utilizando tanto en terapia para enfermedades como para diagnstico. Las inmunoglobulinas son producidas en un hibridoma, producto de la fusin de una clona de linfocito B y una lnea inmortal. Estas inmunoglobulinas reconocen y unen con una alta afinidad, nicamente un determinado antgeno. Los anticuerpos son macromolculas en forma de Y. Tienen por misin luchar contra los invasores. Los anticuerpos monoclonales estn sintetizados por copias idnticas, o clones de un mismo linfocito B, por cuya razn atacan una sola diana especfica. Hay en el mercado una de decena de anticuerpos monoclonales. Cubren desde la prevencin del rechazo de un rgano transplantado hasta la oncoterapia. Otros tres monoclonales esperan la aprobacin de la Oficina de Alimentacin y Farmacia (FDA). Aunque la produccin de anticuerpos monoclonales suele corresponder a los hibridomas, unas clulas de mamferos, se est trabajando en su obtencin a partir de la leche de animales sometidos a ingeniera gentica y a partir de plantas transgnicas (Ezell, 2001). Probiticos. Estn definidos como microorganismos vivos que son ingredientes de los

17

alimentos y que tienen un efecto benfico en la salud humana. Muchas cepas probiticas han sido identificadas, estudiadas y comercializadas: Lactobacillus acidofillus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentun, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium lactis, longum, Bifidobacterium breve. Los probiticos disminuyen los riesgos de cncer, mejora la funcin del tracto intestinal y la inmune, moderan la respuesta alrgica, inhiben la infeccin por la Helicobacter pylori (salud estomacal), inhiben infecciones del tracto urogenital en las mujeres, disminuyen el nivel de colesterol y la hipertensin (Sanders, 1999), (Salminen, 1999). Desarrollo y produccin de sistemas de diagnstico. Los nuevos sistemas de diagnstico son aquellos que utilizan anticuerpos monoclonales y sondas de cidos nucleicos, debido a la alta especificidad de los reactivos, as como a la simplicidad de las pruebas. Otro sistema que tambin tiene importancia es el de los biosensores que se basa en la utilizacin de enzimas o anticuerpos acoplados a dispositivos electrnicos. Ejemplos de stos, son los electrodos enzimticos para analizar el colesterol, los aminocidos, el cido rico, la penicilina, la urea, el etanol y la glucosa (Schultz, 1991), (Quintero et al., 1993), (Illanes, 1994). Desarrollo y produccin de vacunas. La manera ms efectiva de controlar la hepatitis B (VHB) es mediante la vacunacin. En los ltimos aos se han desarrollado dos tipos de vacunas contra la VHB: la plasmtica, mediante el aislamiento del virus del plasma de portadores asintomticos y purificacin del antgeno de superficie (HbsAg) y la recombinante, mediante el clonaje y expresin de este antgeno en una clula eucaritica. El Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa, de la Habana, Cuba, se dio a la tarea de desarrollar una vacuna contra la hepatitis B por va recombinante. Los primeros clones obtenidos en S. cerevisiae llegaron a los fermentadores en 1986. En 1988 se probaron las cepas de la levadura Hansenula polymorpha y Pichia pastori, logrndose muy buenos resultados. A principios de 1990 comenz la produccin a escala piloto y un ao despus se inaugur una nueva instalacin, con dos fermentadores de 3 000 L y se comenzaron los trabajos de puesta en marcha y validacin. A principios de 1992 se comenz la produccin a escala de 3000 L. En 1994 comenzaron las negociaciones para la transferencia de esta tecnologa a otros pases, mientras que en Cuba se inauguraba una segunda planta de produccin del principio activo, con una capacidad 1,5 veces superior a la primera (DazBetancourt, 1996). Actualmente se esta trabajando en la creacin de vacunas comestibles mediante la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que permite introducir en las clulas vegetales los genes de antgenos bacterianos o vricos. Entre los alimentos que se estn investigando como opcin alternativa a las vacunas inyectables se tienen los pltanos, las papas, los tomates, la lechuga, el arroz, el trigo, la soya y el maz (Langridge, 2000). Las vacunas con material gentico, ya sea ADN o ARN, pueden que consigan prevenir el SIDA, el paludismo y la hepatitis C, para las que no existen vacunas eficaces (Weiner, 1999). 1.3.4 Qumico. En la actualidad, la contribucin de los procesos biolgicos a la industria qumica (excluyendo la industria farmacutica) est limitada a: modificacin de esteroides por va enzimtica, produccin de cido itacnico. (termoplsticos), etanol (disolvente, extractor, anticongelante, materia prima de otros compuestos orgnicos y combustible), 18

acetona (disolvente, explosivos), n-butanol (disolvente, plastificantes, lquido para frenos, aditivos para la gasolina, resinas de urea-formaldehido, extractores, cubiertas protectoras, glicerol (disolvente, lubricante en numerosos productos, emoliente, demulgente, como steres de glicerol en los explosivos), cido glucnico (detergentes, evita la precipitacin de sales de calcio y magnesio), cido actico (goma, plsticos, fibras de acetato, colorantes, insecticidas, materiales fotogrficos, productos farmacuticos), cido lctico (acidulante, mordiente en tejidos, plateado elctrico, plsticos), cido butrico, isopropanol (solvente, obtencin de acetona y sus derivados, glicerol, isopropil acetato), cido kjico (insecticida), xidos de alqueno (xido de propileno, plstico polipropileno; xido de etileno, plstico polietileno), cido fumrico (sntesis orgnicas, resinas, mordiente), cido propinico (perfumes, funguicidas, enzima -amilasa y celulasa (textil), enzima proteasa alcalina (detergentes), enzima pancreatina (curtimbre), enzima piranosa-2-oxidasa, haloperoxidasa, epoxidasa (obtencin de xidos de alqueno a partir de alquenos), aminocidos L-arginina y L-serina (cosmticos) y aminocido L-cistena (antioxidante) (Eveleigh, 1981). Las principales tendencias en la investigacin y aplicacin de la biotecnologa en el sector industrial, son (Quintero et al., 1993): Obtencin de cepas mejoradas de microorganismos productores de metabolitos primarios y secundarios: aminocidos, antibiticos, etc. Diseo y sobreproduccin de enzimas con propiedades especiales. Desarrollo de nuevos bioprocesos: enzimas inmovilizadas, biosensores, biorreactores. Produccin de metabolitos por cultivos in vitro de clulas vegetales.

1.3.5 Energa. La biotecnologa trabaja en la bsqueda de alternativas energticas utilizando recursos naturales renovables. Entre los combustibles obtenidos biotecnologicamente estn: gas metano, etanol (gasol), hidrgeno (biofotolisis del agua, basada en la combinacin de fotosistemas de vegetales, enzimas hidrogenasas de origen bacteriano y luz), clulas de combustibles. 1.3.6 Minera. La lixiviacin microbiana es el proceso por el que utilizando microorganismos, se extraen los metales a partir de las rocas que los contienen. En el presente no pueden ser procesadas econmicamente algunas menas por mtodos qumicos debido a su bajo contenido en metal. Para muchos metales existen actualmente mtodos que permiten su extraccin a partir de sulfuros metlicos (hierro y cinc) u otros minerales. Los metales (como el cobre, cobalto, molibdeno, cadmio, arsnico, nquel, titanio, uranio) pueden ser removidos de las rocas por un sistema redox con una solucin de sulfrico cido/Fe3+. (Crueger et al., 1993). Se ha estudiado la biolixiviacin de ndulos de manganeso por bacterias sulfo-oxidantes (Konishi et al., 1997), de sulfuro de cinc concentrado por Thiobacillus ferrooxidans (Konishi et al., 1992). En muchos casos, es posible utilizar bacterias para lixiviar el mineral deseado de profundidades mayores, sin necesidad de remover los depsitos, con lo cual se economizan los costos de mover grandes toneladas de menas y rocas de desecho a la superficie. Adicionalmente, muchos procedimientos convencionales consumen grandes cantidades de energa; por lo tanto, la biolixiviacin de menas y concentrados puede suministrar una alternativa para economizar energa. Por otro lado, un problema frecuente y de larga data en operaciones mineras ha 19

sido la liberacin incontrolada de metales y cidos. La lixiviacin controlada puede dar como resultado tanto la recuperacin de metales valiosos, como la proteccin del ambiente (Colciencias, 2004), (Noriega et al., 2002). 1.3.7 Tratamiento de la contaminacin ambiental. La biotecnologa ambiental tampoco es un campo nuevo: la elaboracin de compost (compostaje) y las tecnologas de aguas residuales son ejemplos conocidos de la antigua biotecnologa ambiental. Desarrollos recientes en biologa molecular, ecologa e ingeniera ambiental, ofrecen actualmente la oportunidad de modificar genticamente organismos, de tal manera que los procesos biolgicos bsicos, sean ms eficientes y capaces de degradar compuestos qumicos ms complejos; as, como mayores volmenes de materiales de desecho. El potencial de la biotecnologa moderna en este sector es muy amplio, ya que permite la aplicacin de sta al tratamiento de efluentes acuosos, gaseosos y slidos; as como a la contaminacin del aire o del suelo. El tratamiento de efluentes tradicionalmente incluye cuatro operaciones bsicas. Los procesos biolgicos inciden en el tratamiento secundario, siendo los microorganismos los responsables de la degradacin de la materia orgnica en procesos aerobios o anaerobios. Tambin se incluye la digestin anaerobia del lodo de los tratamientos primario y secundario (Borja et al., 1992), (Crueger et al.., 1993), (Ortiz et al., 1997), (Colciencias, 2004). La seleccin de procesos de depuracin de tipo biolgico para efluentes industriales depende del xito que se tenga en los ensayos previos para determinar su biodegradabilidad. El xito del ensayo depende en muchos casos de disponer del fango especfico para biodegradar el efluente, as como de que el ensayo se realice a las condiciones adecuadas (Farre, 1994). Tratamiento de aguas residuales. El tratamiento aerobio de las aguas residuales puede llevarse a cabo en tres grandes sistemas: el de lodos activados, el de lagunas o estanques de aireacin y el de filtro de precolacin o percolador. Para el tratamiento anaerobio existen cuatro diseos bsicos de reactores: lecho fijo anaerobio de flujo ascendente, lecho fluidizado anaerobio, filtro anaerobio y reactor anaerobio de mezclado con recirculacin. La biorremediacin es la degradacin, por microorganismos, de productos xenobiticos (compuestos sintticos ajenos a la biosfera). Es una alternativa y una estrategia cada vez ms utilizada e importante para contrarrestar la contaminacin por compuestos qumicos. Los procesos de biorremediacin han sido empleados para tratar residuos o derrames de hidrocarburos (gasolina, diesel, petrleo crudo) y residuos de refinera (naftaleno, estireno, antraceno, tetrahidrofurano, etc.; pesticidas y sus derivados (herbicidas de fenoxiacetato, carbamatos y organofosforados); solventes clorados y compuestos derivados de la manufactura de hidrocarburos alifticos clorados (cloroformo, cloruro de metileno, tricloetileno, tetracloruro de carbono, etc.); hidrocarburos aromticos hidrogenados (pentaclorofenol, bencenos clorados) y solventes no halogenados (tolueno, benceno, fenol, etilbenceno, xileno, etc.). Los procesos microbianos tambin pueden ser empleados para la transformacin y recuperacin de metales tales como arsnico, plomo, cadmio, mercurio, cromo, nquel, bario, uranio, etc. (Dvorak et al.., 1992), (Lee et al., 1993), (Crueger et al., 1993), (Allsop et al., 1993), (Grosso et al., 1995), (Macarie et al., 1996), (Mogolln et al., 20

1996), (Basnakova et al., 1997), (Hu et al., 1997), (Macaskie et al., 1997), (Duong et al., 1997). El problema de la contaminacin ambiental es una de las principales preocupaciones del hombre de cara al siglo XXI. En particular, el petrleo constituye una de las principales fuentes de polucin del medio ambiente, ya que la mayor parte de sus componentes son recalcitrantes a la biodegradacin. Sin embargo, existe un grupo numeroso de microorganismos heterotrficos capaces de utilizar los hidrocarburos del petrleo como fuente de carbono y energa para su crecimiento, produciendo dixido de carbono, agua, biomasa y otros productos parcialmente oxidados que no son txicos (Eweis, et al., 1999), (Daz, 1999). (Gonzlez et al., 2002). Existe el producto AquaBact para la biorremediacin de suelos contaminados con petrleo, constituido por un cultivo mixto de cepas de microorganismos que se presentan en forma natural en el medio ambiente, reforzado con un suministro de nutrientes balanceados, que permiten acelerar la biodegradacin de hidrocarburos del petrleo. Tratamiento de gases. Existen dos tipos de procesos: aerobios y anaerobios. El primero permite tratar corrientes de aire contaminadas, mientras que el segundo puede aplicarse a sistemas tal como el gas natural o las corrientes de la digestin anaerobia. Existen dos tipos de tecnologas para el tratamiento de gases: biolavadores, en donde los contaminantes se extraen en un lquido, generalmente agua, los cuales a su vez son sometidos a oxidacin por sistemas clsicos utilizados en el tratamiento de efluentes y biofiltracin, donde se pasa la corriente gaseosa por un lecho hmedo, en el cual se encuentran los microorganismos oxidantes (Zhil et al., 1993), (Crueger et al., 1993), (Kennes et al., 1996). 1.3.8 Armas biolgicas. El arsenal biolgico ha despertado un inters creciente en los estados y en las bandas terroristas; siendo necesarios controles ms estrictos sobre este tipo de armamento para evitar su empleo. A diferencia de cualquier otro tipo de armamento, el biolgico incrementa su peligrosidad con el tiempo. Unos agentes biolgicos incapacitan a la victima; otros, la matan. El virus Ebola acaba con el 90 % de sus victimas, en poco ms de una semana; no se conoce tratamiento alguno. La bacteria Yersinia pestis produce la peste bubnica; existen las vacunas que proporcionan inmunidad y los antibiticos suelen ser eficaces si se administran precozmente. La toxina botulnica, liberada por la bacteria Clostridium botulinum, produce botulismo, que conlleva a menudo a la muerte; la antitoxina detiene a veces el proceso. El Bacillus anthracis produce ntrax o carbunco, que puede ser fatal; la vacuna y los antibiticos ofrecen proteccin suficiente, a menos que la exposicin sea alta (Cole, 1997). La suelta intencionada de organismos que devoren las cosechas del enemigo, es un arma desvastadora en tiempos de guerra o en manos terroristas (Rogers et al., 1999). Bilogos e ingenieros estn desarrolando detectores consistentes en chips de anticuerpos o ADN que detectan patgenos. Trabajan tambin en la creacin de dispositivos que detectan los olores emitidos por los microorganismos o aditivos introducidos para convertirlos en armas (Casagrande, 2002).

21

1.4 OPERACIONES BIOTECNOLGICAS. Operacionalmente se pueden distinguir cinco aspectos fundamentales en cualquier proceso biotecnolgico, que en la mayor parte de los casos corresponde a etapas de su desarrollo: 1.4.1. Eleccin del cultivo: seleccin, mejora, o en su caso creacin del organismo o la poblacin celular ms adecuada. Esto puede implicar el descubrimiento y la seleccin de las cepas ms adecuadas de entre la enorme variedad de especies naturales de microorganismos, y luego mejorar sus caractersticas hereditarias. Tal seleccin generalmente requiere un conocimiento biolgico general, para conocer donde mirar y que clase de organismo buscar para que, combinado con tcnicas qumicas y bioqumicas se encuentre como detectar mejor lo que se esta buscando. Otras situaciones pueden implicar la seleccin de la poblacin mixta ms apropiada. Un conjunto de posibilidades alternativo, se tiene con las tcnicas que permiten la construccin deliberada del tipo de clula ms adecuada, mediante manipulacin gentica de padres que pueden proporcionar las caractersticas hbridas deseadas. 1.4.2 Cultivo en masa. Para las aplicaciones biotecnolgicas es esencial poder conservar los organismos durante tanto tiempo como se necesiten y a continuacin multiplicarlos a voluntad a una escala adecuada, que puede ser muy grande. Se debe disponer de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el medio del fermentador, adems debe ser metablicamente activo, estar libre de contaminantes y ser capaz de producir el producto que se pretenda obtener en el cultivo subsiguiente. Sin embargo, si, por ejemplo, el fermentador produjera 100 000 L, el volumen del inculo debe estar entre 3000 y 10000 L. Este volumen tiene que prepararse a partir de un cultivo de unos pocos mL, lo que conlleva un gran nmero de fermentaciones sucesivas a una escala cada vez mayor (por ejemplo, en la produccin de cido clavulnico, en un fermentador de 1000 L con 600 L de medio de fermentacin, se toma el microorganismo del agar inclinado y se lleva a 30 mL, luego a 300 mL, 15 L y 60 L) (Trevan et al., 1990). 1.4.3 Respuestas celulares: la eleccin de las actividades deseadas. Los productos o los agentes activos por los que se cultivan las clulas slo se producen ms abundantemente bajo condiciones especficas. En general estas condiciones no son las mismas que las que se requieren para obtener la multiplicacin ms abundante de la biomasa. El conocimiento bsico necesario procede de experimentos en pequea escala. 1.4.4 Operacin del proceso. Un proceso biotecnolgico no se reduce en general a una sola etapa operativa. La ejecucin satisfactoria de todas las etapas que se requieren, completamente optimizado en cuanto a seguridad, reproductibilidad, control y eficiencia es en su mayor parte un asunto de diseo de la ingeniera del proceso, aplicado con un completo entendimiento de los factores biolgicos, qumicos y socioeconmicos. 1.4.5 Recuperacin de los productos. La eficiencia de recuperacin del producto no slo se refleja en los costos, sino que se requiere adems, formas efectivas y ambientalmente aceptables de recuperacin de los productos marginales. Para la recuperacin y purificacin de biomolculas intracelulares se requieren las etapas de: 22

fermentacin, concentracin, ruptura celular, separacin slido lquido, concentracin y aislamiento del producto final. Para la recuperacin y purificacin de biomolculas extracelulares se requieren las etapas de: fermentacin, separacin slido-lquido, concentracin y aislamiento del producto final. Las tcnicas consideradas para la etapa de separacin slido lquido son la filtracin tradicional, la ultrafiltracin, la centrifugacin y la sedimentacin.. Los mtodos usados para la etapa de concentracin son la evaporacin, la smosis reversa, la ultrafiltracin, el secado y la liofilizacin. De los mtodos de ruptura celular, los ms usados a escala de operacin son la agitacin en lquido y la abrasin. En la etapa de aislamiento o purificacin se tiene como etapa primaria la dilisis y electrodlisis, la ultrafiltracin, el intercambio inico, la cromatografa y la cromatografa de alta resolucin (HPLC) y como etapa final se tiene la precipitacin, la extraccin lquidolquido, la cromatografa de intercambio inico y la cromatografa de afinidad.(Fair, 1989).

A: entrada de aire estril. B: salida de aire C: entrada del agua de enfriamiento. D: salida de agua. E: adicin de cido, lcali y antiespumante. F: biomasa (micelio). G: destilacin. H: solvente. I: solucin.

1: cepa productora congelada. 2: crecimiento slant. 3: matraz agitado de cultivo. 4: fermentador de semilla. 5: fermentador principal. 6: filtro rotatorio. 7: centrfuga. 8: cristalizador. 9: secador. 10: empaque del producto.

Figura 1.4. Etapas de un proceso tpico de fermentacin (Quintero, 1990) 23

1.5 CONDICIONES DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO El desarrollo de la biotecnologa no se ha dado como una propuesta a necesidades del mercado, sino como un proceso de acumulacin continua de conocimientos de ciencias bsicas (biologa molecular, gentica, bioqumica, microbiologa, etc.) y por la modernizacin e innovacin de las ingenieras orientadas a establecer cambios cualitativos en la tecnologa. Los pases que liberan el mercado biotecnolgico, Estados Unidos y Japn, se han destacado por su tradicin e investigacin bsica. Japn estudia desde 1968 las fermentaciones aplicadas a bebidas y alimentos fermentados, por su antiqusima tradicin en el consumo de productos obtenidos a travs de estos procesos. En 1980 el Japn posea la totalidad de las licencias de fabricacin de los 20 aminocidos, alrededor de los cuales se investigaba desde 1908. En 1979, de los 11 nuevos antibiticos comercializados en el mundo, 7 se haban sintetizado en laboratorios japoneses (Montoya, 1990). Estados Unidos tiene una tradicin de grandes desarrollos en ciencias bsicas. Sus avances, se presentan en la moderna biotecnologa, inicialmente en recombinacin gentica. Segn la OTA (Office of Technology Assystment), el nmero de empresas de ingeniera gentica no era superior a 14 a finales de 1979; y en 1982 se contaba con 155 compaas. Europa Occidental tena en 1981 aproximadamente 200 equipos y ms de un millar de proyectos de investigacin sobre recombinaciones genticas. Cerca de 70 compaas miraban con inters la biotecnologa, 20 de ellas trabajaban en recombinaciones genticas, en empleo de enzimas inmovilizadas y en cultivos de clulas. En el Japn durante 1998, las ventas de productos y servicios basados en ADN recombinante, cultivo de clulas y otros sectores relacionados sumaron US$ 10 billones y el nmero de empleados en la bioindustria era de aproximadamente 35 000. se espera que el ao 2010 el nivel de empleo en esta rea haya aumentado a los 150 000 y el mercado haya crecido a US$ 210 billones (Aroca, 2004). En general, los ltimos aos, el hombre enfrenta nuevas situaciones y retos por la investigacin en biotecnologa y como consecuencia la liberacin al medio ambiente de seres transgnicos (microorganismos, plantas y animales) con caractersticas nuevas y cuya modificacin gentica aporta beneficios. Sin embargo, no se puede descartar totalmente los riesgos potenciales. Por ejemplo, si las plantas transgnicas se establecen plenamente en la agricultura, esto podra derivar en una mayor prdida de la biodiversidad. Por otro lado, no se sabe que efecto tendrn estos seres transgnicos en nichos especficos (Quintero et al., 1993). Al igual que en casi todos los campos, a Amrica Latina la biotecnologa le llega, en la mayora de los casos, a travs de publicaciones y de recursos humanos formados en pases industrializados. La industria en estos pases no tiene tradicin de investigacin; por lo tanto, dispone de escaso personal capacitado para crear y adaptar conocimientos, y no tiene relacin con los centros de investigacin de las universidades. La poca industria se concentra, en consecuencia, en vinos y cervezas, que utilizan biotecnologa tradicional, cuyo desarrollo no ofrece diferencias significativas con el alcanzado en otros pases. En cuanto a la produccin de antibiticos, enzimas, aminocidos y agroqumicas, la tecnologa utilizada proviene de pases industrializados, salvo excepciones como en el caso de Mxico, Brasil y Argentina (Montoya, 1990). 24

La nueva biotecnologa se realiza bsicamente en centros de investigacin; existe tambin heterogeneidad en la cantidad y calidad de recursos humanos y materiales disponibles en Amrica Latina. Pases como Brasil, Mxico, Argentina y Cuba, han definido la biotecnologa como rea prioritaria de investigacin y desarrollo. Los dos ltimos son lderes en tecnologa endgena. Brasil ha logrado mayor independencia en el campo energtico y en fertilizantes a travs de la biotecnologa. La produccin de alcohol le permiti modificar su consumo interno de gasolina, gracias al etanol obtenido por fermentacin. En relacin con la actividad agrcola, hay programas de fijacin de nitrgeno en diversos centros universitarios brasileos, mexicanos y venezolanos. En el rea agroalimentaria, se destaca el importante desarrollo logrado en Cuba en la produccin de protena unicelular, utilizando melazas de la industria azucarera. En Cuadro 1.1 se muestran las prioridades de aplicacin e inters por sector, para varios pases de la regin y el Cuadro 1.2, se presentan los temas de investigacin en desarrollo en biotecnologa (Quintero et al., 1990). Cuadro 1.1. reas prioritarias de pases latinoamericanos

El impulso de la biotecnologa en Amrica Latina tiene que superar los problemas comunes en dichos pases, entre otros: Dificultad de definir proyectos. 25

Nmero insuficiente de investigadores y personal calificado. Infraestructura inexistente o incompleta para realizar proyectos en biotecnologa. Carencia de experiencia en el desarrollo tecnolgico. Presupuestos exiguos y muy diversificados en lo referente a ciencia y tecnologa. Falta de industria nacional que apoye nuevas tecnologas.

Por ello resulta imprescindible, para los pases en desarrollo, planificar una infraestructura cientfica, que permita estudiar cambios y avances cientficos rpidos y evitar la importacin indiscriminada de tecnologa. Cuadro 1.2. Temas especficos de investigacin en desarrollo en pases Latinoamericanos

Segn expertos, para los pases del Tercer Mundo la biotecnologa presenta buenas oportunidades, especialmente a travs de: La aplicacin del ADN recombinante, para la produccin de vacunas contra enfermedades infecciosas propias de nuestros pases. Reactivos de diagnstico, mediante sondas moleculares y anticuerpos monoclonales. El desarrollo de variedades de plantas resistentes a condiciones extremas y a plagas, por medio de cultivo de clulas vegetales. La utilizacin de desechos lignocelulsicos para produccin de energa o alimento animal o humano. Fermentaciones en medio lquido o slido para la produccin de materias primas, mediante procesos que pasen del laboratorio a la industria con relativa facilidad, 26

y que contribuyan a solucionar problemas de importaciones. En Colombia existe un gran potencial de aprovechamiento de recursos naturales mediante procesos biotecnolgicos. El pas puede contribuir a resolver problemas de salud, a desarrollar la produccin de materias primas para la industria, a producir alimentos cada vez ms escasos y aportar soluciones a la contaminacin que la produccin agrcola e industrial genera. El grupo de Biotecnologa de la Universidad Nacional realiz a finales de 1984, un proyecto de Diagnstico de la Biotecnologa en Colombia, bajo el auspicio de Colciencias y de la UNAL. Se realizaron 164 encuestas acopiadas en 54 industrias, 23 universidades y 11 centros de investigacin. Se identific investigacin en Biotecnologa en las siguientes reas: Ingeniera gentica, cultivo de tejidos vegetales (solucin de problemas alimentarios, floricultura), desarrollo de productos biolgicos, aprovechamiento de residuos agroindustriales, control de la contaminacin, biotransformaciones con aplicaciones en la industria qumica (farmacutica, alimentos, alcohol, cido ctrico y lixiviacin bacteriana), biogs (fermentacin metnica), etc. Las industrias que utilizan biotecnologa se ubican en cuatro sectores: productos biolgicos (vacunas, sueros, etc.); industria alimenticia (quesos y leches cidas); produccin de bebidas alcohlicas (cerveza, etanol) en industrias licoreras y produccin de materias primas (cido ctrico) (Montoya, 1990). En Colombia las investigaciones en biotecnologa deben apuntar hacia (Angarita, 1991): La reduccin del empleo de plaguicidas y de abonos nitrogenados. El mejoramiento de genotipos. La propagacin vegetativa de especies de importancia social y econmica. Obtencin de reactivos biolgicos. Desarrollo de vacunas sintticas. Desarrollo de sistemas para el diagnstico y control de enfermedades infecciosas. Recuperacin del medio ambiente. Valorizacin de la biomasa disponible mediante procesos biotecnolgicos que permitan la obtencin de productos de mayor valor agregado.

Complementar con la lectura de los artculos de Montoya, (1994), Quintero, (1998) y Aramendis et al., (2000).

1.6 CENTROS Y EMPRESAS BIOTECNOLGICAS Las industrias biotecnolgicas en Estados Unidos, por ejemplo, incluyen firmas que generan productos genticamente alterados para servicios de salud (terapia y diagnstico), agricultura, qumica y usos del ambiente. Las compaas del sector salud dominan financieramente la industria biotecnolgica en Estados Unidos. Incluyen un 87 % en la biotecnologa domstica, en tratamientos de enfermedades y diagnstico Las compaas biotecnolgicas del sector agrcola, corresponden a un 5 % del m