Fundamentos y aplicaciones analíticas y …...• 2. Conocer los fundamentos de la citometría de flujo. • 3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que

Jorge Monserrat Sanz

Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas

de la inmunofluorescenciay la citometría de flujo

Asignatura de InmunologíaUniversidad de Alcalá

Unidad mixta

CSIC/UAH


Objetivos• 1. Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la

heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune.

• 2. Conocer los fundamentos de la citometría de flujo.

• 3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se realizan mediante la citometría de flujo.

• 4. Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de flujo.

• 5. Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica.

• 6. Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononuclearesmediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos.


• 7. Adquisición en un citometro de flujo.

• 8. Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantesdel ADN.

• 9. Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo: Comprender las etapas en el proceso de la información obtenida por citometría

• 10. Resolución de diferentes problemas clínicos reales.

• 11. Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e interpretación de intensidades medias de florescencia de célulaslinfocitarias obtenidas de distintos casos patológicos reales.

• 12. Interpretación de los resultados obtenidos.

Objetivos


¿Qué debe ser el alumno al terminar el curso?

• Que después del curso el alumno sea:

1. Conocedor de los fundamentos y consciente de las aplicaciones de la citometría de flujo.

2. Eficiente preparando muestras para citometría y diseñando experimentos de citometría analítica y separativa.

3. Usuario competente y autosuficiente del citómetro de flujo analizador capaz de puesta a punto, adquisición y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones problemáticas (compensación, flujo)

4. Analizador crítico conocedor de las posibilidades de los software de análisis y exportación de datos.


Prácticas de Inmunología • Primer día: Seminarios Interactivos (3 horas):

1. Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo.2. Aplicaciones de la citometría de flujo.

• Segundo y tercer día:1. Dos actividades simultáneas (1.5 horas):- Realización de una separación célular de células mononucleares de sangre periférica.- Contaje de las células.

2. Citómetro de flujo: Fundamentos y utilización de un citómetro de flujo (1.5 horas).3. Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre periférica (1.5 horas):

a. Marcaje de superficie.b. Viabilidad (7add).c. Anexina V.

• Cuarto día (3 horas):– Análisis de imágenes de citometría de flujo. Problemas.


Relevancia

1. Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología:Conocimiento y búsqueda de información de carácter

pronóstico

2. Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía de toda la comunidad científica biomédica


Evolución de la citometría multiparamétrica

Evolución Temporal EE.UU

1960 1970s 1980s 1997 2001 2002 2004 2006

Nº d

e C

olor

es

0

5

10

15

20

25

NºColores

Nº Artículos trabajando en Citometría de Flujo

Evolución temporal1960 1970s 1980s 1997 2001 2002 2004 2006

NºA

rtícu

los

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

NºArticulos

Evolución Temporal Nuestro Laboratorio

1989 1990s 1996 1997-98 2004-2005

Nº d

e C

olor

es

0

2

4

6

8

10

12

14

NºColores

Nace2-3 F

4 F8 F

11 F

17 F

12 F

2 F3 F 4 F

6-12 F

Demanda: - Nuevas herramientas- Nuevas Estrategias de análisis

24 D

!!!más colores, más información!!!

!!!Análisis cada vez más complicados!!!!!


Heterogeneidad celular en el sistema inmune

CD19CD19

CD3CD3

CD56CD56

CD4CD4 CD8CD8

CD2CD2

CD45

CD14

CD45RACD45RA CD45RACD45RA CD45RACD45ROCD45RO CD45ROCD45RO

CD15

NeuMonoBNKT4 T8


Criterios de caracterización de los tipos celulares

• Celulares– Morfología al microscopio.

• Moleculares– Genotípico. (Genoma) Recombinaciones somáticas– Fenotípico (Proteoma) RNA expresado, proteínas.– Citoma: Análisis estadístico multi-celular.

- Antígenos de diferenciación linfocitariaLos antígenos de superficie pueden ser utilizados como marcadores

específicos de líneas, tipos y subtipos celulares.


Para estudiar la heterogeneidad celular son necesarias técnicas:

• 1. Con resolución a nivel de célula individual

• 2. Que caractericen la célula en función de varias características (parámetros). X, Y, Z...

• 3. Capaces de realizar medidas en números representativos de células. 100 células error ± 10%, 10.000 error ± 1%

• 4. Capaces de almacenar, procesar, representar, analizar y reducir toda esa información sobre células individuales en conclusiones útiles acerca de las poblaciones celulares.

Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024

4C5144001 FSC-Height ->

GranulocitosCD15+

MonocitosCD14+

LinfocitosCD3+

Τ2αβΤ1γδCD4+CD8+

CD56+CD19+

CD5+CD5-

Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular


Fases de la citometría: 1. Pre-citometría:

1. Anticuerpos monoclonales y sondas:1. Estudio a nivel tisular2. Estudio a nivel celular

2. Técnicas de separación celular3. Técnicas en Inmunofluorescencia

2. Citómetria(Alternativas: Microscopia de fluorescencia, Confocal, Genética Molecular…)

3. Análisis cuantitativo4. Análisis biológico.


Anticuerpos como herramientas en investigación

• Ventaja• Capacidad de reconocimiento muy específica• Detección muy sensible picomolar• Inconveniente• Son invisibles

– Conjugación con moléculas “reporter”• Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 1977

• Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica

• Moléculas fluorescentes: inmunofluorescencia, citometría de flujo, LSC.


Técnicas de separación celular

• Gradientes de densidad: Medios de densidad constanteGradientes continuos o discontinuos

• Elutriación centrifuga• Sorting: - Magnético

- Sorter

- Células en tejidos:

- Células en disolución:

1. Inmunohistoquímica2. Procesamiento mécanico3. Separación por mallas y filtros


Técnica de separación mediante Ficoll-Hypaque


Directo Indirecto Biotinado1

2

1

2

1b

b

bb b

b

bb

b

b b

b

Tipos de marcajes inmunofluorescentes


Microscopia de fluorescencia


FUNDAMENTOS DE LA

CITOMETRÍA DE FLUJO


¿Qué es la citometría de flujo?

FSC

90º2- 4º

Columna de muestra

Meeting pointLáser

Detecto

res de lu

z

Amplificacióndigitalización

Representacióny Analisis

Flujo


VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO- Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de

células individuales (miles).

- Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en

la precisión de las medidas.

- A menor tiempo de dedicación mayor productividad.

DESVENTAJASLa citometría de flujo no aporta información sobre la distribución

espacial de las células estudiadas.





Citómetro de flujo


¿Cómo funciona un citómetro?• Sistema de flujo• Dispersión de la luz• Fluorescencia• Separación y detección de la luz• Amplificación• Corrección de errores: solapamiento espectral y formación

de dobletes• Digitalización y almacenamiento de la información


SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA

MUESTRA

AIRE

FLUJOMUESTRA


Cámarade flujo

FSC90º

Fluido envolvente

Columna de muestra

Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, α = 90º

Luz incidente

Luz dispersada hacia delante, α=2- 4º


INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE: LUZ

- PROPIEDADES AL ATRAVESAR LA LUZ:- LUZ REFLEJADA O DIFRACTADA

- PROPIEDADES FLUORESCENTES:- FLUOROCROMOS (FITC, PE, APC, TC…)


Luz dispersada a 90 grados

Detector

Detector de 90º

Laser


DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD

SCATTERED LIGHT, FSC)

FSC

SSC

El detector de FSC convierte luz dispersada haciadelante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño

de la célula/particula


DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,

SSC)

FSC

SSC

El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmenteen un pulso de voltaje proporcional a l contenido en

orgánulos membranosos (granularidad)

Jorge Monserrat Sanz0 256 512 768 1024

4C5144001 FSC-Height ->

GranulocitosCD15+

MonocitosCD14+

LinfocitosCD3+

Τ2αβΤ1γδCD4+CD8+

CD56+CD19+

CD5+CD5-

Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celular


Laser

Detectores de fluorescencia

Freq

Fluorescencia

Detector

Detector de fluorescencia(PMT3, PMT4 etc.)


Fluorescencia

FSC

FL-1

FL-2


Imagen de Fluorescencia: Doble Marcaje CD16 PE y CD3 Percp


Fluorescencia• Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su

energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.• Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los

distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.

t (μs)

E

λ1<λ2

λ 1

λ 2


Espectros• Espectro de Absorción

– Representación de la intensidad de absorción de luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia.

• Espectro de Emisión– Representación de la intensidad de emisión de una sustancia

excitada con luz de una determinada longitud de onda.

λ (nm)

excitación medida

Inte

nsid

ad d

e flu

o res

cen c

ia


Fluoresceina (FITC)

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relat

ive I

nten

sity

Wavelength

Proteinas

Excitación Emisión300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm


Etidio

PE

Acido Parinárico

Texas Red

PE-TR Conj.

PI

FITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Laseres

comunes


Fluorocromos


Sondas


Proceso de señales• 1. Separación de señales luminosas

• 2. Detección de señales luminosas

• 3. Amplificación de señales eléctricas

• 4. Corrección de errores – Compensación de señales

– Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).

• 6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales

• 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante


PMT

PMT

PMT

PMT

FiltrosDicroicos

BandpassFiltros

Optica en los citómetros de flujo

Laser

1

2

3

4

Flujo Celular


DETECCIÓN DE FLUORESCENCIATC

PerCPQR

Cy5APC

FL-1 FL-2 FL-3 FL-4Detectores

Fluorocromos


Amplificación de señales

• Lineal• (intervalos regulares) • apropiada para:

– Señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)

– Con distribuciones con picos estrechos como el contenido en DNA.

• Logarítmica • (intervalos crecientes)

– Cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000).

10010 200

100 20010 1000

101 20

100 20010 1000


Escalas

FSC Ej: Lineal FL-1 Ej: Logarítmica


Compensación de señales• Fundamento Superposición de

espectros de emisión. Parte de la señal de emitida por un

fluorocromo es leída por el detector de otro color

• Concepto sustracción de una parte de la señal medida en un color a la señal medida en otro color

• FL-2 - %FL1

λ

excitación

medida

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cen c

ia

FL-1 FL-2


Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos)

• Señal analógica (V)• Altura de señal (H)• Anchura de señal (W)• Área de señal (A)

• En base a la información de área y anchura se pueden detectar dobletes (dos células que pasan juntas).

WA

H

t

V

2 xW


DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN

N

12345678...

10000

FSC

22343422...

SSC

11221238...

FL-1

11341121...

FL-2

12312312...

FL-3

13341134...

FL-4

22335512...

TIEMPO

11112222...

Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitalesLas señales digitales almacenan en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico).


PROCESO DE INFORMACION

HistogramasDiagramas biparamétricos


Proceso de la información generada

• Representación de la información

• Selección de la información

• Reducción de la información

• De la célula a la población celular


Representación monoparamétrica de datos.Histogramas. Se representa en cada valor de x

(intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.

M1


Histogramas

SSC

FSC

FL-1

FL-2

FL-3


Representación biparamétrica en 2D

Diagrama de puntos / dot plot

+

+--

Representación simultánea de dos parámetros X e Y.

X representa el valor de la señal de un parámetro.

Y representa el valor de la señal del otro.

++-

-FL-1

FL-2


Representación 3D Countour plot / Diagramas de contornos

X, Y más una tercera dimensión.

Una superficie tridimensionalLa altura representa el número de células con una determinada combinación de ambos parámetros.


Diagrama de dot plot density


Selección de subpoblaciones definidas en diagramas monoparamétricosSitúan los valores límite superior e inferior de un parámetro que definen a las células de interés.

Selección de la informaciónGates (Puertas) / ventanas (windows)

M1

M2


Gates biparamétricos.

Se pueden utilizar puertas biparamétricas definidas en base a la combinación de los valores de dos parámetros

Se emplean para estudiar las características de subpoblaciones celulares

R1

R2

R3

R4


Gates lógicos / Puertas lógicasPueden combinarse distintas puertas y emplearse simultáneamente como

criterio para seleccionar las células de interés.

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

LINFOCITOSMONOCITOS

GRANULOCITOS

TAMAÑO

CO

MPL

EJI

DA

D C

EL

UL

AR

R5 and R1

T

NK

TK


¿Qué significa la realización de un “gate” electrónico?

N

12345678...

10000

FSC

22343422...

SSC

11221218...

FL-1

11341121...

FL-2

12312312...

FL-3

13341134...

FL-4

22335512...

TIEMPO

12345678...


Estadisticasmonoparamétricas

M1

M2

Histogram Statistics

Marker Left, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median PeakAll 1, 9910 9917 100.00 99.17 1027.48 827.78 37.34 1113.97

M1 685, 9910 8725 87.98 87.25 1153.33 1139.97 16.01 1144.44M2 14, 685 1192 12.02 11.92 106.29 79.55 95.61 66.12

File: ap-24h.011 Log Data Units: Linear ValuesTube: Panel: Acquisition Date: 26-Apr-99 Gate: G3Gated Events: 9917 Total Events: 10000X Parameter: FL3-H FL3-IP (Log)

Análisis de la información.


Estadisticas biparamétricas• Cuadrantes Combinación de dos

umbrales de positividad para dos

parámetros

• Número de células

• % de células

• MFI mean, geo mean

+--

++

-

+-

Quadrant Statistics

File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17

Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43


Estadística por regiones

• Selección libre de un conjunto

de combinaciones de valores

correspondientes a dos

parámetros.R1

R2 Microbeads

Linfocitos


Información generada de una muestra marcada en triple color

Quadrant Statistics



Quadrant Statistics



Quadrant Statistics



Del análisis de cada matriz (9x20.000) nos quedamos con 12-24 nímeros


Estadísticas/Reducción de la información• Análisis gráfico ofrece

información numérica sobre las poblaciones estudiadas.

• Esta información numérica de una muestra se representará en una fila de una matriz de datos

• Con la matriz de datos se obtendrá información estadística y representaciones gráficas sobre poblaciones de individuos.

9x20000

célu

las

parámetros

casovariables

Población controlPoblación casos

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