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GENÉTICA MOLECULAR DE LA HEMOFILIA A Y B: APLICACIÓN DEL ANÁLISIS DE CURVAS
DE DENATURACIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN (HRMA) PARA EL APOYO EN SU DIAGNÓSTICO
Diego Navas Calixto
Estudiante de Maestría en Ciencias Biológicas
Directora: Diana C. Polanía V., M.Sc., Ph.D. Codirectora: Helena Groot, M.Sc.
Universidad de Los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Ciencias Biológicas
2019
2
RESUMEN
La hemofilia es un desorden de coagulación hereditario, caracterizado por la falta de
coagulación apropiada tras una lesión o sangrado espontáneo. En el proceso de coagulación
los factores VIII y IX junto con otros factores participan para detener el sangrado. Cuando
estos factores se encuentran en niveles por debajo de lo normal se presenta la hemofilia A
y B respectivamente. Estas deficiencias son causadas por mutaciones en los genes FVIII y
FIX que producen una proteína anormal. Mediante el diagnóstico clínico no es posible
determinar con exactitud la condición de una mujer portadora, ni el desarrollo de
inhibidores causado por ciertas mutaciones, por esta razón la secuenciación Sanger es el
método de elección para determinar una variación y apoyar con mayor precisión el
diagnóstico clínico, sin embargo, representa un alto impacto económico para el sistema de
salud. En el presente trabajo primero se estudiaron molecularmente 3 pacientes con
hemofilia B para determinar la variación presente mediante secuenciación Sanger. En
segundo lugar, se realizó un análisis de curvas de denaturación de alta resolución (HRMA)
en el que se implementó un código de programación de Python que permitió un nivel mayor
de discriminación en los perfiles de curvas de denaturación. En el análisis molecular de
pacientes con hemofilia B se encontraron 4 variaciones, 3 de estas nuevas. estas variaciones
junto con las variaciones encontradas en 11 pacientes con hemofilia A de estudios
anteriores fueron usadas como controles positivos para validar el método de HRMA, en el
cual 26 muestras confirman la variación presente, lo que demuestra ser un método eficiente
para la selección de exones candidatos a secuenciación como alternativa efectiva y de
menor costo frente a la secuenciación Sanger de todos los exones de los genes FVIII y FIX.
Palabras clave:
Hemofilia A; hemofilia B; escaneo de mutaciones; HRM; diagnóstico; Colombia.
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Introducción
La hemostasia sanguínea se lleva a cabo mediante una compleja red de procesos
coagulatorios y fibrinolíticos que deben mantener un equilibrio entre los sistemas
procoagulantes, anticoagulantes y fibrinolíticos, pues la sangre debe mantenerse fluida y
generar un coagulo cuando se presenta una lesión, cuando esto no ocurre se presentan los
trastornos hemorrágicos, como la hemofilia A (HA) y B (HB), causados por defectos en el
factor de coagulación VIII (FVIII) y factor IX (FIX) respectivamente (Zögg & Brandstetter,
2009).
Después de una lesión en un vaso sanguíneo se inicia la cascada de coagulación, el factor
tisular (TF), las plaquetas y la trombina desempeñan papeles clave en el inicio, la
amplificación y la propagación en la formación de coágulos (Zimmerman & Valentino,
2013). Esta serie de reacciones se dan en la superficie de las células, que expresan el factor
tisular (TF), y cuyo objetivo es la formación de trombina en sitios de lesión vascular. Es un
proceso dinámico y complejo en el que participan numerosas proteínas plasmáticas
conocidas como factores y cofactores de la coagulación, que se producen principalmente
en el hígado y son liberados al plasma (Baute, Alfonso, Salabert, Águila, & Zamora, 2011).
(Martinuzzo, 2017). Este proceso se lleva a cabo cuando el factor tisular (TF) para el
complejo tenaza extrínseca interactúa con el factor VIIa y forman el complejo dependiente
de vitamina K. A su vez los factores IX y X se convierten en las serinas proteasas FIXa y FXa,
que luego forman los complejos intrínsecos de tenaza y protrombinasa respectivamente.
Las acciones combinadas de la tenaza intrínseca y extrínseca y los complejos de
protrombinasa conducen al incremento de trombina (Factor IIa) (Hoffman et al., 2013). La
trombina no solo cumple funciones procoagulantes sino también anticoagulantes cuando
se combina con el cofactor trombomodulina en el complejo de proteína Case, el cual tiene
como resultado la inactivación de los cofactores Va y VIIIa a través de la proteína C activada
(Lee, Berntorp, & Hoots, 2011). Cuando la trombina se genera a través de mecanismos
procoagulantes, la trombina separa el fibrinógeno y activa el factor XIII para formar un
coágulo de fibrina. La trombina-trombomodulina también activa TAFI (Inhibidor de
fibrinólisis activable por trombina) que retrasa la degradación de la fibrina por parte de la
plasmina. TFPI sirve para reducir la actividad de la tenaza extrínseca, el desencadenante de
la coagulación. AT inhibe directamente la trombina, FIXa y el factor Xa. La vía intrínseca
proporciona una ruta alternativa para la generación del factor IXa (Hoffman et al., 2013).
Cuando una persona presenta niveles reducidos de los factores de coagulación FVIII y FIX,
se presentan los trastornos hereditarios de coagulación conocidos como hemofilia A y B
respectivamente, los cuales presentan un patrón de herencia recesivo ligado al sexo (Graw
et al., 2005; Zimmerman & Valentino, 2013). Clínicamente las hemofilias se clasifican de
acuerdo con la actividad residual del factor de coagulación: la hemofilia severa (factor de
coagulación < 0.01 UI/ml) se caracteriza por sangrado espontáneo en músculos y
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articulaciones, la hemofilia moderada (0.01–0.05 UI/ml) presentan un sangrado ocasional y
la hemofilia leve (> 0.05 UI/ml) (Swystun & James, 2015).
Según la Federación Mundial de la Hemofilia, a nivel mundial la enfermedad se presenta en
1 de 10,000 personas, siendo la hemofilia A la más común con 1:5000 nacimientos
masculinos, mientras que la hemofilia B ocurre en 1:30,000 nacimientos masculinos. La
hemofilia se presenta en todos los grupos étnicos; no hay predilección geográfica o de
poblaciones (Zimmerman & Valentino, 2013). En Colombia la HA y HB representan las
enfermedades huérfanas más prevalentes y para el 2018 fueron reportados a la Cuenta de
Alto Costo (CAC) 1.841 casos de personas con HA, de las cuales 1.808 eran varones y 33
mujeres, mientras que para HB 393 casos de estos 383 fueron varones y 13 mujeres (CAC,
2019).
Aproximadamente del 5% al 10% de los pacientes con hemofilia A y del 40% al 50% de los
pacientes con hemofilia B producen una proteína disfuncional, lo que resulta en una
disminución de la actividad proteica sin una disminución cuantitativa. Se han identificado
más de 1.000 mutaciones en los genes del factor VIII o del factor IX que causan hemofilia,
además de una alta tasa de mutación espontánea (aproximadamente un tercio de los casos)
(Zimmerman & Valentino, 2013). En otros casos, puede desarrollarse mediante la
inactivación del cromosoma X (Radic et al., 2015). Dado que es una enfermedad recesiva
ligada al cromosoma X, los varones son hemicigotos, mientras que las mujeres son
heterocigotas (portadoras), por lo general asintomáticas presentando niveles normales o
intermedios de la actividad estos factores de coagulación (Radic et al., 2015).
El gen que codifica al factor VIII se localiza en la banda distal del cromosoma X, en la posición
Xq28.4, tiene una longitud de 186 Kilo bases (kb) y consta de 26 exones, que codifican un
ARN mensajero de 9 kb. El factor VIII sintetizado está conformado por 2.332 aminoácidos
que en su estructura presenta una cadena pesada (compuesta por los dominios A1 y A2) y
una cadena ligera (compuesta por los dominios A3, C1 y C2) (Fabián Amador-Medina &
Vargas-Ruiz, 2013; Graw et al., 2005).
El gen que codifica al factor IX de la coagulación (FIX) se encuentra en la banda distal del
cromosoma X, en la posición Xq27.4, tiene una longitud de 38 kb y consta de ocho exones
que codifican un ARN mensajero de 3 kb y sintetizan al factor IX en forma de una proteína
de 415 aminoácidos. El producto final contiene al menos dos regiones importantes dentro
de su estructura, una región catalítica, la cual está diseñada para su sitio de unión al factor
VIII, y una región Gla, que necesita un proceso de gamma carboxilación para activar al factor
IX antes de su unión al factor VIII (Fabián Amador-Medina & Vargas-Ruiz, 2013; Goodeve,
2015).
El diagnóstico clínico de la hemofilia típicamente se lleva a cabo mediante la medición de
los factores de coagulación VIII y IX, tiempo parcial de tromboplastina (TPT) y tiempo de
protrombina (TP), sin tener en cuenta ensayos moleculares, pese a que estos últimos
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permiten la identificación de mutaciones en los genes del FVIII y FIX, y dan información
importante para confirmar el estatus de una mujer portadora o un diagnóstico prenatal. Los
ensayos moleculares también permiten identificar las mutaciones específicas que se
correlacionan con el desarrollo de anticuerpos inhibidores, que actúan en contra de un
factor de coagulación exógeno y resultan en una reacción anafiláctica después del
reemplazo del factor de coagulación, que ocurre del 1 – 3 % en pacientes con HB y del 25 –
30 % en pacientes con HA (Goodeve, 2015; Mauro, Bonetti, Balter, Poli, & Cesaro, 2016;
Swystun & James, 2015).
Dado que el FVIII es susceptible de degradación proteolítica cuando no está acompañado
del factor de von Willebrand, la disminución de un factor puede afectar la actividad del otro.
Como consecuencia, los pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2 (VWD 2) no se
pueden distinguir de los pacientes con hemofilia A mediante pruebas de diagnóstico
convencionales. Esto resulta en que varios pacientes (en general mujeres) que son
diagnosticadas con hemofilia A, a las cuales se les realizan pruebas moleculares y que no
presentan mutaciones en el gen F8, son reorientadas hacia un diagnóstico de VWD 2. Esto
es importante considerando las diferencias en cuanto al tratamiento de la patología, ya que
resultaría ineficiente la administración de factor recombinante FVIII en un paciente con
VWD 2 (Graw et al., 2005; Leuer et al., 2001; Polanía, Narváez, & Groot, 2014).
Sabiendo de antemano la importancia de los ensayos moleculares en el diagnóstico,
típicamente para el escaneo de mutaciones en el gen FVIII y FIX, se han utilizado diferentes
técnicas como PCR seguida de secuenciación Sanger para los exones, las regiones no
traducidas 5´y 3´, y los límites de empalme (Goodeve, 2015). Se han encontrado más de
1000 mutaciones únicas en el gen F9 incluyendo la región del promotor y la UTR 3´. La
mayoría son mutaciones puntuales (73 %), deleciones (16.3%), inserciones (3,3 %), indels
(1,5 %) y duplicaciones (0,4%), además más de un tercio de los casos de hemofilia son
causados por mutaciones de novo (Swystun & James, 2015).
En este sentido, las tecnologías de escaneo de mutaciones (MST) como el polimorfismo
conformacional de cadena sencilla (SSCP), basado en la migración dentro de la
electroforesis en gel y la electroforesis en gel sensible conformacional (CSGE), basada en
análisis de heterodúplex, ambas detectan del 80-90% de las mutaciones puntuales
potenciales, estas técnicas permiten detectar variantes de secuencia sin la necesidad de un
conocimiento previo de la identidad de la variante, y han demostrado ser efectivas para
diagnosticar una condición genética, siendo la mejor técnica de escaneo la cromatografía
líquida de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC), cuya principal limitación radica en la
utilización de un equipo especializado que pocos laboratorios cuentan con él, además de
ser costoso (Kakela et. al 2006).
Uno de los métodos que ha cobrado mayor importancia en el escaneo de mutaciones y genotipificación es el análisis de curvas de denaturación de alta resolución en inglés High Resolution Melting Analysis (HRMA). Varios estudios han demostrado la eficacia en el
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escaneo de mutaciones mediante HRMA (Garritano et al., 2009; Krypuy et al., 2007; Laurie, Smith, & George, 2007; Simi et al., 2008). Esta técnica es sensible, específica, rápida, simple, de bajo costo y robusta, que no requiere de procesamiento posterior de la muestra, reduciendo el riesgo de contaminación, dura solo 3 horas, si se detecta una variante, se puede identificar mediante secuenciación, agregando 3 horas al proceso (Montgomery, Sanford, & Wittwer, 2010; Wittwer, 2009). El desarrollo de esta se da gracias a nuevos colorantes que saturan completamente la molécula de ADN de doble cadena y detectan la formación de heterodúplex, el aumento de la resolución en la denaturación en los equipos de PCR; y, por último, el desarrollo de software para la normalización de los datos y comparación de las formas de las curvas (Farrar & Wittwer, 2016).
En detalle, en el HRMA, la temperatura de denaturación (Tm) es la temperatura a la cual el 50% del ADN es bicatenario (ADNbc) y el resto es monocatenario, esta denaturación del ADN ocurre cuando el ADNbc se convierte en ADN monocatenario. La denaturación del ADN puede monitorearse con colorantes que se intercalan y fluorescen en el ADNbc. Cuando un producto de PCR se denatura en presencia de un colorante de ADNds, la fluorescencia es controlada continuamente y se representa gráficamente contra la temperatura (Reed, Kent, & Wittwer, 2007). A medida que aumenta la temperatura típicamente 0,02 °C por cada segundo, hay una caída característica en la fluorescencia que coincide con la denaturación del producto de PCR, este pequeño y progresivo aumento de temperatura permite un mayor detalle en el análisis del comportamiento de denaturación (Farrar & Wittwer, 2016). El perfil de denaturación de un producto de PCR depende de su contenido, longitud y secuencia de guanina-citosina (GC). Los productos de PCR cortos generalmente se denaturan en una sola transición, mientras que los productos de PCR más largos a menudo se denaturan en múltiples transiciones, correspondientes a dominios de denaturación de diferente estabilidad (Erali & Wittwer, 2010; Taylor, 2009).
Así pues, una variante de secuencia homocigótica usualmente cambia la Tm del dúplex. Donde hay un intercambio entre G:C y T:A, el cambio en Tm es relativamente grande: aprox. 0.8–1.4 °C. Sin embargo, si las bases intercambian hebras, pero el par de bases no cambia, el cambio en Tm es más pequeño y se vuelve indetectable. Una muestra heterocigótica contiene cuatro especies dúplex (Anexo Figura 1) y su curva de fusión observada es un compuesto de las cuatro curvas de fusión individuales, así la contribución de los heterodúplex relativamente inestables cambia la forma de la curva de fusión heterocigótica (Taylor, 2009).
En Colombia no se cuenta con servicios de diagnóstico que realicen pruebas de escaneo de
mutaciones para determinar con precisión la condición de un individuo, actualmente la
detección de variaciones se realiza mediante la secuenciación Sanger que representa un
elevado costo y tiempo de procesamiento de la muestra.
De acuerdo con lo anterior, el presente estudio tiene por objetivo apoyar el diagnóstico
clínico de pacientes diagnosticados con hemofilia mediante métodos moleculares, para
esto: primero se realizó un análisis de las variaciones presentes en los exones del gen del
factor de coagulación FIX de pacientes diagnosticados clínicamente con hemofilia B,
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segundo se utilizó el método de HRMA para determinar por medio de los perfiles de curvas
de denaturación las variaciones presentes en los exones del FVIII y FIX, y así validar el
método para ser usado en la selección de exones candidatos a secuenciación Sanger como
un método efectivo y de menor costo en el apoyo del diagnóstico clínico. Además, esta
investigación contribuye a los trabajos realizados por Diana Polanía y Juliana Lago sobre
genética molecular y mejoramiento del diagnóstico de la hemofilia A realizados en el
Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de los Andes.
Metodología
Muestra de estudio y aspectos éticos
Se reclutaron 4 pacientes adultos de la Liga Colombiana de Hemofílicos, con diagnóstico
clínico confirmado o sospecha de portador de hemofilia B (Anexo Tabla 1). A los pacientes
se les tomaron 2 muestras de 4ml de sangre periférica en un laboratorio de referencia en
hemostasia para los debidos análisis moleculares. Para probar el método de HRMA, se
tomaron como controles negativos muestras de sangre periférica de 16 individuos
correspondientes a mujeres y hombres sanos, sin diagnóstico clínico sobre enfermedades
de coagulación, ni familiares que presenten estos desórdenes. Todos los pacientes y
participantes firmaron un consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética de la
Universidad de Los Andes, según acta 761 de 2017.
Extracción de ADN
Se realizó la extracción de ADN de la capa de leucocitos por el método de fenol: cloroformo:
alcohol isoamílico (Sambrook, Fritsch, Maniatis, & others, 1989), se probó mediante el
espectrofotómetro Nanodrop™ la concentración de ADN y que la pureza estuviera entre
valores cercanos a 1.8. Posteriormente se estandarizaron condiciones para la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para lograr la correcta amplificación de productos (Tabla 1).
Tabla 1. Iniciadores usados en la PCR para para los exones del gen F9
Iniciadores Secuencia (5´a 3´) Condiciones
PCR*
Tamaño exón (pb)
Tamaño amplicón
(pb)
FIXE1+promotorF CCCATTCTCTTCACTTGTCC 95 °C 30 s, 50 °C 45 s, 72 C° por 90 s (30X)
117 407 FIXE1+promotorR CCTAGCTAACAAAGAACCAGT
8
FIXE2-3F AGAGATGTAAAATTTTCATGATGTT 95 °C 30 s, 50 °C 90 s, 72° C por 90 s (30X)
164 - 25 514 FIXE2-3R GCAGAGAAAAAACCCACATAAT
FIXE4F GCTGGCTTCCAGGTCAGTAG 95 °C 30 s, 51 °C 30 s, 72 °C por 90 s (30X)
114 307 FIXE4R CCAGTTTCAACTTGTTTCAGAGGG
FIXE5F CATGAGTCAGTAGTTCCATGTACTTT 95 °C 30s, 60 °C 30 s, 72 °C por 90 s (30X)
129 275 FIXE5R TGTAGGTTTGTTAAAATGCTGAAGTT
FIXE6F GTGACAAGGATGGGCCTCAA 95 °C 30 s, 60 °C 30s, 72 °C por 90 s (30X)
203 432 FIXE6R TGGTTAGTGCTGAAACTTGCC
FIXE7F ATTTTGTTTTCACAGGTTGTTTTGA 95 °C 30 s, 58 °C 45 s, 72 °C por 90 s (30x)
115 150 FIXE7R TATTCTTTCTGTGTATTTACCTGCG
FIXE8-1F AGGTCAGTGGTCCCAAGTAGT 95 °C 30 s, 50 °C 90 s, 72 °C por 90 s (30x)
1,935 823 FIXE8-1R TTCCTCTAGTGGTTCCATTTTCT
FIXE8-2F TGAAAATTAACAGGGCCTCTCAC 95 °C 30 s, 54 °C 90 s, 72 °C por 90 s (30x)
1,935 867 FIXE8-2R AGCTCTTAGAATGGCTTATTGCT
FIXE8-3F CTATCAAACCCAGACTTGCTTCC 95 °C 30 s, 56 °C 45 s, 72 °C por 90 s (30x)
1,935 800
FIXE8-3R TTTTGTCAGTAGTCCCATGCATCA
9
*Las muestras fueron amplificadas bajo las mismas condiciones de PCR: 95 °C durante 2
minutos, seguido de 30 ciclos con temperatura de anillamiento variable para cada par de
iniciadores, extensión final de 72 °C por 5 min. Dado el tamaño del exón 8 (1,935 pb) fue
dividido en tres segmentos sobrelapantes: 8-1, 8-2 y 8-3.
Para la comprobación de los productos de amplificación (Anexo figura2 a y b) se realizó
electroforesis en gel de agarosa 0,8 % al cual se le adicionó 0,5 µl de colorante Gelred®, se
usó el marcador de peso HyperLadder I (1kb)™, se configuro la fuente de poder a 85 V por
60 minutos, el producto se visualizó en el fotodocumentador Gel Doc XR™, se compararon
los tamaños de las muestras amplificadas de acuerdo al tamaño de la banda dado por el
marcador de peso. Las muestras correctamente amplificadas fueron posteriormente
purificadas y secuenciadas en el Laboratorio de Secuenciación (GenCore) de la Universidad
de Los Andes mediante el método de Sanger en el analizador genético ABI prism 3500®. Se
analizaron las secuencias en búsqueda de variaciones usando Chromas v2.6®, BioEdit
v7.0.5.3® y Geneious v4.5® comparando con la secuencia de NCBI de referencia para cada
exón (coagulation factor IX, ID: 2158).
Escaneo de mutaciones en los exones de los genes FVIII y FIX mediante HRMA
Las muestras de pacientes en los que se encontraron variaciones fueron usadas como
controles positivos para probar si el método de HRM logra discriminar entre muestras de
pacientes e individuos sanos, para muestras de pacientes HB (Tabla 2) y pacientes HA
(Anexo Tabla 2) que corresponde a las variaciones encontradas por Lago et al (2018) en su
trabajo sobre Genética Molecular de la Hemofilia A y Enfermedad de von Willebrand en
pacientes de Bogotá, Colombia. El método de HRMA se realizó en un equipo LightCycler 96®
de ROCHE propiedad de Corpogen, se usó el protocolo del equipo (LightCycler 96, Manual
2016). Se utilizó MeltDoctor HRM master mix® que contiene el colorante SYTO 9, se
utilizaron 10 µl de MeltDoctor HRM master mix, 1 µl de cada primer, 6,6 µl de agua miliQ y
1 µl de ADN con una concentración estándar de 25 ng/µl. Las condiciones para la
amplificación fueron: preincubación a 95 °C 10 minutos con rampa de 4,4 °C, amplificación
en 3 pasos con denaturación a 95 °C durante 15 s, temperatura de anillamiento de los
iniciadores variable dependiendo de cada exón por 20 s, amplificación a 72 °C 20 s durante
45 ciclos, seguido de HRM a 95 °C 60 s, 40 °C 60 s con rampa de 2,2 °C/s, 65 °C 1 s, 97 °C 1 s
rampa 0,04 °C/s con un máximo de 25 lecturas/°C que corresponde al mayor número de
lecturas de fluorescencia por cada grado centígrado. Para la detección de variaciones en
exones de pacientes hombres mediante HRM es necesario mezclar con igual volumen y
concentración de ADN del paciente con ADN de un hombre sano, ya que los varones son
hemicigotos para este gen, esta mezcla asegura que el exón amplificado es heterocigoto
para la variación (Laurie, Smith, & George, 2007).
10
Mejoramiento en el análisis de HRM mediante un código de programación
Se utilizó y mejoró un código de programación Python a partir de la metodología de (Li, Lan
et al 2016 y Palais & Wittwer, 2009) para el análisis de curvas de denaturación de alta
resolución (HRMA). Una de las principales ventajas es la utilización del filtro Savitzky – Golay
el cual obtiene las curvas de denaturación usando el método de sustracción de fondo
exponencial (EBS) este enfoque propuesto genera una curva -dF/dT mucho más suave y
mejora el rendimiento y la objetividad de las mediciones generadas con el análisis HRM en
contraste con las generadas por el programa Lightcycler de ROCHE.
Por último, Se realizo el cálculo de costos para 14 pacientes en el que se comparan los
métodos para el escaneo de variaciones mediante secuenciación Sanger y HRMA (Anexo
Tabla 3). Y se elaboró un diagrama que indica en general el procedimiento para realizar el
ensayo molecular mediante HRMA.
Resultados
Análisis bioinformático de pacientes diagnosticados con hemofilia B
Se analizaron las secuencias usando los programas Chromas v2.6, Bioedit v7.0.5.3 y
Geneious v4.8.5, se ensamblaron y alinearon las secuencias de los pacientes con la
secuencia de referencia del NCBI (FXI Gene ID:2158), para probar la posible patogenicidad
de cada variación encontrada y su impacto en la función biológica de la proteína FIX, se
utilizó la herramienta bioinformática MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/).
Tres variaciones no reportadas se identificaron, dos de estas en el paciente Af1B (Tabla 2)
con un polimorfismo en la posición X,138645101,-1,T/C en el exón 8.3, una inserción de un
nucleótido (exones 7) y una en el paciente Af2B (exón 8.1) que corresponde a una deleción
de un solo nucleótido que provoca un cambio en la secuencia de aminoácidos , además se
encontró una mutación reportada presente en el exón 8-1 del paciente Am1B. En el
paciente Am1B, la mutación R384* puede producir una proteína truncada debido a los
codones de terminación prematura (CTP). Falta más del 10% de los aminoácidos en la
proteína (78 aa), lo que podría causar un “Nonsense-mediated decay” (NMD). También
puede haber cambios en el sitio de empalme.
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Tabla 2. Variaciones encontradas en pacientes HB
Código paciente
Diagnóstico Posición
SNP Exón
Efecto de la variación
dbSNP ID Género
Am1B Hemophilia B X,139561836,-1,C/T
8.1
Substitution: R384* Frameshift - PTC Mutation taster: Disease Causing
Model: complex_aae,
prob: 1
rs137852261
HGMD ID: CM94067
1
M
Af1B Hemophilia B X,138645101,-1,T/C
8.3
Mutation taster: Polymorphism
Model: without_aae, prob: 0,99
Novel F
Af1B Hemophilia B
X,138642991_138642992
insC
7
Mutation taster: Disease Causing
Model: complex_aae, prob: 1
Novel F
Af2B Hemophilia B X,
138643882,1,C/-
8.1
Mutation taster: Disease Causing
Model: complex_aae, prob: 1
Novel F
Escaneo de variaciones mediante las curvas de denaturación de alta resolución (HRMA)
Las curvas de denaturación se analizaron mediante el código de programación en Python
basados en la metodología de Li et. al (2016). Está metodología permitió la normalización
de las curvas, la extracción del ruido de fondo en el plot de curvas crudas, la identificación
de la temperatura de denaturación que se obtiene mediante la derivada negativa y, por
último, construye un plot de diferencias al sustraer una curva de referencia conocida a partir
de las curvas de fluorescencia (Li, Lan, Peng, Sun, & Zhu, 2016).
Mediante el escaneo de variaciones en los exones de los pacientes diagnosticados con HB
se encontraron perfiles de curvas distintos al tipo normal (Tabla 3), Así, por ejemplo, el exón
12
7 de la muestra Af1B, la cual presenta una inserción de un nucleótido (Figura 1a -1c) fue
evidente una curva claramente diferenciable con respecto a las muestras de individuos
sanos.
Figura 1a. Curvas de denaturación de muestras de pacientes con hemofilia B, exón 7, eje
X=Temperatura (°C), Y= Fluorescencia normalizada (RFU).
Figura 1b. Plot de derivada negativa de muestras de pacientes con hemofilia B, exón 7, (-
dF/dT), (eje X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
X,138642991_138642992insC
X,138642991_138642992insC
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Figura 1C. Plot de diferencias de muestras de pacientes con hemofilia B, exón 7, (eje
X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
También fue evidente el perfil de curva para el exón 8.3 del paciente Af1B al compararse
con 6 controles sanos, esto se puede ver en los tres tipos de figuras generadas por el
código de Python (Figura 2a – 2c)
Figura 2a. Curvas de denaturación de muestras de pacientes con hemofilia B, exón 8.3 (eje
X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
X,138645101,-1, T/C
X,138642991_138642992insC
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Figura 2b. Plot de derivada negativa de muestras de pacientes con hemofilia B, exón 8.3 (-
dF/dT), (eje X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
Figura 2c. Plot de diferencias de muestras de pacientes con hemofilia B, exón 8.3 (eje
X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
A continuación, se presentan los perfiles de curva de denaturación de dos pacientes de los
11 diagnosticados con hemofilia A, a los que igualmente se probaron exones mediante
HRM. Las figuras 3a - 3c, muestran un perfil distinto de los normales para el exón 3 del FVIII
en hombres, en este caso tanto la muestra del paciente como la muestra de este mezclada
con el ADN de un hombre sano se muestran claramente diferentes.
X,138645101,-1, T/C
X,138645101,-1, T/C
15
Figura 3a. Curvas de denaturación de de muestras de pacientes con hemofilia A, exón 3 (eje
X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
Figura 3b. Plot de derivada negativa de muestras de pacientes con hemofilia A, exón 3 (-
dF/dT), (eje X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
X,154225349,-
1,A/C
X,154225349,-
1,A/C
16
Figura 3c. Plot de diferencias de muestras de pacientes con hemofilia A, exón 3 (eje
X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
Los pacientes Af3 y Af4 de hemofilia A, para el exón 4 (Figura 4a – 4c) presentan un perfil
similar entre ellas y diferente de los controles sanos.
Figura 4a. Curvas de denaturación de muestras de pacientes con hemofilia A, exón 4 (eje
X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
X,154225349,-1,A/C
X,154221372,-1,T/C
17
Figura 4b. Plot de derivada negativa de muestras de pacientes con hemofilia A, exón 4, (-
dF/dT), (eje X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
Figura 4c. Plot de diferencias de muestras de pacientes con hemofilia A, exón 4, (eje
X=Temperatura (°C), Y=Fluorescencia normalizada (RFU)).
En la muestra Am7 en exón 3 (Figura 3a-c) se identifica la variación por medio del plot de
diferencias, siendo el cambio más notable presente en la muestra que corresponde
solamente al paciente y no a su heterocigoto artificial. No fue posible identificar la variación
X,154221372,-1,T/C
X,154221372,-1,T/C
18
en las muestras: af3 exón 2 (Anexo Figuras 6a-c) en este caso la curva no presenta un perfil
diferente de los controles sano y se mantiene dentro del rango de variación de las muestras
sin variaciones.
En las muestras Am6A y Am7A para el exón 6 (Anexo Figuras 8a - c) no fue posible identificar
un perfil de curva diferente, en este caso todas las curvas del plot de derivada negativa se
encuentran entre el patrón de variación de las curvas de los controles sanos, en el exón 16
(mujeres), las muestras Af4A y Af2A (Anexo Figura 10a - c) se pudieron diferenciar mientras
que las muestras Af1 y Af3 no son diferentes siendo el plot de diferencias el que permitió
identificar las variaciones en las otras dos muestras positivas (Af2, Af3 y Af4), en el exón 16
(hombres) (Anexo Figura 11a - c) todos las muestras con variaciones fueron diferentes del
control, finalmente las muestras para el exón 24 presentan un perfil de denaturación
distinto del tipo normal (Anexo Figuras 12a - c).
Tabla 3. Resultados de HRMA para los exones del FIX
Exón Paciente Variación HRM
7 af1B X,138642991_138642992insC V 8.1 af2B X, 138643882,1,C/- V 8.1 am1B X,139561836,-1,C/T V
8.3 af1B X,138645101,-1,T/C V
● V: validado, N: no validado
Tabla 4. Resultados de HRMA para los exones del gen FVIII
Exón Paciente Variación HRM
1 am4A X,154197826,-1,T/C V 2 af3A X,154227864,-1,G/A N 2 am2A X,154227816,-1,C/T V 3 am7A X,154225349,-1,A/C V 4 af3A X,154221372,-1,T/C V 4 af4A X,154221372,-1,T/C V 6 af2A X,154213076,-1,A/G N 6 am6A X,154213076,-1,A/G N 6 am7A X,154213076,-1,A/G N 7 am3A X,154197826,-1,T/C V
16 af1A X,154133232,-1,G/A N 16 af1A X,154133133,-1,G/A N 16 af2A X,154133227,-1,G/A V 16 af3A X,154133288,-1,G/A N
19
16 af3A X,154133239,-1,T/G N 16 af3A X,154133101,-1,C/T N 16 af4A X,154133232,-1,G/A V 16 af4A X,154133170,-1,C/T V 16 am1A X,154133297,-1,T/A V 16 am2A X,154133288,-1,G/A V 16 am3A X,154133232,-1,G/A V 16 am4A X,154133227,-1,G/A V 16 am4A X,154133200,-1,C/T V 16 am4A X,154133166,-1,T/G V 16 am5A X,154133137,-1,A/T V 24 af1A X,154090111,-1,A/T V 24 af2A X,154090111,-1,A/T V 24 am2A X,154090111,-1,A/T V 24 am3A X,154090111,-1,A/T V 24 am5A X,154090111,-1,A/T V 24 am6A X,154090111,-1,A/T V
• V: validado, N: no validado
Figura 5. Resumen de variaciones validadas y no validadas en los exones del FVIII.
20
Discusión
Variaciones encontradas en el gen FIX
El paciente Af1B es una posible portadora, sin clasificación de severidad de la enfermedad,
presenta las dos variaciones encontradas que corresponden a un polimorfismo en el exón
8.3 y una inserción del nucleótido C en el exón 7 en la posición x,1386429991_138642992
que produce una proteína fuertemente truncada. Falta más del 10% de los aminoácidos
(188 aminoácidos faltantes). El codón de parada se coloca en el aminoácido (aa) 274 en
lugar del aa 462 como en una secuencia normal o sana. Como consecuencia se predice la
pérdida del dominio peptidasa S1. También se predice la pérdida de los sitios del sistema
de transmisión de carga (aminoácidos: 315 y 411) y los sitios de puentes disulfuro
(aminoácidos: 335, 382, 396, 407, 435).
El paciente Am1B presenta un fenotipo severo de hemofilia B, con historial familiar de la
enfermedad en madre y hermanos, el paciente ha tenido prueba de inhibidores por parte
de su servicio médico siendo negativo para el desarrollo de inhibidores. La variante
patogénica rs137852261 que presenta se encuentra reportada y está asociada a la
deficiencia hereditaria del factor IX (ID HGMD: CM940671). Según el predictor Mutation
Taster, se pierde el dominio peptidasa S1. También se pierden los sitios disulfuro (396, 407,
411, 435) y de retransmisión de carga. Como se mencionó anteriormente, se pierden 78
aminoácidos carboxi-terminales restantes en el FIX, dentro de los cuales está incluido el
residuo de serina en la posición 365, uno de los principales residuos de aminoácidos que
participan en la catálisis de la serina proteasa.
Según lo informado por Ludwig et al. (1989) una transición de C a T en la cadena no
codificante puede explicar estas sustituciones de nucleótidos individuales. Los
dinucleótidos CpG son puntos calientes de mutación debido a una metilación de la citosina
seguida de una desaminación espontánea a timina. No se ha informado respuesta inmune
en el paciente Am1B como en el estudio de Ludwig et al (1989). Estos resultados indican
que ninguno de los ocho exones que codifican el factor IX parece ser crítico para la
tolerancia inmune.
Las variaciones presentadas por los pacientes Am1B y Af1B alteran el FIX, el cual se secreta
como una molécula monocatenaria de 415 residuos en la sangre, donde se activa a FIXa por
escisión proteolítica. Una única división en los aa Arg-181-Ile-182 en el FlX genera la forma
activa FIXaa, mientras que una segunda división elimina el segmento Ala-146-Arg-180 para
generar la forma activa fisiológica FIXaf3. La cadena ligera N-terminal (145 residuos) y la
cadena pesada C-terminal (235 residuos) están unidas por puentes disulfuro a través de
Cys-132-Cys-289.
La cadena ligera consta de varios módulos, que también reflejan la estructura del exón. La
cadena pesada (residuos 181-415), que es la cadena afectada en este paciente, forma el
módulo catalítico. El FIXaf3 es una proteinasa extremadamente pobre pero se convierte en
21
un potente activador del FX en la formación de complejos con su cofactor FVIIIa a través de
la unión mediada por calcio a las superficies de las células endoteliales o plaquetas activadas
(Brandstetter, Bauer, Huber, Lollar, & Bode, 1995). La pérdida de la peptidasa S1 del
dominio impide la formación de un puente salino enterrado. Asp-364 (c194), característica
de una serina proteinasa "activa", de acuerdo con el efecto desfavorable de las mutaciones
de cualquiera de los residuos FIX en la actividad de coagulación. Se recomienda realizar
estudios de expresión y análisis funcional para demostrar que estas variaciones de
secuencia afectan a la síntesis o función del FIX.
En el caso del paciente Af2B que presenta la deleción de un solo nucleótido, hay un cambio
en la secuencia de aminoácidos en la posición 347 donde cambia el aminoácido lisina por
asparagina, esta deleción produce una cambio en el marco de lectura o codones de
terminación prematura (PTC), esta deleción produce una proteína fuertemente truncada,
que puede causar un “Nonsense-mediated decay” (NMD), faltan más del 10% de los
aminoácidos de la proteína (-109 AA) estos resultados puede confirmar la expresión
fenotípica de la enfermedad.
Curvas de denaturación de alta resolución
De acuerdo a los estudios de Laurie et al (2007), Salviato et al (2019) dónde realizan la
mezcla de ADN un hombre sano y un hombre con una variación para generar un
heterocigoto artificial y detectar el heterodúplex formado es necesaria, sin embargo en este
estudio se detectó la variación de la muestra Am7A (hombre) para el exón 3 de HA, en este
caso el plot de diferencia revela una diferencia mayor de la muestra sin mezcla de ADN con
respecto a las muestras normales que el heterocigoto artificial (Figura 3a - c).
Con respecto al tamaño del amplicón que se está probando con HRMA, y según
Meistertzheim et al (2012), Gundry et al (2003) y Reed & Wittwer (2004) existe una perdida
significativa de sensibilidad para la detección de variantes en el caso de amplicones largos
(>400 bp), sin embargo, la variaciones confirmadas presentes en los exones (8.1 y 8.3) del
gen FIX de los pacientes Af2B, Am1B y Af1B fueron detectadas a pesar del tamaño del
amplicón (800 pb). En el HRMA resulta en ciertas ocasiones difícil la detección de pequeñas
inserciones y deleciones en comparación con las substituciones (Wittwer, 2009), a pesar de
esto fue posible identificar tanto la inserción de un solo nucleótido como la deleción de un
sólo nucleótido en los exones 7 y 8.1 del FIX.
Optimización del análisis HRMA mediante la implementación del código de programación
de Python
Este código permitió la identificación de la región de denaturación al extraer los datos de la
temperatura inicial de denaturación (T1) y la final de denaturación (T2) mediante las
funciones “HRMStart.m” y “HRMEnd.m, encontrando los puntos en la curva de la derivada
22
negativa en donde el ángulo se encuentra entre la tangente de los puntos y la línea base de
interés. La tangente se obtuvo usando la función “polyfit ()”. Para hallar el área del ángulo
se usó la antiderivada de la tangente.
Dado que las muestras presentan una variación en la fluorescencia ya que la curva de
denaturación no solo ocurre en función de la temperatura, la curva de denaturación
requería de la sustracción de la fluorescencia de fondo y la normalización para una mejor
precisión y una comparación más fácil de la transición de denaturación, para llevar a cabo
esto existen dos métodos para lograr la sustracción de fondo, el método de línea base y el
método de sustracción exponencial (EBS) siendo este último el implementado en el código,
el cual ofrece una solución mejor cuando el método de línea base falla. En EBS la
fluorescencia total F(T) se modela como la composición de la curva de fusión M(T) y un
fondo de decaimiento de fondo exponencial B(T). Después de la sustracción exponencial
del fondo, la curva de fluorescencia de denaturación debe presentar una pendiente
horizontal antes y después de la transición de denaturación. La normalización del nivel de
fluorescencia se puede realizar para comparar mejor la transición de fusión. Un método de
normalización ampliamente aplicado es escalar la curva a un rango de 0 y 100 con un
desplazamiento lineal mediante la aplicación de un desplazamiento lineal. En esta
implementación, la fluorescencia máxima se escala a 100 mientras que el valor mínimo de
fluorescencia se escala a 0. El desplazamiento lineal se realiza aplicando este algoritmo
Encontrar la Tm es esencial para el análisis de las variantes homocigóticas donde solo un
cambio en la Tm significa un genotipo diferente, esta se determina como el pico de la curva
derivada negativa. Primero, la función de filtro Savitzky-Golay se usa para derivar las
primeras curvas derivadas y, posteriormente, los valores se cambian a negativos.
Mediante el plot de diferencias se logró visualizar mejor los perfiles de denaturación en los
casos en los cuales los plot de las curvas de denaturación o de derivada negativa no lo
permitían. En este tipo de plot se amplifican las diferencias en las formas de las curvas de
denaturación. La curva de referencia también conocida como línea de base o curva conocida
correspondía a los controles sanos y en los casos en los que se probó con más de uno de
estos, correspondía al promedio de todas las curvas de tipo (sanos) para facilitar los grupos
alrededor del eje horizontal, de esta forma se logró que los grupos de genotipos distintivos
sean más fáciles y más precisos de identificar. Para la curva de referencia conocida, las
gráficas de diferencia se obtuvieron restando sistemáticamente todas las curvas de
denaturación con respecto a la curva de referencia. Para la curva de referencia mediana, la
curva de referencia mediana se obtiene al encontrar la fluorescencia mediana entre todos
los conjuntos de datos para cada punto de temperatura en la curva de denaturación usando
la función mediana. Cada curva de fusión en el conjunto de datos se resta con la curva
mediana. En el estudio actual, se utiliza la mediana compuesta.
23
Conclusiones
Se logro identificar las variaciones en los pacientes diagnosticados con hemofilia B al
describir puntualmente la afectación desde un nivel molecular que sirva como apoyo en el
diagnóstico y tratamiento de las estas personas afectadas.
El método de Análisis de curvas de denaturación de alta resolución demuestra tener éxito
para establecer la selección de exones candidatos a secuenciación y al usar el código de
programación se mejoró el rendimiento y la objetividad de las mediciones generadas con el
análisis HRMA, entre las ventajas fueron: la identificación objetiva de la Tm1 y Tm2, pues
estos representan parámetros subjetivos cuando se trabaja solo con el programa
LightCycler. Así mismo la ventaja de un código abierto permite un mejoramiento continuo
al aplicar más funciones que permitan un análisis más objetivo que no es posible en los
programas comerciales.
Teniendo en cuenta las limitaciones económicas en La implementación del método de
HRMA resulta 54 % menos costoso que la secuenciación Sanger, además implica menor
tiempo para su ejecución y no requiere de procesamiento posterior esto representa un
aspecto de gran importancia en asesoramiento genético por parte del personal médico que
contribuya a un diagnóstico preciso de la enfermedad.
24
Agradecimientos:
Este trabajo fue posible con el apoyo financiero de la Facultad de Ciencias para los proyectos
semilla de Juliana Lago y Diana Polanía Villanueva, a la convocatoria de terminación de
producto de la Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andes. Agradezco
al Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de Los Andes, Helena Groot de
Restrepo por permitirme ser miembro del laboratorio, como también sus valiosos aportes
y tiempo, a Diana Polania Villanueva y Juliana Lago por su dedicación, apoyo, sugerencias y
extrema paciencia en este trabajo. A Paula Lago por su trabajo en el desarrollo y
mejoramiento del código. Al centro de investigaciones Corpogen por su colaboración
técnica, en especial a los investigadores Dayana Calderón y Adán Ramírez por su tiempo y
colaboración. A mis compañeros de Laboratorio: Andrea Rodríguez, Adriana Galván, Ángela
Gonzáles, Diana Narváez y Wilmer Gutiérrez. A mi familia, mi hermana Andrea Navas por
apoyarme en todo el proceso de formación del posgrado. Gracias.
(Zimmerman & Valentino, 2013) (Martinuzzo, 2017) (Baute, Alfonso, Salabert, Águila, & Zamora, 2011) (Hoffman et al., 2013) (Lee, Berntorp, & Hoots, 2011) (Nießner, Denzau, Peichl,
Wiltschko, & Wiltschko, 2014)(Radic et al., 2015) (Fabián Amador-Medina & Vargas-Ruiz, 2013) (Swystun & James, 2015) (Goodeve, 2015)(Mauro, Bonetti, Balter, Poli, & Cesaro,
2016)(Erali, Voelkerding, & Wittwer, 2008; Erali & Wittwer, 2010; Palais & Wittwer, 2009)(Erali et al., 2008; Erali & Wittwer, 2010)(J. L. Montgomery, Sanford, & Wittwer, 2010; J.
Montgomery, Wittwer, Kent, & Zhou, 2007)(Ludwig et al., 1989)(Salviato, Belvini, Radossi, & Tagariello, 2019)(Gundry et al., 2003)(Krypuy et al., 2007)
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28
Anexos:
Figura 1. Formación de cuatro dúplex a partir de un heterocigoto (Taylor, 2009).
29
Tabla 1. Características clínicas de pacientes con hemofilia B.
Código paciente
Sexo Edad Tipo de sangre
Diagnóstico Historia familiar
Asesoramiento genético
Clasificación de la
enfermedad FIX(%) TP(s) TPT(s)
am1B M 42 0 Hemofilia B Madre y
Hermanos No Severa 0,1 / /
af1B F 49 B Posible
portadora Madre y
Hermanos No
Sin clasificación
1,5 11,1 38,1
af2B F 42 0 Hemofilia B Sin
antecedentes
No Sin
clasificación / / /
am2B M 31 0 Hemofilia B Madre No Severa / / /
/ = sin información.
Información suministrada por los pacientes, se resumen las características clínicas. Factor de
coagulación FIX(%); Tiempo de protrombina (TP); Tiempo parcial de tromboplastina (TPT) .
30
Estandarización de condiciones de PCR para los exones del FIX
Figura 2a. Visualización del producto amplificado de PCR para el exón 7 del gen FIX para las
muestras Af1B (92B) y AF3B (97B).
Figura 2b. Visualización del producto amplificado de PCR para el exón 8.3 del gen FIX para
las muestras af1B (92B2) y af2B (94B1).
31
Tabla 2. Variaciones encontradas en el estudio de Lago Martínez (2018), en pacientes con
hemofilia A.
Muestra Sexo Exón del FVIII Variación
Am8 M 1 X,154250950,-1,C/T
Am4 M 2 X,154227816,-1,C/T
Af5 F 2 X,154227864,-1,G/A
Am11 M 3 X,154225349,-1,A/C
Af5 F 4 X,154221372,-1,T/C
Af7 F 4 X,154221372,-1,T/C
Af2 F 6 X,154213076,-1,A/G
Am10 M 6 X,154213076,-1,A/G
Am11 M 6 X,154213076,-1,A/G
Am6 M 7 X,154197826,-1,T/C
Am11 M 8 X,154194806,-1,A/C
Af1 F 16 X,154133232,-1,G/A
Af1 F 16 X,154133133,-1,G/A
Af2 F 16 X,154133227,-1,G/A
Am3 M 16 X,154133297,-1,T/A
Am3 M 16 X,154133288,-1,G/A
Am3 M 16 X, 154133112,-1,T/G
Af5 F 16 X,154133288,-1,G/A
Af5 F 16 X,154133239,-1,T/G
Af5 F 16 X,154133101,-1,C/T
Am6 M 16 X,154133232,-1,G/A
Af7 F 16 X,154133232,-1,G/A
Af7 F 16 X,154133170,-1,C/T
Am8 M 16 X,154133227,-1,G/A
Am8 M 16 X,154133200,-1,C/T
Am8 M 16 X,154133166,-1,T/G
Am9 M 16 X,154133137,-1,A/T
32
Af1 F 24 X,154090111,-1,A/T
Af2 F 24 X,154090111,-1,A/T
Am4 M 24 X,154090111,-1,A/T
Am6 M 24 X,154090111,-1,A/T
Am9 M 24 X,154090111,-1,A/T
Am10 M 24 X,154090111,-1,A/T
Tabla 3. Comparación de costos en el escaneo de mutaciones mediante secuenciación
Sanger y HRMA, los cálculos se realizan hipotéticamente para 14 pacientes. El método de
HRMA resulta ser 54 % menos costoso y de menor tiempo de procesamiento de la muestra
que la secuenciación Sanger.
Reactivo costo (COP)/reacción costo (COP) por 15
pacientes Total
Master mix PCR 2.300 662.400
Secuenciación Sanger 47.000 13´536.000 14´198.40
0
HRM Master mix 4.090 3´538.944
Sello + placa 7446 + 64480
71.926 * 4´186.278 7´725.222
* para 14 pacientes con hemofilia A son 24 exones, y 3 con hemofilia B son 8 exones, total
exones = 288, en una qPCR por triplicado equivale a 864, en una placa de 96 pozos se
necesitarían 9 placas.
33
Variaciones probadas en hemofilia B mediante curvas de denaturación de alta resolución
HRMA
Figura 3a
Figura 3b.
Figura 3c.
X,139561836,-1,C/T
X,139561836,-1,C/T
X,139561836,-1,C/T
34
Exón 8.1 Mujeres
Figura 4a
Figura 4b
Figura 4c
X, 138643882,1,C/-
X, 138643882,1,C/-
X, 138643882,1,C/-
X, 138643882,1,C/-
35
Variaciones probadas en hemofilia A mediante curvas de denaturación de alta resolución
HRMA
Exón 1 Hombres
Figura 5a.
Figura 5b
Figura 5c
X,154197826,-1,T/C
X,154197826,-1,T/C
X,154197826,-1,T/C
36
Exón 2 Mujeres
Figura 6a
Figura 6b
Figura 6c
X,154227864,-1,G/A
X,154227864,-1,G/A
X,154227864,-1,G/A
37
Exón 2 hombres
Figura 7a
Figura 7b
Figura 7c
X,154227816,-1,C/T
X,154227816,-1,C/T
X,154227816,-1,C/T
38
Exón 6 hombres
Figura 8a
Figura 8b
Figura 8c
X,154213076,-1,A/G
X,154213076,
-1,A/G
X,154213076,-1,A/G
39
Exón 7 hombres
Figura 9a
Figura 9b
Figura 9c
X,154197826,-1,T/C
X,154197826,-1,T/C
X,154197826,-1,T/C
40
Exón 16 mujeres
Figura 10a
Figura 10b
Figura 10c
X,154133232,-1,G/A X,154133170,-1,C/T
X,154133227,-1,G/A
41
Exón 16 hombres
Figura 11a
Figura 11b
Figura 11c
42
Exón 24 Mujeres
Figura 12a
Figura 12b
Figura 12c
X,154090111,-1,A/T
X,154090111,-1,A/T
43
Exón 24 Hombres
Figura 13a
Figura 13b
Figura 13c
44
Procedimiento para realizar un ensayo molecular mediante HRMA que apoye el diagnóstico
clínico de pacientes con hemofilia.
