Genética molecular aplicada: usa los principios del conocimiento de la estructura y función del DNA para investigar la base del fenotipo controlado por un genotipo determinado en condiciones normales y patológicas.

Análisis Genético

GENOTIPO FENOTIPO

Genética inversa (a veces denominado clonado posicional)

•Aislamiento de variantes fenotípicasAislamiento de variantes fenotípicas

•Análisis de descendientes de cruzamientos controlados entre varientas fenotípicasAnálisis de descendientes de cruzamientos controlados entre varientas fenotípicas

•Análisis bioquímico de los procesos celulares controlados por genes concretosAnálisis bioquímico de los procesos celulares controlados por genes concretos

•Análisis microscópicoAnálisis microscópico

•Análisis del DNAAnálisis del DNA

FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

SÍNTESIS DE DNA: REPLICACIÓN

SÍNTESIS DE RNA Y PROTEÍNAS: TRANSCRIPCIÓNY TRADUCCIÓN

COMPLEMENTARIEDAD Y ESTRUCTURA TRI-D DELDNA

Factores de transcripción: regulan la iniciación de síntesis de RNApor unión a secuencias de DNA específicas en los promotores

1. Composición de bases

2. Longitud DNA doble

3. Fuerza iónica

Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C)

DESNATURALIZACIÓN DEL DNA

•Temperatura•Fuerza iónica•Concentración de DNA•Tiempo de reacción

RENATURALIZACIÓN DEL DNA

Agentes desnaturalizantes:

•Formamida•Urea

•Enzimas de restricción•Ligasas•DNA y RNA polimerasas•Nucleasas

ENZIMAS METABÓLICOS DEL DNA EN APLICACIONES

Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas y reconocen secuencias de DNA palindrómicas

G ' GATCCBamHI

SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO

TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN

LIGASAS: formacióndel enlace fosfo-di-éster

EXTRACCIÓN DE DNA

•Homogenización tejido (Dodecil sulfato sódico SDS; Ác. Etilendiaminotetraacético EDTA; Proteinasa K)

•Eliminación proteínas (Phenol; Cloroformo)

•Eliminación RNA (RNAasa)

•Precipitación (Etanol; Isopropanol en presencia de Na+)

Bromuro de metil-trimetil-amonio CTAB

EXTRACCIÓN DE RNA

DEPC: Dietil pirocarbonatoN-Lauril Sarcosina Mercaptoetanol

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE CsCl

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

% Concentración Rango pb0.5 1000-30.0000.7 800-12.0001.0 500-10.0001.2 400-70001.5 200-30002.0 50-2000

Xileno de cianol 5 KbAzul de bromofenol 0.5 Kb

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

% Gel PAA Rango pb

3.5 100-1000

5.0 75-500

8.0 50-400

12.0 35-250

15.0 20-150

20.0 5-100

Acrilamida [CH2=CHCONH2]n

Metilen-bis-acrilamida (CH2=CHCONH2)2CH2

En presencia de Persulfatoamónico y TEMED (N.N,N’,N’ tetrametiletilendiamina)

HIBRIDACIÓN DESOUTHERN

1. NaOH 1N2. Tris buffer3. 20xSSC (NaCl 3M, Citrato Na 0.3M)

HIBRIDACIÓN NORTHERN

SECUENCIACIÓN DEDNA

KARY MULLIS Y LA REACCIÓN EN CADENADE LA POLIMERASA (PCR)

Dos cebadores (oligonucleótidos cortos de DNA de cadena simple)utilizados para amplificar un segmento definido de DNA genómico.

Premio Nobel 1993

Ventajas de la PCR: especificidad y sensibilidad

•DNA a amplificar (diana)

•primers (18-25 nts)

•DNA polimerasa termoestable

•dNTPs

MECANISMO Y COMPONENTES DE LA PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Desnaturalización Hibridación primers Extensión (síntesis DNA)

Producción PCR = (cantidad DNA inicial) x (1 + % eficiencia) nº ciclos

Eficiencia: % de conversión de DNA molde a producto por cicloP. ej. con una eficiencia del 70% se obtiene 1 µg a partir de 1 pg en unos26 ciclos

CICLOS COPIAS

1 2

2 4 4 16 10 1,024 15 32,768 20 1,048,576 25 33,554,432 30 1,073,741,824

POLIMERASAS TERMOESTABLES

Pol termoestables: •activas despues de repetidamente a 95ºC•óptimo a 75ºC

Taq: Thermus aquaticus

Tli: Thermococcus litoralis

Pfu: Pyrococcus furiosus

Tth: Thermus thermophilus

DISEÑO DE PRIMERS PARA PCR

•Longitud de los primers (usualmente 18-24 nts)

•Temperaturas de fusión Tm (usualmente 44-55% G-C)

•No complementariedad entre los dos primers en los extremos 3’ (problema de dímeros de primer)

•No lazos intracatenarios (carecer de secuencias palindrómicas)

•Distancia entre primers (ideal entre 150-500 pb pero hasta 20 Kb)

EFECTO DE LA TEMPERATURA DE HIBRIDACIÓNEN LA PRODUCTIVIDAD, SENSIBILIDAD YESPECIFICIDAD

PARÁMETRO ALTERACIÓN EFECTO

Temperaturahibridación

Incremento

Decremento

Aumenta especificidad

Aumenta sensibilidad y productividad

DNApolimerasa

Concentración

Tipo de Taq

Alta decrece especificidadBaja insuficiente productividad

Dilema eficiencia y tasa de error

Concentraciónde Mg++

Variación Baja incrementa especificidad

Alta incrementa sensibilidad

Ciclos Temp.desnaturaliación

Alta incrementa especificidad peroactividad Taq decrece

Número ciclos Solo subir a más de 35 si menos de 103

moleculas de partida

Duraciónextensión

Incrementa sensibilidad en PCR larga

CONDICIONES DE LA PCR OPTIMIZABLES

RT-PCR: OBTENCIÓN DE RNAm

Síntesis de DNAc primera cadena requiere: •RNAm

•dNTPs

•primer (oligodT, pDn6 ala azar o específico de un gen)

•Transcriptasa reversa

•rTth (DNA pol Thermus thermophilus recombinante)•RT AMV (Virus de mieloblastosis de aves)•RT MMLV (Virus de la leucemia murina de Moloney)

SÍNTESIS DE DNAc

PRIMERS PARA LA SÍNTESIS DE LA PRIMERA CADENA

SÍNTESIS DE LA SEGUNDA CADENAUSANDO “AUTOPRIMING”

SÍNTESIS DE LASEGUNDA CADENAUSANDO RNAasaH

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERA CONTRANSCRIPTASA REVERSA (RT-PCR)

•Combina la reacción de formación de DNAc y la amplificación por PCR.

•Puede ser de un solo enzima (rTth) o en dos reacciones (primero usando p. ej. AMV-RT y después Taq polimerasa para amplificar el DNAc.

APLICACIONES BÁSICAS DE LA RT-PCR

•RACE: Amplificación rápida de extremos de DNAc

•RT-PCR cuantitativa

•Aislamiento de transcritos que están presentes a diferentes niveles en dos poblaciones de RNAm

•“differential display”• “suppresion substraction hybridization”

PROTOCOLO PARALA RT-PCR RACE

PCR CUANTITATIVA 1:RT-PCR COMPETITIVA USANDO UN RNA “MIMÉTICO”

RT-PCR CUANTITATIVA 2: EN “TIEMPO REAL”

TaqMan probe used in Real Time PCR sample amplification

CT = cycle at which the observed fluorescence is 10-fold above background (10x amplification).

DETECCIÓN DE GENES CON EXPRESIÓN DIFERENTERT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)

RT-PCR “Differential display” (DDRT-PCR)

“Suppression subtraction hybridization” (SSH)