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Glosario.
Antiportador. sistema de transporte que intercambia solums.
Buffer. solución amortiguadora
Dihlisis. es un proceso que se utiliza para la el.iminación de sales principalmente y que se basa en el
establecimiento de un equilibrio de concentraciones entre dos compartimentos separados por una
membrana de diálisis.
Diltiazem. CzzHz&Jz04S droga ampliamente usada como vasodilatador.
Electroforktico. sistema de transporte que responde a un potencial de membrana eléctrico.
Epítopes. estructura específica que los anticuerpos reconoce.
Isoelectroenfoque. Técnica de separación de proteínas, la cual se basa en el hecho de que todas las
proteínas tienen una carga neta dependiente del pH. La carga neta estA determinada por la secuencia
amimoacídica de las proteínas y el pH del ambiente. Cuando una proteína es separada a través de un
m e n t e de pH establecido, migrará hasta alwuar el pH donde la carga neta de las proteinas es cero.
Liposomas. vesículas selladas formadas de fosfolípidos, es una estructura de bicapa.
Mitoplastos. Mitmndria desprovista de membrana externa.
Pellet. botón o pastilla obtenida por centrifügación.
Proteblisis. ruptura de proteínas.
Punto Isoelkctrico. pH en el cual una proteína alcanza una carga neta de cero.
Sonicaci6n. proceso de ruptura mecánica de estructuras celulares, mediante vibraciones ultrasónicas.
TMPD. tetrameeetil-p-fenilendiarmna, el cual transfiere electrones directamente al citocromo c.
Uniportador. Sistema de transporte que mueve solutos en una sola dirección.
SEPARACI~N Y CARACTERIZACION DE PROTEÍNAS MITOCONDRIALES
INVOLUCRADAS EN EL TRANSPORTE DE CALCIO.
Introduccih
En las células de organismos superiores, aproximadamente el 95% de la energía celular es
producida por las mitmndrias, las cuales están involucradas en la regulación metabólica y en la
producción eficiente de ATP, estos organelos poseen también sistemas elaborados para el transporte
de iones a través de su membrana interna. A nivel celular se ha propuesto que la mitocondria al
igual que el reticulo endoplásmico actúan como almacenes de calcio, sin embargo, se ha establecido
que este catión regula diversas funciones intramitocondriales, como la activación de tres
deshidrogenasas acopladas al transporte de electrones: a cetoglutarato deshidrogenasa, piruvato
deshidrogenasa e isocitrato deshidrogenasa. La activación de estas deshidrogenasas produce un
incremento en la velocidad de transporte de electrones y en la fosforilación del ADP, por lo tanto, es
importante elucidar los mecanismos a través del cual el calcio es captado por la mitmndria (1).
La captación de calcio por la mitocondria f i e descubierto en 1960, y fue considerado en términos
de una captación activa y una liberación pasiva.
Los mecanismos de transporte de calcio que se conocen son dos: el de entrada de calcio vía un
Uniportador, y el de salida de calcio a través de un antiportador que puede ser dependiente o
independiente de Nd (Figura 1). La vía dependiente de Na' es característica de corazón, músculo
esquelético, y cerebro. La vía independiente de Na' es característica de hígado y riñón. El antiportador
2Na'/Caz' ( pero no la vía independiente de Na' ) puede ser inhibido por varios componentes
conocidos como bloqueadores de canales de Caz' , como el diltiazem.
La captación de calcio vía un Uniportador electroforético, se favorece con el establecimiento de
un potencial de membrana negativo interno dependiente de energía y no se encuentra acoplado al
transporte de ningún otro ión. El Uniportador es activado por Caz', ADP, por varios antibióticos
aminoglucosídicos como la estreptomicina y por protaminas (2).
El uniportador exhibe cinéticas sigmoidales con respecto al Caz' extramitmndrial con una &,,
de aproximadamente 10 pM, el cual es mucho mayor que el intervalo normal de concent,raciones de
Caz' libre encontrado en el citoplasma de células animales. Se han descrito dos fibidores no
fisiológicos de la captación de Caz' mitocondrial, y son el rojo de rutenio e iones lantánidos.
Generalmente se acepta que hay un continuo reciclamiento de iones de calcio a través de la
membrana interna mibcondrial. La operación de las rutas de captura y salida son eventos separados.
La distribución de calcio a través de la membrana depende de la actividad relativa de ambas vías, a
altas concentraciones de calcio extramitocondrial la captación de calcio puede exceder a la vía de
salida. A bajas concentraciones fisiológicas la dnstribución de calcio puede alcanzar el equilibrio (3).
Desde 1982 Lehninger y colaboradores (4), se dedicaron a la investigación y caracterización del
uniportador de Caz’. Sottocasa y col. (5) aislaron una glicoproteína del espacio intennembranal la
cual une calcio con elevada afínidad. A esta proteína se le ha atribuido un papel regulador sobre la
homeostasis del calcio mitocondrial (6). En 1974 describieron una glicoproteína localizada en la
membrana interna mitocondrial la cual transporta calcio e incrementa la conductancia eléctrica en un
modelo de bicapa lipídica (7). En 1982 describieron también una glicoproteína y aislaron un péptido,
los cuales son de 40 y 2 kDa respectivamente, este transporte activo de calcio es inhibido por el rojo
de rutenio en concentraciones de 1 a 1 O pM (8).
Zazueta y col. (9) reportaron que extractos mitocondriales incorporados en Vesículas de
Citocromo Oxidasa (COV), transportan Ca”’ de una manera dependiente de energía y se encontró que
esta acumulación de calcio es también sensible al rojo de rutenio.
Saris y col. reportaron que anticuerpos inducidos contra una glicoproteína mitocondrial de
aproximadamente 20 kDa que une calcio, inhibe el transporte de calcio en mitoplastos preparados de
mitocondrias de hígado de rata. Mencionaron también que esta glicoproteína está asociada a un
pequeño canal peptidic0 y, por lo tanto, concluyen que la identificación del sistema de transporte de
calcio, es un reto que permite abrir todas las posibilidades (10).
Zazueta y col. presentaron resultados dirigidos a purificar el sistema de membrana involucrado
en el transporte de calcio mitocondrial. Un estracto parcialmente purificado, que transporta calcio con
una actividad específica de 1 194 nmol Ca2’/mg de proteínd5 minutos, fue usado para obtener suero
hiperinmune de ratones, este suero inhibió la captación de calcio en mitoplastos y en vesículas a las
que se incorporaron proteínas mitmndriales y que contienen citocromo oxidasa. Por análisis de
Western Blot de la fracción semipurificada se encontró que el suero reconoce especificamente dos
antígenos, uno de 75 kDa y otro de 20 kDa. Ambos anticuerpos fueron semipurificados por elución
de la membrana de nitrocelulosa analizando su capacidad de inhibición. El anticuerpo que reconoció a
la proteína de 20 kDa, produce el mayor grado de inhibición. Se puede inferir que la proteína de 20
kDa podría ser el uniportador de calcio, o al menos un constituyente fundamental en la transpork&jn
de calcio (1 1).
Figura 1. Representación esquemática de los mecanismos de transporte de calcio mitocondria. El
mecanismo de entrada de calcio representado como U (Uniportador); El mecanisno de salida
independiente de sadio (I) es representado como IUI intercambio de Ca2'/2H', el cual recibe energía de
la cadena transportadora de electrones (ETC); El mecanismo de salida dependiente de Na' @) el cual se indica como un intercambio de Ca2+Na+; Existe un tercer mecanismo indicado como una
salida de calcio inespecifica y es representado cano TP (transición de la permeabilidad).
OBJETIVO GENERAL.
Purificar al uniportador de calcio en mitocordrias de riñón de rata.
OBJETIVOS ESPECÍFWOS.
1.- Obtener las proteínas involucradas en el transporte de entrada de calcio en mitocondrias
utilizando anticuerpos especificos.
2.- Caracterizar a las proteínas obtenidas en base a ensayos por isoelectroenfoque para determinar
si existe interacción entre las mismas, y reconstituir el sistema de transporte en liposomas.
METAS ALCANZADAS.
Se purificaron las inmunoglobulinas (IgG’s) de los sueros hiperinmunes, y se acoplaron a una
columna de afinidad (hidrazida), logrando una eficiencia del 100%. Con ello se consiguió la
purificación de una fracción proteíca, la cual al ser sometida a un proceso de isoelectroenfoque dió
lugar a una separación de dos proteínas las cuales están involucradas en el transporte de calcio. Con
esta fracción se logró inmunizar a dos conejas de raza Nueva Zelanda y se obtuvieron anticuerpos
específicos contra dichas proteínas, con el fin de obtener cantidades adecuadas de la fracción
enriquecida para separar a los dos componentes .
METODOLOGÍA.
A.- Purificación de mitmndrias.
A partir de riñones de rata hembras Wistar, se obtuvieron mitocondrias homogenizando el tejido
con sacarosa 250mMITRIS 10mM/EDTA lmM[ a pH de 7.3 en frio, y se centrifugó a 2500 rpm por
10 minutos, el sobrenadante fue sometido a una segunda centrifugación a 10 O00 rpm durante 10
minutos y el pellet se resuspendió con sacarosa 2 5 O m " i s lOmM + albúmina bovina O. 1% a pH de
7.3 y se incubó por 10 minutos, posteriormente se centrifugó a 10 O00 rpm durante 10 minutos, se
resuspendió el pellet en sacarosa 250 mM/TRIS 10 mM obteniendo un volumen íinal de
aproximadamente 3 ml(12). Se determinó la concentración de proteínas por el método de Biuret (1 7).
B.- Preparación de partículas submitocondriales (PSM).
Se partió de mitocondrias congeladas, aproximadamente 30mg/ml, se diluyó un volumen de
mitocondrias con 4 volúmenes de sacarosa 2 5 O n W R I S lOmM/EDTA 1mM a pH de 7.3, ajustando
el pH a 8.6 con TRIS, se sonicaron alícuotas de 30 a 40 ml. (4 pulsos de 60 segundos por 30 segundos
de descanso) a una intensidad de 20 micrones, se centrifugó a 10 O00 rpm por 10 minutos, el
sobrenadante fue sometido a centrifugación a 38 O00 rpm durante 1 hora, recuperando el pellet con
sacarosa 250mM/TRIS lOmM a pH de 7.3 (13). Se le determinó la concentración de proteínas por el
método de Lowry modificado ( 18).
C.- Extracción de la F90.
Se solubilizaron las PSM, aproximadamente 150 mg/ml con colato de sodio 1.2% y sacarosa
25OmM/TRIS lOmM/EDTA 1mM a pH de 7.3. Se precipitaron con @4I&)2SO4 hasta un 50% de
saturación y se c e n ~ g ó a 10 O00 rpm durante 10 minutos, se midió el volumen del sobrenadante y
se realizó una segunda precipitación con (NH&S04 hasta un 90% de saturación, se centrifugó a
13 O00 rpm durante 15 minutos y se recuperó el pellet con sacarosa 250mMKRIS 10 mM a pH de
7.3. Se dializó la muestra con un buffer de TRtS 10 mM, se concentró la muestra con Carboximetil
celulosa (AquazideII) (1 1). Se le determinó la concentración de proteína por el método de Lowry
modificado (1 8).
1 .- Formación de anticuerpos por inmunización de la F90 a ratones cepa balbc.
Se obtuvo suero hiperinmune de ratones 1)alb-c hembras, de 6-8 semanas de edad, las cuales
fueron inmunizadas por vía subcutánea o intradermica con 40 pg de la fracción semipurificada (F90)
emulsificada con coadyuvante incompleto de Freund’s cada tres semanas. El suero de los ratones fue
almacenado a menos 20 grados centígrados. La especificidad del suero contra los componentes de la
proteína F90 fue determinada por ensayos de ELISA (Enzime-linked inmunoabsorbent assay), y
técnicas de Western Blot. El suero de cada ratón fue evaluado por separado y sólo el antisuero activo
fue utilizado (AntiUni-Cd+) (14).
2.- Purificación de inmunoglobulinas para la formación de una columna de afinidad (agarosa - proteína A) affi - gel.
2.1 .- Preparación de la muestra:
El suero activo se diluyó 1 : 1 con buffer de unión
2.2.- Purificación de las IgG de ratón:
Se llenó una columna de cromatografía de 1x10 cm. con el volumen deseado de Agarosa-
AfE gel Proteína A, la cual se equilibró con 5 volúmenes de buffer de unión llevando el pH a 9.0,
posteriormente se adicionó la muestra diluida del suero hiperinmune, lavando con 15 volumenes del
buffer de unión. Se eluyeron las proteínas con ImfTer de elución hasta asegurarse de la recuperación
total de las IgG. Después se lavó la columna cm un buffer de regeneración y se almacenó con un
buffer de PBS (Buffer de fosfato de sodio O.OlM, NaCl 0.1M) con 0.05% de azida de sodio a 4
grados centígrados.
2.3.- Inmobilización del anticuerpo.
A l a s IgG purificadas se les oxidó la fracción del carbohidrato en la región constante (FC)
con periodato de sodio (NaIO& se desaló con un buffer de intercambio acoplando a s í a las IgG a
una columna de inmunoaíiidad =-gel Hz (que forma un enlace hidrazona con el carbohidrato).
Posteriormente se calculó la eficiencia de unión de las IgG’s a la columna. Para ello se diluyó la
muestra de IgG hasta obtener valores de absorbancia entre O. 1 y 1 .O (a 280 nm en luz ultravioleta),
y se realizaron los siguientes calculos: (14).
C Proteínas totales antes del acoplamiento 1 - C Total de las proteínas acopladas1 = Total de proteínas
acopladas.
(Total de proteínas acopladas / total de proteinas antes del acoplamiento) X 100 = % de proteínas
acopladas.
Nota: El buffer de unión y el buffer de elución keron obtenidos de "gel Protein A MAPS I1
Kit: 153-6060.
D.- Utilización de la columna de afinidad de agarosa-bidrada + Antiuni-Caz', para la separación de
proteínas F90.
Se partió de 1.4 mg de proteína (F90) + 0.1% de CHAPS en 1 ml de TRIS lOmM a pH de
7.0, se aplici, a la columna de agarosa y se lavó con aproximadamente 25 volúmenes de TRIS l O m M /
CHAPS O. 1% recuperando alícuotas de l m l hasta obtener una linea basal, midiendo su absorbancia a
280 m, posteriormente se eluyeron a las proteínas afines al Antiuni-Caz+ con citrato de sodio
150mM/CHAPS0.3% hasta obtener el pico de proteína y después una lectura de cero (leyendo
también a 280 nm en luz UV), se concentraron con Aquaziden en una bolsa de diálisis, posteriormente
se dializó contra TRIS lomM a pH de 7.0 (1 1). Se le determinó la concentración de proteína por el
método de Lowry modificado ( 18).
E.- Separación por isoelectroedque.
Se recuperó el equivalente a 1 mg de proteína y se llevó a una celda preparativa de
isoelectroenfque en presencia de CHAPS 0.3% + 0.5 ml de anfolitos en un rango de pH de 5 a 8 + ghcerol, llevando a un volumen final de 55 ml con agua destilada. El proceso de isoelectroenfque se
mantuvó durante 7 horas a 12 watts constantes a 4 grados centígrados, hasta llegar al equilibrio. Se
mantuvieron los valores de equilibrio en cada corrida: 74OV/16mAmp/12W (V/H=4586). Se
recuperaron las 20 hcciones y se les deternlinó el pH ajustando las muy ácidas con TRIS.
Posteriomente se dializaron contra TRIS 10 &I a p H de 7.0 (19, a cada fracción se le determinó la
concentración de proteínas por medio de un Lowry modificado. (1 8).
F.- Determinación del transporte de Ca2+ en liposomas de citocromo oxidasa, incorporadas con
proteínas mitmndriales.
1 .- Preparación de liposomas de citocromo oxidasa.
Se tomó un volumen de fosfolípidos (30 mg/ml de asolectima de soya), se secaron con N2
gas y se disolvieron en un buffer de H3P04 5 0 M TEA a pH de 7.0, y se sonicaron a claridad. Se
incubaron con 250 pg de citocromo oxidasd ml de fosfolípidos sonicados, a 30 grados centígrados en
baño durante 10 minutos. Se congelaron con N2 líquido y se descongelaron a temperatura ambiente.
2.- Incorporación de proteínas mitmndriales.
Se diluyó 2 mg de proteína (PSM, Mitocondrias, F90 y otras fracciones purificadas) en un
buffer de &Po4 50mM mEA a pH de 7.0 + 1.2 % de colato de sodio a un volumen final de 0.250 ml,
los cuales se incorporaron a 0.5 ml de una suspención de liposomas de citocromo oxidasa. se sonid
por 3 segundos y se dializó contra un buffer de KH2P04 50 mM a pH de 7.0 durante 24 horas. Se
pasó por una columna de sephadex G-50 equilibrada contra KH2P04 , lo recuperado se centrifugó a
48 O00 rpm durante una hora, se recuperó el pellet con 0.5 ml de buffer de H3P04 50-A pH de
7.0. Se realizó la determinación de la actividad de transporte de calcio a 30 grados centígrados,
3 .- Transporte de calcio.
Para cada muestra a evaluar se prepararon tres series de tubos por duplicado de la siguiente
manera:
Solución Con Energía + Inhibidor Con Energía Sin Energía
Buffer de H3P04 50mM
0.010 ml 0.010 ml - Ascorbato 1 .O M
0.915 ml 0.925 ml 0.950 ml
I I I
TMPD 0.1M 0.010 ml 0.010 ml - I I I
Citocromo C 30 mg/ml I - 0.005 ml 0.005 m l
Ru 360 10.75pM
0.050 ml 0.050 ml 0.050 ml 45[~a2+] 1 O ~ M
0.010 ml - -
Liposomas 0.050 ml 0.050 ml 0.050 ml
La reacción se inició con liposomas y se incubó a 30 grados centígrados durante 5 minutos, se
precipitó con 0.200 ml de protamina 4mg/ml y se filtró 0.500 ml. (usando filtros millipore de 0.45 pn
de diámetro del poro), se lavó con CaClz fiio 10 mM, se secaron durante 1 minuto y se procedió a
evaluar la marca radiactiva en un contador de centelleo.
G.- Electroforesis de Laemmli para el análisis ex.perimental de las proteínas .
Se preparó un gel al 15% con buffer de TRIS/SDS pH de 8.8 + Acrilamida-bisacrilamida 30:0.8
+ agua destilada + persulfato (50 mg/ml) + TEMED, se adicionó 20 pg de cada muestra + 20 pl de
SDS (buffer de muestra). Se conió a 150 volts durante una hora aproximadamente (15).
Posteriormente se le realizó la tinción con nitrato de plata para la observación de las bandas (16).
H.- Inmunización a conejas raza ‘Nueva Zelanda” para la formación de una nueva c o l u m n a de
afinidad. Se realizó un sangrado preinmune en la oreja a dos conejas (suero control), posteriormente se les
inyectó interdigitalmente azul de evam en solución salina 0.5 ml para colorear al ganglio popliteo,
que se encuentra localizado en el hueco popliteo en las extremidades inferiores del conejo, y tiene la
propiedad de responder con una formación rápida de anticuerpos. Se inmunizó una dosis de 50 pg en
1 ml de coadyuvante completo de Freund’s (el cual contiene una bacteria muerta por calor, la
Mzcobacteriurn trrberculosis), esta dosis fue administrada de la siguiente manera: 5 pg en 0.1 ml. de
coadyuvante ( para cada ganglio) y los 40 pg restantes se aplicó intradérmico en el dorso. Se
aplicaron refuerzos a los 10 y 2 1 días con 50 pg de proteína en 1 ml de coadyuvante incompleto de
Freund’s por vía intradérmica, a los 30 días se realizó un sangrado de prueba en la oreja para
realizar ensayos de Elisa (18) y poder valorar el grado de titulación. Se aplicó un tercer y cuarto
refuerzo de 50 pg de proteína sin coadyuvante, en solución salina por vía intravenosa (vena
marginal de la oreja), se realizó un segundo sangrado de prueba y se realizó nuevamente las técnicas
de Elisa obteniendo una buena respuesta por ambas conejas, lo que nos llevó a realizar una punción
cardíaca recuperando 60 ml de sangre de cada una. Se centrifugó a 3 O00 rpm durante 10 minutos
para la obtención del suero. El suero fue almacenado a menos 20 grados centígrados hasta su
posterior utilización ( 14).
RESULTADOS.
as proteínas que son reconocidas por los anticuerpos acoplados a la columna de afinidad (figura
2), presentaron actividad de transporte de calcio al ser reconstituidos en un sistema de liposomas que
pueden formar un potencial de membrana negativo interno. Aunque estas proteínas se aislaron en
bajas concentraciones, se copurificaron junto con otras proteínas. Una de estas proteínas fue el
citocromo C (figura 3), cuyo punto isoe1éctric:o (PI) es de entre 9.5 - 10.0. La presencia de esta
proteína en los extractos que reconstituímos en los liposomas, podría ser la causa del incremento en la
actividad de transporte de calcio observado. El citocromo c necesita de electrones provenientes del
ascorbato y TMPD para donarlos a la citocromo oxidasa y formar el gradiente negativo interno
necesario para que el calcio sea captado por los liposomas (figura 4). De ser así, la estimulación de la
citocromo oxidasa podría estar generando una acumulación del catión independiente de la presencia
del uniportador. Sin embargo, esta idea f i e descartada ya que el citocromo c f i e eliminado
experimentalmente al someter a la fracción purificada a una separación por isoelectroedque en fase
líquida (figura 5).
Cada fracción obtenida del isoelectroenfcque se incorporó a un sistema de liposomas con
citocromo oxidasa, y se observó que la mayor acqividad de transporte fue de 14,888.00 nmol Caz'/mg
de proteína/ 5 minutos en proteínas que presentan un punto isoeléctrico entre 5.0 y 5.4, y un peso
molecular de entre 14 y 18 kDa preferencialmente (figura 6). A cada fracción se le determinó la
concentración de proteínas por el método de Lowry modificado y se observó que las proteínas que
presentan mayor actividad de transporte de calcio, se encuentran a muy bajas concentraciones
(figura 7).
Al combinar las técnicas de isoelectroenfoque y cromatografía de afinidad, se consiguió
incrementar la purificación de extractos mitmndriales de 443.00 nmol de Caz+/mg de proteína/
5 minutos hasta 14,888. O0 nmol Caz'/mg de proteína/ 5 minutos, lo que representa un total de 90
veces de purificación (Tabla 1).
Una vez que se identificaron l a s proteínas obtenidas de la separación por isoelectroenfoque
(figura 8), se decidió formar anticuerpos especificos contra las mismas utilizando conejas de raza Nueva Zelanda. El suero hiperinmune obtenido de ambas conejas, fue sometido a técnicas de Elisa
para determinar la afinidad de los anticuerpos, a l c d d o s e un titulo máximo de 1:6400.
Se hicieron ensayos de Western blot (19,20) para evaluar la especificidad de los anticuerpos a
partir de diferentes estractos mitmndriales (PSM de riñón de res y PSM de riñón de rata). Se observó
que no sólo hay reconocimiento de las dos proteínas que inmunizamos (Figura 8), sino que hay
aparentemente otras proteínas que son reconocidas por los anticuerpos en partículas submitocondriales
de rata, estas proteínas no estan presentes en el suero preinmune, lo cual nos confirma la especificidad
de los anticuerpos hacia las dos únicas proteinas que inmunizamos. La presencia de estas proteínas
puede ser el resultado de proteólisis en donde se conservan intactos los epítopes que los anticuerpos
reconocen (figura 9). Al hacer un ensayo comparativo utilizando como antigen0 partículas
submitocondriales de res se observó que sólo hay reconocimiento de dos proteínas que pesan
aproximadamente 60 y 20 kDa respectivamente (figura 10).
Posteriormente se realizaron ensayos con el suero hiperinmune para medir la capacidad
inhibitoria de los anticuerpos sobre la actividad de transporte de calcio en mitoplastos de riiIbn de
rata y corroborar si efectivamente los anticuerpos están dirigidos contra dicho transportador. Se
observó que la inhibición se lleva a cabo de una manera parcial, podríamos pensar por un lado que los
anticuerpos no pueden interaccionar con las proteínas que en mitoplastos se encuentran embebidas en
la membrana, y por lo tanto los sitios de reconocimiento se encuentran ocultos. Por otro lado, que
estos anticuerpos esten reconociendo a proteínas que no estan involucrados directamente en el
transporte calcio o quizá solo forman parte dell sistema.
En base a los resultados obtenidos, pensamos continuar utilizando estos anticuerpos para aislar
al uniportador de calcio utilizando la siguiente estrategia:
A partir de membranas de nitrocelulosa incubadas previamente con los anticuerpos, separar
cada una de las poblaciones por dilución ácida, y evaluar su capacidad inhibitoria en mitopiastos de
riñón de rata. UM vez identifhda la proteína aislar al o los componentes involucrados en el
transporte.
Figura 2. Patrón electroforético de las p r 0 t e . b que reconocen los anticuerpos acoplados a la
columna de afinidad, cada carril representa una purificación diferente en las condiciones descritas en
material y métodos.
Figura 3. Eledroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-15%) de separaciones por isoelectroenfoque en la
cual se observa la presencia de citocromo c, como contaminante, aunque no se observa el mismo patrón de
purificación, el citocromo c miga en el mismo rango de pH.
Figura 4. Esquematización del modelo de bicapa liridica (liposoma) en el cual se encuentran incorporadas
las proteínas a estudiar (representada como un triangulo), y la citocromo oxidasa (a), que genera un
gradiente negativo en el interior del liposoma al bombear protones al exterior en presencia de su sustrato
citocromo c (c), el cual recibe los electrones del donador ascorbato, TMPD (AscEMPD) generando agua.
Figura 5. Tinción con plata de la electroforesis en gel de poliacrilamida en SDS (%T=15) de las proteínas
separadas por isoelectroenfque en fase líquida. En la parte superior se encuentran los puntos isoeléctricos
(PI) de las proteínas cuando alcanzan una carga neta de cero. A la derecha se representan los pesos
moleculares.
- 24 k l h .
- 13kDa.
Figura 6. Actividad del transporte de calcio evaluado por el método de filtración de 45[Cazfi. Las proteínas fueron separadas por isoelectroenfque e incorporadas en liposomas de citocromo oxidasa.
20000
i
Figura 7. Determinación de la concentración de proteína total, tras la separación p o r isoelectroenfoque por el método de Lowry modificado.
Tabla 1. Comparación de la actividad de captación de calcio en diferentes extractos mitmndriales,
reconstituidos en liposomas de citocromo oxidasa.
Proteína
específica InCorpOrada Rendimiento Proteína Total
Actividad
(mg) nmo1ca2+/mg/5min (pg/mg P.L.) (%)
Mitocondrias 158.80 f 10.00 130.00 100.00 4000.00 I I I 1
PSM 127.13 k 13.00 130.00 33.75 1350.00
(NH4)2S04 90% 443.00 k 32.00 60.00 0.46 18.54
Columna Hz 1655.03 k 408.12 60.00 o. 122 4.90
I I I I
Isoslectroenfque 14888.0 f 2922.0 60.00 o. 10 0.20
Los valores de la actividad específica representan la diferencia entre los grados de captación
energizados y no energizados. Bajo todas las condiciones la actividad de transporte de calcio fue
inhibida por rojo de rutenio.
Podemos concluir, que al incorporar proteínas con carga positiva neta, se reconstituye el transporte de
calcio y se incrementa la actividad específica. Estas proteínas representan el 0.01% del total de
proteínas en la mitmndria.
Figura 8. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-l5%) de l a s proteínas que presentan mayor actividad de transporte de calcio.
m u e s t r a pesos moleculares
I I _"
4 1
Figura 9. Western blot de proteínas de partículas submitmndrides de riñón de rata, incubadas con diferentes diluciones del suero hiperinmune 39. A la derecha se muestra el control con suero preinmune a l a s diluciones indicadas e igualmente tratadas con el segundo anticuerpo a una dilución de 15000.
SUERO HIPERINMUNE
1500 1: 1000 1 :2000 1 :4000 1:8000
SUERO PREINMUNE
1500 1 : 1000
~ t 2 0 k d a i '
I !"- "
I '
.- I
"
Figura 10. Western blot de proteínas de partículas submitocondriales de riñón de res, incubadas a diferentes diluciones del suero hiperinmune 39. Todas heron incubadas con el segundo anticuerpo: Anti-IgG de conejo con peroxidasa conjugada, a una dilución de 1:5000.
1500
4
SUERO
1:lOOO
1 1
I I
c I
HIPERINMUNE
1 :2000 1 :4000 1 : 8000 7 r- *
Las flechas indican los pesos moleculares de las dos unicas proteínas que se inmunizaron y son de aproximadamente de 60 y 20 kDa respectivamente.
RECOMENDACIONES
Es muy importante trabajar a temperaturas bajas de 4 grados centígrados, desde la obtención de los
riñones para la conservación del tejido y a s í obtener mitmndrias bien acopladas, hasta la separación
de las proteínas, impidiendo así, que éstas se desnaturalizen.
En cuanto a la diálisis es recomendable hacer de dos a tres cambios con TRIS 10 mM a un pH de
7.0 de dos horas como mínimo hasta 24 horas., esto con el fin de eliminar las sales lo más que se
pueda ya que esto puede interferir en la purificación de las proteínas.
Para la formación de la columna, no es necesario cambiar drásticamente el pH de la columna para
la elución de las proteínas, es decir, de un pH de 7.0 a 3 .O, basta con bajar el pH de 7.0 a un rango de
5.0 - 6.0 para la recuperación de las proteínas ,afines al AntiUni-Caz". Ya que el cambio drástico de
pH puede dañar a las anticuerpos y a la columna.
En la determinación de transporte de calcio: Primero los fosfolípidos deben secarse con nitrógeno
gas para eliminar el éter en el que se encuentran disueltos, y evitar a s í la oxidación de estos. En el
momento de disolverlos, se debe de hacer de una manera lo más lento que se pueda en el vortex.
Segundo, es muy importante sonicar a claridad los fosfolípidos, en tiempos excesivamente cortos y en
volumenes pequeños, midiendo su absorbancia, hasta que esta sea aproximadamente de 0.08. Algo
sumamente importante es cuidar la temperatura a la hora de incubar los fosfolípidos con la citocromo
oxidasa, ya que esta puede alterar la capacidad de transporte de los liposomas ya formados.
CONCLUSIONES.
De acuerdo a los resultados obtenidos, se logró cumplir con los objetivos específicos, logrando
obtener proteínas involucradas en el transporte de calcio mitmndrial utilizando anticuerpos
específicos, y esto lo demostramos, haciendo los enasayos de inhibición con los anticuerpos en
mitoplastos de riñón de rata.
El que la inhibición sea parcialmente nos hace suponer que además de estas proteínas obtenidas,
existan también otras que forman parte del uniportador.
Las proteínas separadas por isoelectroenfique no forman parte de un mismo multímero, y esto lo
demostramos haciendo separaciones en geles no desnaturalizantes en donde se encontraron solamente
dos proteínas. Al caracterizar parcialmente estas proteínas se encontró que presentan pesos
moleculares de entre 60 y 20 kDa, las cuales tienen un punto isoeléctrico entre 5.0 - 5.4, y se
corroboraron los resultados presentados en 1994 por Zazueta y colaboradores, esta última proteína
se encuentra en menor concentración pero no podemos descartar el posible papel que cada una tenga
en la actividad de transporte de calcio.
Esto nos abre camino para seguir purificando al uniportador de calcio por medio de una segunda
separación por isoelectroediue o aplicando l m a técnica de electroforesis de doble dimensión, y
posteriormente poder seguir a la proteína o a los, componentes proteícos involucrados en el transporte
de entrada de calcio con un inhibidor radiactivo específico para el uniportador: Un complejo dinuclear
amino de rutenio (Ru360) que será sintetizado en el laboratorio.
BIBLIOGRAFIA.
(1) Gunter, T.E., Gunter, K.K., Shey-Shing Sbeu y Gavin,C.E., Mitochondria Calcium Transport
Physiological and PhatoZogical Relevance. Am J. Physiol. 267 (Cell Physiol): C3 134339, 1994.
(2) Gunter, T.E. y D. R. PfeifTer., Mechanisms by Which Mitochondria Transport Calcium. Am J. Physiol. 258 (Cell Physiol): C755-C786, 1990.
(3) Denton, R. M. y McCormack, J. G. C f l Transport by Mammalian Mitochondria and its Role
in Hormone Action. Am J. Physiol. 249 (Endocrinol. Metab.12): E553-E554, 1982
(4) Lehninger A., A Soluble, Heat-Labile, High AJinity Ca2+-binding Factor Extracted from Rat
Liver Mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 42:3 12-3 18, 1982.
(5 ) Sottocasa, G. L., Sandri, G., Panfili, E. y DeBernard, B. A., Glicoprotein Located in the
intermembrane Space ofRat Liver Mitochondria. FeBS Lett., 17:lOO-105, 1971.
(6) Panfili, E., Sandri, G., Sottocasa, G. L. y Liut,G., Activation of Calcium Uptake in Rat Liver
Mitochondria by Aminoglucoside Antbiotics, Eur. J. Biochem. 105:205-2 10, 1980.
(7) Carafoli, E. y Sottocasa, G. L., In Dinamics of Energy-Transducing Membranes (Eirster, L.
Stabrook, R. W. Slatter, E. C. Ed.) Elsevier Amsterdam. pp. 455-489, 1974.
(8) Mironova, G. D., Sirota, T. V., Pronevich, L. A., Trofimenko, N. V., Miranov, G. P., Grogorjev,
P. A. y Kondrashova, M.N., Isolation and Properties of Ca2+-Transporting Glycoprotein and
Peptide from BeefHeartMitochondria. J. Bionerg. Biomembr. 23:213-225, 1982.
(9) Zazueta, C., Holguin, J. A. y Ramirez, J., Calcium Transport Sensitive to Rutenium Red in
Cytochrome Oxidasa Vesicles Reconstituted wjth Mitochondria Proteins. J. Bioenerg. Biomembr.
23:889-902, 1991.
(10) Saris, N., Sirota, T., Virtanem, Y., Niva., K., Penttita, T. y Mironova, G., In Dinamics of
Energy-Transducing Membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 25: 307-3 12, 1993.
(1 1) Zazueta, C., Masso, F., Paez, A., Bravo, C., Vega, A., Montaño, L., Vazquez, M., Ramirez, J.,
y Chávez, E., Identification of 20-kDa Protein with Calcium Uptake Transport Activity
Reconstitution in Membrane Model. J. Bionerg. Biomembr. 5:555-562, 1994.
(12) Chavez, E., Briones,R., Bravo,C. y Jay, D., Evidence for Involvement of Dithiol Groups in
Mitochondria Calcium Transport Studies with Calcium. Arch.Biochem.Biophys. 242: 492-497,
1995.
(13) Lee, C. P. y Ernster, I., In Symposium of Regulation OfMetabolic Process in Mitochondrial.
(tager, J., Papa, S., Quaghanello, E. y Slater, E., Eds) Elsevierhlorth Holland. New York. 17:216-
234, 1985.
(14) Hudson, L. y Hay, F. C., In Practical Inmunology, 3h Edition, Blackweell Scientific
Publications. New York, pp 207-216, 371-375, 1994.
(15) Hames, B.D. y Rickwood, D., In Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach, 2nd
Edition, Ed. Ir1 Press, New York, pp 119-123, 1992.
(16) Oakley, B.R., Kirsch, D.R. y Moms, N.R., Silver Stain of Proteins in Acrylamide Gel.
Electrophoresis. Anal. Biochem. 105:361, 1980.
(17) G o d , A. G., Barwill, C.1 y David, M.M., Determination of Serum Proteins by Mean of
Biuret Reaction.. J. Biol. Chem. 177:751-757, 1949.
(18) Engvall, E., y Perlmann, P. In Immunochemistry. 8a. Edition, Ed. Ir1 Press, New York, 1971.
(19) D. Catty, In Antibodies. A Praaactical Approach. Vol . 1 Ed. Ir1 Press, Word England, pp
162-167, 1989.
(20) Towbin, H., Staehelin, T. y Gordon, J. Electrophoretics transfer ofproteins ro nitrocelullose
sheetsfrom polyacrylamide gels. Proc.Nat1. Acad. Sci. USA 76: 43504354, 1979.
