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CAPÍTULO 11

Identificación bacteriana mediante secuenciaciónd e l ARNr 16S: f u n d a m e n t o, metodología y aplicacionese n microbiología cl í n i c aMaría del Rosario Rodicio y María del Carmen Mendoza

Departamento de Biología Funcional. Área de Microbiología. Universidad de Oviedo. España.

to be sequenced uses preferably DNA extracted from abacterial pure culture, but can be achieved also directlyfrom a clinical sample. The latter has led to the discoveryof new pathogens. Bearing in mind its potential, as thetechnical resources improve and the prize becomes morecompetitive, the identification based on 16S rDNAsequencing will certainly find a wider application in theclinical microbiology laboratory.

Key words: 16S rRNA. Bacterial identification.Phylogenetic analysis.

I n t r o d u c c i ó nLos ácidos nucleicos y las proteínas, macromoléculas

comunes a todos los seres vivos, cambian con el tiempo.Por ello, pueden considerarse como cronómetros molecula-res o documentos de la historia evolutiva. Asumiendo quelos cambios se producen al azar y que aumentan con eltiempo de manera lineal, las diferencias en la secuencia delos monómeros (nucleótidos o aminoácidos) que integranmacromoléculas homólogas, presentes en dos formas devida, reflejan la distancia evolutiva existente entre ellas.Esta idea, introducida por Zuckerkandl y Pauling1, se havenido utilizando durante décadas para establecer las re-laciones filogenéticas entre los seres vivos, creando unmarco apropiado para su clasificación e identificación.

El ARN ribosómico (ARNr) 16S es la macromoléculamás ampliamente utilizada en estudios de filogenia y ta-xonomía bacterianas. Su aplicación como cronómetro mo-lecular fue propuesta por Carl Woese (Universidad de Illi-nois) a principios de la década de 19702. Los estudios deWoese originaron la división de los procariotas en dos gru-pos o reinos: E u b a c t e r i a y A r c h a e o b a c t e r i a , cuya divergen-cia es tan profunda como la encontrada entre ellos y loseucariotas. Además, permitieron establecer las divisionesmayoritarias y subdivisiones dentro de ambos reinos3.Posteriormente, Woese introdujo el término dominio parasustituir al reino como categoría taxonómica de rango su-perior, y distribuyó a los organismos celulares en tres do-m i n i o s : B a c t e r i a, A r c h a e a y E u k a r y a, el último de los cua-les engloba a todos los seres eucariotas4. Desde entonces,el análisis de los ARNr 16S se ha utilizando ampliamentepara establecer las relaciones filogenéticas dentro delmundo procariota, causando un profundo impacto ennuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en laclasificación e identificación bacteriana. De hecho, las edi-ciones vigentes de los dos tratados fundamentales de bac-

La comparación de las secuencias de los ARNr 16S (o de losgenes que los codifican) permite establecer las relacionesfilogenéticas existentes entre los organismos procariotas.Este hecho ha tenido una enorme repercusión entaxonomía bacteriana, dando lugar al sistema declasificación vigente y permitiendo la identificación rápida yprecisa de las bacterias. En microbiología clínica laidentificación molecular basada en el ADNr 16S se utilizafundamentalmente para bacterias cuya identificaciónmediante otro tipo de técnicas resulta imposible, difícil orequiere mucho tiempo. La amplificación del gen, para suposterior secuenciación, parte preferentemente de ADNextraído de un cultivo puro de la bacteria, pero tambiénpuede conseguirse directamente de una muestra clínica.Esto último ha conducido al descubrimiento de nuevosagentes patógenos. Teniendo en cuenta su potencialidad, a medida que los recursos técnicos aumenten y el precio sehaga más competitivo, la identificación bacteriana basadaen el ADNr 16S encontrará probablemente una aplicaciónmás amplia en el laboratorio de microbiología clínica.

Palabras clave: ARNr 16S. Identificación bacteriana.Análisis filogenético.

Enferm Infecc Microbiol Clin 2004;22(4):238-45

Identification of bacteria through 16S rRNA sequencing:P r i n c i p l e s, methods and applications in clinical microbiology

Phylogenetic relationships among prokaryotes can beinferred from comparisons of their 16S rRNA (or 16S rDNA)sequences. This has had an enormous repercussion onbacterial taxonomy, leading to the currently appliedsystem of classification, and allowing a rapid and preciseidentification of bacteria. In clinical microbiology,molecular identification based on 16S rDNA sequencing isapplied fundamentally to bacteria whose identification bymeans of other types of techniques turns out impossible,difficult, or requires a lot of time. Amplification of the gene

Correspondencia: Dra. M.C. Mendoza.Área de Microbiología. Facultad de Medicina.Julián Clavería, 6. 33006 Oviedo. España.Correo electrónico: cmendoza@uniovi.es

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teriología, el Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology( h t t p : / / w w w . s p r i n g e r-ny.com/bergeysoutline/main.htm) yThe Prokaryotes (http://www.prokaryotes.com), basan suestructuración del mundo procariota en las relaciones filo-genéticas establecidas con esta macromolécula.

Los ARNr 16S pueden caracterizarse en términos de se-cuencia parcial, mediante el método de catalogación de oli-gonucleótidos, utilizado en los estudios pioneros de Woese.Siguiendo esta técnica, el ARNr 16S marcado in vivo, y pu-rificado, se trata con la enzima ribonucleasa T1. Los frag-mentos generados se separan, determinándose posterior-mente la secuencia de todos aquellos que incluyan almenos seis nucleótidos (nt). A continuación, las secuenciasde la colección de fragmentos correspondientes a diferentesbacterias se alinean y comparan, utilizando programas in-formáticos, para calcular finalmente los coeficientes de aso-ciación. Como se verá más adelante, la secuenciación delgen que codifica el ARNr 16S ha sustituido en la actuali-dad a la secuenciación de catálogos de oligonucleótidos.

En microbiología clínica, la identificación rápida y co-rrecta de los agentes patógenos es un requisito esencialpara el diagnóstico y la aplicación posterior de un trata-miento adecuado. En la actualidad, la mayor parte de lasbacterias de interés clínico pueden identificarse fácilmen-te mediante técnicas microbiológicas convencionales, querequieren el aislado previo del agente patógeno y se ba-san en características fenotípicas. Sin embargo, existen si-tuaciones en las cuales la identificación fenotípica necesi-ta mucho tiempo, resulta difícil o, incluso, imposible. Enestas circunstancias, la identificación molecular basada enel análisis del ARNr 16S (o del gen que lo codifica) puederepresentar una ventaja tanto en tiempo como en preci-sión, llegando incluso a competir de manera favorable conotras técnicas rápidas y eficaces, como las inmunológicas.En este artículo, revisaremos el fundamento y los aspectostécnicos de la metodología implicada, analizaremos susventajas e inconvenientes con respecto a métodos tradicio-nales, y presentaremos ejemplos de distintas aplicacionesen el campo de la microbiología clínica.

Los ribosomas, los operones ribosómicos y el ARNr 16SR i b o s o m a s

Son orgánulos complejos, altamente especializados, queutilizan los organismos para el complicado proceso de sínte-sis de proteínas. El ribosoma bacteriano (fig. 1) tiene un coe-ficiente de sedimentación de 70S (expresado en unidadesSvedberg), y puede disociarse en dos subunidades, la sub-unidad grande (50S) y la subunidad pequeña (30S). Cadasubunidad es un complejo ribonucleoproteico constituidopor proteínas ribosómicas y moléculas de ARNr específicas.La subunidad 30S contiene el ARNr 16S y 21 proteínas di-ferentes (numeradas desde S1-S21, donde S procede des m a l l), mientras que la subunidad 50S contiene los ARNr5S y 23S junto con unas 34 proteínas (L1-L34; L, large).

En bacterias, los genes que codifican los ARN ribosoma-les están organizados en operones (conjunto de genes que setranscriben a partir de la misma región promotora). Cadaoperón ribosómico (r r n; fig. 2) incluye genes para los ARNr2 3 S ( r r l ), 16S ( r r s ) y 5S ( r r f ), separados por regiones espa-ciadoras o intergénicas (IG), y contiene además genes para

uno o más ARN de transferencia (ARNt). El producto de latranscripción del operón a partir de dos promotores, P1 yP2, situados en la región anterior a r r s, será procesado por elenzima ARNasa III mediante cortes en sitios específicos queseparan las tres clases de ARNr, el/los ARNt y las dos IG.

ARNr 16SEs un polirribonucleótido de aproximadamente 1.500 n t ,

codificado por el gen r r s, también denominado ADN riboso-mal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya secuencia se puedeobtener información filogenética y taxonómica. Como cual-quier secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, el ARNr16S se pliega en una estructura secundaria, caracterizadapor la presencia de segmentos de doble cadena, alternandocon regiones de cadena sencilla5 ( f i g . 3). En eucariotas elARNr 18S es la macromolécula equivalente. Dado que losARNr 16S y 18S proceden de las subunidades pequeñasde los ribosomas, el acrónimo ARNr SSU (del inglés, sm a l lsu bun i t) se utiliza para ambos. Los ARNr SSU se encuen-tran altamente conservados, presentando regiones comu-nes a todos los organismos, pero contienen además varia-ciones que se concentran en zonas específicas (fig. 3). El

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Figura 1. El ribosoma bacteriano. Se muestra un esquema de su estructura, yse indican las subunidades y macromoléculas que lo componen.

Figura 2. El operón ribosómico (r r n ). A ) Representación esquemática del ope-rón, donde se muestran los genes estructurales de los tres tipos de ARNr (r r s,r r l y r r f), los promotores P1 y P2, y las regiones intergénicas (IG). B ) E s t r a t e g i ade amplificación del gen r r s (ADNr 16S). Se indica la posición de los iniciadoresI 1 (directo), I2 e I3 (reversos) utilizados para la amplificación (y posterior se-cuenciación) del gen completo (I1-I3; amplicón de 1500 pb, aproximadamente)o de un fragmento menor (11-I2; 500 pb correspondientes al extremo 59 del gen;ver explicación en el texto). C ) Visualización de ambos fragmentos por electro-foresis en gel de agarosa.

análisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos gru-pos filogenéticos reveló un hecho adicional de gran impor-tancia práctica: la presencia de una o más secuencias ca-racterísticas que se denominan oligonucleótidos firma6. Setrata de secuencias específicas cortas que aparecen en to-dos (o en la mayor parte de) los miembros de un determi-nado grupo filogenético, y nunca (o sólo raramente) estánpresentes en otros grupos, incluidos los más próximos. Porello, los oligonucleótios firma pueden utilizarse para ubicara cada bacteria dentro de su propio grupo.

El número de copias del operón ribosómico por genomabacteriano varía considerablemente, de 1 a 15, siendo re-lativamente constante a nivel de especie, género e inclu-so familia7 (tabla 1). Entre las copias de los ARNr 16S co-dificadas por un mismo genoma se ha detectado un ciertogrado de heterogeneidad (denominada microheterogenei-dad). El análisis de 14 genomas bacterianos, cuya secuen-cia completa se encuentra disponible, indicó una diver-gencia máxima del 1,23%, que corresponde a los ADNr16S de Escherichia coli ( t a b l a 1). Además, diferentes autores encontraron variabilidad intragenómica entrelos ADNr 16S de otras bacterias de interés clínico, cuyogenoma aún no ha sido secuenciado. Destaca la elevadaheterogeneidad (1,43%) detectada entre las 4 copias del

ADNr 16S presentes en la cepa clínica ADV 360.1 de Vei-llonella8. Obviamente, la variabilidad intragenómica, tie-ne importantes implicaciones prácticas para la identifi-cación. Sin embargo, en la mayor parte de los casos, todaslas copias del ADNr 16S de un organismos son idénticaso casi idénticas.

Características relevantes del ARNr 16S para su utilización como herramientafilogenética y taxonómica

Aunque existen cronómetros moleculares alternativos alARNr 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido des-plazarle. De hecho, esta macromolécula presenta una se-rie de características, en base a las cuales fue consideradopor Woese3 como cronómetro molecular definitivo:

Rodicio MR, et al. Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica

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TABLA 1. Número de operones ribosómicos ( r r n ) en bacterias de interés clínico y variabilidad intragenómica

B a c t e r i a O p e r o n e s r r nD i f e r e n c i a s

n t P o r c e n t a j e

A c i n e t o b a c t e r s p . 7Bacillus cereus 1 2Bacteroides fragilis 5Borrelia burgdorferi 2 / 1B r u c e l l a s p p . 3Campylobacter jejuni

ATCC 700819 3 0 0C h l a m y d i a s p p . 1Clostridium perfringens 1 0C o r y n e b a c t e r i u m 5Coxiella burnetii 1Escherichia coli

ATCC 10798 7 0-1 9 1 , 2 3Haemophilus influenzae

ATCC 51907 6 0 0Helicobacter pylori

2 6 6 9 5 2 0 0Leptospira interrogans 2Listeria monocytogenes 6Mycobacterium tuberculosis 1Mycoplasma genitalium 1Mycoplasma hominis 2Neisseria meningitidis

MC 58 4 0 0Pseudomonas aeruginosa 4Rickettsia prowazekii 1S a l m o n e l l a s p p . 7S h i g e l l a s p p . 7Staphylococcus aureus 5 / 6Streptococcus pneumoniae 4Streptococcus pyogenes 6Treponema pallidum

ATCC 25870 2 0 0Ureaplasma urealyticum

serovar 3 2 1 0 , 0 7Vibrio cholerae

ATCC 39315 8 0-1 4 0 , 9 1Yersinia pestis 6

n/n: Indica variación intraespecífica del número de operones r r n e n t r ecepas de la misma especie. La última columna se refiere a los ADNr 16Sde cepas bacterianas cuyo genoma ha sido secuenciado. Adaptada deKlappenbach et al7 y de http://rrndb.cme.msu.edu.

Figura 3. Estructura secundaria del ARNr 16S (tomada de Neefs et al5, conpermiso de Oxford University Press; Reino Unido). Las hélices comunes a todoslos seres vivos, denominadas hélices universales, se numeran de la 1 a la 48, enorden de aparición a partir del extremo 59. Las hélices específicas de procariotasse indican con Pa-b, donde a es el número de la hélice universal precedente y bel número de serie. Las regiones relativamente conservadas se presentan en ne-grilla. Las regiones variables, en líneas finas, se designan V1-V9, teniendo encuenta que V4 es exclusiva de eucariotas. Las regiones que se muestran en líneasdiscontinuas sólo están presentes en un número limitado de estructuras.

1 . Se trata de una molécula muy antigua, presente entodas las bacterias actuales. Constituye, por tanto, unadiana universal para su identificación.

2 . Su estructura y función han permanecido constantesdurante un tiempo muy prolongado, de modo que las alte-raciones en la secuencia reflejan probablemente cambiosa l e a t o r i o s .

3 . Los cambios ocurren de manera suficientemente len-ta, como para aportar información acerca de todos los pro-cariotas y, junto con las variaciones en los ARNr 18S, a lolargo de toda la escala evolutiva. Los ARNr SSU contie-nen, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciarno sólo los organismos más alejados, sino también los másp r ó x i m o s .

4 . El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S( 1 . 5 0 0 nt) minimiza las fluctuaciones estadísticas.

5 . La conservación en estructura secundaria puede ser-vir de ayuda en las comparaciones, aportando una basepara el alineamiento preciso.

6 . Dado que resulta relativamente fácil secuenciar losADNr 16S existen bases de datos amplias, en continuoc r e c i m i e n t o .

Una vez determinada la secuencia de nucleótidos y esta-blecidas las comparaciones, será el grado de similitud en-tre las secuencias de los ADNr 16S de dos bacterias lo queindique su relación evolutiva. Además, el análisis compa-rativo de secuencias permite construir árboles filogenéti-cos, que reflejan gráficamente la genealogía molecular dela bacteria, mostrando su posición evolutiva en el contextode los organismos comparados.

Hay que tener en cuenta, no obstante, que es la compa-ración de genomas completos, y no la comparación de losADNr 16S, la que aporta una indicación exacta de las re-laciones evolutivas. En su ausencia, la especie bacterianase define, en taxonomía, como el conjunto de cepas quecomparten una similitud del 70% o más, en experimentosde reasociación ADN-ADN. Stackebrandt y Goebel9 d e-mostraron que cepas con este nivel de relación presentantípicamente una identidad del 97% o más entre sus genesARNr 16S. Así, cepas con menos del 97% de identidad enlas secuencias de sus ADNr 16S es improbable que lleguena estar relacionadas a nivel de especie. Sin embargo, exis-ten cepas que comparten una similitud inferior al 50% enexperimentos de reasociación, y son por tanto clasificadasen especies diferentes, pero presentan una identidad del9 9-100% a nivel de ADNr 16S. Por ello, en taxonomía, ac-tualmente se recomienda la identificación polifásica, queutiliza criterios fenotípicos junto con datos de secuencia-c i ó n1 0. En microbiología clínica, esto implica que la se-cuenciación del ADNr 16S no aportará siempre una iden-tificación definitiva a nivel de especie1 1.

Aspectos metodológicos de la identificaciónbacteriana mediante secuenciación del ADNr 16S

El método molecular de identificación bacteriana me-diante secuenciación del ADNr 16S incluye tres etapas:a ) amplificación del gen a partir de la muestra apropiada;b ) determinación de la secuencia de nucleótidos del am-plicón, y c ) análisis de la secuencia (fig. 4 ) .

A m p l i f i c a c i ó nLa amplificación del ADNr 16S se consigue en un ter-

mociclador, gracias a la reacción en cadena de la polimera-sa (PCR). Como sustrato se utiliza normalmente ADN pu-rificado a partir de un cultivo puro del agente patógeno.Alternativamente, el ADN podrá obtenerse directamentede la muestra clínica, en el caso de bacterias fastidiosas ono cultivables, cuando aquella proceda de órganos o teji-dos normalmente estériles. Para la extracción del ADNbacteriano existen protocolos generales1 2, pero pueden re-querirse modificaciones, dependiendo de la bacteria. Ade-más, la amplificación también puede conseguirse directa-mente a partir de una colonia aislada o un cultivo líquidode la bacteria de interés, o incluso a partir de una muestraclínica, simplificando significativamente la identificación,al evitar el laborioso proceso de extracción del ADN.

Oligonucleótidos iniciadoresPara la amplificación del ADNr 16S, las regiones con-

servadas facilitan el diseño de oligonucleótidos iniciadores( 2 0 nt, aproximadamente). Cuando se pretende amplificarel ADNr 16S prácticamente completo, se utilizan inicia-dores diseñados en base a secuencias conservadas próxi-mas a los extremos 59 y 39 del gen, que originan amplico-nes de 1.500 pb, aproximadamente. Se ha demostrado, sinembargo, que una identificación precisa no siempre re-quiere la amplificación, y posterior secuenciación, delADNr 16S completo. En estas circunstancias se utiliza-rán oligonucleótidos que permitan la amplificación defragmentos de menor tamaño, preferentemente las 500 p bcorrespondientes al extremo 59 del gen (v. más adelante).

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Figura 4. Etapas a seguir en el proceso de identificación bacteriana median-te secuenciación del ADNr 16S.

En cualquier caso, antes de pasar a la siguiente etapa esconveniente comprobar el producto mediante electrofore-sis en gel de agarosa, para asegurar la presencia de unúnico fragmento, amplicón, del tamaño adecuado (fig. 2 ) .

Secuenciación del amplicónEn esta etapa se llevan a cabo las reacciones de secuen-

ciación y el análisis de los productos por electroforesis.Actualmente, se emplea la secuenciación cíclica, en unareacción similar a la de amplificación, que utiliza un úni-co iniciador por reacción y terminadores marcados confluorocromos adecuados, que interrumpirán la síntesisd e manera aleatoria, y facilitarán la detección posterior delos fragmentos interrumpidos.

La disponibilidad de secuenciadores automáticos facilitaenormemente la etapa de detección. El número de basesgeneradas por un secuenciador automático es de 500 a900, dependiendo del capilar utilizado en la electroforesis.Por ello, para la secuenciación de las dos cadenas delADNr 16S completo, serán necesarios de 8 a 4 i n i c i a d o-res, dos de los cuales podrán ser los mismos utilizados enla amplificación. Sin embargo, la secuencia obtenida podrácontener errores y/o presentar posiciones ambiguas (indi-cadas por N). Por ello, la obtención de la secuencia defini-tiva requiere la evaluación de los electroferogramas y laalineación de la cadena directa con la reversa, para resol-ver las posibles discrepancias. Así, aunque la secuencia-ción de una cadena del amplicón puede conducir a una co-rrecta identificación, la calidad de la secuencia seráóptima cuando la comparación de ambas cadenas se utili-za para la corrección de errores.

Ya se ha indicado que la identificación de una bacteria anivel de especie no requiere necesariamente la secuencia-ción del ADNr 16S completo. De hecho, aunque existen po-siciones filogenéticamente informativas a lo largo de todoel gen, la mayor variabilidad se concentra en las primeras5 0 0 bases, correspondientes al extremo 59. Generalmente,esta secuencia de 500 bases será suficiente para la correctaidentificación de un aislado clínico, necesitándose única-mente 2 i n i c i a d o r e s1 1 , 1 3-1 5. En cualquier caso, la secuencia-ción de las dos cadenas del ADNr 16S completo será nece-saria a la hora de identificar nuevos patógenos.

Análisis de la secuenciaLa última etapa será la comparación de la secuencia del

ADNr 16S con las depositadas en bases de datos. Actual-mente existen distintas bases de datos, algunas públicas,cuyo acceso es libre a través de internet, como GenBankNCBI (National Center for Biotechnology Information),EMBL (European Molecular Biology Laboratory), RDP(Ribosomal Database Project), RIDOM (Ribosomal Diffe-rentiation of Medical Microorganisms), y otras privadas,como MicroSeq (Applied Biosystems) y SmartGene IDNS(Integrated Database Network System).

RDP (http://rdp.cme.msu.edu/html/) es la principal basede datos de secuencias de ADNr (no sólo 16S, sino también23S de procariotas, y 18S y 28S de eucariotas). Permite lacomparación de secuencias on line, y ofrece otras muchasposibilidades (incluida la construcción de árboles filoge-néticos; ver más adelante). En octubre de 2003 c o n t e n í amás de 78.000 secuencias de ADNr 16S, que son alinea-das, teniendo en cuenta la estructura secundaria de la mo-lécula. La base de datos RIDOM (http://www.ridom.de) se

limita también a secuencias de ADNr, centrándose exclu-sivamente en microorganismos patógenos. Como se veráposteriormente, la elección de la base de datos es impor-tante, siendo recomendable la utilización de más de unade ellas, para comprobar si conducen al mismo resultado.Finalmente, se podrá construir un árbol filogenético, querefleja, de forma esquemática, el grado de parentesco ge-nético entre las bacterias comparadas.

Sistemas comercialesLa identificación bacteriana basada en el análisis de la

secuencia del ADNr 16S se facilita grandemente porl a disponibilidad de sistemas comerciales. Entre ellos des-taca MicroSeq500 (Applied Biosystems; Foster City,EE.UU.), diseñado para la identificación rápida y correc-ta de bacterias patógenas. Este sistema utiliza un par deoligonucleótidos que permiten amplificar un fragmentode 527-bp correspondiente al extremo 59 del ADNr 16S. Enrealidad se trata de una versión simplificada del “Micro-Seq 16S rRNA” original (también disponible en AppliedBiosystems), que sólo requiere dos iniciadores para la se-cuenciación de ambas cadenas, reduciendo de manera con-siderable el coste y el trabajo requeridos para la identifi-cación. Como parte del sistema, se incluye una base dedatos para determinar el género y la especie del aislado.Además, el s o f t w a r e permite exportar las secuencias quepodrán ser comparadas con otras bases de datos, e inclu-ye herramientas para el análisis filogenético. La utilidadde MicroSeq500 ha sido ampliamente demostrada p a r auna gran variedad de patógenos bacterianos (v. más ade-lante). El coste de cada identificación estimado en diferen-tes laboratorios varía considerablemente: 84 a 144 €

1 4 , 1 1, s i nel gasto previo destinado a tener en cuenta equipamiento(termociclador, secuenciador automático, etc.). Sí se in-cluyen los gastos de extracción, material desechable, reac-tivos, utilización de la base de datos y salarios del personalde laboratorio. Dado que la mayor proporción correspondea este último concepto, el coste por identificación se redu-ce de manera considerable al identificar más de un aislados i m u l t á n e a m e n t e .

Actualmente, otro aspecto a favor es la disponibilidad dek i t s comerciales independientes para cada etapa del pro-ceso de identificación (extracción de ADN, amplificaciónpor PCR y secuenciación), así como la posibilidad de recu-rrir a servicios comunes de secuenciación automática. Estoúltimo resulta interesante, ya que sólo requiere generar elproducto de PCR, cuya secuencia será determinada por elservicio de secuenciación y remitida directamente al labo-ratorio solicitante, por correo electrónico. En nuestro la-boratorio se han utilizado, con excelentes resultados, losServicios de Secuenciación Automática de la Universidadde Oviedo, del Hospital Central de Asturias y del CentroSuperior de Investigaciones Biológicas (Consejo Superiorde Investigaciones Científicas). En estos casos, partiendodel amplicón, la secuencia puede estar disponible en 24-4 8h ,a un precio de 10-1 2 € por reacción. Muchos otros hospi-tales españoles disponen también de secuenciadores au-tomáticos de ADN.

Aplicaciones de la secuenciación del ARNr 16S en el diagnóstico microbiológico

La identificación basada en la secuenciación del gen quecodifica el ARNr 16S en los laboratorios clínicos se centra

Rodicio MR, et al. Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica

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principalmente en cepas cuya identificación por métodosfenotípicos resulta imposible, difícil o requiere muchotiempo, incluyendo los siguientes casos:

1 . Bacterias no cultivables presentes en muestras clíni-cas, hecho que en ocasiones ha conducido al descubrimien-to de nuevos agentes patógenos.

2 . Bacterias cuyas características bioquímicas no seadaptan a las de ningún género o especie reconocido. Estasituación puede presentarse cuando se trata de patógenosnuevos, patógenos infrecuentes o también cepas de espe-cies comunes que exhiben un perfil bioquímico ambiguo.

3 . Bacterias para las cuales la caracterización fenotípi-ca sea sustancialmente deficiente.

4 . Bacterias fastidiosas, a consecuencia de sus requeri-mientos nutricionales.

5 . Bacterias de crecimiento lento, que retrasa conside-rablemente la identificación convencional.

A continuación se presentan algunos ejemplos relevantes.Entre mediados y finales de la década de 1980, pacien-

tes infectados por el virus de la inmunodeficiencia hu-mana (VIH), manifestaron una forma peculiar de an-giomatosis, con lesiones en la piel que recordaban a lascaracterísticas del sarcoma de Kaposi. Estas lesiones con-tenían invariablemente grupos de bacilos pleomórficos, ypor ello se denominó angiomatosis bacilar1 6. Sin embargo,a pesar de repetidos intentos, el microorganismo no logróser cultivado. Por tanto, el análisis fenotípico, aparte dela simple observación morfológica in situ, resultó imposi-ble y, sin material purificado, no era factible desarrollarensayos serológicos. Fue en este caso cuando se utilizó porprimera vez el ADNr 16S para la identificación, indepen-diente de cultivo, de un agente patógeno1 7. El ADNr 16Sdel agente causal de la angiomatosis bacilar se amplificóa partir de tejido infectado, utilizando oligonucleótidosdeducidos en base a regiones conservadas, comunes a to-das las bacterias. El análisis de la secuencia amplificadareveló una nueva bacteria, estrechamente relacionada conR o c h a l i m a e a ( d e s p u é s B a r t o n e l l a) q u i n t a n a. La identifi-cación permitió poco después idear condiciones para sucultivo en el laboratorio1 8 y esto, a su vez, permitió el de-sarrollo de ensayos serológicos. La estrategia que condujoa la identificación de B. quintana fue posteriormenteadoptada como método general para el descubrimiento denuevos agentes patógenos1 9.

Se ha utilizado la misma metodología para la identifi-cación directa de agentes infecciosos, a partir de mues-tras clínicas que deberían encontrarse estériles, sin nece-sidad de cultivo previo. Así, se han identificado bacteriaspatógenas presentes en el líquido cefalorraquídeo2 0 , 2 1, lí-quido sinovial2 2, válvulas cardíacas2 3 y sangre2 4 - 2 6. Aun-que la identificación directa a partir de muestras clínicases una técnica sumamente eficaz, carece de algunas delas ventajas que ofrece el cultivo1 1. Por ejemplo, en ausen-cia de éste, no es posible la caracterización posterior delmicroorganismo infeccioso, incluida la determinación desu susceptibilidad a agentes antimicrobianos o la diferen-ciación intraespecie para estudios epidemiológicos. Porello, la identificación directa a partir de muestras clínicasse utiliza principalmente cuando fracasa el cultivo.

Actualmente, una de las aplicaciones más importantesdel ADNr 16S es la identificación de micobacterias no tu-

berculosas, cuya incidencia y relevancia clínica ha aumen-tado de manera considerable en la última década, aso-ciada a la pandemia del sida. El método tradicional deidentificación de estas micobacterias se basa en caracte-rísticas fenotípicas (pruebas bioquímicas, producción depigmento, fisiología, y morfología de las colonias), cuya de-terminación requiere un tiempo considerable, como con-secuencia del crecimiento lento de estas bacterias en me-dios de cultivo convencionales. Además, la interpretaciónde los resultados exige experiencia, y está limitada por labaja especificidad y la subjetividad. Por ello, la secuencia-ción del ADNr 16S se está imponiendo como método rápi-do y preciso para la identificación tanto de micobacteriaspreviamente reconocidas como de nuevas especies1 3 , 1 5 , 2 7-2 9.La identificación molecular puede completarse 1 o 2 d í a sdespués del aislado en cultivo puro, y puede incluso reali-zarla personal sin experiencia en biología molecular.

El sistema MicroSeq500, utilizado en la mayor parte delos trabajos ya citados, se está aplicando también a la iden-tificación de bacterias corineformes, grupo para el cual losmétodos fenotípicos disponibles en los laboratorios de mi-crobiología clínica son sustancialmente deficientes. Tang eta l1 4 analizaron un total de 52 aislados, y encontraron quea nivel de género los resultados de la identificación por se-cuenciación eran concordantes con los obtenidos utilizan-do criterios fenotípicos. A nivel de especie, la identificaciónpor secuenciación fue más fiable en las dos especies deC o r y n e b a c t e r i u m con mayor relevancia clínica: C. diphte-r i a e y C. jeikeium. El tiempo requerido fue inferior a 24 h .

Por último, y como ejemplo de aplicación a la identifica-ción de bacterias con perfiles bioquímicos ambiguos, cabemencionar el trabajo de Woo et al3 0. Estos autores utili-zaron el sistema MicroSeq500 para la identificación de3 7 aislados bacterianos, clínicamente relevantes, que in-cluían bacterias aerobias grampositivas, bacterias anaero-bias gramnegativas y especies del género M y c o b a c t e r i u m,previamente identificadas por métodos fenotípicos. El81,1% de los aislados pudieron ser correctamente identifi-cados, mientras que en el 13,5% de los casos la identifica-ción de género fue incorrecta y en el 5,4% (2 de 37), de es-pecie. En 5 casos, la identificación errónea se debió a laausencia de las secuencias ADNr 16S de las bacterias co-rrectas en la base de datos del sistema MicroSeq500. Estosresultados apoyan la conveniencia de utilizar más de unabase de datos, sobre todo cuando se trata de bacterias queraramente se encuentran en la práctica clínica.

C o n c l u s i ó nLa secuenciación del ADNr 16S constituye un método rá-

pido y eficaz de identificación bacteriana, del cual puede be-neficiarse la microbiología clínica, al igual que otras ramasde la microbiología. A medida que los recursos técnicos au-mentan, el precio se hace más competitivo, por lo que pro-bablemente su utilización para la identificación sistemáti-ca de bacterias patógenas será sólo cuestión de tiempo.

A g r a d e c i m i e n t o sQueremos agradecer a los Dres. Fernando Vázquez del Hospital

Monte Naranco de Oviedo, M. Cruz Martín, del Instituto de ProductosLácteos (Asturias) y José Luis Martínez Fernández, del Servicio deSecuenciación Automática de la Universidad de Oviedo, por la lectu-ra crítica de este artículo, y por sus comentarios.

PUESTA AL DÍA EN MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO

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Rodicio MR, et al. Identificación bacteriana mediante secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica

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