11Tema 1 ADN recombinante Manipulacin in vitro de cidos nucleicos (ADN) Enzimasqueactansobrecidosnucleicos:protenaspurificadasextradasdebacterias.Demanera natural forman parte del ciclo celular normal. - ADN polimerasas: sintetizan ADN - Nucleasas: cortan o degradan - Enzimas de modificacin de extremos: para conseguir residuos concretos - Ligasas: unen fragmentos de ADN Nucleasas EnzimasquedegradanADNy/oARNrompiendolosenlacesfosfodisterentrenucletidos.Se clasifican segn su actividad: - Exonucleasas:eliminannucletidosdelosextremoshaciaelinteriordelamolcula.Noatacaa molculas circulares.- Endonucleasas: cortan en medio de la molcula o cadena Pueden ser especficas de ADN o ARN, de cadena simple (ss) o doble (ds) Ejemplos: Exonucleasa del fago : ADN ds 5 3 Exonucleasa III: ADN ds 3 5 Nucleasa Bal31: exonucleasa 3 5 especfica de ADN ds. Tambin es endonucleasa sobre ARN ss Nucleasa S1: endonucleasa de ss, tanto ADN como ARN. Tambin corta la segunda cadena de molcula ds cuando hay una muesca DNasaI:especficadeADN.Cortapreferentementeenpirimidinas(CyT).Usoen produccin de muescas y mapeo de unin de protenas. Endonucleasa RNasaA:especficadeARNss.EliminaARNpresenteenpreparacionesdeADNyla cadena de ARN en un hbrido ADN: ARN RNasaH:actividadesendonucleasa,exo53yexo35sobreARNpresenteen hbridos hbrido ADN:ARN Endonucleasas de restriccin o restrictivasCatalizanelcortedemolculasdeADNdsensitiosespecficos.Losfragmentosobtenidosson especficos y se denominan fragmentos de restriccin.Reconocen una secuencia corta bicatenaria: sitio o diana de restriccin 22Formanpartedelossistemasderestriccin-modificacin(RM)bacterianos,noatacaalADN bacteriano porque est metilado. Defensa /proteccin frente a la entrada de ADN extrao. Sistemas RMDesempean,enlaclulabacteriana,unafuncindeproteccingentica,dirigidaaimpedirel establecimientoensuinteriordematerialgenticoexgenoquepudieracodificarproductoscapacesde alterar la vida celular.El sistema incorpora dos actividades enzimticas ambas con una misma especificidad de secuencia.- Metilasa: metil-transferasa (M). la metilacin protege al ADN en sitios especficos - Endonucleasa(R):catalizalaroturadelasdoshebrasdeADNsinoseencuentrametiladaal menos una de ellas. Elsitioodianadereconocimientoesunacortasecuenciadeparesdebases,constituidoporlasdos hebras Hay tres tipos de sistemas RM: 9 SistemasRMtipoI:tienentressubunidades(metilasa,restrictasayespecificidad).Reconoceny metilan una secuencia, pero el corte se produce fuera de la diana de reconocimiento y en secuencia no especfica 9 SistemasRMtipoIII:tienendossubunidades:metilacin/especificidadyrestriccin.Elcortese produce fuera de la diana de reconocimiento. 9 SistemasRMtipoII:Actividadrestrictasaymetilasaenprotenasdistintas.Reconocenyactan sobre la misma secuencia (diana de reconocimiento). Rotura en sitios especficos y definidos. Tipos I y IIITipo II

Endonucleasas de restriccin tipo II Son de una gran especificidad, actan sobre una diana concreta Nomenclatura:EcoRI - 3 primeras letras indican gnero y especie de donde se aisl - 4 letra indica cepa - Nmero romano indica orden de aislamiento Dianas - Secuencia ADNds: cataliza la hidrlisis simultnea de las dos hebras de un ADN bicatenario y no acta sobre estructuras monohebra.- Entre 4-8 bp (pueden ser ms). Constituida por una secuencia especfica de algunos pares de bases. - Generalmente palindrmicas Puntoderoturasimtricorespectodelejedeladiana,unoencadahebra.Puedenproducir extremos: - Romos: rotura en enlaces enfrentados - Cohesivos (5 protuberantes o 3 protuberantes): rotura en enlaces no enfrentados 33Romos Cohesivos5 protuberantes 3 protuberantes44 Isosquizmeros Reconocenycortanlamismasecuencia,enalgunoscasosdemaneradistinta,compartenelsitiode restriccin. Ambasenzimasreconocenycortanlamismasecuencia,enalgunoscasosdemaneradistinta.SmaI rompeporpuntosenfrentados,porelenlacecentraldeladiana,yXmaIrompeentrelaprimerayla segunda C. Endonucleasasdeespecificidadrelajada.Enalgunaposicindeladiananorequierebase especifica,sinoqueaceptamsdeuna.Larelajacindelaespecificidadaumentalaprobabilidadde aparicin de la diana, por tanto el tamao medio de los fragmentos obtenidos sern ms pequeos. Anlisis y separacin de fragmentos de ADN mediante electroforesisMigracindemolculasdeADNatravsdeunsoportereticulado(matriz)dentrodeuntampn por accindeuncampoelctrico.Elcomportamientodeunamolculavienedefinidoporsumovilidad electrofortica, que depende de la carga, el tamao y la forma de la misma. Matriz Soportereticuladoatravsdelcualsedesplazanlasmolculasqueseanalizan.Elentramado tridimensionalformaporoscuyasdimensionesdebenpermitirelpasodelasmolculas.Unentramado denso produce poros pequeos y las molculas de tamao similar o mayor encuentran gran resistencia y se retrasan . Agarosa:polisacridodeestructuralineal,derivadodealgas.Insolubleatemperaturaambiente,pero soluble a 100 C. Cuando se enfra gelifica. Por sus poros pueden desplazarse molculas con dimensiones medias (hasta 40-50 kb) Poliacrilamida:polmeroformadoporacrilamidayN,N-metilbisacrilamida.Laconcentracinde ambosreactivosdefineelgradodereticulacindelgel.Sonestablesqumicaymecnicamenteenun Enzimas que producen extremos compatiblesCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaICGGGCCCCGGGCXmaICYCGRGAvaI CCSGGCauI WGGCCWHaeI GCNNNNGCBspCI Y: pirimidina (C/T) R: purina (A/G) S: G/C W: A/T N: cualquiera 55ampliorangodepHytemperatura.Polimerizamedianteagentesqumicos.Presentamayorpoderde separacin al permitir una mayor densidad de reticulacin, una red ms tupida y unos poros menores. Se suele aplicar al anlisis de fragmentos pequeos (5-500 pb), por ejemplo el aislamiento y purificacin de pequeosfragmentosdeADNamplificadosydesecuenciacin.Permitesepararfragmentosdecidos nucleicos que se diferencian en 1 nucletido. TampnOfreceunaconductividadapropiadaenelmedio,mediantelaaportacindeunaconcentracin moderadadeiones,yparamantenerunvalorconstantedepHalolargodetodoelprocesoasegurando una carga constante en las molculas que se estn separando. Mantienen la temperatura que aumenta por el paso de la corriente y de la resistencia presentada por el medio y el soporte, y puede afectar al soporte (matriz) y a la estructura de las molculas. Varios tipos que puede afectar a la movilidad de las molculas. ADNescido,portantotienecarganegativaymigrarhaciaelpolopositivo.Secolocarnlas muestras siempre en el polo negativo. Preparacin de muestra Muestradisueltaentampndecarga:compuestodealtadensidad (glicerol o ficoll), para que la muestra no flote en el gel, ms uno o dos colorantes, para separar tamaos de molculas. De color oscuro sern las molculaspequeasydecolorclarolasgrandes.Elcolorantepermite seguir la marcha del proceso.Marcadoresdetamao:patrnconocidodetamaos,se obtienencomercialmente.Mezcladefragmentosdetamao conocido. Visualizacindelgel:Tincinconbromurodeetidioqueseintercalaentrelasbases,emite fluorescencia(naranjaintensa)conluzultravioleta.Cuandolasmolculasdecidonucleicoestn saturadas de etidio la fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de cido nucleico, lo que permite disponer de un procedimiento alternativo para su cuantificacin. Factores que influyen en la separacin Tamao fragmentos: a mayor tamao, menor distancia recorrida - Agarosa: 50 bp- 40 kb - Poliacrilamida: 5-500 bp Concentracin de agarosa/ poliacrilamida: grado de reticulacin del gel Conformacin/topologadelasmolculas:importanteen plsmidos (molculas circulares) - Formacircular:migranmsrpidosufrensuperenrollamiento facilitandosumovimientoatravsdelamatriz.Amayor superenrollamiento mayor ser su movilidad. - Formacircularabierta:migranmslento,nopresentan superenrollamiento. - Formalineal:intermedia,serpenteanatravsdelosporosyavanzan segn su tamao. FC FLFCA66ADN polimerasasEnzimas que sintetizan ADN ADNpolimerasadependientedemolde:requierenunahebramoldequedirijalaseleccindeldNTP que ha de ser incorporado. Necesitan un cebador o primer de oligonucletidos. Actividades de las polimerasas - Sntesis 5 3 Exonucleasa3 _ 5 : corrige errores Exonucleasa5_ 3: degrada por delante si se encuentra una cadena y sintetiza por detrs. 9 ADN polimerasas utilizadas en investigacin ADN polimerasa I E. Coli. Temperatura ptima 37C 53 sntesis 35exonucleasa53 exonucleasa77Posee las 3 actividades. Rellena huecos en un ADN ds que los contenga, es la base de participacin en sistemasdereparacininvivo.Degradalosextremos5fosforiladosdeunADNdsounhbridoADN: ARN.Aplicaciones: - UsoenmarcajedeADN:sehaceunamuescaenunahebraysecebaconnucletidosmarcados radiactivamente. Klenow polimerasa: fragmento grande de ADN polimerasa I de E coliCarece de actividad 5 3 exonucleasa Uso en marcaje de ADN y relleno de extremos. Aplicaciones: - Relleno de extremos de ADN ds con terminales 3 retrados formando terminales romos. - Marcaje de extremos 5 protuberantes, solamente Taq polimerasa ADN polimerasa de Thermus aquaticus Termoestable, temperaturaptima 72 C. Soporta hasta 95 C Presenta: - Actividad ADN polimerasa 5 _ 3 sobre un ADN ss cebado. - Actividad exonucleasa 5 _ 3 dependiente de la actividad polimerizadora Aplicaciones: - Secuenciacin de ADN- Amplificacin de regiones especficas de ADN mediante PCR Retrotranscriptasa Transcriptasa reversa, dependiente de ARN. Utiliza ARN como molde. Sntesis de ADNc (copiado)

Aplicaciones de las ADN polimerasas: PCR PolymeraseChainReactionoReaccinencadenadelapolimerasa.Amplificacindirectaydirigida de un fragmento de ADN ARN. Tenemosqueconocerlasecuenciaopartedeelladelfragmentoaamplificar,estasregionesson utilizadas como cebadoresObjetivos: - Amplificar cantidad ADN disponible - Detectar secuencia nica - ObtenermolculasdeADNbicatenarioparaobtenerunasecuenciaconcreta,seprecisandos cebadores La reaccin de amplificacin consiste en la repeticin de un ciclo integrado por tres etapas: - DesnaturalizacindelADNmoldemediantelaelevacindelatemperaturaparaconseguirla unin de los cebadores. - Hibridacindecebadores:reduciendolatemperaturaseinducesuuninalaszonas complementariasdelADNdesnaturalizado.Traslaunindecadacebadorasusecuencia complementaria, se forma una estructura monocatenaria cebada, sustrato de las polimerasas. - Elongacin: llevando la disolucin a una temperatura adecuaday en presencia de un gran exceso molar de los cuatro dNTPs, la polimerasa elonga el sustrato cebado.5 5 3 3 5 35 388Para realizar la PCR se necesita: Molde de ADN que se quiere amplificar Cebadores: oligonucletido monocatenario de secuencia idntica a unacorta regin de cadaunadelasdoshebras,localizadasenlosextremosdelareginquesequiere amplificar. Polimerasa Tampn con Mg2+, imprescindibles para el funcionamiento de la polimerasa Ciclo 1

Se aumenta la temperaturaLos cebadores reconocen los extremosPolimerizacin, temperatura a 94C.temperatura ptima 50-60C. ptima 72C, la de la enzima. Depende del porcentaje de G/ C. 1000 pb /m Ciclo 2 Ciclo 3 Aumenta exponencialmente 20 ciclos 106 copias Se consigue el fragmento exacto que se quiereamplificarPaso 1: DesnaturalizacinPaso 2: Hibridacin Paso 3: Polimerizacin 99El producto mayoritario es un fragmento de ADNds cuyos extremos corresponden a los terminales 5 de los cebadores y cuya longitud est definida por la posicin de stos en la secuencia del ADN original. Durante la reaccin se producen otras molculas ms largas cuya concentracin en la mezcla no aumenta o lo hace de forma lineal. nicamente la concentracin del segmento limitado por ambos cebadores crece de manera exponencial, con lo que, tras varios ciclos de amplificacin, este producto es mayoritario.Latemperaturaeselparmetroesencialacontrolar,quehadesermuyaltaenlaprimeraetapapara asegurarladesnaturalizacin,sereduceenlasegundaparapermitirlauninaloscebadoresylams adecuada para el buen funcionamiento de la polimerasa sin que se afecte la integridad del moldecebado en la ltima etapa.10101111Caractersticas de las polimerasas a emplear en PCR: - Termoestable -Fidelidad: Tasa de error Taq polimerasa 10-4Tasa de error Pfu polimerasa 10-6 Limitaciones de la PCR: - Tenemos que conocer la secuencia a amplificar o las regiones flanqueantes - Lmite de tamao del fragmento a amplificar: unas 5-10 kb. Funciona mejor con 5 kb Diseo de cebadores5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5 Lalongituddelosoligonucletidoscebadoressueleserdelrangode15-30.cuantomayorseasu tamao,mayoreslaprobabilidaddequeseasocienasecuenciasnoperfectamentecomplementariasy conduzcan a la amplificacin de productos no especficos. Cuanto ms corto sea el cabador, ms perfecta tiene que ser su complementaridad con el molde y ms especfica ser la amplificacin, aunque su unin al molde es ms dbil y con menor rendimiento.La composicin de bases de los cebadores es importante por el efecto que tiene sobre la estabilidad del hbrido;loidealesquetenganun50%deGC.Sielporcentajeesinferiorinteresaunamayorlongitud, para evitar una baja temperatura de fusin. Debenevitarsesecuenciasconbasesrepetidas(msde3-4seguidas)paradificultarunionesno correctas. Hay que reducir la posibilidad de formacin de estructuras bicatenarias no productivas : - Intramoleculares: cebadores con estructura secundaria - Intermoleculares: cebadores parcialmente complementarios entre s. Desnaturalizamos 5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CACGACTGGGCAACG-5 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5 5-GATTTTGCAATCGGC-3Polimerizacin 5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5 5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5 Los cebadores han de estar presentes en la reaccin a una concentracin adecuada. Paralaamplificacindesecuenciasespecficasseutilizancebadoresespecficosderivadosderegiones conocidas que flanquean a la secuencia blanco. Cuando la secuencia es desconocida se utilizan cebadores arbitrarios.Los cebadores solapantes se empleanpara reducir la presencia de productos de amplificacin inespecficos;elresultadodeunaprimerareaccinesutilizadocomosustratodeunasegundacon cebadores ms cortos de secuencia idntica e incluida en la de los primeros.1212Aplicaciones de la PCR Obtencin de grandes cantidades de un fragmento determinado de ADN DeteccindeunasecuenciaconcretadeADNendiferentesmuestrasy/oenmuestras contaminadas Diagnsticodeenfermedades:Deteccindemutaciones,deleciones,insercionesygenes concretos.Lasdelecionesoinsercionespuedendeducirsedevariacionesdetamaodelos productos amplificados. Deteccin de patgenos:- Anlisisdemuestrasmicrobiolgicasbasadoenladeteccindesecuenciasespecficasde microorganismos utilizando cebadores especficos. - Deteccin de infecciones basado en la amplificacin selectiva de ciertas secuencias. Produccin de sondas Reconstrucciny amplificacin de ADN a partirde muestras degradadas, para realizar estudios evolutivos. Los fragmentos degradados sirven como cebadores para la PCR. Amplificacin de secuencias largas a partir de fragmentos de degradacin cortos. La PCR es capaz de regenerar piezas del ADN original de tamao mucho mayor. Teniendo en cuenta que los fragmentos de la muestra, resultado de la degradacin del ADN original, solapan unos con otros, las etapas de desnaturalizacin e hibridacininducir la formacin de hbridos con extremos 3 retrados que podran ser elongados por la polimerasa para generar fragmentos de mayor longitud. Este mecanismo se repite varios ciclos y el resultado es la recuperacin de largas molculas de bicatenarias a partir de pequeos fragmentos iniciales. As se han conseguido preparar grandes trozos de ADN de especies extinguidas, a partir de muestras de fsiles, permiten un estudio de la evolucin molecular. ConstruccindeunADNsintticoconcebadores solapantes ADNsintticoqueincorporalassecuencias de los 6 cebadores iniciales Se puede construir un gen sinttico mediante ciclos sucesivos de PCR a partir de oligonucletidos sintticos y solapantes, que se van aadiendo ordenadamente a la reaccin, actan como cebadores. Fragmento de ADN1313 Introduccin de modificaciones en las secuencias de ADN En los extremos (promotores, dianas de corte,)

Cambios en los extremos de la molcula Se introducen cebadores que incluyan en su extremo 5 la secuencia de una diana de restriccin ausente en la regin que se quiere amplificar. Aunque esta regin no hibrideconelmolde(comounapequeacola),la presenciadebasesnoapareadasenelextremo5no afectaalacapacidaddeolignucletidoparacebarla polimerizacin,enlossiguientesciclosdePCRla secuenciaextraresultaincorporadaysecrean molculasdedoblehebraquecontienenlasnuevas secuencias dianas en sus extremos.Paraexpresarelgenenotroorganismosecolocan promotores en el gen.- Mutaciones en puntos interiores (mutagnesis dirigida). Se trabaja con 4 cebadores, 2 terminales y 2 internos. Los dos cebadores internos son dos oligonucletidos sintticos, complementarios, que contienen en su interior la alteracin (sustitucin, delecin o insercin) que se desea incorporar. Su hibridacin sobre la hebra molde no es perfecta, pero la reaccin funciona. En la primera amplificacin se utilizan uno de los cebadores extremos y el interior de la hebra complementaria, generndose un fragmento que nace en un terminal de la regin y finaliza en la zona que incluye mutacin. En una segunda, la PCR se lleva a cabo sobre el molde cebado con el otro oligonucletido interno (portador de la mutacin) y el procedente del 2 extremo del DNA blanco; se consigue un 2 fragmento desde la zona central mutada hasta el segundo extremo de la secuencia blanco. Se purifican los fragmentos amplificados y se eliminan los cebadores y se mezclan ambos productos que se unen por la secuencia central mutada, presentan 3 retrado que puede ser elongado por la polimerasa hasta completar el molde. Finalmente, una tercera reaccin de PCR con los dos cebadores terminales conduce a la amplificacin de la secuencia portadora de la alteracin deseada, 1414- Modificacin de la secuencia: Deleciones

Amplificacin de de una parte de una secuencia del ADN mediante la utilizacin de cebadores de la regin interna, no terminales. Y de una manera ms amplia, en un conjunto de reacciones de PCR cebadas por una serie de oligonucletidos progresivamente desplazados (solapantes), se puede generar un conjunto de mutantes de delecin perfectamente definidos. Un cebador en una cadena y varios solapantes en la otra, tres cebadores que hibridan en tres regiones diferentes Obtencin ADN monocatenario - PCR asimtricaPermite la produccin de grandes cantidades de una determinada secuencia monocatenaria, para secuenciar.Se utilizan 2 cebadores a distinta concentracin (difieren en un factor de 100) la reaccin produce inicialmente fragmentos de ADNds, pero llega un momento en que el cebador limitante se agota; el segundo contina cebando la sntesis de una de las hebras. El resultado es la amplificacin de una secuencia de ADN ss en cantidad suficiente para el anlisis de su secuencia. El producto no sirve de molde y no se consigue tanto. Amplificacin secuencias desconocidas - PCR inversaEn los siguientes ciclos se amplifica

1515SerealizaunadigestindelADNorigenconunaenzimaderestriccinquenopresentedianasenla regin conocida, ligado (ligasa) intramolecular de los fragmentos producidos para que formen crculos. A partir de ah se realiza PCR utilizando dos cebadores diseados a partir de la regin de secuencia conocida y apuntando hacia las regiones adyacentes. La polimerasa acta sobre la molcula circular que contiene la reginconocidayamplificarunfragmentolinealconorigenyfinalendichazonayqueincluyelas secuenciasquelaflanqueabanenelADNoriginal.Launinentreestasltimasquedamarcadaporla presencia de un sitio de restriccin para la enzima usada en la digestin. Los dos fragmentos obtenidos se amplifican con PCR. RT-PCR:amplificacindesecuenciasdeARNpor retrotranscripcin y PCR.DeteccindemolculasdeARN,clonajedeADNcdeun mensajero,construccindebibliotecasdeADNc,obtencinde material para anlisis de secuencia. Amplificamos usando como molde ARNm Mtodo1:Usodeoligo(dT),seunealacolapoli(A)dela mayoradelosmensajeroseucariotas,seconsiguelaamplificacin delasecuenciacompletadelosARNmquellevenlacolapoli(A). Se construye una cadena de ADN. Hbrido ARN : ADNAmplificacin de todos los ARNm de una mezcla Se aade ribonucleasa H que degrada ARN, dejndola actuar un tiemposinquedestruyatodoelARNparaastenercebadorescon los que la polimerasa pueda sintetizar la cadena complementaria. Mtodo2:Usodeoligoespecfico,permitelaamplificacinde un ARNm especfico entre una mezcla. No hbrida en cola poli (A), sinomsadelante,nohacefaltaRT-PCR.Seconstruyeuncebador delARNmlapolimerasaelongacadenadeADN,seconsigueun hbrido ARN-ADN que se desnaturaliza y en el 2 ciclo se tienen los doscebadoresespecficosparalasdoscadenas.Nosedegradael ARN,nomolesta,seamplificaelADNbicatenario.Lacantidadde producto por PCR es proporcional a la cantidad de ARNm que hay. Aplicaciones de las ADN polimerasas: Secuenciacin Determinacin de la secuencia de nucletidos de un fragmento de ADN PartimosdeADN1c(unicatenario).Dosmtodos.Obtencindecoleccindefragmentosque comparten un mismo extremo 5, pero difierenen su extremo 3 1616Mtodo de Maxam y Gilbert (rotura qumica del ADN)Marcaje de la cadena a secuenciar. Se tienen muchas copias de las cadenas que se quieren secuenciar, que se marcan radiactivamente en extremo 5. Se preparan cantidades en alcuotasy se someten a cuatro tratamientos qumicos: En cada muestra se elimina una determinada base, y luego se produce hidrlisis, la molcula se rompe porellugardondeseproducelamodificacin.Elmarcajeradiactivoseobservaen5.Serealiza electroforesisengeldepoliacrilamida,encallesdistintas.Aparecelaprimerabanda,fragmentoms grande en G+A pero no en G por tanto el nucletido es A. Se sigue secuenciando. Mtodo de Sanger (amplificacin enzimtica del ADN) G G + A C + T C 1717Sntesis enzimtica del ADN Secuenciamos la cadena complementaria Uso de ddNTPs: paran la reaccin, la polimerasa los reconoce y los coloca en la cadena sin problemas y ya no plimeriza ms.Se marcan radiactivamente. 4reacciones:mezclade4dNTPsms una pequea cantidad de ddATP. Cada vezqueentraunddATPlacadenase paraycomoestmarcada radiactivamente se puede detectar. Estemtodoeselmsutilizadoy ha permitido la automatizacin. ojo!Estescritaalrevs,seleede5 a 3 AutomatizacinMarcajedecadaddNTPconunfluorforodistinto,darcoloresdistintosenundetectorde fluorescencia.Sehaceunasolareaccinconlos4ddNTPs,lacadenaacabaenuncolorquerepresenta una base. Se realiza una electroforesis capilar, que se coloca delante del detector de fluorescencia, se transfieren los datos a un ordenador que dar un cromatograma. Semezclaelmoldeconelcebador,ddNTPs,ypolimerasa.SehacenvariosciclosdePCRyse amplifica una sola cadena. Enzimas de modificacin de extremosAaden o eliminan grupos de los extremos 5 3 1818 Fosfatasa alcalina Eliminacin del grupo fosfato 5 en ADN y ARN Usos:- Eliminacindefosfatosen5,parasusustitucinporfosfatosmarcadoscon 32Pmediante reaccin con quinasa. - Eliminacinderestosfosfatodelosterminales5defragmentosdedsADN,paraimpedirsu dimerizacin, polimerizacin o circularizacin. Polinucletido quinasa T4 (PNK) Cataliza la transferencia de un fosfato del ATP a un extremo 5 de ADN y /o ARN Se usan en: - Eliminacin / adicin de fosfatos dependiendo de las necesidades de clonacin - Sustitucin del fosfato 5 por grupo fosfato marcado (P32): Marcaje de ADN y/ o ARN Transferasaterminalodesoxinucleotidilterminal tranferasa CatalizalatransferenciadedNTPsalextremo3-OHde molculasdeADN(ssds).SimilaralapolimerasaperoNO COPIAMOLDE,aadenucletidosalazar.Noseconsiderauna polimerasa. Se utiliza en: - Laobtencindehomopolmerosenlosextremosdeuna cadenaparagenerarextremoscohesivosdesecuencia conocida. Contando el tiempo de reaccin se puede conocer los nucletidos aadidos. - Marcaje de los extremos 3 Poli(A) polimerasa IncorporaresiduosdeAapartirdeATPalextremo3deun ARNss, creabdo una cola poli(A) Se utiliza en: -Marcaje de ARN y en adicin de colas poli(A) a mensajeros como paso previo a la obtencin de ADNc LigasasEnzimasquecatalizanlauninentredosextremosdeADN.RequiereenergaenformadeATP NAD. Requiere Mg2+Papel in vivo: unin de muescas (replicacin /reparacin) - Una molcula lineal se puede unir quedando circular- Dos molculas lineales con extremos compatibles se unen formando una sola molcula - Unin de muescas durante la replicacin /reparacin, une covalentemente dos nucletidos Ligasa de T4 1919Cataliza la unin de extremos compatibles de dos molculas de ADN o de los extremos de una misma molcula. Ms difcil, las molculas deben chocar y Se forma un apareamiento no permanente,encontrar la ligasaporque queda una muesca en cada cadena, laligasa la encuentra. Es ms fcil, ms eficientey ms rpida. Requisitos: Extremos compatibles Extremo 5 a unir debe estar fosforilado por lo menos en una de las cadenas, solo es necesaria la fosforilacin en una cadenaSi la molcula es grande se puede hacer circular y para evitarlo se alteran los extremos 5 conservando losfosfatosenunadelasmolculasyeliminandolosde laotra.Sedesfosforilalamolculamsgrande para evitar que se circularice. 9 Extremos de los fragmentos a unir - Extremos cohesivos generados con la misma enzima Recuperamos la diana de corte.- Extremos cohesivos generados con enzimas diferentesNo siempre recuperamos la diana de corte - Extremos romos No siempre recuperamos la diana de corte 9 Modificacin de extremos para generar extremos compatibles - Conversin de extremos cohesivos en romos Eliminacindereginmonocadena:exonucleasasespecficadecadenasencillaque eliminanucletidoanucletidohastallegaralazonadecadenabicatenaria.Nose recupera la diana de corte. Relleno de extremos: polimerasas + dNTPs. Sintetiza lo que falta. Slo si tenemos 5 protuberantes!. Se recupera la diana de corte. - Conversindeextremosromosencohesivos: consisteenlaconstruccindeunaregin homopolimrica en los extremos 3 de un ADNds Homopolmerosterminales:Transferasa terminal.Seformaunacolapoli(G)yotra poli( C ) Extremos romosExtremos cohesivos2020 Linkers:cortassecuenciasADNdsdeextremosromoscondianasparaenzimasde restriccinqueproducenextremoscohesivos.Sepuedensintetizarytenergrandes cantidades.Unagranconcentracinfacilitalaunin.Serequierecortarconenzimas de restriccin.

Adaptadores:PiezascortasdeADNdsconextremoscohesivoscorrespondientesa dos enzimas diferentes. No requiere corte Pueden fabricarse con dos oligonucletidos Pueden fabricarse uniendo dos linkers y cortando despus Modificacin de extremos para favorecer /evitar la ligacin Fosforilacin de extremos 5 - Polinucletido quinasa - Unin de linkers /adaptadores construidos con oligonucletidos sintticos - Ligacin de productos de PCR Desfosforilacin de extremos 5 - Fosfatasa alcalina - Evitar autoligacin de los extremos de una misma molcula de ADN Dos extremos cohesivos GATCCGGCCG GCCGGCTTAA EcoRI BamHI Un extremo romo y otro cohesivoGCCGGCTTAACGGCCGCCGGATCCGGGGCCTAGGCCLinker CCGAATTCGG GGCTTAAGCC Linker CCGGATCCGG GGCCTAGGCC CCGAATTCGG GGCTTAAGCC GATCCGGCCG GCCGGCTTAAEcoRI BamHI 2121Clonacin de ADN recombinanteClon:conjuntodeclulasderivadasdeunanicaclulaprogenitoray,porlotanto,poseedorasde idntico contenido gentico. Clonar un ADN significa aislar y disponer de una clon de clulas portadoras de una misma molcula de ADN recombinante.Aplicaciones: - Aislamiento y amplificacin de secuencias gnicas - Estudio de regiones genmicas medias y grandes, y de genomas completos - Produccin de protenas y otros compuestos Lasecuenciaqueinteresaclonarsecorta conlaenzimaderestriccinadecuadaose amplificaconPCR.Luegoseunaaunvector que es el que permite integrar el insertoen otro organismo. El vector es el ADN recombinante. Luegosecultivanlasclulasyseobtienen muchas copias del inserto. PararecuperarelADNrecombinantese rompen las clulas hospedadoras. Lasclulashospedadorasofrecentodoslos sistemas genticos y bioqumicos y actan como unlaboratorioespecializadodondesellevaa cabo el proceso diseado. La clonacin implica: Mantenimiento dentro de la clula Transferencia a la descendencia Amplificacin (aumento del n de copias), en cada clula puede haber cientos de copias del ADN recombinante Expresin del ADN clonado, que se pueda transcribir y traducir el gen clonado Tres elementos clave en clonacin: Inserto (ADN a clonar) Vector Clula hospedadora Inserto o ADN pasajero Puedeserunnicofragmentoounacoleccindesecuencias,formanpartedelasgenotecas.Se obtiene: - Por digestin con endonucleasas de restriccin- Digestin con endonucleasas de restriccin - Producto de PCR - ADNc, en eucariotas a partir de un mRNA 2222 Clula hospedadora Debeaceptarlamolcularecombinantesinafectarsuintegridad,ypermitirquesemantengaestable en sus descendientes.La clula ms utilizada es Escherichia coli, es un organismo modelo, se han realizado mucos estudios yseconocecasiperfectamente;tienefcilyrpidocrecimiento,losmediosdecultivoutilizadosson sencillos(Carbono,Nitrgenoysales).Sedividecada30-40minutos.Existeunagrancoleccinde mutantes. Nosinteresanmutantesdeficienteenrestrictasasyrecombinacinparaquenodestruyanelvectory para evitar que el vector se integre en el cromosoma bacteriano y no pueda manipularlo. Tambinseutilizanotrasbacterias(gram-positivasygram-negativas).Avecesinteresaexpresarel gen en el mismo organismo del que se extrae el inserto.Eneucariotasseutilizanlevaduras,Saccharomycescerevisiae,simpleyunicelular,sedividecada3 horas.Plantas, clulas aisladas o plantas completas. Lneas celulares animales (cultivos in vitro), tiles para trabajo con genes de organismos superiores y terapia gnica. Embrionesanimales,fuenteparalaobtencindeindividuostransgnicos,deintersparael conocimiento de la biologa de organismos superiores. Mtodos de introduccin de ADN en las clulas9 Transformacin Captacin de ADN desde el medio extracelular Tratamiento con compuestos qumicos para alterar la envuelta, provoca poros, se da choque trmico, la temperatura aplicada depende del organismo receptor.Las clulas tratadas qumicamente alterando su envuelta se denominan clulas competentes. Si se introduce ADN procedente de virus (sin encapsidar) hablamos de transfeccin 9 Infeccin Usamos un virus (partcula vrica) para introducir el ADN dentro de la clula, normalmente animales. 9 Electroporacin Uso de descargas elctricas para alterar la envoltura 9 Transfeccin con ADN precipitado con fosfato de calcio Forma clsica de introducir ADN en clulas eucariotas en cultivo, el ADN est unido al precipitado y la clula lo endocita. 9 Lipofeccin ADNensolucinseacomplejaconvesculasformadasporlpidoscatinicos(liposomas).Los liposomas se fusionan con la membrana plasmtica.Se usa en clulas animales en cultivo, protoplastos (clulas sin pared) de levaduras o clulas vegetales9 Microinyeccin Usamos un aguja /pipeta muy fina para inyectar el ADN directamente dentro del ncleo, normalmente en ovocitos de anfibio y embriones 9 Biolstica Bombardeamos las clulas con pequeos proyectiles de oro o tungsteno que tienen adherido el ADN. Eficaz en clulas de pared o envoltura fuerte (clulas vegetales), para no destruir el tejido. Vector Molcula de ADN,generalmente de pequeo tamao, con caractersticas (y /o secuencia) conociday capacidaddereplicacinautnoma.Generalmentebasadosenplsmidosbacterianosogenomasvricos. Capaces de recibir al inserto y en el interior celular es capaz de hacer que el hospedador lo replique y de que sus copias se repartan correctamente entre las clulas descendientes. 2323Se puede dividir en dos grandes grupos: Vectores de clonacin /propagacin: solo mantienen y propagan el inserto de inters. Vectoresdeexpresin:poseenloselementos/sealesnecesariosparalatranscripciny traduccin del inserto en la clula hospedadora. Estos elementos deben ser funcionales. - Podemos clasificarlos segn: Origen (procariota /eucariota) Tipo de molcula (plsmido, virus, cromosoma artificial, etc) Tamao del inserto que puede incorporar Tipo de clula donde puede replicarse y /o expresarse Tipo de marcador de seleccin Caractersticas de un vector- Origendereplicacin:debetenerunorigendereplicacin(reginori)queseaactivoenla clulahospedadora.Permitelareplicacindentrodelaclulahuspedyelcorrectorepartode copiasentrelasclulashijasosupropagacinporinfeccin(casodelosvirus).Defineel organismo /s utilizable /s como clula hospedadora.- Marcadordeseleccin.Permitedistinguir/seleccionarlasclulasquecontienenelvector.Los ms utilizados son genes de resistencia a antibiticos. Confiere una cualidad especial a la clula. - Sitiosdeclonacinmltiple(MCSopolylinkers).Cortassecuenciasquecontienenmltiples dianas de restriccin de corte nico en el vector, donde se coloca el inserto. - Marcadores de seleccin adicionales. Que permitan la deteccin/ seleccin de los recombinantes. - Sealesdetranscripciny/otraduccin.Enelcasodevectoresdeexpresin.Debenser funcionales en la clula hospedadora. Tipos de vectores- Derivados de plsmidos (bacterianos, de levaduras, de plantas) - Derivados de virus (bacterianos, animales o de plantas) - Deorigenmixto,compuestosporpiezasdediferenteorigen.Conmsdeunorigende replicacin - Cromosomas artificiales Vectores para el clonaje en Escherichia coli Vectores plasmdicosLos plsmidos son estructuras adaptadas al entorno celular, disponen de las seales precisas para que la maquinaria celular lleve a cabo su replicacin y particin y la expresin de sus genes. La posibilidad de introducirensumolculaunfragmentodeADNextraodemaneraquenoseveanafectadasesas funciones esenciales permite disponer de un vehculo de clonaje en bacterias.PlsmidoesunamolculacirculardeADNbicatenariodepequeotamao.Enbacteriasyalgunos eucariotas. Admiten insertos de unas 10-15 kb. Utilizan la maquinaria celular para replicarse. -Replicn:regindondeseproducenlasinteraccionesconloselementosreplicativos,yes responsabledelmantenimientodelplsmidoenlaclulahospedadora.Normalmentelosplsmidos presentan un nicoreplicn. El replicn incluyeel origen de replicacin (ori)y los elementos decontrol que actan en cis.El tipo de replicn define: Grupodeincompatibilidad:Plsmidosconrepliconesidnticosorelacionadosson incompatibles N de copias del plsmido: - Plsmido de replicacin estricta: 1-5 copias clula- Plsmido de replicacin relajada: 15-20 copias clula Rango de hospedador: especie /s donde puede replicarse 2424 pBR322: Tiene4363pb,ledabuenacapacidaddetransporte, ms de 10 pb. Contiene genes de resistencia a ampicilina (ampR) y a tetraciclina (tetR) No tiene MCS Contieneotrasdianasderestriccinrepartidas, algunasdentrodelosgenesderesistencia.Esto permiteunainactivacindelaresistenciapor insercin de un fragmento de ADN en esa zona. Unas 20 copias por clula.

Permite inactivacin por insercin, Si introducimos un inserto en una diana interna de uno de los genes de resistencia, se pierde la resistencia correspondiente. SiseinsertaenelgentetRlasclulasobtenidaspodrnsertetS-ampRytetR-ampR.Sisesiembranen cultivoconampicilinacrecerntodaslasclulasquehayansidotransformadas.Sisehacencrecerestas coloniasenunmediocontetraciclinasolocrecernlastetR,ysepuedenrecuperardelaplacacon ampicilina.LaincorporacindelinsertoenelsitioBamHIdelvectorlinealinactivalafuncinde resistenciaatetraciclina,perosilaligasalosuneyrecircularizaelgentetRserecomponeylasclulas transformadas sern resistentes. 2525 Vectores serie pUC El rendimiento conseguido en la transformacin de un cultivo bacteriano es inversamente proporcional altamaodelADNqueseintentaintroducir.Cuantomenorseaelvectormayorespacioquedaparael inserto. Por ello se eliminaron secuencias superfluas. Eliminacindesecuenciassuperfluas:Menortamaodelvector(2,6-3,2kb),Mayortamaodel inserto (ms de 12 kb) PoseenunMCS,permiteelegirentrediferentesenzimasderestriccinypermiterealizarclonacin direccional.El clonaje direccional, dondeel vector tiene MCS asimtrico,le permite recibir insertos con diferentestiposdeextremos,inclusohaciendousodedosdianas,sepuedelograrlainsercindelADN extraoenunaorientacinnicayforzadaalmismotiempoqueseevitalaposiblerecircularizacindel ADN vector.9 Deteccin de recombinantes mediante color (identificacin cromognica) Esta serie de vectores se ha dotado de un sistema gnico que permite distinguir clones transformados porADNrecombinantedelosquehansidotransformadosporvectorrecircularizado.Estesistemaesel Opern lac.ElopernlacdeE.colieselresponsabledelcatabolismodeldisacridolactosa.Esunaunidad transcripcional compuesta por tres genes estructurales (lacZ, lacY y lacA).LacZ codifica la enzima -galactosidasa, cataliza la hidrlisis de glucosa y galactosa de la molcula de lactosa;tambinescapazdehidrolizaranlogoscomoX-gal,compuestoincoloroperosuhidrlisis conduce a un producto de color azul. Elsistemapresentaunaregulacinnegativainducibleporsusustrato(lactosaoanlogos,como IPTG). La regin reguladora del opern est compuesta por un promotor (Plac) para la unin de la ARN-polimerasa,yunoperador(Olac)secuenciaquesolapaconelpromotoryalaqueseunelaprotena represora codificada en el gen lacI. Enausenciadesustrato,laprotenarepresoraseunealoperadoreimpidelaaccindelaARN-polimerasa;peroelsistemaseinduceporlapresenciadeunsustratoqueseunealaprotenarepresora inactivndola y permitiendo la transcripcin del opern.EnunaestirpenormaldeE.coli,elanlogoIPTGinducelasntesisde-galactosidasa,porloque cuando crece en un medio con X-gal produce colonias azules. lacZ (-galactosidasa) Degrada lactosa en glucosa + galactosa 2626HayestirpesmutantesincapacesdedegradarlactosaporqueelgenlacZnoseexpresaoporquesu producto no manifiesta actividad -galactosidasa, estas estirpes producen colonias blancas cuando crecen sobre X-gal. Una de estas mutaciones (M15) presenta una delecin en lacZ Enpresenciadeunpptido()procedentedela expresindelosprimeroscodonesdelgenlacZ, idnticoalareginN-terminaldelaprotena completa,laprotenadefectuosarecuperasu actividad-galactosidasa.Ambospolipptidosse unenparaformaruncomplejoenzimticamente activo.El sistema incorporado a la serie pUC es un fragmento de ADN del cromosoma de E.coli que contiene el comienzo del opern lac, las regiones reguladoras (promotor y operador) y el comienzo del gen lacZ (la regincodificadoradelpptido).InducidoporIPTGseexpresarpptidoquellevaacabola complementacinsobre-galactosidasadefectuosa.CuandolascepasmutanteslacZM15son transformadas por un ADN que contenga este sistema, crecern en un medio con IPTG y X-gal formando colonias azules. Se expresa en C-terminal -galactosidasa inactiva Expresin fragmento N-terminal lacZ Mutantes M15 Complementacin -galactosidasa activa Degradacin de X-gal: color azul! 2727Complementa mutante M15 MCS est dentro de lacZ Deteccin plsmido pUC Resistencia a ampicilina En medio con X-gal: Color azul!!! Colonias azules: vector sin modificar Colonias blancas: plsmido recombinante Vectores basados en bacterifagos 9 Fago ADN bicatenario de 49 kb. Infecta a E. coli Dos tipos de ciclo: - Cicloltico:replicacindelfago,lisisy liberacin departculas vricas - Ciclolisognico:elADNseintegraenel cromosomadelabacteriaypermanece dormido hasta induccin de ciclo ltico En las calvas de lisis hay ADN que se purifica

Formas del ADN de : - Forma lineal (dentro de la cpsida):en las regiones terminales presenta extremos 5 protuberantes, formadosporsecuenciasde12nucletidos,monocatenariasycomplementariasentres,son cohesivos; son sitios cos- Forma circular cerrada (forma integrativa) debido a la asociacin de los sitios cos.Concatmeros lineales (tras replicacin; sustrato para empaquetar el ADN) Se empaqueta cualquier fragmento de 37-52 kb de ADN flanqueado por secuencias cos.Organizacindelgenomade:losgenesquecodificanfuncionesrelacionadasseencuentran agrupadosy se transcriben simultneamente. Para el ciclo ltico completo solo esnecesario la regin de lasprotenasdelacpsideylaregindeprotenasderegulacin.Laregindeintegracinpuedeser sustituida por el ADN que se quiere clonar. Calva de lisisRegin no esencial2828 Vectores de insercin Hemos eliminado parte de la regin no esencial. Los puntos de corte generan dos fragmentos llamados brazos Introducimos un sitio nico de corte. Puede realizar el ciclo ltico. Tamao del inserto: unas 8 kb como mucho Seleccin fagos recombinantes: - Punto de corte en gen cI (gen represor de lisis). Si se colocaelinsertoenmediodecIsiemprerealizarel cicloltico,calvasclaras.SiniserompecIsevern calvasturbias,porquerealizaelciclolisognicoy ltico. Recombinantes producen clavas ms claras. - FragmentolacZconsitiodecorte.EnX-galdar calvas azules Vectores de sustitucin - Sustituimos toda la regin noesencial por un ADN de relleno - Cambiamos el ADN de relleno por nuestro inserto - Podemosincluirsistemasdeseleccindentrodel ADN de relleno - Tamao del inserto de hasta 22 kb - Nopuedenproducirlisogenianiintegrarseenel genoma, pero tampoco nos interesa Uso de la forma circular cerradaIgual que si fuera un plsmido. Transfeccin,unavezenlaclulase comporta como un virus. Uso de la forma linealSecortaelADNvricoysecolocaelinserto,seforman concatmeros,seintroducenlasprotenasdelacpsideyla purificada.Empaquetamientoinvitro.Seseleccionaeltamao paraelempaquetamiento,steseharcuandohayabrazo izquierdo-inserto-brazo derecho. Una vez empaquetado se infecta la clula. 2929 Csmidos Vectores derivados del fago . Combina caractersticas de plsmido, replicnmnimoparalareplicacindecopias,ydefagolassecuencias cosparaempaquetar.Elempaquetadoesnecesarioparaintroducirloen la bacteria,porque es un plsmido muy grande. Plsmidoquecontienesitioscosde.Necesariosparala encapsidacin. Empaquetamos in vitro con cpside de y producimos infeccin. Dentro de la bacteria se comporta y replica como un plsmido Ojo: Aislamos colonias, no calvas!!!! Podemosclonarenelloshasta46-47kb,peroparaencapsidarlono puede tener ms de 37-52 kb Seleccionamos en funcin de los marcadores que tengamos en el plsmido 9 Vectores basados en M13 M13esunfagofilamentosodeE.coli.ADNmonocatenario.Infectaatravsdelospili.ElADNes linealdentrodelacpsideperounavezdentrodelabacteriasehacebicatenarioycircular,eslaforma infectiva, es la que sintetiza las protenas de la cpside, solo copias de una cadena, luego sale de la clula, no provoca lisis, la clula ralentiza su crecimiento. El tamao no es restrictivo en este fago: a mayor cantidad de ADN, mayor se hace la cpside. Insertos de 8-10 kb pueden ser inestables. Podemos aislar la forma replicativa y manipularla como si fuera un plsmido. No podemos eliminarle genes, ya que todos son imprescindibles. Introducimos inserto en regin intergnica II-IV III-VIII. La volvemos a introducir en la bacteria y prosigue el ciclo. El ADN que podemos obtener de la clula es bicatenario, si lo conseguimos una vez que el fago ha salido el ADN ser monocatenario. F-pilus FDNAM133030 Fagmidos Plsmido que posee la regin del fago M13 que contiene el origen de replicacin. Ms eficiente en la replicacin al ser un plsmido y admite insertos ms grandes No puede empaquetar por si solo en el interior celular, necesita de un fago M13 ayudante.Se infecta la bacteria con las dos partculas, pero se obtienen dos partculas diferentes, unas tendrn el insertoyotraselADNdelayudante.Secreaunayudantemutante,quesoloproduzcaprotenasdela cpside .9 Cromosomas artificiales de bacterias BACs Basados en el plsmido F de E. coli (contienen su origen de replicacin) Permiten clonar unas 300 kb 9 Derivados del fago P1 Similar a Podemos empaquetar en su cpside hasta 125 kb 9 Cromosomas artificiales derivados de P1 Combinan caractersticas de los BACs y P1 Hasta 300 kb 9 Fsmidos Similares a los csmidos. Contienen el origen de replicacin de F Menor n de copias que los csmidos. Ms estables En todos estos caben ms kb para clonar y tienen un origen de replicacin especial. 3131 Vectores plasmdicos para expresin de protenas en E. coliVectores de clonacin que poseen seales de transcripcin y traduccin funcionales en E. coli TranscripcinReginpromotora:promotor+ secuencias reguladoras (5) TerminadorTraduccin- RBS sitio de unin al ribosoma - Secuencia Shine-Dalgarno (SD) - ATG: sitio de inicio, codifica Met - Secuencia de stop 3232Regiones promotoras en E.coli - Fuerza del promotor (P): depende de la afinidad por la ARN polimerasa.- Mecanismoderegulacin(operador,op):paracontrolarcuandoycuantoexpresamos,esmuy importante. - Dependiendo del promotor se tendr ms o menos expresin y esto depende de la afinidad por el mecanismo de transcripcin. - Promotores hbridos funcionan mejor que los originales Regulado por represor lac y CRP Reguladoporrepresor trp.Ms fuerte quePlac

Permite regulacin por T SlosetranscribeporlaARNpolde T7 Mutante lac no sensible a CRP HbridosentrePtrcyOlac.Fuerte expresin regulado por represor lacTerminadores en E.coliNosonimprescindibles,peromejoranlaexpresin.Seusanterminadoresdegenesconocidos(rrnB ARNr 5S de E.coli)Transcritos muy largos pueden afectar a la replicacin del plsmido y disminuir la expresin Gen rrnB ARNr 5S E. colitL y tR de los genes tempranos de fago RBS sitio de unin al ribosoma Importanteparalauninrpiday eficiente del ribosoma Secuencia S-D: variaentre 3y9 pb.No muy conservada No esta presente en genes eucariotas 33339 Tipos de secuencias a expresar - Regiones /genes procariotas que contienen sus seales nativas o Regin promotora, terminador y RBS propios o Clonamos toda la unidad transcripcional en un plsmido de clonacin tpico - Regiones /genes procariotas que tienen regin promotora mala El promotor es muy dbil, no tenemos buena regulacin o carece de promotor y /o mecanismoderegulacin.ElinsertocontieneelRBS,laORFyelcodonde STOP Utilizamos un vector que posee las seales de transcripcin adecuadas y un MCS Realizamosunafusintranscripcionalentrelassecuenciasdelvectorylasdel inserto - Regiones /genes que no poseen buen RBS o carecen de RBS El vector contiene el RBS (secuencia SD + ATG) Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con el ATG del vector Fusin traduccional entre las secuencias del vector y las del inserto Regulacin de la expresinLa mayora contienen el operador del opern lac : regulacin por represor de lac (lacI)Ojo: Tenemos el plsmido en alto/ medio n decopias : represor limitante!. En una clula normal en estado natural, hay pocas molculas de represor, stas solo regulan una o dos copias del opern.Dos estrategias: Estirpes de E. coli que sobreexpresan el represor lacIq, de forma constitutiva. El plsmido contiene el gen lacI bajo el control de promotor constitutivo. Si tenemos un vector conelpromotor,eloperadorylaprotenaXquequeremosexpresar,luegotieneresistenciaa ampicilinaqueseleeenunadireccinyelrepresorlacIqueseleeendireccincontraria, reprimiendo a lacI la protena se expresa. - Control de la expresin: IPTG, es un anlogo de lactosa que la bacteria no puede degradar.ElIPTGseunealrepresor,peronosedegrada,porlotantolacantidaddeprotenaproducidaes proporcional a la concentracin de IPTG aadida. 3434 Vectores con seales de transcripcin Los usamos para genes que poseen un buen RBS Elplsmidoproporcionalareginpromotora,seguidadeun MCS y un terminador pKK177-3

Algunos vectores posee secuencia SD justo antes del MCS: podemos clonar solo la ORF Vectores con sitio de clonaje inmediato a un ATG Genes que no poseen buen RBS o carecen de l (genes eucariotas) El ATG est codificado en el vector, y el sitio de clonacin solapa con el ATG NcoI CCATGGNdeI CATATGFusin traduccional pTRC99a Expresamos la protena nativa Podemosusarcualquierotrositiodeclonacin,peroentonces laprotenaqueseexpresetendrmsaminocidosenelN-terminal Cuidado con la fase de lectura!!! 3535- Ejemplo de fusin traduccional para expresin Queremos expresar el gen eucariota Shv en E. Coli. La secuencia del ADNc es: TenemoselplsmidodeexpresinpORF,contresvariantesquedifierenenlapautadelecturadel sitio de corte EcoRI EnquvariantetendramosqueclonarelADNcdigeridoconEcoRIparaqueseexpresara correctamente Shv? Pauta de lectura correcta!! Codon de STOP antes de llegar al inicio de Shv Pauta de lectura incorrecta: se sintetiza un pptido de secuencia diferente a Shv 3636Produccin de protenas de fusin - Expresin in vivo de una protena hbrida obtenida por fusin traduccional de dos ORFs - El vector proporciona las seales reguladoras y una ORF con un MCS - Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con la ORF presente en el vector - Podemos tener: ORFdelvector::ORFdeinters.ElgenseclonaenelMCSylaprotenaresultante estarenN-terminallaprotenadelvectoryenC-terminallaprotenaclonada.(P-ORFvector-MCS) ORFdeinters::ORFdelvector.LaN-terminalestarlaprotenaclonadayenC-terminal la protena del vector (P-MCS-ORFvector) Ventajas o inters del uso de protenas de fusinMuchas protenas eucariotas son ms estables si las expresamos fusionadas a una protena de E. coli, si nosonestableslasprotenasdegeneranoseacumulanenbloquesdeinclusinynosepuedenrescatar, pero fusionadas con protenas de E.coli se vuelve estable. La protena resultante conserva las actividades de ambas protenas: deteccin fenotpica Facilitalapurificacindelaprotenadeinters:cromatografadeafinidadosecrecinalmedio extracelular Fcilesdedetectareidentificarenunamezcla:grantamaoyexistenciadeanticuerposcontrala protena del vector. Fusin traduccional: ojo con la pauta lectura!! Existe una seal de proteolisis especfica en la secuencia frontera entre las dos protenas, hay proteasas que reconocen una secuencia concreta y separan las protenas.3737Purificacin protenas de fusinCromatografa de afinidad Exclusin por tamao. Esquema general de preparacin de protenasnativasmediantela expresin de un producto de fusin, su purificacin por retencin por afinidad y su rotura endoproteoltica. Ejemplos de protenas de fusin para purificacin Sistema del apndice /cola de histidina Incluye un conjunto de vectores: Derivados de Pbr322: con ori ColE1 y gen de ApR Promotor fuerte que reconoce la ARN-polimerasa de E.coli Operador lac duplicado, para asegurar una represin eficaz RBS bacteriano Codones de stop en los tres marcos de lectura Dos fuertes terminadores de la transcripcin Un MCS colocado en todos los marcos de lectura entre los distintos vectores Secuenciacodificadorade6residuosdehistidinaparalasntesisdelapndice (tag) Laprotenaexpresadallevarunapndicede6histidinasenlosextremosNoC-terminal.ParaN-terminal,secuenciadeunvectortpico;paraC-terminal,semodificalapautadelectura,dondecodifica prolina, para que codifique histidina. Fusionamos nuestra protena a una secuencia de 6 histidinas,La histidina tiene afinidad por el nquel. Purificamos con resina cargada con Ni2+Elumos con tampn que contenga imidazol, ste es un anlogo de la estructura de histidina No suele afectar a la actividad de la protena y muchas veces no se elimina 3838 Sistema de la GST GSTeslaenzimaglutatinS-transferasa.La reginN-terminaldelaprotenadefusin correspondealaGST,capazdeserretenidaen columnasdeglutation-Sepharosayeluidacon glutation reducido. Purificamos con resina que contiene glutatin.Elumos con glutatin reducido. LosvectoresdelaseriepGEXcontienenel promotorPtac,laregincodificadoradelaGST consuRBSinterno,lasecuenciaquecodificala seal de endopeptidasa y un pollinker. Sistema de la MBP MBP es la protena de unin a maltosa. LaprotenadefusinllevaensumitadN-terminallaMBP; esretenidaencolumnasdeagarosa-amilosayeluidacon maltosa. Purificamos con agarosa-amilosa. Elumos con maltosa. LosvectorespMALllevanelpromotorPtac,elRBSyla secuencia codificadora del gen malE que codifica a la MBP, una reginespaciadoraquecodifica10residuosdeasparagina(para aislarconformacionalmentelasdosmitadesdelaprotenade fusin), una secuencia que codifica una seal de reconocimiento paraunaendopeptidasayunpolylinkerqueinterrumpeelgen lacZ (lo que permite detectar recombinantes sobre X-gal) 3939Algunos problemas /limitaciones de la expresin de protenas en E. coli- Toxicidad de la protena: Podemostrabajarconunplsmidodemenornmerodecopiasointegrarelgenenel cromosoma - Efecto del uso de codones La frecuencia de uso de codones sinnimos es diferente en cada especie La cantidad de ARNt para codones de baja frecuencia es limitante. Se han construidos estirpes de E. coli con ARNt raros y son capaces de expresar protenas con codones que normalmente no expresan. Siaparecencodonesrarosbajalavelocidaddelatraduccinyempiezanaaparecer fallos - Plegamiento incorrecto de la protena: E. coli no posee todas las chaperonas necesarias. Silaprotenanosepliegabienseformanagregadosinsolubles:cuerposdeinclusin, no se pueden purificar. Podemos disminuir la velocidad de crecimiento o inducir la sntesis de chaperonas. Al disminuirlavelocidaddecrecimientolasntesisdeprotenasesmslentaysevan plegando a medida que se van sintetizando. Hay mutantes que expresan chaperonas.- Modificacin post-traduccional. Algunas protenas requieren ser modificadas tras la traduccin para ser activas. Podemos introducir los genes de las enzimas modificadoras en E. coli o bien expresar la protena en el tipo celular adecuado 40Vectores para clonaje en bacterias diferentes de E. coliBacterias de inters: Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces (antibiticos), etc Utilidades: hay que modificarlas - Degradacin de compuestos - Descontaminacin de suelos - Produccin industrial de enzimas y /o antibiticos Dificultades:- Poca eficiencia en la introduccin de ADN - Falta de mutantes que carezcan de sistemas de restriccin - Limitacionesenelndevectoresreplicativosymarcadoresdeseleccin.Elorigende replicacindefinelabacteriaenalquesepuedeclonarelvector;nohayningnorigende replicacin funcional, los marcadores existentes no se expresan. Dos opciones: - Plsmidos de amplio espectro, capaces de replicarse en cualquier bacteria - Vectores derivados de plsmidos naturales especficos Ejemplo de plsmido de amplio espectro: RSF1010 - dosgenesderesistenciaaantibiticos,SuR(sulfonamida)ySmR (estreptomicina) - dos orgenes de replicacin: oriV, vegetativo oriT o nic: dirige la transferencia del plsmido por conjugacin - tres genes que codifican protenas de replicacin: repA, repB y repC- genes para la movilizacin: mob- sitios nicos para endonucleasas de restriccin EsteplsmidosepuedeconstruirymantenerenE.coli,yporconjugacintransferirloaotras bacterias. 9 PseudomonasEstasbacteriassoncapacesdemetabolizarcompuestosorgnicosyllevaracaboreaccionesde destoxificacin con metales pesados, por ello es de gran inters por su aplicacin en biodegradacin y biorremediacin. Se utilizan vectores derivados del plsmido natural pVS1 de amplio espectro Resistente a la mayora de antibiticos: se usan genes de resistencia a Hg y a Amp (carbenicilina) 9 BacillusMuyfcildetransformar:competentenatural,comorespuestaaunalimitacindenutrientes.Las molculasdeADNdssonabsosrbidasporlasuperficiedelaclulacompetente,captafcilmenteel ADN. Vectoresderivadosdeplsmidonaturalodelfago105,muysimilaralfago.Tienesealesde transcripcin/traduccinespecficaspropias:factorsigma,SDycodonesdeiniciodiferentes(UUG, GUG y CUG). Para expresar las protenas hay que usar los sistemas de la bacteria. Vectores para clonaje en levaduras9 Saccharomyces cerevisiae Levaduraunicelularnopatgenaquesereproduceporgemacinycreceenmediossimples.Se considera organismo modelo para otros eucariotas, de rpido y fcil crecimiento en laboratorio, existen mutantesdisponibles.Tiempodegeneracin3horas,temperaturaptima30C.Sonfcilmente transformables. Permite expresar protenas que necesitan modificacin pos-traduccional. Como marcadores de seleccin son poco usados los genes de resistencia a antibiticos se utilizan: - NeoRresistenciaaG418,aminoglucsidocapazdeimpedirelcrecimientodelasclulas eucariotas por inhibicin de la sntesis de protenas41- Marcadores nutricionales: complementacin de auxotrofas. Existe un gran conjunto decepasauxtrofas,mutantesenrutasbiosintticasdeaminocidos,genesimplicadosen sntesis de aminocidos (histidina, leucina, triptfano...) o de nucletidos (UMP), y de los genes de levadura que los complementan (HIS3, LEU2, TRP1, URA3...), aislados y purificados, lo que permiteutilizarestosgenescomomarcadoresdeseleccinsobrelascepasauxtrofas correspondientes. El gen LEU2, sintetiza leucina. El mutante leu2-necesitamedioconleucinaparano morir,siseintroduceunplsmidoconel genLEU2,laclulayanonecesitaleucina enelmedio,puestoquelasintetizael plsmido. Paraseleccionaralatransformacin,se cultivan en un medio sin leucina, las clulas transformadas sobreviven. Vectores plasmdicos para levaduras 9 Plsmidos integrativos (YIPs)Bsicamente son plsmidos bacterianos con un gen de levaduras (LEU2).Seintegranporrecombinacinhomloga,yaqueno pueden replicarse en levaduras.Silacopiadelcromosomaestmutada,podemosutilizarelgen de levaduras como marcador de seleccin de los recombinantes. Elplsmidonosereplicaporquenotieneorigendereplicacin para levadura. Necesitan leucinaLas clulas que llevan el plsmido sobreviven en medio sin leucina Gen de levaduraspBR322 Recuperamos gen URA3 funcional!!! 429 Plsmidos replicativos (YRPs)Poseen una secuencia ARS (secuencia de replicacin autnoma) Soninestables:nosegregancorrectamentealdividirselaclula, sedistribuyenmalytiendenaquedarseasociadosalaclula madre. Se pierden al cabo de varias divisiones. Presenta un nmero moderado de copias, son tiles para ensayos decomplementacinyserecuperanfcilmente,exceptosiseha integrado en el cromosoma. 9 Minicromosomas o plsmidos ARS/CENLainestabilidaddelosvectoresYRPsecorrigeincorporando laregincentromricadealgncromosoma,CEN(especfica paracadaespeciedelevadura).Estosnuevosvectores,YCp, muestranunasegregacinequitativaenladivisincelular,se comporta de forma anloga a un minicromosoma.Demenornmerodecopias.Larecuperacindelasecuencia clonadaesdifcilporlapocaconcentracinenlaquese encuentra.Siguen siendo inestables: se pierden!!! 9 Plsmidos derivados del plsmido de 2mPlsmidonaturaldeS.cerevisiae.50-100copiasporclula haploide,representa2-4%delADNcelulartotal.Sinfuncin conocida. Secuencias clave para la replicacin: ori y REP1/REP2 Se comporta como un minicromosoma circular. Funciona como un plsmido bacteriano. Se ha utilizado para construir plsmidos lanzadera. Plsmidos lanzadera E. coli-S.cerevisiae OrigenesdereplicacindepBR322(E.coli)y2m (S.cerevisiae),permitelaseleccindetransformantes deambostiposcelulares.Sealcanzaunafrecuenciade transformacinmuyalta,semantieneenformade plsmido multicopia. Fcil recuperacin. Tiene marcadores de seleccin, ApR para E.coli y y un gen de levadura con alguna auxotrofa.Serealizalaconstruccin/seleccindecoloniasApRdelADNrecombinanteenE.coliyluegoseintroduce enlevadura.Hayquetrabajarconmutantes delecionados,queelgennoseencuentreenel cromosomaparaqueelplsmidonoseintegre,asse obtienen mayor nmero de copias. Sitenemoscopiadelmarcadorenelcromosoma podemos tener integracin (como los YIPs) 43 Cromosomas artificiales de levaduras 9 YACsContiene centrmero y telmeros, mantienen la estabilidad del cromosoma.Loconstruimos/mantenemosenformadeplsmidode10-12kb.SepuedemantenerenE.coliy levaduras. Paraelclonaje,sepreparanlosbrazosdelvectorapartirdeunvectorlanzaderamantenidocomo plsmido en E.coli.Tiene ADN de relleno, secuencias centromricas, marcadores de seleccin y origen de replicacin.Los cromosomas de levaduras tienen entre 250-1700 kb Los YACs nos permiten clonar fragmentos de 600-1400 kb Clonacin en un YAC Podemosincorporarungenmarcadorenlasecuenciaquesustituimosparacomprobarquela clonacinse ha hecho bien. SecortaelADNcirculardeformaquequedenlosdosbrazos,cadabrazollevaunmarcadorde seleccin y, en su extremo, un telmero. El inserto se une a los dos brazos quedando un ADN lineal. Se ponen marcadores de seleccin, el gen Trp y el gen URA3.44 Vectores para expresin en levaduras Los promotores son diferentes de los de bacterias Necesitamos activadores transcripcionales y regiones reconocidas por ellos Esquemadelareginpromotoradeungentpico de levadura. - La caja TATA: inicio de la transcripcin, donde se une la polimerasa - Regin iniciadora o de inicio de la transcripcin - Secuencias activadoras y represoras anteriores: UAS y URS - Secuencias activadoras y represoras posteriores: DASPromotores ms usados: - ADH1 alcohol deshidrogenasa: inducible por glucosa, expresin constitutiva - Promotores genes GAL: promotor fuerte, inducibles por galactosa Vectores para clonaje/ expresin en plantas9 Plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens A.tumefaciensinfectaatravsdeheridas produciendo tumores. Es capaz de transferir ADN desdesucitoplasmaalinteriordeclulasde plantas,deformanatural.Soloinfectaalgunas dicotiledneas.PlsmidoTideunas200kb,eselagenteinductordelproceso.EsunADNdscircular,grandeque codifica lsa funciones de virulencia y tumoracin. Posee numerosos genes implicados en la infeccin, en el crecimiento del tumor y en determinar la especificidad del husped. ADN-T:fragmentode15-30kbqueseintegraenelgenomadelaplantadeformaestable.La integracin ocurre de forma aleatoria, si se integra en medio de un gen lo inactiva. Tiene oncogenes. 45 Introduccin de genes en plantas utilizando el plsmido Ti Sistema binario de transferencia: uso de dos vectores TransferimoselADN-TdeunminiTutilizandounplsmidoTiaccesoriosinADN-T.Ambosse introducenenA.tumefaciens,lasprotenascodificadasenelgrandepermitenqueseintegreelADN del miniT. Sistema de cointegracin Introducimosporrecombinacinhomlogaunplsmido de E. coli en el plsmido Ti. Elplsmidorecombinanteresultantetransfierelaregin ADN-T que incluye ahora el plsmido de E. coli9 Vectores lanzadera E. coli-plantas basados en Ti El ADN-T solo precisa de dos repeticiones de 24 pb en los extremos para transferirse al genoma de la planta. EnelvectordeE.coliseclonaelinserto,senecesitaunplsmidoaccesorio.Enlegenomadela planta se integran las secuencias que hay entre los extremos.Solo se modifican las clulas afectadas. Si infectamos protoplastos, podemos regenerar plantas completas que posean el ADN transferido en todas sus clulas. MiniT Plsmido Ti accesorio469 Plsmido Ri de Agrobacterium rhizogenes Similar al psmido Ti A.rhizogenesinduceaumentodelnmeroderacesadventicias,soloenalgunasdicotiledneas distintas de las que infecta A.tumefaciens. Problemas con Ti y Ri Agrobacterium slo infecta a dicotiledneas Transferencia directa de genesEmpleamos un plsmido de E. coli (pBR322) Incubamos protoplastos con el plsmido y polietilenglicol Plsmido se adhiere a la membrana de la clulayse induce la endocitosis. Poco eficiente. Integracin al azar por recombinacin no homloga Marcadores de seleccin en plantas- Neo /apt: Resistencia a kanamicina, G418 o neomicina - Dihidrofolato-reductasa: Resistencia a metotrexato - hyg : Resistencia a higromicina Vectores vricos para plantasLamayoradevirusdeplantassondetipoARN.Difcilmanejo/manipulacin.Sonmuy especficos.Vectores de ADN: 9 Caulimovirus - Tiene restriccin de tamao para empaquetar, como lambda - Podemos generar vectores tipo fagmido - Problema: infecta a muy pocas especies 9 Geminivirus - Infecta a monocotiledneas - Problema: su ADN sufre deleciones y reorganizaciones durante la infeccin Vectores para clonacin en clulas animalesSe utilizan lneas celulares en cultivo. Mtodos de transferencia de ADN: transfeccin - Precipitacin con fosfato clcico - Liposomas - Microinyeccin - Electroporacin Marcadores de seleccin - Resistenciaaantibiticos:nosuelenusarse,peroseutilizaelgenneomodificadodeE.coli, confiere resistencia a G418, anlogo de kanamicina - Rutas metablicas biosintticas de precursores de ADN: Rutasdenovo:partendecompuestossimples(glicocola,aspartato)paraconstruirlas molculas de los desoxinucletidos pricos y pirimidnicos Rutasderecuperacin:utilizanelconjuntodebasesnitrogenadasyeldemononucletidos, alimentadoporprocesosdegradativosdecidosnucleicos,paralaconstruccindela estructura nucleotdica. 47TKtimidinaquinasa:esunodelosmarcadoresmsutilizado.Elgencodificaunaenzima(timidina kinasa)conactividadimplicadaenunadelasrutasdebiosntesisdedesoxinucletidos.Latimidinase convierte en dTTPen una reaccin catalizada por la timidina kinasa.Se han podido aislar mutantes defectivos en actividades de las rutas de recuperacin: - APRT-: defectivas en adenina-fosforribosil-transferasa, enzima que convierte la adenina en AMP) - HGPRT-:defectivasenhipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa,enzimaquetransformala hipoxantina en IMP y la guanina en GMP - TK-: defectivas en timidina-kinasa Xantina-guaninafosforribosil-transferasa(XGPRT):estaenzimadeE.coliesanlogadelaenzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasademamferos.SintetizaGMPapartirdexantina.Utiliza como sustratos hipoxantina, guanina y xantina. Un fragmento de ADN que exprese la actividad XGPRT es capazdeconvertirclulasdemamferoHGPRT-enHGPRT+ypermitirlascrecerenunmedioHAT (hipoxantina, aminopterina, timidina).Seales de transcripcin /traduccin Esta seal la proporciona el vector para permitir incorporar la cola poliA al ARNm El tipo de promotor determina el nivel de expresin y en que tipo de clulas se expresa 48Esquema de unidad transcripcional - Reginpromotora:necesitalaunindeprotenasactivadoras,factoresgeneralesdetranscripcin. Cadapromotordicedondeycuandosevaaexpresarelgen.Lamayoratienensecuenciasde reconocimiento: La caja TATA, para la correcta ubicacin de la ARNpolimerasa II Elementosanteriores(upstreampromoterelements):antesdelacajaTATAyson responsables de la velocidad del proceso de iniciacin de la transcripcin -Sealesdeterminacinypoliadenilacin:eltranscritoprimario(pre-mRNA)esmodificadoensu estrmo 3, y una rotura por un punto intermedio y la sntesis de una cola poliA en 3 creado tras la rotura - sealesdelprocesamientointernodeltranscritoprimario:losgeneseucariotasestninterrumpidos porintrones,quesontranscritasyluegoeliminadassegnunmecanismodeunin(splicing)de exones.- SealesparalatraduccindelmRNA:losmensajeroseucariotassonminocistrnicos.Traslafase demaduracinsontransportadosalcitoplasmaparasutraduccinporelribosoma.steentraen contactoconelmRNApor5queactacomositiodeuninalribosoma.Lalecturadetripletes procededesdeelprimerAUGhastaelcodnstop.Estemecanismonohacenecesarialainclusin de seales para la traduccin en el vector. - Casetesdeexpresinparaclulaseucariotas:incorporansealesdeiniciacindelatranscripcin (promotor y potenciadores), un sitio de clonaje para el pasajero que se quiere expresar, un intrn y la seal de poliadenilacin. Vectores vricos para clonacin en clulas animalesLa mayora de los vectores son bastante especficos en cuanto al tipo celular (clulas permisivas).Se puede trabajar con plsmidos y todas sus seales pero, la clula animal tarda mucho en dividirse, aunque la protena encuestin se expresa, el plsmido se pierdeal dividirse la clula. En clulasanimales no se habla de transformar sino de transfectar. Vectores derivados de SV40. SV40 es un virus del grupo del papiloma, produce infeccin ltica en clulas de mono. Virus que infecta a primates.Genomade5243pb,circular,muybienaprovechado.Seempleanencultivosdeclulasderinde mono verde africano. Slo empaqueta 5300 bp, se usa para secuencias pequeas. Se pueden obtener 2 tipos de vectores, dependiendo de las funciones del virus que retienen: Vectores transductores o de reemplazamiento:Realizanelciclovricocompleto:replicanyempaquetanelgenoma.Tienepocacapacidadde transporte,queseresuelveconelempleodedosderivadosdefectivosdelvirusquenosoncapacesde replicar por s mismos, pero si lo hacen en una infeccin conjunta.Mantenemos el origen de replicacin, las secuencias necesarias para empaquetar el genoma y un tamao entre3,9-5,3kb.Eliminamosgenesdereplicacinodeencapsidacin,reemplazamosporinserto. Necesitamos un virus ayudante para replicar/ empaquetar. Un vector de reemplazamiento de los genes tardos, no tiene capacidad de encapsidar pero si de replicar, laclulainfectadapuedelisarperonoseconsiguenpartculasvricas.Unvectorayudantedefectivoen genestempranos,nopuedereplicarperosiencapsidar.Unatransfeccinconjuntaagrupaenlaclula todos los genes que dirigen el ciclo completo (complementacin).49Sepuedeutilizarcomovirusayudanteaunmutante quecodificaunaprotenaTtermosensible.Trasla infeccinmixtaelcultivocreceatemperatura restrictiva: - lasclulastransfectadasporelADNmutanteno producen copias, no se produce la lisis.- sololasclulastransfectadasporambosADN propagarn la infeccin. - LasclulasquetienenelADNrecombinanteno encapsidan Podemos usar clulas COS Hay vectores de reemplazamiento de la regin temprana, han sido sustituidos por el ADN pasajero. Este ADNnosepuedereplicarporquecarecedelaprotenaTnecesariaparaelproceso,perohayclulas capaces de aportar esta protena, son clulas COS. Tienen en el cromosoma insertado un SV40 defectivo, pero que produce la protena T necesaria para la replicacin. Podemosempaquetarlosvectoresdereemplazamientodegenesdereplicacinytenerslovirus recombinantes. Vectoresno infectivos o plasmdicos Sin capacidad infectiva pero con capacidad para transportarpasajerossinlmitedetamao.son pocoslostiposcelularesquepuedenser infectadosporelvirus(clulaspermisivas)pero sonmuchaslasclulasquepuedenser transfectadaseficazmenteporsuADNyenlas que se alcanza gran nivel de expresin a partir de las seales virales.Constan de:- Slocontienenelorigendereplicacinde SV40 - Promotor de amplio espectro - Seal de poliadenilacin - Intrn de la protena T de SV40 - Un MCS - Marcador de seleccin Pueden replicarse en clulas de mono, pero no empaquetarse. Si tenemos marcador de seleccin los mantenemos como si fueran plsmidos (10-100 copias) Con frecuencia de 10-3-10-5 tenemos integracin en el genoma. Se pueden construir vectores lanzadera. Vectores derivados de BPV: virus del papiloma bovino Papilomavirus: produce verrugas. Especie especfico, solo infecta a vacas pero es capaz de producir una morfologatransformadaenclulasderoedorinvitro,peronodepropagarseencultivodetejidos.En estossistemascelulares,elvirusnoproduceviriones,suADNreplicadentrodelaclulacomoun episoma pero no se propaga. Slo se obtienen virus maduros de las clulas epidrmicas de las verrugas.50Puede replicarse en otras clulas bovinas y de roedores (en cultivo): - No se integra en el genoma - 10-100 copias por clula - no necesita marcadores de seleccin - Se transmite a la descendencia - Tiene la capacidad de transformar las clulas de un cultivo en tumorales.- Los transformantes crecen en foco o colonia Podemos construir vectores lanzadera E. coli-BPV que usamos como si fueran plsmidos. Retrovirus Poseen un genoma RNA, su ruta replicativa pasa por una fase en la que su informacin gentica aparece en forma de ADNds.NecesitaobtenerunADNcparareplicarse, insertarse en el genoma y expresar protenas. Slo infectan clulasendivisin.Noprovocanlisiscelular,sinoque funcionan como M13 Su genoma posee secuencias importantes para: - Retrotranscripcin: R, U3,U5, P y Pu - Procesamiento de intrones: S- Encapsidacin: - Integracinenelgenoma:LTR(repeticiones terminaleslargas).Provocalaexpresinexcesivade lo que va detrs.

Muchos retrovirus son oncognicos. 2 mecanismos: Incorporacinalgenomadeoncogenes:elvirustransportaungenimplicadoenregulacindel ciclo celular, pero mutado Alteracindelaregulacindelosgenesadyacentes:lassecuenciasdeLTRtienenpromotores muy activos que transcriben hacia afuera Uso de vectores derivados de retrovirusDejamos las secuencias LTR, necesarias para su integracin en el genoma, y las , dirige el proceso de ensamblaje del virin,y sustituimos el resto por el inserto y el gen marcador. Losgenesvirales,gag,pol,env,sondispensablesyaquelasfuncionesquecodificanpuedenser aportadas por otro provitus. As se han construido vectores de reemplazamiento. Se insertan en el genoma y se quedan estables en cultivo, en forma de provirus. Si le damos las protenas del virus, podemos producir partculas vricas infectivas. 51La construccin del recombinante se suele hacer enE.coliyconvectoresbacterianos,mediantela unin de las secuencias retrovirales adecuadas y el ADNpasajero.Mediantetransfeccinse introduceenlalneacelularqueademses coinfectadaconunvirusayudante.La transcripcindelasecuenciadeADNviral recombinantedalugaraunmRNArecombinante queentraenelcicloreplicativoretroviralcomo RNAgenmico,pudiendoserempaquetadoo convertido en provirus. La expresin de los genes retrovirales conducea la aparicin de una mezcla departculasviralesinfectivasquecontinanla infeccin.Elayudanteeselquemarcala especificidad de hospedador. Realizan ciclo completo: obtenemos progenie de virus.Obtenemos las protenas que necesita de profago ayudante: progenie mixta Sielprofagoesmutanteenqueimpideel ensamblajedesuRNAviral,lasclulasproducen todaslasprotenasnecesariasparaelempaquetado, sonclulasempaquetadoras.Cuandolasclulasde estalneasontransfectadasconunDNAproviral recombinante,defectivo,seproducenpartculas virales recombinantes infectivas y puras, sin mezcla deningnvirusayudante,tenemosprogeniepura del retrovirus recombinante.Vectores derivados de otros virus Adenovirus - No se integran en el genoma - Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos Adenoasociados - Requieren coinfeccin con un adenovirus o virus herpes - Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos Herpes - Genoma muy grande (difcil manejo) - Citotxico Baculovirus - Para introduccin y expresin de genes en cultivos de clulas de insectos 52Genotecas Conjunto de clulas ( o virus) que albergan, fragmentado e incorporado en un vector, todo el contenido gentico (ADN) de un cierto organismo. 2 datos siempre importantes: Tamaodelagenoteca:nmerodeclonesquelaforman.DependedeltamaodelADNde partida y del vector a utilizar (tamao medio del inserto) Representatividad:porcentajedelassecuenciasoriginalesqueestpresenteenlosclonesdela genoteca. Es una medida de la calidad de la genoteca Objetivos: - Conservacin del ADN de una estirpe, especie o individuo. - Aislamiento de secuencias y genes. - Estudio de grandes regiones genmicas y genomas completos. - Inicio de los proyectos de secuenciacin Tipos en funcin del ADN pasajero mixto que contienen: Genotecasgenmicas:Contienenelgenomacompletodeunaespecie,enformadefragmentos clonados. Genotecas parciales o bancos de genes: Contienen las secuencias de un ADN ms simple, como un megaplsmido bacteriano o un cromosoma eucaritico aislado (genoteca cromosmica) GenotecasdeADNc:ProcedendelaclonacindelosADNcobtenidosdeuntipocelular concreto.Contienenlassecuenciasquehansidoexpresadasenlaclulaoriginal.Utilizadasen paraelaislamientodegenesexpresadosentejidosespecficosyparaelestudiodelos mecanismosqueregulanesaexpresin.Sonsecuenciascarentesdeintrones,permitesu expresin en sistemas procariticos. Genotecas genmicasContienen, fragmentado, todo el material gentico (genoma) de una especie. Nos interesa que los clones sean solapantes Cualidades /caractersticas de la genoteca a tener en cuenta: - Representatividad:DebecontenertodaslassecuenciaspresentesenelADNdepartida.Debe mantenerse y no disminuir durante la conservacin y amplificacin de la genoteca. - Complejidad(otamao):nmeromnimodeclonesquedebetenerlagenotecaparaquetodoel ADN de partida est representado. - Tamaomediodelosinsertos:Importantesiqueremosaislargenescompletosdegenomas eucariotas,paralograrelaislamientodeungencompleto,labibliotecadebecontenerinsertos suficientementegrandes.Eltamaodelagenotecadependedelarelacinqueexisteentrela longituddelmaterialinicialyeltamaomediodelosinsertos.Enlaprctica,necesitamosun nmerodeclonesindependientesmayordeltericoparaasegurarnoslarepresentatividaddela genoteca:N = ln (1-P) / ln (1-1/n) N: nmero de recombinantes independientes P: probabilidad de hallar un inserto dado n: tamao ADN original /tamao medio insertos Se aconseja la construccin de genotecas con pasajeros grandes porque son ms manejables al estar formadasporunmenornmerodeclonesyofrecenmsfacilidadenelaislamientodegenes completos. A ms nmero de clones mayor fiabilidad. Pasos clave en la construccin de la genoteca:9 Mtodo de fragmentacin del ADN de partida Define la complejidad de la genoteca, su representatividad y la facilidad de clonacin de los insertos. Digestin con endonucleasas: en teora, se puede anticipar el tamao promedio de los fragmentos, pero no es real. Dependiendo de la posicin de las dianas en relacin con la secuencia de un gen, puede que la digestin con una enzima rompa al gen en varias piezas impidiendo que aparezca completo en la genoteca. 53Fragmentacinpormtodosfsicos:ultrasonidos.Produceunaroturaalazar,porsitiosnoespecficos. Losfragmentosresultantesrequierenalgntratamientopararepararsusextremos.Laroturaalazar presentaunaheterogeneidadmayor,aumentalaprobabilidaddeaislarundeterminadogencompletoy disminuyelaprobabilidaddequesepierdansecuenciasporestarlocalizadasenfragmentosgrandesno clonables. Muchos fragmentos solaparn entre s. Digestin parcial con una endonucleasa de diana corta (4 pb). Controlando las condiciones de digestin sepuedenconseguirfragmentosdemayortamao.producefragmentossolapantes,aumentandolas posibilidades de clonaje de cualquier secuencia y permitiendo el desplazamiento por el genoma9 Seleccin del vector de clonacin Dependedeltamaodelosinsertosaclonar.Determinalaconservacinyfacilidaddeanlisisdela genoteca Vectores usados en construccin de genotecas genmicas: Genomas pequeos: Plsmidos o derivados de (reemplazamiento) Genomas grandes: BACs o YACs Esquemaparaconstruirunagenotecacon.ObtencindelADN.Fragmentacin.ADN.Ligacin entre ambos. Empaquetamiento, en cada fago habr un fragmento de la genoteca. Amplificar la genoteca mediantecultivos,seconsiguencalvasdelisiscon.Paraconservarlagenotecasepuedecongelar,en E.coli se debe aadir un agente criognico; se pueden hacer diluciones.Digestin total con enzima A (corte poco frecuente; diana 6 bp) Fragmentacin por mtodos fsicos (inespecfica) Digestin parcial con enzima B (corte muy frecuente; diana 4 bp) Fcil unir los insertosInsertos de tamao heterogneo Representatividad media Clones no solapantes Difcil unir los insertosInsertos de tamao homogneo Representatividad alta Clones solapantes Fcil unir los insertosInsertos de tamao homogneo Representatividad alta Clones solapantes 54 Conservacin y amplificacin de la genotecaImportantequelaviabilidaddelagenotecaysurepresentatividadnosepierdaduranteel almacenamientoy/oamplificacin.Losvectoresderivadosdesepuedenalmacenarmstiemposin prdida de viabilidad y pierden menos representatividad al amplificar la genoteca. Genotecas de ADNcSeobtienenalclonarlosADNcobtenidosa partirdelosARNmpurificadosdeunciertotipo celular. Refleja los genes que se estn expresando enesetejidoomomentodeldesarrollo.Permite identificargenesespecficos.Tienemenor complejidad que las genotecas genmicas. Representatividad: NotodoslosADNcestnigualde representados,yaquedependedelaabundancia delosARNm.Alahoradelaislamientodeun clones necesario tener en cuenta la concentracin de su ARNm en el sistema de partida. Enriquecimiento:PodemosenriquecerlagenotecaenelADNcdeintersmediantefraccionamientoportamaosdelos ARNm o uso de cebadores especficos en la obtencin de los ADNc. Genotecas de expresinSeconstruyenconunvectordeexpresin,aportalassealesnecesariasparaqueelinsertopuedaser transcritoytraducidoenlaclulahospedadora.Permitequelagenotecapuedaseranalizadaatravsde losproductoscodificadosenlospasajerosydesuposibleactividad,alternativaparaladetecciny aislamiento de clones. El pasajero se inserta en un sitio localizado dentro de un gen presente en le vector, de manera que la expresin conjunta de ambos puede conducir a la sntesis de una protena mixta. Interesantequeseapromotorinducible.Asevitamosquesepierdaladeteccindeclonesque codifiquen para protenas txicas. G. de expresin genmicas En procariotas: poco ADN no codificante Representatividad puede ser menor: sobretodo las obtenidas por digestin Necesitamos nmero mayor de clones.Tener en cuenta la pauta de lectura. Usar vectores que difieran en la pauta de lectura. G. de expresin de ADNc En eucariotas: mucho ADN no codificante. Podemos expresar esas protenas en E. coli. El diseo de los cebadores nos permite que todos los ADNc se clonen en la pauta de lectura adecuada. Anlisis /escrutinio de la genotecaLa utilidad de una genoteca es funcin de un mtodo que permita identificar, entre el conjunto de clones o fagos recombinantes, a aquel que contenga el inserto deseado. Deteccin y aislamiento del clon que nos interesa. Tres estrategias fundamentales: Hibridacin con una sonda marcada. Es la ms utilizaday la ms general. Nos permite analizar cualquier genoteca. No requiere que el gen a identificar se encuentre completo en el mismo clon ni que se exprese la protena codificada en el ADN.55 Anlisisconanticuerpos(inmunoscreening).Soloengenotecasdeexpresin,dadoqueel anticuerporeaccionaconlaprotenanoconelADN.Dependiendodeltipodeanticuerpo utilizado requiere que la protena se exprese entera o no. Anlisispordeteccindelaactividaddelproductocodificado(Anlisisfenotpico).Sloen genotecas de expresin, y en casos concretos. Se requiere que la protena se exprese completa y /o que retenga su actividad.Anlisis por hibridacin con sondas marcadasSuele ser el mtodo ms utilizado y es el ms fiable. Detectamos la presencia de una secuencia concreta, por lo que no necesitamos que la genoteca sea de expresin Sonda: Hebra de cido nucleico (ADN ARN) monocatenaria y de secuencia complementaria a la que estamos buscando 9 Sondas de ADN Sitenemoslasecuenciadeintersclonadaenunvector,lapodemoscortarconenzimasy purificar. Necesitaremos desnaturalizar antes de usar Podemosamplificarlasecuenciaquebuscamos(opartedeella)porPCR.SirealizamosPCR asimtrica, ya la tenemos en forma de monohebra y no necesita desnaturalizacin Sondas sintticas (oligonucletidos). Si no conocemos la secuencia del gen de inters, pero s la de la protena podemosdisear sondas degeneradas.Las sondas degeneradas son una coleccin desondasobtenidasapartirdeunasecuenciadeaminocidoscontodaslascombinacionesde tripletesposibles.Tambinpodemosincorporarinosinaenlosresiduosquepuedanvariar.Este residuopuedeaparearconcualquieradelascuatrobases;sereduceelnmerodemolculasa sintetizar y se puede alargar su longitud. 9 Sondas de ARN Tambinllamadasribosondas.Transcripcindelinsertodeinters,clonadoenunvectorespecial.La secuencia buscada, con promotor, se expresa y se utiliza el ARN. Secuencia protena 56Marcaje de las sondasEmpleo de radiactividad, es el mtodo ms sensible.ElistopomsusadoeselP32,aunquetambinpuedenusarseotroscomoS35 .podemosmarcarlas sondas de diferentes maneras:- Incorporando dNTPs radiactivos a la reaccin de PCR o de sntesis de oligos - Trasladodemella:creamosmellasenelADNutilizandolaDNasaI.Empleamoslas actividades exonucleasa 5 3y polimerasa de la ADN polimerasa I (de E.coli) para sustituir parte de las bases por dNTPs radiactivos. Ligasa para unir la mella que queda detrs. Se obtiene las misma molcula pero marcada radiactivamente. - Relleno de extremos:Si la sonda tiene extremos cohesivos, podemos rellenarlos con Klenow utilizando dNTPs radiactivos. - EmpleodelatranferasaterminalolapoliA(soloATP)polimerasaparaincorporardNTPs radiactivos a los extremos de la sonda. - Adicin de grupos fosfato con P32 en los extremos 5 usando la polinucletido quinasa. Primero se utiliza una fosfatasa para quitar fosfatos, luego se utiliza la quinasa que aade fosfatos.Detectamos la presencia de la sonda realizando una autorradiografa. Otros marcajes: - dNTPs marcados con fluorocromos. Detectamos con: Fluorimetra - Biotina: Aadimos protena detectora (avidina)conjugada confluorocromo o enzima. la biotinaes la sonda en el ADN, la avidina es afn a la biotina. Detectamos con: Fluorimetra o reaccin colorimtrica de la enzima. - Digoxigenina:Aadimosanticuerpoespecficoconjugadoconfluorocromooenzima.Detectamos con: Fluorimetra o reaccin colorimtrica de la enzima Ensayo de hibridacin de la genoteca en soporte slidoCultivodeE.coliyfagosenplaca.Cadacalvacorrespondeaunclon diferente de la genoteca. Transferimos las calvas /colonias a un filtro de nitrocelulosa Tratamos con lcali para lisar las colonias y /o desnaturalizar el ADN Podemos fijar el ADN al filtro con luz UV. El ADN se queda pegado a la nitrocelulosa. Incubamosconlasondamarcada,soloseuniralassecuencias complementarias de la genoteca.Lavamos el exceso de sonda que no ha hibridado. Revelamoselfiltroparadetectarenquecalva/coloniahahibridadola sonda. Rescatamos la calva /colonia de la placa original para aislar el inserto. 57Hibridacin SouthernCombinalaseparacindefragmentosdeADN(genmicototal)medianteelectroforesisconsu transferencia a una membrana y su hibridacin con una sonda. Es una de las tcnicas de anlisis de ADN ms usada a partir de muestras biolgicas (sangre, esputo, tejidos, etc). Lasbandasdelgel(agarosa)setransfierenaunamembranadenailon.ElADNsequedapegadoala membrana. LatransferenciadelADNdesdeelgelalamembranapuederealizarseporcapilaridadopor electrotransferencia. Se obtienen bandas, la sonda hbrida con la banda complementaria. La banda nos da relacin del tamao del ADN, no de la sonda. Lascondicionesenlasqueserealicelahibridacindeterminarsilasondasepuedeunirsloasu secuencia completamente complementaria o puede unirse a secuencias parcialmente complementarias. La temperaturaesimportanteparaquelasondaseunasolamentealahebracomplementaria;sila temperatura es inferior a la ptima la sonda se hbrida a secuencias parcialmente complementarias. Tcnicas relacionadas con la hibridacin Southern Hibridacin Northern Tcnicasimilaralaanterior,peroenestecasotransferimosARN.Permiteestudiarlatranscripcinde un gen, ya que podemos usarla para detectar /cuantificar un ARNm concreto. Se separa por electroforesis, se transfiere a una membrana de nailon y se hbrida con la sonda. Hibridacin Western Enestecasoloquetransferimosydetectamossonprotenas.Nousamossondas,sinoanticuerpos especficoscontralaprotenaquepretendemosestudiar.Elgelutilizadoenlaelectroforesisesde acrilamida. Combinando las tres tcnicas podemos estudiar un gen/ protena a varios niveles: SouthernNorthern Western Secuencia ADNARNmProtena Presencia del genTranscripcinTraduccin Eneucariotasungensepuedeestartranscribiendoperonotraduciendo,sepuededetectarADN,ARN pero no la protena. Pueden dar pistas sobre la regulacin de un gen. 58Anlisis con anticuerpos (inmunoscreening)Tcnica similar a la hibridacin con sondas, pero usamos un anticuerpo contra la protena que queremos detectar. Necesitamos que la genoteca sea de expresin. Traslasiembradeclulastransformadas,elmaterialde lasplacasestransferidoaunsoporteslidoparafijarlas protenas en l. El filtro es tratado con un anticuerpo contra laprotenacodificadaporelrecombinantebuscado.La identificacindeunareaccinpositivaseconsigue mediantetratamientoconunsegundoanticuerpo,dirigido contraloseptoposespecficosdelprimero;estesegundo anticuerpo va unido a una enzima cuya actividad se detecta con facilidad.Los anticuerpos primarios pueden ser: - Ac.policlonal:nonecesitamosquelaprotenaestcompletaniqueretengasuactividad.Mayor ruidodefondo.Reconocevarioseptopos,aumentalaposibilidaddequereconozcaunclonque expresetanslounfragmentodelaprotena,aunqueproduceunfondomuyaltodebidoalas reacciones contra otros antgenos. - Ac. monoclonal: Menor ruido de fondo. Podemos perder la deteccin de algunos clones. El nmero derecombinantesquereconoceesmenor.Sloreconocenunasecuenciadelaprotena.Nose pueden detectar protenas fragmentadas. Anlisis por deteccin de la actividad del producto codificadoSloencasosenquelaprotenaquebuscamostengaunaactividaddefcilensayo.Requierequela protena se exprese y que est completa y /o retenga su actividad. Complementacin de mutantes bacterianos, aislamiento de genes de resistencia, protenas que podamos medir mediante ensayos colorimtricos9 Aislamientodegenesporcomplementacindemutantesbacterianos.Elusodeunaextirpe auxtrofa,mutantedeficitariaenalgunaactividadimplicadaenunarutabiosinttica,como hospedadoraparalaconstruccindeunagenotecaobligaautilizarunmediodecultivo complementado con el producto que no puede sintetizar. La genoteca no crece cuando se siembra en placas con medio mnimo, pero si el recombinante de alguna de sus clulas portara un pasajero capaz de expresar una actividad que complementara el defecto de la cepa hospedadora, sta s crecera en ese medio dando lugar a una colonia detectable. Se trata de una seleccin. El procedimiento requiere queelinsertoseexpreseutilizandounagenotecadeexpresinotrabajandoconunaquecontenga fragmentosdetamaosuficienteparaquecontengacompletoelgenylassealesactivas responsables de su expresin.59Tema 2 Mapas genticos y fsicos Mapadeungenoma:Representacingrficadelaordenacinylaposicindegenesymarcadores genticos dentro del genoma. Estas representaciones, sobretodo en genomas de gran tamao y alto contenido en secuencias repetidas, son de gran ayuda para el posterior ensamblaje de las secuencias obtenidas en los Proyectos Genoma.Laobtencindemapaspreviosaliniciodeunproyectodesecuenciacinnossirvecomoguapara situar correctamente los fragmentos que se van secuenciando. Dependiendo de la estrategia utilizada para posicionar los diferentes marcadores, se pueden obtener mapas fsicos o genticos. Secuencia de un genoma: mapa del genoma realizado al nivel ms detallado. Obtencin de mapas:- Dependientes de la disponibilidad de marcadores genticos (alelos) - Dos tipos de mapas dependiendo de cmo se obtienen y se miden las distancias Tipos de mapas Mapas genticos (clsicos) Basados en frecuencias de recombinacin de alelos (frecuencias fenotpicas).Basados en la frecuencia de recombinacinentrelos marcadores utilizados, por lo que la medidade la distancia entre marcadores se expresa en forma de distancias genticas (unidades de mapa). Losprimerosmarcadoresutilizadosfueronlospropiosgenes.Elempleoexclusivodemarcadores genticosdalugaralaobtencindemapaspocosprecisos,dadalabajaproporcindegenesenlos diferentes organismos cuyos fenotipos asociados son distinguibles visual o bioqumicamente.60 Mapasfsicos:seobtienenmediantetcnicasdebiologamolecular(restriccinconenzimas, tcnicas de hibridacin, PCR) y son ms precisos que los genticos. La utilizacin de paneles de lneascelularessomticashbridasolneascelulareshbridasporradiacinpermiteasignar marcadoresauncromosomaoregincromosmicaconcreta.Lasdiferentesvariantesde hibridacin in situ (FISH) permite posicionar marcadores con resoluciones que varan entre 1Mb (baja resolucin) y 10 kb (alta resolucin).Losmapasderestriccinpermitenposicionardianasdereconocimientoparadiferentes endonucleasas,ypuedenaplicarseadiferentestiposdefragmentosdeADN,desdeinsertos clonados a fragmentos genmicos o cromosomas bacterianos completos. Basadosenlasecuencia,obtenidoscontcnicasdeingenieragentica.Medidoenparesde bases. Marcadores polimrficos:implican un polimorfismo poblacional (ocurrencia en un locus de numerosos alelos alternativos identific