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GUIacuteA PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO

DE PARAacuteSITOS DEL GEacuteNERO Plasmodium spp

DIRECCIOacuteN REDES EN SALUD PUacuteBLICA

SUBDIRECCIOacuteN LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA

GRUPO DE PARASITOLOGIacuteA 2017

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Direccioacuten

Martha Lucia Ospina Martiacutenez Directora General Instituto Nacional de Salud

Coordinacioacuten

Mariacutea Alexandra Duraacuten Romero Director Teacutecnico (E)

Redes en Salud Puacuteblica

Rosa Elvinia Rodriacuteguez Rodriacuteguez Subdirectora (E)

Laboratorio Nacional de Referencia

Martha Ayala Sotelo Coordinadora

Grupo de Parasitologiacutea Subdireccioacuten Laboratorio Nacional de Referencia

Direccioacuten Redes en Salud Puacuteblica

Omayda Caacuterdenas Bustamante Equipo Teacutecnico

Subdireccioacuten Laboratorio Nacional de Referencia Direccioacuten de Redes en Salud Puacuteblica

Elaborado por Liliana Jazmiacuten Corteacutes Corteacutes Angela Patricia Guerra Vega

Grupo de Parasitologiacutea Subdireccioacuten Laboratorio Nacional de Referencia (SLNR)

Direccioacuten Redes en Salud Puacuteblica

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TABLA DE CONTENIDO

OBJETIVOS DE LA GUIacuteA 5

ALCANCE 5

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS 6

1 GENERALIDADES 8

11 Agente etioloacutegico 8

12 Modo de transmisioacuten 8

13 Prevencioacuten 8

2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 9

21 Bioseguridad 9

22 Toma de muestras 9

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte 10

24 Documentacioacuten requerida 12

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico 12

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica 12

252 Diagnoacutestico molecular 13

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp 15

3 CONTROL DE CALIDAD 17

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) 17

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) 17

4 VIGILANCIA POR LABORATORIO DE Plasmodium spp 18

41 Vigilancia parasitoloacutegica 18

42 Vigilancia de Plasmodium falciparum con mutaciones en el gen k13 asociadas con resistencia a artemisininas 18

5 ESTRUCTURA Y FUNCIONES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS

(RNL) PARA EL EVENTO 19

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51 Integrantes de la Red Nacional de Microscopiacutea Para la vigilancia de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp 20

52 Funciones 20

521 Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social 20

522 Instituto Nacional de Salud 20

523 Direcciones Territoriales de Salud 21

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) 21

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal 21

6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 23

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OBJETIVOS DE LA GUIacuteA Describir los lineamientos y el proceso de vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp Establecer los procesos de obtencioacuten conservacioacuten y transporte de las muestras para la deteccioacuten del Plasmodium spp Describir los fundamentos teacutecnico-cientiacuteficos de los meacutetodos de ensayos empleados para el diagnoacutestico por laboratorio del Plasmodium spp Describir los criterios teacutecnico-operativos para la participacioacuten en el programa interlaboratorio de control de calidad para la evaluacioacuten del desempentildeo externo directo e indirecto Precisar coacutemo se articula la red nacional de laboratorios para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp asiacute como describir las funciones y responsabilidades en cada uno de los niveles

ALCANCE La presente guiacutea aplica para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp en diferentes matrices y meacutetodos con los cuales se detectan en el laboratorio nacional de referencia del INS

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DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Diagnoacutestico parasitoloacutegico el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se realiza por el laboratorio mediante visualizacioacuten directa de la especie parasitaria infectante presente en sangre (Plasmodium spp Trypanosoma sp Mansonella ozzardi) por medio de examen microscoacutepico de gota gruesa y extendido de sangre como meacutetodo complementario

Extendido de sangre peliacutecula delgada de sangre que se fija en una laacutemina portaobjeto y que sirve como herramienta complementaria del diagnoacutestico realizado en la gota gruesa ya que permite la observacioacuten microscoacutepica de la morfologiacutea globular y parasitaria intacta Pude ser tentildeida con cualquier colorante derivado de Romanowsky

Gota gruesa es un examen de laboratorio para determinar microscoacutepicamente la presencia de hemoparaacutesitos en una muestra de sangre concentrada la cual es coloreada con los derivados de Romanowsky y permite la identificacioacuten cualitativa y cuantitativa del paraacutesito La gota gruesa es el meacutetodo de referencia o Gold Estaacutendar para el diagnoacutestico de malaria

Malaria es una enfermedad con manifestaciones agudas y croacutenicas causada por protozoarios del geacutenero Plasmodium spp de los cuales cinco especies son productoras de malaria humana en el mundo P falciparum P vivax P malariae P ovale y recientemente P knowlesi Los paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp son transmitidos al humano a traveacutes de la picadura de la hembra del vector Anopheles la cual se infecta al realizar una ingesta de sangre de un paciente infectado con gametocitos de Plasmodium El vector una vez infectado y al ingerir nuevamente sangre de un nuevo hueacutesped inocula esporozoitos infectantes dando lugar al ciclo de vida del paraacutesito en el humano La transmisioacuten tambieacuten puede ocurrir ocasionalmente por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados (transfusioacuten sanguiacutenea o accidente de laboratorio) y por transmisioacuten vertical de madre a hijo El cuadro cliacutenico claacutesico consiste en escalofriacuteo fiebre y sudoracioacuten El ataque agudo inicia con accesos febriles precedidos por escalofriacuteos seguidos de intensa sudoracioacuten repetidos cada 48 o 72 horas seguacuten la especie parasitaria infectante

Poblacioacuten objeto el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se debe hacer con sospecha de la enfermedad y en general a todos los habitantes y visitantes de zonas del territorio nacional localizada en zonas tropicales y subtropicales consideradas de riesgo para la transmisioacuten de estas enfermedades Adicionalmente al laboratorio de Parasitologiacutea del Instituto Nacional de Salud llegan laacuteminas para confirmacioacuten diagnoacutestica procedentes tanto de laboratorios privados como puacuteblicos del paiacutes

Prueba raacutepida para malaria (PDR) es una prueba inmunocromatograacutefica disentildeada para el diagnoacutestico raacutepido de malaria en la cual se detectan antiacutegenos parasitarios especiacuteficos permitiendo diferenciar malaria por P falciparum y malaria por una especie diferente de P falciparum La teacutecnica utiliza anticuerpos monoclonales anclados a una membrana de nitrocelulosa los cuales capturan el complejo especiacutefico antiacutegeno-anticuerpo previamente formado

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Recuento parasitario estimacioacuten de nuacutemero de paraacutesitosl realizada en la gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica para el reporte de resultados especiacuteficamente del diagnoacutestico de malaria

Diagnoacutestico molecular de malaria herramienta diagnoacutestica que se basa en la amplificacioacuten de los aacutecidos nucleicos de los paraacutesitos causantes de la malaria siendo la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingleacutes) la teacutecnica maacutes comuacutenmente usada El diagnoacutestico molecular constituye el meacutetodo de deteccioacuten maacutes sensible ventaja que ha sido de gran utilidad en la deteccioacuten de infecciones sub-microscoacutepicas

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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Direccioacuten

Martha Lucia Ospina Martiacutenez Directora General Instituto Nacional de Salud

Coordinacioacuten

Mariacutea Alexandra Duraacuten Romero Director Teacutecnico (E)

Redes en Salud Puacuteblica

Rosa Elvinia Rodriacuteguez Rodriacuteguez Subdirectora (E)

Laboratorio Nacional de Referencia

Martha Ayala Sotelo Coordinadora

Grupo de Parasitologiacutea Subdireccioacuten Laboratorio Nacional de Referencia

Direccioacuten Redes en Salud Puacuteblica

Omayda Caacuterdenas Bustamante Equipo Teacutecnico

Subdireccioacuten Laboratorio Nacional de Referencia Direccioacuten de Redes en Salud Puacuteblica

Elaborado por Liliana Jazmiacuten Corteacutes Corteacutes Angela Patricia Guerra Vega

Grupo de Parasitologiacutea Subdireccioacuten Laboratorio Nacional de Referencia (SLNR)

Direccioacuten Redes en Salud Puacuteblica

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TABLA DE CONTENIDO

OBJETIVOS DE LA GUIacuteA 5

ALCANCE 5

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS 6

1 GENERALIDADES 8

11 Agente etioloacutegico 8

12 Modo de transmisioacuten 8

13 Prevencioacuten 8

2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 9

21 Bioseguridad 9

22 Toma de muestras 9

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte 10

24 Documentacioacuten requerida 12

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico 12

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica 12

252 Diagnoacutestico molecular 13

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp 15

3 CONTROL DE CALIDAD 17

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) 17

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) 17

4 VIGILANCIA POR LABORATORIO DE Plasmodium spp 18

41 Vigilancia parasitoloacutegica 18

42 Vigilancia de Plasmodium falciparum con mutaciones en el gen k13 asociadas con resistencia a artemisininas 18

5 ESTRUCTURA Y FUNCIONES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS

(RNL) PARA EL EVENTO 19

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51 Integrantes de la Red Nacional de Microscopiacutea Para la vigilancia de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp 20

52 Funciones 20

521 Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social 20

522 Instituto Nacional de Salud 20

523 Direcciones Territoriales de Salud 21

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) 21

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal 21

6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 23

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OBJETIVOS DE LA GUIacuteA Describir los lineamientos y el proceso de vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp Establecer los procesos de obtencioacuten conservacioacuten y transporte de las muestras para la deteccioacuten del Plasmodium spp Describir los fundamentos teacutecnico-cientiacuteficos de los meacutetodos de ensayos empleados para el diagnoacutestico por laboratorio del Plasmodium spp Describir los criterios teacutecnico-operativos para la participacioacuten en el programa interlaboratorio de control de calidad para la evaluacioacuten del desempentildeo externo directo e indirecto Precisar coacutemo se articula la red nacional de laboratorios para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp asiacute como describir las funciones y responsabilidades en cada uno de los niveles

ALCANCE La presente guiacutea aplica para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp en diferentes matrices y meacutetodos con los cuales se detectan en el laboratorio nacional de referencia del INS

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DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Diagnoacutestico parasitoloacutegico el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se realiza por el laboratorio mediante visualizacioacuten directa de la especie parasitaria infectante presente en sangre (Plasmodium spp Trypanosoma sp Mansonella ozzardi) por medio de examen microscoacutepico de gota gruesa y extendido de sangre como meacutetodo complementario

Extendido de sangre peliacutecula delgada de sangre que se fija en una laacutemina portaobjeto y que sirve como herramienta complementaria del diagnoacutestico realizado en la gota gruesa ya que permite la observacioacuten microscoacutepica de la morfologiacutea globular y parasitaria intacta Pude ser tentildeida con cualquier colorante derivado de Romanowsky

Gota gruesa es un examen de laboratorio para determinar microscoacutepicamente la presencia de hemoparaacutesitos en una muestra de sangre concentrada la cual es coloreada con los derivados de Romanowsky y permite la identificacioacuten cualitativa y cuantitativa del paraacutesito La gota gruesa es el meacutetodo de referencia o Gold Estaacutendar para el diagnoacutestico de malaria

Malaria es una enfermedad con manifestaciones agudas y croacutenicas causada por protozoarios del geacutenero Plasmodium spp de los cuales cinco especies son productoras de malaria humana en el mundo P falciparum P vivax P malariae P ovale y recientemente P knowlesi Los paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp son transmitidos al humano a traveacutes de la picadura de la hembra del vector Anopheles la cual se infecta al realizar una ingesta de sangre de un paciente infectado con gametocitos de Plasmodium El vector una vez infectado y al ingerir nuevamente sangre de un nuevo hueacutesped inocula esporozoitos infectantes dando lugar al ciclo de vida del paraacutesito en el humano La transmisioacuten tambieacuten puede ocurrir ocasionalmente por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados (transfusioacuten sanguiacutenea o accidente de laboratorio) y por transmisioacuten vertical de madre a hijo El cuadro cliacutenico claacutesico consiste en escalofriacuteo fiebre y sudoracioacuten El ataque agudo inicia con accesos febriles precedidos por escalofriacuteos seguidos de intensa sudoracioacuten repetidos cada 48 o 72 horas seguacuten la especie parasitaria infectante

Poblacioacuten objeto el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se debe hacer con sospecha de la enfermedad y en general a todos los habitantes y visitantes de zonas del territorio nacional localizada en zonas tropicales y subtropicales consideradas de riesgo para la transmisioacuten de estas enfermedades Adicionalmente al laboratorio de Parasitologiacutea del Instituto Nacional de Salud llegan laacuteminas para confirmacioacuten diagnoacutestica procedentes tanto de laboratorios privados como puacuteblicos del paiacutes

Prueba raacutepida para malaria (PDR) es una prueba inmunocromatograacutefica disentildeada para el diagnoacutestico raacutepido de malaria en la cual se detectan antiacutegenos parasitarios especiacuteficos permitiendo diferenciar malaria por P falciparum y malaria por una especie diferente de P falciparum La teacutecnica utiliza anticuerpos monoclonales anclados a una membrana de nitrocelulosa los cuales capturan el complejo especiacutefico antiacutegeno-anticuerpo previamente formado

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Recuento parasitario estimacioacuten de nuacutemero de paraacutesitosl realizada en la gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica para el reporte de resultados especiacuteficamente del diagnoacutestico de malaria

Diagnoacutestico molecular de malaria herramienta diagnoacutestica que se basa en la amplificacioacuten de los aacutecidos nucleicos de los paraacutesitos causantes de la malaria siendo la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingleacutes) la teacutecnica maacutes comuacutenmente usada El diagnoacutestico molecular constituye el meacutetodo de deteccioacuten maacutes sensible ventaja que ha sido de gran utilidad en la deteccioacuten de infecciones sub-microscoacutepicas

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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TABLA DE CONTENIDO

OBJETIVOS DE LA GUIacuteA 5

ALCANCE 5

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS 6

1 GENERALIDADES 8

11 Agente etioloacutegico 8

12 Modo de transmisioacuten 8

13 Prevencioacuten 8

2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 9

21 Bioseguridad 9

22 Toma de muestras 9

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte 10

24 Documentacioacuten requerida 12

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico 12

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica 12

252 Diagnoacutestico molecular 13

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp 15

3 CONTROL DE CALIDAD 17

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) 17

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) 17

4 VIGILANCIA POR LABORATORIO DE Plasmodium spp 18

41 Vigilancia parasitoloacutegica 18

42 Vigilancia de Plasmodium falciparum con mutaciones en el gen k13 asociadas con resistencia a artemisininas 18

5 ESTRUCTURA Y FUNCIONES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS

(RNL) PARA EL EVENTO 19

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51 Integrantes de la Red Nacional de Microscopiacutea Para la vigilancia de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp 20

52 Funciones 20

521 Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social 20

522 Instituto Nacional de Salud 20

523 Direcciones Territoriales de Salud 21

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) 21

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal 21

6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 23

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OBJETIVOS DE LA GUIacuteA Describir los lineamientos y el proceso de vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp Establecer los procesos de obtencioacuten conservacioacuten y transporte de las muestras para la deteccioacuten del Plasmodium spp Describir los fundamentos teacutecnico-cientiacuteficos de los meacutetodos de ensayos empleados para el diagnoacutestico por laboratorio del Plasmodium spp Describir los criterios teacutecnico-operativos para la participacioacuten en el programa interlaboratorio de control de calidad para la evaluacioacuten del desempentildeo externo directo e indirecto Precisar coacutemo se articula la red nacional de laboratorios para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp asiacute como describir las funciones y responsabilidades en cada uno de los niveles

ALCANCE La presente guiacutea aplica para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp en diferentes matrices y meacutetodos con los cuales se detectan en el laboratorio nacional de referencia del INS

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DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Diagnoacutestico parasitoloacutegico el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se realiza por el laboratorio mediante visualizacioacuten directa de la especie parasitaria infectante presente en sangre (Plasmodium spp Trypanosoma sp Mansonella ozzardi) por medio de examen microscoacutepico de gota gruesa y extendido de sangre como meacutetodo complementario

Extendido de sangre peliacutecula delgada de sangre que se fija en una laacutemina portaobjeto y que sirve como herramienta complementaria del diagnoacutestico realizado en la gota gruesa ya que permite la observacioacuten microscoacutepica de la morfologiacutea globular y parasitaria intacta Pude ser tentildeida con cualquier colorante derivado de Romanowsky

Gota gruesa es un examen de laboratorio para determinar microscoacutepicamente la presencia de hemoparaacutesitos en una muestra de sangre concentrada la cual es coloreada con los derivados de Romanowsky y permite la identificacioacuten cualitativa y cuantitativa del paraacutesito La gota gruesa es el meacutetodo de referencia o Gold Estaacutendar para el diagnoacutestico de malaria

Malaria es una enfermedad con manifestaciones agudas y croacutenicas causada por protozoarios del geacutenero Plasmodium spp de los cuales cinco especies son productoras de malaria humana en el mundo P falciparum P vivax P malariae P ovale y recientemente P knowlesi Los paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp son transmitidos al humano a traveacutes de la picadura de la hembra del vector Anopheles la cual se infecta al realizar una ingesta de sangre de un paciente infectado con gametocitos de Plasmodium El vector una vez infectado y al ingerir nuevamente sangre de un nuevo hueacutesped inocula esporozoitos infectantes dando lugar al ciclo de vida del paraacutesito en el humano La transmisioacuten tambieacuten puede ocurrir ocasionalmente por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados (transfusioacuten sanguiacutenea o accidente de laboratorio) y por transmisioacuten vertical de madre a hijo El cuadro cliacutenico claacutesico consiste en escalofriacuteo fiebre y sudoracioacuten El ataque agudo inicia con accesos febriles precedidos por escalofriacuteos seguidos de intensa sudoracioacuten repetidos cada 48 o 72 horas seguacuten la especie parasitaria infectante

Poblacioacuten objeto el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se debe hacer con sospecha de la enfermedad y en general a todos los habitantes y visitantes de zonas del territorio nacional localizada en zonas tropicales y subtropicales consideradas de riesgo para la transmisioacuten de estas enfermedades Adicionalmente al laboratorio de Parasitologiacutea del Instituto Nacional de Salud llegan laacuteminas para confirmacioacuten diagnoacutestica procedentes tanto de laboratorios privados como puacuteblicos del paiacutes

Prueba raacutepida para malaria (PDR) es una prueba inmunocromatograacutefica disentildeada para el diagnoacutestico raacutepido de malaria en la cual se detectan antiacutegenos parasitarios especiacuteficos permitiendo diferenciar malaria por P falciparum y malaria por una especie diferente de P falciparum La teacutecnica utiliza anticuerpos monoclonales anclados a una membrana de nitrocelulosa los cuales capturan el complejo especiacutefico antiacutegeno-anticuerpo previamente formado

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Recuento parasitario estimacioacuten de nuacutemero de paraacutesitosl realizada en la gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica para el reporte de resultados especiacuteficamente del diagnoacutestico de malaria

Diagnoacutestico molecular de malaria herramienta diagnoacutestica que se basa en la amplificacioacuten de los aacutecidos nucleicos de los paraacutesitos causantes de la malaria siendo la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingleacutes) la teacutecnica maacutes comuacutenmente usada El diagnoacutestico molecular constituye el meacutetodo de deteccioacuten maacutes sensible ventaja que ha sido de gran utilidad en la deteccioacuten de infecciones sub-microscoacutepicas

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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51 Integrantes de la Red Nacional de Microscopiacutea Para la vigilancia de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp 20

52 Funciones 20

521 Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social 20

522 Instituto Nacional de Salud 20

523 Direcciones Territoriales de Salud 21

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) 21

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal 21

6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 23

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OBJETIVOS DE LA GUIacuteA Describir los lineamientos y el proceso de vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp Establecer los procesos de obtencioacuten conservacioacuten y transporte de las muestras para la deteccioacuten del Plasmodium spp Describir los fundamentos teacutecnico-cientiacuteficos de los meacutetodos de ensayos empleados para el diagnoacutestico por laboratorio del Plasmodium spp Describir los criterios teacutecnico-operativos para la participacioacuten en el programa interlaboratorio de control de calidad para la evaluacioacuten del desempentildeo externo directo e indirecto Precisar coacutemo se articula la red nacional de laboratorios para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp asiacute como describir las funciones y responsabilidades en cada uno de los niveles

ALCANCE La presente guiacutea aplica para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp en diferentes matrices y meacutetodos con los cuales se detectan en el laboratorio nacional de referencia del INS

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DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Diagnoacutestico parasitoloacutegico el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se realiza por el laboratorio mediante visualizacioacuten directa de la especie parasitaria infectante presente en sangre (Plasmodium spp Trypanosoma sp Mansonella ozzardi) por medio de examen microscoacutepico de gota gruesa y extendido de sangre como meacutetodo complementario

Extendido de sangre peliacutecula delgada de sangre que se fija en una laacutemina portaobjeto y que sirve como herramienta complementaria del diagnoacutestico realizado en la gota gruesa ya que permite la observacioacuten microscoacutepica de la morfologiacutea globular y parasitaria intacta Pude ser tentildeida con cualquier colorante derivado de Romanowsky

Gota gruesa es un examen de laboratorio para determinar microscoacutepicamente la presencia de hemoparaacutesitos en una muestra de sangre concentrada la cual es coloreada con los derivados de Romanowsky y permite la identificacioacuten cualitativa y cuantitativa del paraacutesito La gota gruesa es el meacutetodo de referencia o Gold Estaacutendar para el diagnoacutestico de malaria

Malaria es una enfermedad con manifestaciones agudas y croacutenicas causada por protozoarios del geacutenero Plasmodium spp de los cuales cinco especies son productoras de malaria humana en el mundo P falciparum P vivax P malariae P ovale y recientemente P knowlesi Los paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp son transmitidos al humano a traveacutes de la picadura de la hembra del vector Anopheles la cual se infecta al realizar una ingesta de sangre de un paciente infectado con gametocitos de Plasmodium El vector una vez infectado y al ingerir nuevamente sangre de un nuevo hueacutesped inocula esporozoitos infectantes dando lugar al ciclo de vida del paraacutesito en el humano La transmisioacuten tambieacuten puede ocurrir ocasionalmente por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados (transfusioacuten sanguiacutenea o accidente de laboratorio) y por transmisioacuten vertical de madre a hijo El cuadro cliacutenico claacutesico consiste en escalofriacuteo fiebre y sudoracioacuten El ataque agudo inicia con accesos febriles precedidos por escalofriacuteos seguidos de intensa sudoracioacuten repetidos cada 48 o 72 horas seguacuten la especie parasitaria infectante

Poblacioacuten objeto el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se debe hacer con sospecha de la enfermedad y en general a todos los habitantes y visitantes de zonas del territorio nacional localizada en zonas tropicales y subtropicales consideradas de riesgo para la transmisioacuten de estas enfermedades Adicionalmente al laboratorio de Parasitologiacutea del Instituto Nacional de Salud llegan laacuteminas para confirmacioacuten diagnoacutestica procedentes tanto de laboratorios privados como puacuteblicos del paiacutes

Prueba raacutepida para malaria (PDR) es una prueba inmunocromatograacutefica disentildeada para el diagnoacutestico raacutepido de malaria en la cual se detectan antiacutegenos parasitarios especiacuteficos permitiendo diferenciar malaria por P falciparum y malaria por una especie diferente de P falciparum La teacutecnica utiliza anticuerpos monoclonales anclados a una membrana de nitrocelulosa los cuales capturan el complejo especiacutefico antiacutegeno-anticuerpo previamente formado

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Recuento parasitario estimacioacuten de nuacutemero de paraacutesitosl realizada en la gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica para el reporte de resultados especiacuteficamente del diagnoacutestico de malaria

Diagnoacutestico molecular de malaria herramienta diagnoacutestica que se basa en la amplificacioacuten de los aacutecidos nucleicos de los paraacutesitos causantes de la malaria siendo la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingleacutes) la teacutecnica maacutes comuacutenmente usada El diagnoacutestico molecular constituye el meacutetodo de deteccioacuten maacutes sensible ventaja que ha sido de gran utilidad en la deteccioacuten de infecciones sub-microscoacutepicas

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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OBJETIVOS DE LA GUIacuteA Describir los lineamientos y el proceso de vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp Establecer los procesos de obtencioacuten conservacioacuten y transporte de las muestras para la deteccioacuten del Plasmodium spp Describir los fundamentos teacutecnico-cientiacuteficos de los meacutetodos de ensayos empleados para el diagnoacutestico por laboratorio del Plasmodium spp Describir los criterios teacutecnico-operativos para la participacioacuten en el programa interlaboratorio de control de calidad para la evaluacioacuten del desempentildeo externo directo e indirecto Precisar coacutemo se articula la red nacional de laboratorios para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp asiacute como describir las funciones y responsabilidades en cada uno de los niveles

ALCANCE La presente guiacutea aplica para la vigilancia por laboratorio del Plasmodium spp en diferentes matrices y meacutetodos con los cuales se detectan en el laboratorio nacional de referencia del INS

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DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Diagnoacutestico parasitoloacutegico el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se realiza por el laboratorio mediante visualizacioacuten directa de la especie parasitaria infectante presente en sangre (Plasmodium spp Trypanosoma sp Mansonella ozzardi) por medio de examen microscoacutepico de gota gruesa y extendido de sangre como meacutetodo complementario

Extendido de sangre peliacutecula delgada de sangre que se fija en una laacutemina portaobjeto y que sirve como herramienta complementaria del diagnoacutestico realizado en la gota gruesa ya que permite la observacioacuten microscoacutepica de la morfologiacutea globular y parasitaria intacta Pude ser tentildeida con cualquier colorante derivado de Romanowsky

Gota gruesa es un examen de laboratorio para determinar microscoacutepicamente la presencia de hemoparaacutesitos en una muestra de sangre concentrada la cual es coloreada con los derivados de Romanowsky y permite la identificacioacuten cualitativa y cuantitativa del paraacutesito La gota gruesa es el meacutetodo de referencia o Gold Estaacutendar para el diagnoacutestico de malaria

Malaria es una enfermedad con manifestaciones agudas y croacutenicas causada por protozoarios del geacutenero Plasmodium spp de los cuales cinco especies son productoras de malaria humana en el mundo P falciparum P vivax P malariae P ovale y recientemente P knowlesi Los paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp son transmitidos al humano a traveacutes de la picadura de la hembra del vector Anopheles la cual se infecta al realizar una ingesta de sangre de un paciente infectado con gametocitos de Plasmodium El vector una vez infectado y al ingerir nuevamente sangre de un nuevo hueacutesped inocula esporozoitos infectantes dando lugar al ciclo de vida del paraacutesito en el humano La transmisioacuten tambieacuten puede ocurrir ocasionalmente por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados (transfusioacuten sanguiacutenea o accidente de laboratorio) y por transmisioacuten vertical de madre a hijo El cuadro cliacutenico claacutesico consiste en escalofriacuteo fiebre y sudoracioacuten El ataque agudo inicia con accesos febriles precedidos por escalofriacuteos seguidos de intensa sudoracioacuten repetidos cada 48 o 72 horas seguacuten la especie parasitaria infectante

Poblacioacuten objeto el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se debe hacer con sospecha de la enfermedad y en general a todos los habitantes y visitantes de zonas del territorio nacional localizada en zonas tropicales y subtropicales consideradas de riesgo para la transmisioacuten de estas enfermedades Adicionalmente al laboratorio de Parasitologiacutea del Instituto Nacional de Salud llegan laacuteminas para confirmacioacuten diagnoacutestica procedentes tanto de laboratorios privados como puacuteblicos del paiacutes

Prueba raacutepida para malaria (PDR) es una prueba inmunocromatograacutefica disentildeada para el diagnoacutestico raacutepido de malaria en la cual se detectan antiacutegenos parasitarios especiacuteficos permitiendo diferenciar malaria por P falciparum y malaria por una especie diferente de P falciparum La teacutecnica utiliza anticuerpos monoclonales anclados a una membrana de nitrocelulosa los cuales capturan el complejo especiacutefico antiacutegeno-anticuerpo previamente formado

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Recuento parasitario estimacioacuten de nuacutemero de paraacutesitosl realizada en la gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica para el reporte de resultados especiacuteficamente del diagnoacutestico de malaria

Diagnoacutestico molecular de malaria herramienta diagnoacutestica que se basa en la amplificacioacuten de los aacutecidos nucleicos de los paraacutesitos causantes de la malaria siendo la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingleacutes) la teacutecnica maacutes comuacutenmente usada El diagnoacutestico molecular constituye el meacutetodo de deteccioacuten maacutes sensible ventaja que ha sido de gran utilidad en la deteccioacuten de infecciones sub-microscoacutepicas

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Diagnoacutestico parasitoloacutegico el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se realiza por el laboratorio mediante visualizacioacuten directa de la especie parasitaria infectante presente en sangre (Plasmodium spp Trypanosoma sp Mansonella ozzardi) por medio de examen microscoacutepico de gota gruesa y extendido de sangre como meacutetodo complementario

Extendido de sangre peliacutecula delgada de sangre que se fija en una laacutemina portaobjeto y que sirve como herramienta complementaria del diagnoacutestico realizado en la gota gruesa ya que permite la observacioacuten microscoacutepica de la morfologiacutea globular y parasitaria intacta Pude ser tentildeida con cualquier colorante derivado de Romanowsky

Gota gruesa es un examen de laboratorio para determinar microscoacutepicamente la presencia de hemoparaacutesitos en una muestra de sangre concentrada la cual es coloreada con los derivados de Romanowsky y permite la identificacioacuten cualitativa y cuantitativa del paraacutesito La gota gruesa es el meacutetodo de referencia o Gold Estaacutendar para el diagnoacutestico de malaria

Malaria es una enfermedad con manifestaciones agudas y croacutenicas causada por protozoarios del geacutenero Plasmodium spp de los cuales cinco especies son productoras de malaria humana en el mundo P falciparum P vivax P malariae P ovale y recientemente P knowlesi Los paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp son transmitidos al humano a traveacutes de la picadura de la hembra del vector Anopheles la cual se infecta al realizar una ingesta de sangre de un paciente infectado con gametocitos de Plasmodium El vector una vez infectado y al ingerir nuevamente sangre de un nuevo hueacutesped inocula esporozoitos infectantes dando lugar al ciclo de vida del paraacutesito en el humano La transmisioacuten tambieacuten puede ocurrir ocasionalmente por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados (transfusioacuten sanguiacutenea o accidente de laboratorio) y por transmisioacuten vertical de madre a hijo El cuadro cliacutenico claacutesico consiste en escalofriacuteo fiebre y sudoracioacuten El ataque agudo inicia con accesos febriles precedidos por escalofriacuteos seguidos de intensa sudoracioacuten repetidos cada 48 o 72 horas seguacuten la especie parasitaria infectante

Poblacioacuten objeto el diagnoacutestico de hemoparaacutesitos se debe hacer con sospecha de la enfermedad y en general a todos los habitantes y visitantes de zonas del territorio nacional localizada en zonas tropicales y subtropicales consideradas de riesgo para la transmisioacuten de estas enfermedades Adicionalmente al laboratorio de Parasitologiacutea del Instituto Nacional de Salud llegan laacuteminas para confirmacioacuten diagnoacutestica procedentes tanto de laboratorios privados como puacuteblicos del paiacutes

Prueba raacutepida para malaria (PDR) es una prueba inmunocromatograacutefica disentildeada para el diagnoacutestico raacutepido de malaria en la cual se detectan antiacutegenos parasitarios especiacuteficos permitiendo diferenciar malaria por P falciparum y malaria por una especie diferente de P falciparum La teacutecnica utiliza anticuerpos monoclonales anclados a una membrana de nitrocelulosa los cuales capturan el complejo especiacutefico antiacutegeno-anticuerpo previamente formado

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Recuento parasitario estimacioacuten de nuacutemero de paraacutesitosl realizada en la gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica para el reporte de resultados especiacuteficamente del diagnoacutestico de malaria

Diagnoacutestico molecular de malaria herramienta diagnoacutestica que se basa en la amplificacioacuten de los aacutecidos nucleicos de los paraacutesitos causantes de la malaria siendo la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingleacutes) la teacutecnica maacutes comuacutenmente usada El diagnoacutestico molecular constituye el meacutetodo de deteccioacuten maacutes sensible ventaja que ha sido de gran utilidad en la deteccioacuten de infecciones sub-microscoacutepicas

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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Recuento parasitario estimacioacuten de nuacutemero de paraacutesitosl realizada en la gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica para el reporte de resultados especiacuteficamente del diagnoacutestico de malaria

Diagnoacutestico molecular de malaria herramienta diagnoacutestica que se basa en la amplificacioacuten de los aacutecidos nucleicos de los paraacutesitos causantes de la malaria siendo la Reaccioacuten en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingleacutes) la teacutecnica maacutes comuacutenmente usada El diagnoacutestico molecular constituye el meacutetodo de deteccioacuten maacutes sensible ventaja que ha sido de gran utilidad en la deteccioacuten de infecciones sub-microscoacutepicas

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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1 GENERALIDADES

11 Agente etioloacutegico El Plasmodium spp es un geacutenero de protozoos paraacutesitos perteneciente al filo Apicomplexa y la familia Plasmodiidae causantes del paludismo o la malaria Son paraacutesitos intracelulares capaces de multiplicarse en el hombre en el hepatocito (esquizogonia hepaacutetica) y maacutes tarde en el eritrocito (esquizogonia sanguiacutenea) Las especies productoras de malaria humana son P falciparum P vivax P malariae P ovale y P knowlesi Dentro de estas especies P falciparum es el que maacutes frecuentemente causa complicaciones y mortalidad En Colombia las especies maacutes frecuentes en zonas endeacutemicas son Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum la transmisioacuten de P malariae ocurre en focos dispersos a lo largo de la costa Paciacutefica y no existe transmisioacuten de P ovale Tambieacuten pueden ocurrir casos de infecciones mixtas definidas como infecciones simultaacuteneas por 2 especies usualmente P vivax y P falciparum (1)

12 Modo de transmisioacuten Los Plasmodium spp son transmitidos al hombre por mosquitos hembras del geacutenero Anopheles que estando infectados al picar inoculan los esporozoitos forma infectante del paraacutesito La transmisioacuten puede ocasionalmente ocurrir por inoculacioacuten directa de gloacutebulos rojos infectados por viacutea transfusional asiacute como congeacutenitamente y en forma casual por pinchazos con jeringas contaminadas (2)

13 Prevencioacuten La prevencioacuten de las picaduras de mosquito entre el atardecer y el alba constituye la primera liacutenea de defensa contra el paludismo Entre las medidas destinadas a prevenir las picaduras estaacute el uso durante la noche de mosquiteros tratados con insecticidas de larga duracioacuten y el uso de ropa de proteccioacuten y repelentes contra los insectos Algunos grupos de riesgo tales como nintildeos menores de 5 antildeos mujeres embarazadas y personas con inmunodepresioacuten deben evitar viajar a zonas con trasmisioacuten de malaria y de ser necesario el desplazamiento tener precauciones para evitar la exposicioacuten a la picadura del vector En caso de vivir en zonas endeacutemicas se debe realizar la gota gruesa dentro de los exaacutemenes prenatales y a los nintildeos con diarrea o problemas respiratorios Antes de viajar a paiacuteses o regiones con paludismo endeacutemico los viajeros deberiacutean acudir a instituciones que ofrezcan asesoramiento a viajeros para obtener informacioacuten relativa a las medidas de prevencioacuten que deberaacuten adoptar (3)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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2 DIAGNOacuteSTICO POR LABORATORIO 21 Bioseguridad La toma de muestra debe hacerse siguiendo las normas generales de asepsia antisepsia y bioseguridad En caso de remisioacuten de laacuteminas o muestras estas deberaacuten ser enviadas con todas las medidas de bioseguridad utilizando el sistema de triple embalaje

22 Toma de muestras Para el diagnoacutestico directo de malaria se deben emplear tres (3) laacuteminas dos para gotas gruesas y una para el extendido de sangre perifeacuterica Se debe tener en cuenta que la gota gruesa debe tener la muestra de sangre extendida con movimientos de N para lograr formar un cuadrado de aproximadamente 1 cm x 1 cm sobre la laacutemina portaobjeto con un grosor y homogeneidad adecuados y asiacute obtener un mayor nuacutemero de campos microscoacutepicos ideales En la misma laacutemina a una distancia de 05 cm se toma una segunda gota de sangre de la misma forma que se tomoacute la primera gota como se observa en la Figura No 1 y se repite el procedimiento anteriormente indicado Se toma la siguiente laacutemina para efectuar la otra gota gruesa la elaboracioacuten de esta segunda muestra es muy importante ya que puede ser trabajada en caso de que ocurra alguacuten accidente con la primera muestra Una gota gruesa ideal macroscoacutepicamente se observa como una capa continua y uacutenica de eritrocitos que no toca el borde de la laacutemina Figura No 1 Esquema de distribucioacuten de gotas gruesas en la laacutemina

Haciendo nuevamente presioacuten en el dedo del paciente se coloca una gota de sangre en una nueva laacutemina a una distancia de 05 cm de la identificacioacuten de la misma para realizar el extendido de sangre perifeacuterica Con la ayuda de una laacutemina extensora y con una inclinacioacuten de 30 - 40o se deja extender la sangre por capilaridad por el borde de la laacutemina la cual se hace deslizar horizontalmente hasta levantarla al final del extendido como se observa en la figura No 2

Identificacioacuten

1cm 05 cm 15 cm

Figura 1 Esquema de distribucioacuten de las gotas gruesas en la laacutemina

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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Figura No 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en laacutemina

Para evitar contaminacioacuten cruzada con sangre de otros pacientes estaacute indicado limpiar con alcohol antiseacuteptico la laacutemina con la que se realizan las gotas gruesas y el extendido Antes de realizar la siguiente toma de muestra o extendido

23 Tipo de muestra conservacioacuten almacenamiento y transporte

Para hemoparaacutesitos en laacutemina sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Para pruebas moleculares sangre impregnada en papel de filtro (100-200 microL) o sangre capilar o venosa con anticoagulante EDTA (ge200 microL)

Para pruebas raacutepidas sangre capilar o sangre venosa con EDTA

Tabla 1 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos directos

Tipo de muestra conservacioacuten

y transporte

Momento de toma de la muestra

Teacutecnica a realizar

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para FSP y GG transportar las laacuteminas a temperatura ambiente

protegidas de su posible ruptura

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG)

Coloreados con colorantes derivados de Romanowsky

Sangre total obtenida por venopuncioacuten en tubos con

EDTA (5 mL) transportar a 4 a 8 degC con refrigerantes Nota la viabilidad de los paraacutesitos es por un periodo

no mayor a 8 horas

Cualquier momento

Frotis de Sangre Perifeacuterica (FSP) Gota Gruesa (GG) Coloreados con

colorantes derivados de Romanowsky o el mismo

Figura 2 Esquema de distribucioacuten del extendido de sangre perifeacuterica en la laacutemina

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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Tabla 2 Muestras para ensayos parasitoloacutegicos indirectos

Tipo de muestra conservacioacuten y transporte y

cantidad en volumen

Momento de toma de muestra seguacuten fase de la enfermedad

Teacutecnica a realizar

Ensayos moleculares Sangre obtenida por puncioacuten digital o venosa

impregnada en papel de filtro (150-200 microl o 3 - 4 gotas)

Cualquier momento PCR anidada para deteccioacuten de

Plasmodium spp

Sangre capilar obtenida por puncioacuten digital para Pruebas raacutepidas de malaria (PDR) en caso de

remitirse para control de calidad transportarlas a temperatura ambiente

Cualquier momento Prueba raacutepida

Para el anaacutelisis patoloacutegico ante el deceso es necesaria la remisioacuten de la laacutemina de gota gruesa al laboratorio de parasitologiacutea del INS para su re-evaluacioacuten De igual manera es fundamental remitir copia de la historia cliacutenica que permita identificar la definicioacuten de malaria grave Los hallazgos en muestras de diferentes oacuterganos obtenidos durante la necropsia en casos de malaria complicada que permiten aportar con la confirmacioacuten del caso son los siguientes

Pigmento malaacuterico en hiacutegado y bazo

Granuloma malaacuterico encefaacutelico de Duumlrck

Cambio hipoacutexico-isqueacutemico cortical o edema cerebral

Dantildeo alveolar difuso-DAD edema pulmonar microtrombos de fibrina o hemorragia alveolar

Necrosis hepaacutetica focal o zonal de tipo coagulativa-cambios por shock

Fenoacutemenos hemorraacutegicos encefaacutelicos viscerales y del tracto gastrointestinal

Necrosis tubular aguda edema glomerular cilindros hemaacuteticos hialinos o granulosos micro-angiopatiacutea tromboacutetica microtrombos de fibrina sugestivos de coagulacioacuten intravascular diseminada (CID) Grados variables de engrosamiento capilar glomerular

Hallazgos por respuesta inflamatoria en el hiacutegado o el bazo

Identificacioacuten de eritrocitos parasitados

La ausencia de pigmento malaacuterico no excluye el diagnoacutestico dado que algunas complicaciones de la malaria grave carecen de hallazgos especiacuteficos y deben ser documentadas mediante historia cliacutenica con exaacutemenes de laboratorio complementarios especiacuteficamente en acidemiaacidosis metaboacutelica hiperpirexia o hipotermia deshidratacioacuten e hipoglicemia extrema y la hiperparasitemia

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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24 Documentacioacuten requerida En caso de solicitud de confirmacioacuten diagnoacutestica enviar laacutemina de gota gruesa del paciente junto con

Formato de datos baacutesicos del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica del INS

Ficha epidemioloacutegica de malaria INS 465

Resultado del LSP que remite

25 Meacutetodos de laboratorio empleados para el diagnoacutestico del agente etioloacutegico

251 Examen directo a traveacutes de Gota gruesa y extendido de sangre perifeacuterica

Precoloracioacuten y coloracioacuten Meacutetodo de Romanowsky modificado

Para el diagnoacutestico de Plasmodium spp verificar que la muestra esteacute completamente seca para que no se desprenda sumergir en solucioacuten de azul de metileno fosfatado por dos (2) segundos escurrir sobre papel absorbente en posicioacuten vertical para eliminar el exceso enjuagar con agua amortiguadora de pH 72 escurrir y proceder a colorear Para la coloracioacuten por cada laacutemina a colorear en un tubo Falcon dispensar 3 mL de agua amortiguadora una gota de solucioacuten A y una gota de solucioacuten B mezclar suavemente por inversioacuten En una laacutemina coacutencava para coloracioacuten colocar las laacuteminas con la muestra hacia abajo Adicionar la solucioacuten colorante evitando la formacioacuten de burbujas y dejar actuar por 17 minutos y colocar la laacutemina en posicioacuten vertical para secado (4) Para la lectura de la gota gruesa es necesario colocar una gota de aceite de inmersioacuten sobre la muestra y enfocar al microscopio con objetivo de 100X luego se busca un campo microscoacutepico ideal (que contenga de 10 a 20 leucocitos) y se continuacutea observando los campos adyacentes de arriba abajo o de izquierda a derecha figura No 3 Figura No 3 Lectura de la gota gruesa

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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Confirmar la positividad o negatividad de la gota gruesa asiacute

Se define una muestra negativa para hemoparaacutesitos como la ausencia de paraacutesitos despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie o especies parasitarias (infeccioacuten mixta) Luego se realiza el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000

Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (4)

Para el informe de resultados del diagnoacutestico Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp

252 Diagnoacutestico molecular La extraccioacuten del ADN del paraacutesito se realizaraacute a partir de una muestra de sangre impregnada en papel filtro o sangre anticoagulada mediante kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante Se usaraacute una hoja de bisturiacute por cada muestra y antes de comenzar el proceso con las muestras de los pacientes se haraacute el control de extraccioacuten tomando un ciacuterculo de papel filtro sin sangre y realizando el mismo procedimiento

Deteccioacuten de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp por PCR La primera reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos para determinar geacutenero seguacuten Snounou et al (5) Las condiciones de la mezcla de reaccioacuten son 2 mM MgCl2 125 μM dNTP 025 μM iniciadores y 1 unidad de enzima Taq Polimerasa El programa de amplificacioacuten consiste en una denaturacioacuten inicial a 95degC por 5 minutos un anillaje a 58degC por 2 minutos una extensioacuten a 72degC por 2 minutos y una denaturacioacuten a 94degC por 1 minuto seguido por 25 ciclos del siguiente programa 58degC por 2 minutos y 72degC por 5 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 3 (5)

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Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

15 de 24

El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

14 de 24

Tabla No 3 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de geacutenero de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de geacutenero

Iniciador Secuencia

rPLU6 Sentido 5acute- TTA AAA TTG TTG CAG TTA AAA CG -3acute

rPLU5 Antisentido 5acute- CCT GTT GCC TTA AAC TTC -3acute

La segunda reaccioacuten de PCR se realizaraacute con iniciadores especiacuteficos de especie los cuales anillan dentro de la secuencia previamente amplificada Las condiciones de la mezcla son 2 mM MgCl2 200 μM dNTP iniciadores 025 μM y 05 unidades de Taq Polimerasa El programa del termociclador seraacute una denaturacioacuten inicial a 94 degC por 4 minutos seguido por 30 ciclos de 94degC por 30 segundos 58degC por 1 minuto y 72degC por 1 minuto La extensioacuten final seraacute de 72degC por 4 minutos Las secuencias de los iniciadores se muestran en la tabla No 4

Tabla 4 Secuencias de iniciadores para la deteccioacuten de especies de Plasmodium spp

Iniciadores para deteccioacuten de especie

Iniciador Secuencia Especie

rFAL1 Sentido 5acute TTA AAC TGG TTT GGG AAA ACC AAA TAT ATT-3acute P falciparum

rFAL2 Antisentido 5acute ACA CAA TGA ACT CAA TCA TGA CTA CCC GTC-3acute

rVIV1 Sentido 5acute CGC TTC TAG CTT AAT CCA CAT AAC TGA TAC -3acute P vivax

rVIV2 Antisentido 5acute ACT TCC AAG CCG AAG CAA AGA AAG TCC TTA -3acute

rMAL1 Sentido 5acute ATA ACA TAG TTG TAC GTT AAG AAT AAC CGC -3acute P malariae

rMAL2 Antisentido 5acute AAA ATT CCC ATG CAT AAA TTA TAC AAA -3acute

Los productos de PCR para todas las reacciones seraacuten resueltos por electroforesis en gel de agarosa al 2 tentildeido con gel red y visualizados sobre luz UV Los resultados se registraraacuten en un analizador de imaacutegenes y se analizaraacuten con el software disponible en el equipo Para el reporte de resultados la PCR se considera positiva cuando se visualiza una banda de ADN en el tamantildeo esperado siempre y cuando los resultados del control negativo (ausencia de bandas) y del control positivo hayan sido los esperados El tamantildeo de ampliacioacuten variacutea de acuerdo con la especie Para P falciparum con cebadores rFAL1rFAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

205 bp Para P vivax con cebadores rVIV1 y rVIV2 el producto de amplificacioacuten esperado es de 117

pb Para P malariae con cebadores rMAL1 y rMAL2 el producto de amplificacioacuten esperado es de

144 pb

15 de 24

El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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El uso potencial de herramientas diagnoacutesticas moleculares maacutes sensibles deberaacute ser considerado solo en situaciones de baja transmisioacuten donde ya existe y estaacute ampliamente difundido el diagnoacutestico y tratamiento para malaria y la tasa de prevalencia es baja (lt10) El uso de meacutetodos diagnoacutesticos basados en la amplificacioacuten del aacutecido nucleico deberaacute fortalecer las acciones de prevencioacuten y control de la malaria y el fortalecimiento de los servicios de salud incluyendo el sistema de vigilancia El programa de malaria debe considerar el uso de estas metodologiacuteas con miras al proceso de pre-eliminacioacuten en aacutereas con baja transmisioacuten investigaciones epidemioloacutegicas y encuestas con el objetivo de mapear las infecciones sub-microscoacutepicas en aacutereas de baja intensidad de transmisioacuten Estos meacutetodos tambieacuten pueden utilizarse para la identificacioacuten de focos para medidas de intervencioacuten especiales en situaciones de eliminacioacuten (6) El uso de teacutecnicas moleculares tambieacuten se recomienda en casos especiales como deteccioacuten de infecciones submicroscoacutepicasasintomaacuteticas por Plasmodium spp en pacientes sintomaacuteticos con gota gruesa negativa yo PDR negativa con sospecha de malaria para confirmacioacuten de malaria mixta o malaria por especies distintas a P falciparum y P vivax y como apoyo al control de calidad de la microscopiacutea en situaciones discordantes (evaluacioacuten indirecta) y en la elaboracioacuten de los paneles de laacuteminas para la evaluacioacuten externa del desempentildeo directa (7)

253 Pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp Las pruebas raacutepidas se fundamentan en la deteccioacuten de antiacutegenos liberados mediante la lisis de los paraacutesitos Estos antiacutegenos se unen a anticuerpos monoclonales o policlonales La unioacuten del antiacutegeno y del anticuerpo migra a lo largo de una tira de nitrocelulosa y se ubica en una zona predeterminada de la tirilla en la cual se observaraacute una liacutenea de color violeta en caso de haber una reaccioacuten positiva es decir que se encuentre el antiacutegeno de paraacutesito Los usos potenciales de las pruebas raacutepidas para el diagnoacutestico de malaria pueden fortalecer la atencioacuten del paciente con malaria y seraacuten empleadas en los siguientes casos

Zonas de alto riesgo como medida de contingencia en brotes y epidemias cuando la capacidad de diagnoacutestico sea desbordada por las urgencias

Zonas de mediano y bajo riesgo principalmente en los laboratorios

de salud puacuteblica como complementariedad del diagnoacutestico microscoacutepico y ante la duda de una de las especies de Plasmodium spp observadas al microscopio

En general en regiones con poblacioacuten dispersa con problemas de malaria y en donde no se cuente con el diagnoacutestico microscoacutepico pero que cuente con las condiciones necesarias para mantener las caracteriacutesticas ambientales sugeridas por el fabricante de las pruebas raacutepidas (8)

Para garantizar la calidad del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp mediante el uso de pruebas raacutepidas es necesario capacitar al personal responsable de esta actividad en el manejo y cuidados de las mismas las condiciones ambientales (temperatura entre 2 a 30degC) que indique el fabricante y toda adquisicioacuten debe ser sometida al control de calidad mediante paacuteneles de sangre total en el Laboratorio Nacional de Referencia

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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Los estuches de pruebas raacutepidas que se comercialicen en Colombia deberaacuten contar con el registro sanitario y contar con la respectiva validacioacuten que acredite los atributos del meacutetodo en la deteccioacuten de P falciparum entre estos atributos encontramos una sensibilidad ge95 y una especificidad cercana al 100 y detectar otras especies parasitarias como Pvivax infeccioacuten mixta (Pvivax + P falciparum) con una sensibilidad ge90 de acuerdo a criterios OMS (9) Para el informe de resultados del diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario informar meacutetodo de diagnoacutestico (Gota gruesa extendido o prueba raacutepida) positividadnegatividad de la muestra especie parasitaria infectante y recuento parasitario en unidades paraacutesitosmicroL

Positivo se interpreta como positiva una laacutemina de gota gruesa en la que se observen formas parasitarias compatibles con especies de Plasmodium spp o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como positiva seguacuten el fabricante

Negativo se interpreta como negativa una laacutemina de gota gruesa en la que no se observen formas parasitarias compatibles con Plasmodium spp despueacutes de observar por lo menos 300 campos microscoacutepicos con objetivo 100x o una prueba raacutepida vaacutelida que cumpla con los criterios de lectura como negativa seguacuten el fabricante

Si se diagnostica una muestra positiva se debe confirmar especie descartar una posible Infeccioacuten mixta bajo los siguientes criterios

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con gametocitos de P falciparum

Observacioacuten de formas sexuadas y asexuadas de P vivax junto con formas asexuadas de P falciparum en cantidades similares de las dos especies En este caso se realiza un recuento a 100 paraacutesitos y se determina el porcentaje de cada especie Para definir infeccioacuten mixta debe observarse gt40 de formas asexuadas de P falciparum

Si persisten dudas en la especie se debe usar el extendido de sangre para observar los cambios que ocasiona el paraacutesito al gloacutebulo rojo o la morfologiacutea maacutes definida y clara de las estructuras parasitarias Realizar el recuento parasitario teniendo en cuenta la siguiente foacutermula

Nuacutemero de paraacutesitos X 8000 Nuacutemero de Leucocitos (200)

Si al contar 200 leucocitos se observan 10 o maacutes paraacutesitos aplicar la foacutermula en base a 200 leucocitos Si al contar 200 leucocitos se observan 9 o menos paraacutesitos continuar el recuento hasta llegar a los 500 leucocitos y aplicar la foacutermula en base a los 500 leucocitos Si se cuentan maacutes de 500 paraacutesitos sin llegar a contar los 200 leucocitos el recuento se daraacute por terminado cuando se finalice la lectura del uacuteltimo campo y la parasitemia debe calcularse seguacuten la foacutermula anterior (10)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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Para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es necesario realizar gota gruesa de control al paciente al diacutea 3 de inicio del tratamiento

3 CONTROL DE CALIDAD

31 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Directo (PEEDD) El PEEDD para el diagnoacutestico de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp es un ensayo de aptitud de comparacioacuten interlaboratorio de tipo simultaacuteneo cualitativocuantitativo y continuo El PEED corresponde a la evaluacioacuten a partir de un panel de diez (10) laacuteminas de gotas gruesas y extendidos de oacuteptima calidad de las especies presentes en la regioacuten con infecciones mixtas de P falciparum y P vivax y de otros hemoparaacutesitos denominadas ldquoLaacuteminas problemardquo homogeacuteneas y estables identificadas individualmente con coacutedigos irrepetibles se incluyen laacuteminas con diferentes grados de complejidad (densidad parasitaria morfologiacutea artefactos) y laacuteminas negativas Los paraacutemetros a determinar en los iacutetems de ensayo son la positividad o negatividad de las muestras la especie o especies presentes en la muestra la identificacioacuten morfoloacutegica de las formas sexuadas y asexuadas y la densidad parasitaria en los iacutetems de ensayo positivos Los paquetes son enviados por el Laboratorio Nacional de Referencia a los LSP (sin costo) y privados participantes en forma anual para que estos uacuteltimos hagan la lectura y posteriormente poder evaluar su desempentildeo Las laacuteminas son revisadas por un experto antes de su remisioacuten de tal forma que la complejidad sea similar y que la evaluacioacuten sea comparable para todos los participantes (11) Para mayor informacioacuten consultar el link wwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx La participacioacuten en Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo es una funcioacuten de los LSP Artiacuteculo 16 numeral 7 (Decreto 2323 de 2006) ademaacutes su participacioacuten contribuye en los procesos de acreditacioacuten al fortalecer los esquemas de aseguramiento de la calidad y el mejoramiento del desempentildeo analiacutetico del laboratorio Se evaluacutean los paraacutemetros de positividad y negatividad especie parasitaria y recuento parasitario (13)

32 Programa de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo Indirecto (PEEDI) La Evaluacioacuten Externa Indirecta del desempentildeo es una actividad que contribuye a la calidad del diagnoacutestico en los Laboratorios de Salud Puacuteblica razoacuten por la que se constituye en un apoyo en la vigilancia epidemioloacutegica de malaria Esta evaluacioacuten aplica para los 33 Laboratorios Departamentales y el Laboratorio Distrital de Bogotaacute de acuerdo a la endemicidad de estos eventos Los LSP deberaacuten remitir al INS

Todas las laacuteminas positivas para otras especies parasitarias (P malariae P ovale y P knowlesi

Todas las laacuteminas de infecciones mixtas

Todas las laacuteminas con recuento ge 50000 paraacutesitosmicroL

Todas las laacuteminas de pacientes que hayan fallecido con diagnoacutestico probable de malaria (14)

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4 VIGILANCIA POR LABORATORIO DE Plasmodium spp La vigilancia del Plasmodium spp consiste en identificar y describir su circulacioacuten mediante variables relacionadas con sus caracteriacutesticas genotiacutepicas su estacionalidad y los sitios en donde circula con el fin de suministrar informacioacuten que permita orientar las acciones de prevencioacuten primaria y secundaria asiacute como estrategias de control De igual manera se definiraacuten indicadores que permitiraacuten resumir estos aspectos y realizar su publicacioacuten en forma perioacutedica a traveacutes de informes teacutecnicos asiacute como en la construccioacuten de repositorios institucionales donde faacutecilmente se puedan obtener los microdatos y permitir su uso por parte de la comunicad cientiacutefica meacutedica acadeacutemica y administrativa del sistema de salud y el puacuteblico en general

41 Vigilancia parasitoloacutegica Consiste en la identificacioacuten y caracterizacioacuten de las especies circulantes en teacuterminos de especie parasitaria formas parasitarias y recuento y la relacioacuten con el comportamiento cliacutenico de la enfermedad y la oportunidad en el diagnoacutestico en los municipios del paiacutes a partir de la informacioacuten generada en los registros del laboratorio y del Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Puacuteblica (SIVIGILA) A partir de los resultados de la gota gruesa se identificaraacuten especie parasitaria formas parasitarias y recuento De igual manera se relacionaraacute la especie formas parasitarias y el recuento parasitario con las complicaciones y con datos como fecha de inicio de siacutentomas fecha de consulta fecha de diagnoacutestico y fecha de tratamiento Esta informacioacuten la generaraacuten todos los puestos de diagnoacutestico del paiacutes y seraacute revisada por los Laboratorios de Salud Puacuteblica

42 Vigilancia de Plasmodium falciparum con mutaciones en el gen k13 asociadas con resistencia a artemisininas El propoacutesito de esta vigilancia es generar evidencia e informacioacuten oportuna sobre la aparicioacuten de paraacutesitos resistentes a las artemisininas y sus derivados en el paiacutes con el fin de orientar la formulacioacuten de poliacuteticas en salud puacuteblica de competencia del sector para la prevencioacuten y control de la resistencia a los antimalaacutericos Esta vigilancia se realizaraacute de forma rutinaria en todo el territorio nacional mediante dos estrategias 1) Gota gruesa de control mediante este examen se haraacute el seguimiento parasitoloacutegico a los pacientes diagnosticados con malaria no complicada por P falciparum que hayan sido tratados con artemeter + lumefantrina (Coartem) Al diacutea tres post-tratamiento los pacientes regresaraacuten nuevamente al servicio de salud para toma de una gota gruesa de control la cual se considera positiva si se encuentran formas asexuadas del paraacutesito 2) Deteccioacuten de mutaciones en el gen k13 de P falciparum con esta vigilancia se espera detectar oportunamente la aparicioacuten de paraacutesitos que contengan mutaciones en el dominio propeller del gen kelch 13 (k13) asociadas con resistencia a artemisininas en el paiacutes Para realizar esta vigilancia se le tomaraacute una muestra de sangre al paciente con malaria no complicada por P falciparum antes que eacuteste ingiera la primera dosis del tratamiento por puncioacuten

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capilar la cual se impregnaraacute en una tarjeta de papel de filtro La tarjeta se remitiraacute desde el nivel local al LSP departamental o distrital y desde alliacute al Grupo de parasitologiacutea del INS quien realizaraacute las pruebas moleculares A la par con estos exaacutemenes al paciente se le tomaraacute gota gruesa de control al diacutea 3 post-tratamiento El grupo de parasitologiacutea presentaraacute un informe semestral de resultados y toda la informacioacuten seraacute almacenada en el Sistema de Informacioacuten del Laboratorio Nacional de Referencia

5 ESTRUCTURA Y FUNCIONES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS (RNL) PARA EL EVENTO

La Red Nacional de Laboratorios es un sistema teacutecnico gerencial cuyo objeto es la integracioacuten funcional de laboratorios nacionales de referencia laboratorios de salud puacuteblica laboratorios cliacutenicos otros laboratorios y servicios de toma de muestras y microscopia para el desarrollo de actividades de vigilancia en salud puacuteblica prestacioacuten de servicios gestioacuten de la calidad e investigacioacuten El sistema de garantiacutea de calidad del diagnoacutestico de malaria funciona en cabeza del Instituto Nacional de Salud (INS) desde 1995 seguacuten decreto 2323 de 2006 del Ministerio de la Proteccioacuten Social de Colombia El Instituto Nacional de Salud (INS) Laboratorio Nacional de Referencia como cabeza de la red de microscopiacutea en salud puacuteblica tiene por objetivo lograr la integracioacuten funcional de laboratorios nacionales de referencia laboratorios de salud puacuteblica laboratorios cliacutenicos servicios de toma de

MINISTERIO DE SALUD Y PROTECCIOacuteN SOCIAL

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

DIRECCIOacuteN REDES EN SALUD PUacuteBLICA

LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA

LABORATORIOS DE SALUD PUacuteBLICA Y SECRETARIAS DISTRITALES DE SALUD

HOSPITALES LABORATORIOS CLIacuteNICOS CENTROS DE SALUD Y PUESTOS DE DIAGNOSTICO

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muestras y microscopia para el desarrollo de la gestioacuten de la calidad entre otros procesos Por otra parte las actividades de la red cumplen con los requisitos establecidos en la normatividad ISO 17025 del 2005 numeral 59 referente al aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo en la cual se menciona que el laboratorio debe tener procedimientos de control de calidad para realizar el seguimiento de la validez de los ensayos y las calibraciones llevadas a cabo dicho seguimiento debe ser planificado y revisado y puede incluir entre otros la participacioacuten en comparaciones iacutenter laboratorios o programas de ensayo de aptitud La estructura de la Red de microscopiacutea fue definida en el capiacutetulo II del Decreto 2323 de 2006 (Estructura y funciones de la Red Nacional de Laboratorios) por el cual se reglamenta parcialmente la Ley 9ordf de 1979 en relacioacuten con la Red Nacional de Laboratorios y se dictan otras disposiciones Teniendo en cuenta lo establecido en este decreto se definen los siguientes aspectos

51 Integrantes de la Red Nacional de Microscopiacutea Para la vigilancia de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp

El Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social

El Instituto Nacional de Salud INS

Los laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital de Bogotaacute

Los laboratorios cliacutenicos y otros laboratorios de la red puacuteblica y privada que realicen anaacutelisis de intereacutes para la vigilancia en salud puacuteblica (puestos de microscopiacutea)

52 Funciones

521 Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social Dirigir la Red Nacional de Laboratorios y definir las poliacuteticas programas planes y proyectos requeridos para su adecuado funcionamiento

522 Instituto Nacional de Salud Es laboratorio de referencia del nivel nacional y los laboratorios departamentales de salud puacuteblica y del distrito capital lo seraacuten en sus respectivas jurisdicciones El Grupo de Parasitologiacutea-RNL del INS ejerceraacute la coordinacioacuten de la Red Nacional de microscopiacutea de malaria y ademaacutes de las competencias propias asignadas por ley cumpliraacute las funciones de asesoriacutea y apoyo teacutecnico al Ministerio de la Proteccioacuten Social en todo lo relacionado con la red de microscopiacutea adquisicioacuten de equipos e insumos definir los estaacutendares de calidad para el diagnoacutestico de malaria supervisar el cumplimiento de dichos estaacutendares de calidad por parte de los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del distrito capital vigilar la calidad del diagnoacutestico de malaria de las laacuteminas remitidas por los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del Distrito Capital participar en programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo con instituciones nacionales e internacionales aplicar las normas de bioseguridad en los procedimientos de laboratorio realizar la validacioacuten de reactivos pruebas diagnoacutesticas y de teacutecnicas y procedimientos analiacuteticos para el diagnoacutestico de

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malaria procesamiento de muestras para deteccioacuten de mutaciones en el gen k13 de P falciparum apoyar y promover la realizacioacuten de investigaciones en salud y en biomedicina seguacuten las necesidades del paiacutes y directrices dadas por el Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social promover y realizar actividades de capacitacioacuten en malaria realizar transferencia tecnoloacutegica prestar asesoriacutea y asistencia teacutecnica a los laboratorios de salud puacuteblica en aspectos relacionados con sus competencias e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea de malaria

523 Direcciones Territoriales de Salud Las direcciones territoriales de salud asumiraacuten la direccioacuten y coordinacioacuten de la red de laboratorios en el aacutembito departamental o distrital para lo cual deberaacuten cumplir con las siguientes funciones organizar y controlar el funcionamiento de la Red en su jurisdiccioacuten adoptar las poliacuteticas nacionales de la Red de microscopiacutea establecer los objetivos metas y estrategias de la red a nivel departamental o distrital verificar el cumplimiento de los estaacutendares de calidad de los laboratorios y puestos de microscopiacutea brindar asistencia teacutecnica a los laboratorios de su aacuterea de influencia promover y realizar actividades de capacitacioacuten en temas de intereacutes para los integrantes de la red seguacuten las necesidades garantizar la infraestructura y el talento humano necesario para el manejo de la informacioacuten del Laboratorio de Salud Puacuteblica y en general de la Red de microscopiacutea en su jurisdiccioacuten

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) Los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del Distrito Capital como laboratorios de referencia en su jurisdiccioacuten seraacuten los actores intermedios de articulacioacuten en el aacuterea de su competencia entre el nivel nacional y municipal y tendraacuten las siguientes funciones adoptar e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea establecido por el nivel nacional en los temas de su competencia adoptar e implementar en su jurisdiccioacuten el sistema de monitoreo y evaluacioacuten (certificacioacuten) de la Red de microscopiacutea acorde con los lineamientos del Ministerio de la Proteccioacuten Social implementar el sistema de gestioacuten de la calidad para garantizar la oportunidad confiabilidad y veracidad del diagnoacutestico de malaria participar en los programas nacionales de evaluacioacuten externa del desempentildeo y desarrollar programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo a nivel municipal vigilar la calidad del diagnoacutestico de malaria consolidar y enviar mensualmente al INS todas las muestras recolectadas en papel filtro que reciban de los diferentes laboratorios que se encuentren bajo su jurisdiccioacuten para anaacutelisis molecular (gen k13) con la respectiva documentacioacuten implementar los programas de bioseguridad y manejo de residuos de acuerdo con la normatividad nacional vigente cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos apoyar la investigacioacuten y control de brotes epidemias y emergencias brindar capacitacioacuten y asistencia teacutecnica a los municipios y a otras entidades participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal Los laboratorios puacuteblicos y privados de la jurisdiccioacuten municipal y redes de microscopistas tendraacuten las siguientes funciones desarrollar la gestioacuten para su integracioacuten funcional a la Red Nacional de microscopiacutea apoyar a la entidad territorial en la realizacioacuten de pruebas de laboratorio seguacuten su

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capacidad y aacuterea de especializacioacuten adoptar las directrices nacionales y territoriales que permitan su articulacioacuten al Sistema de Vigilancia en Salud Puacuteblica y su participacioacuten en el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea informar de manera obligatoria y oportuna a la Direccioacuten Local de Salud los datos y resultados de pruebas de laboratorio de intereacutes en salud puacuteblica a los interesados para la toma de decisiones participar en los programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos prestar los servicios de toma de muestra incluida la toma de muestra de sangre por puncioacuten digital (pulpejo del dedo) o venopuncioacuten en una hoja de papel filtro de los pacientes que presenten gota gruesa positiva al diacutea 3 post-tratamiento con Coartem y enviacuteo de estas tarjetas al LSP procesamiento anaacutelisis e informe de resultados de laboratorio de manera oportuna eficiente y confiable participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas Los servicios de toma de muestras y los puestos de microscopia deberaacuten adoptar y cumplir con los estaacutendares de calidad de acuerdo con la complejidad del servicio que prestan bajo la supervisioacuten y monitoreo de laboratorios departamentales (12)

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6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 1 Chaparro-Narvaez PE Loacutepez-Peacuterez M Rengifo LM Padilla J Herrera S Areacutevalo-Herrera M Clinical and epidemiological aspects of complicated malaria in Colombia 2007ndash2013 Malar J 201615 (1)269 Disponible en httpdxdoiorg101186s12936-016-1323-5 2 Alano P The emerging role of the human bone marrow as a privileged developmental niche for the transmission stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum Ann Ist Super Sanita 2017 5396-99 Disponible en httpdxdoi104415ANN_17_02_03 3 Organizacioacuten Mundial de la Salud Paludismo informacioacuten para viajeros Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2017 Disponible en httpwwwwhointmalariatravellerses 4 Instituto Nacional de Salud Fondo Mundial MCP Manual para el diagnoacutestico de malaria no complicada en puestos de diagnoacutestico y tratamiento 2015 ISBN 978-958-13-0175-1 5 Snounou G Viriyakosol S Zhu XP Jarra W Pinheiro L do Rosario VE Thaithong S Brown KN High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction Mol Biochem Parasitol 1993 61315-20 6 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en situaciones de baja transmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwusaidamiorgextrasrecomendadaporlaOMSpdf 7 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en zonas de baja trasmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozmalaria-diagnosis-low-transmission-settings-sep2014pdf 8 Organizacioacuten Mundial de la Salud Accioacuten e inversioacuten para alaria 2016-2030 Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2015 ISBN 978 92 4 150897 1 Disponible en httprollbackmalariaorgwp-contentuploads201709RBM_AIM_Report_A4_EN-Sept2015-ORGpdf 9 World Health Organization Recommended selection criteria for procurement of malaria rapid diagnostic tests WHO 2016 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozrdt-selection-criteriapdf 10 Organizacioacuten Panamericana de la Salud Memorias Taller de Capacitacioacuten y Certificacioacuten de microscopistas para paiacuteses de la regioacuten de las Ameacutericas Meacutexico DF Organizacioacuten Panamericana de la Salud 2016 11 Instituto Nacional de Salud Protocolo Programas Evaluacioacuten del Desempentildeo Bogotaacute Instituto Nacional de Salud 2016 Disponible en httpwwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx

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capilar la cual se impregnaraacute en una tarjeta de papel de filtro La tarjeta se remitiraacute desde el nivel local al LSP departamental o distrital y desde alliacute al Grupo de parasitologiacutea del INS quien realizaraacute las pruebas moleculares A la par con estos exaacutemenes al paciente se le tomaraacute gota gruesa de control al diacutea 3 post-tratamiento El grupo de parasitologiacutea presentaraacute un informe semestral de resultados y toda la informacioacuten seraacute almacenada en el Sistema de Informacioacuten del Laboratorio Nacional de Referencia

5 ESTRUCTURA Y FUNCIONES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS (RNL) PARA EL EVENTO

La Red Nacional de Laboratorios es un sistema teacutecnico gerencial cuyo objeto es la integracioacuten funcional de laboratorios nacionales de referencia laboratorios de salud puacuteblica laboratorios cliacutenicos otros laboratorios y servicios de toma de muestras y microscopia para el desarrollo de actividades de vigilancia en salud puacuteblica prestacioacuten de servicios gestioacuten de la calidad e investigacioacuten El sistema de garantiacutea de calidad del diagnoacutestico de malaria funciona en cabeza del Instituto Nacional de Salud (INS) desde 1995 seguacuten decreto 2323 de 2006 del Ministerio de la Proteccioacuten Social de Colombia El Instituto Nacional de Salud (INS) Laboratorio Nacional de Referencia como cabeza de la red de microscopiacutea en salud puacuteblica tiene por objetivo lograr la integracioacuten funcional de laboratorios nacionales de referencia laboratorios de salud puacuteblica laboratorios cliacutenicos servicios de toma de

MINISTERIO DE SALUD Y PROTECCIOacuteN SOCIAL

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

DIRECCIOacuteN REDES EN SALUD PUacuteBLICA

LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA

LABORATORIOS DE SALUD PUacuteBLICA Y SECRETARIAS DISTRITALES DE SALUD

HOSPITALES LABORATORIOS CLIacuteNICOS CENTROS DE SALUD Y PUESTOS DE DIAGNOSTICO

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muestras y microscopia para el desarrollo de la gestioacuten de la calidad entre otros procesos Por otra parte las actividades de la red cumplen con los requisitos establecidos en la normatividad ISO 17025 del 2005 numeral 59 referente al aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo en la cual se menciona que el laboratorio debe tener procedimientos de control de calidad para realizar el seguimiento de la validez de los ensayos y las calibraciones llevadas a cabo dicho seguimiento debe ser planificado y revisado y puede incluir entre otros la participacioacuten en comparaciones iacutenter laboratorios o programas de ensayo de aptitud La estructura de la Red de microscopiacutea fue definida en el capiacutetulo II del Decreto 2323 de 2006 (Estructura y funciones de la Red Nacional de Laboratorios) por el cual se reglamenta parcialmente la Ley 9ordf de 1979 en relacioacuten con la Red Nacional de Laboratorios y se dictan otras disposiciones Teniendo en cuenta lo establecido en este decreto se definen los siguientes aspectos

51 Integrantes de la Red Nacional de Microscopiacutea Para la vigilancia de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp

El Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social

El Instituto Nacional de Salud INS

Los laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital de Bogotaacute

Los laboratorios cliacutenicos y otros laboratorios de la red puacuteblica y privada que realicen anaacutelisis de intereacutes para la vigilancia en salud puacuteblica (puestos de microscopiacutea)

52 Funciones

521 Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social Dirigir la Red Nacional de Laboratorios y definir las poliacuteticas programas planes y proyectos requeridos para su adecuado funcionamiento

522 Instituto Nacional de Salud Es laboratorio de referencia del nivel nacional y los laboratorios departamentales de salud puacuteblica y del distrito capital lo seraacuten en sus respectivas jurisdicciones El Grupo de Parasitologiacutea-RNL del INS ejerceraacute la coordinacioacuten de la Red Nacional de microscopiacutea de malaria y ademaacutes de las competencias propias asignadas por ley cumpliraacute las funciones de asesoriacutea y apoyo teacutecnico al Ministerio de la Proteccioacuten Social en todo lo relacionado con la red de microscopiacutea adquisicioacuten de equipos e insumos definir los estaacutendares de calidad para el diagnoacutestico de malaria supervisar el cumplimiento de dichos estaacutendares de calidad por parte de los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del distrito capital vigilar la calidad del diagnoacutestico de malaria de las laacuteminas remitidas por los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del Distrito Capital participar en programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo con instituciones nacionales e internacionales aplicar las normas de bioseguridad en los procedimientos de laboratorio realizar la validacioacuten de reactivos pruebas diagnoacutesticas y de teacutecnicas y procedimientos analiacuteticos para el diagnoacutestico de

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malaria procesamiento de muestras para deteccioacuten de mutaciones en el gen k13 de P falciparum apoyar y promover la realizacioacuten de investigaciones en salud y en biomedicina seguacuten las necesidades del paiacutes y directrices dadas por el Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social promover y realizar actividades de capacitacioacuten en malaria realizar transferencia tecnoloacutegica prestar asesoriacutea y asistencia teacutecnica a los laboratorios de salud puacuteblica en aspectos relacionados con sus competencias e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea de malaria

523 Direcciones Territoriales de Salud Las direcciones territoriales de salud asumiraacuten la direccioacuten y coordinacioacuten de la red de laboratorios en el aacutembito departamental o distrital para lo cual deberaacuten cumplir con las siguientes funciones organizar y controlar el funcionamiento de la Red en su jurisdiccioacuten adoptar las poliacuteticas nacionales de la Red de microscopiacutea establecer los objetivos metas y estrategias de la red a nivel departamental o distrital verificar el cumplimiento de los estaacutendares de calidad de los laboratorios y puestos de microscopiacutea brindar asistencia teacutecnica a los laboratorios de su aacuterea de influencia promover y realizar actividades de capacitacioacuten en temas de intereacutes para los integrantes de la red seguacuten las necesidades garantizar la infraestructura y el talento humano necesario para el manejo de la informacioacuten del Laboratorio de Salud Puacuteblica y en general de la Red de microscopiacutea en su jurisdiccioacuten

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) Los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del Distrito Capital como laboratorios de referencia en su jurisdiccioacuten seraacuten los actores intermedios de articulacioacuten en el aacuterea de su competencia entre el nivel nacional y municipal y tendraacuten las siguientes funciones adoptar e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea establecido por el nivel nacional en los temas de su competencia adoptar e implementar en su jurisdiccioacuten el sistema de monitoreo y evaluacioacuten (certificacioacuten) de la Red de microscopiacutea acorde con los lineamientos del Ministerio de la Proteccioacuten Social implementar el sistema de gestioacuten de la calidad para garantizar la oportunidad confiabilidad y veracidad del diagnoacutestico de malaria participar en los programas nacionales de evaluacioacuten externa del desempentildeo y desarrollar programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo a nivel municipal vigilar la calidad del diagnoacutestico de malaria consolidar y enviar mensualmente al INS todas las muestras recolectadas en papel filtro que reciban de los diferentes laboratorios que se encuentren bajo su jurisdiccioacuten para anaacutelisis molecular (gen k13) con la respectiva documentacioacuten implementar los programas de bioseguridad y manejo de residuos de acuerdo con la normatividad nacional vigente cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos apoyar la investigacioacuten y control de brotes epidemias y emergencias brindar capacitacioacuten y asistencia teacutecnica a los municipios y a otras entidades participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal Los laboratorios puacuteblicos y privados de la jurisdiccioacuten municipal y redes de microscopistas tendraacuten las siguientes funciones desarrollar la gestioacuten para su integracioacuten funcional a la Red Nacional de microscopiacutea apoyar a la entidad territorial en la realizacioacuten de pruebas de laboratorio seguacuten su

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capacidad y aacuterea de especializacioacuten adoptar las directrices nacionales y territoriales que permitan su articulacioacuten al Sistema de Vigilancia en Salud Puacuteblica y su participacioacuten en el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea informar de manera obligatoria y oportuna a la Direccioacuten Local de Salud los datos y resultados de pruebas de laboratorio de intereacutes en salud puacuteblica a los interesados para la toma de decisiones participar en los programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos prestar los servicios de toma de muestra incluida la toma de muestra de sangre por puncioacuten digital (pulpejo del dedo) o venopuncioacuten en una hoja de papel filtro de los pacientes que presenten gota gruesa positiva al diacutea 3 post-tratamiento con Coartem y enviacuteo de estas tarjetas al LSP procesamiento anaacutelisis e informe de resultados de laboratorio de manera oportuna eficiente y confiable participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas Los servicios de toma de muestras y los puestos de microscopia deberaacuten adoptar y cumplir con los estaacutendares de calidad de acuerdo con la complejidad del servicio que prestan bajo la supervisioacuten y monitoreo de laboratorios departamentales (12)

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6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 1 Chaparro-Narvaez PE Loacutepez-Peacuterez M Rengifo LM Padilla J Herrera S Areacutevalo-Herrera M Clinical and epidemiological aspects of complicated malaria in Colombia 2007ndash2013 Malar J 201615 (1)269 Disponible en httpdxdoiorg101186s12936-016-1323-5 2 Alano P The emerging role of the human bone marrow as a privileged developmental niche for the transmission stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum Ann Ist Super Sanita 2017 5396-99 Disponible en httpdxdoi104415ANN_17_02_03 3 Organizacioacuten Mundial de la Salud Paludismo informacioacuten para viajeros Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2017 Disponible en httpwwwwhointmalariatravellerses 4 Instituto Nacional de Salud Fondo Mundial MCP Manual para el diagnoacutestico de malaria no complicada en puestos de diagnoacutestico y tratamiento 2015 ISBN 978-958-13-0175-1 5 Snounou G Viriyakosol S Zhu XP Jarra W Pinheiro L do Rosario VE Thaithong S Brown KN High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction Mol Biochem Parasitol 1993 61315-20 6 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en situaciones de baja transmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwusaidamiorgextrasrecomendadaporlaOMSpdf 7 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en zonas de baja trasmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozmalaria-diagnosis-low-transmission-settings-sep2014pdf 8 Organizacioacuten Mundial de la Salud Accioacuten e inversioacuten para alaria 2016-2030 Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2015 ISBN 978 92 4 150897 1 Disponible en httprollbackmalariaorgwp-contentuploads201709RBM_AIM_Report_A4_EN-Sept2015-ORGpdf 9 World Health Organization Recommended selection criteria for procurement of malaria rapid diagnostic tests WHO 2016 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozrdt-selection-criteriapdf 10 Organizacioacuten Panamericana de la Salud Memorias Taller de Capacitacioacuten y Certificacioacuten de microscopistas para paiacuteses de la regioacuten de las Ameacutericas Meacutexico DF Organizacioacuten Panamericana de la Salud 2016 11 Instituto Nacional de Salud Protocolo Programas Evaluacioacuten del Desempentildeo Bogotaacute Instituto Nacional de Salud 2016 Disponible en httpwwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx

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muestras y microscopia para el desarrollo de la gestioacuten de la calidad entre otros procesos Por otra parte las actividades de la red cumplen con los requisitos establecidos en la normatividad ISO 17025 del 2005 numeral 59 referente al aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo en la cual se menciona que el laboratorio debe tener procedimientos de control de calidad para realizar el seguimiento de la validez de los ensayos y las calibraciones llevadas a cabo dicho seguimiento debe ser planificado y revisado y puede incluir entre otros la participacioacuten en comparaciones iacutenter laboratorios o programas de ensayo de aptitud La estructura de la Red de microscopiacutea fue definida en el capiacutetulo II del Decreto 2323 de 2006 (Estructura y funciones de la Red Nacional de Laboratorios) por el cual se reglamenta parcialmente la Ley 9ordf de 1979 en relacioacuten con la Red Nacional de Laboratorios y se dictan otras disposiciones Teniendo en cuenta lo establecido en este decreto se definen los siguientes aspectos

51 Integrantes de la Red Nacional de Microscopiacutea Para la vigilancia de paraacutesitos del geacutenero Plasmodium spp

El Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social

El Instituto Nacional de Salud INS

Los laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital de Bogotaacute

Los laboratorios cliacutenicos y otros laboratorios de la red puacuteblica y privada que realicen anaacutelisis de intereacutes para la vigilancia en salud puacuteblica (puestos de microscopiacutea)

52 Funciones

521 Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social Dirigir la Red Nacional de Laboratorios y definir las poliacuteticas programas planes y proyectos requeridos para su adecuado funcionamiento

522 Instituto Nacional de Salud Es laboratorio de referencia del nivel nacional y los laboratorios departamentales de salud puacuteblica y del distrito capital lo seraacuten en sus respectivas jurisdicciones El Grupo de Parasitologiacutea-RNL del INS ejerceraacute la coordinacioacuten de la Red Nacional de microscopiacutea de malaria y ademaacutes de las competencias propias asignadas por ley cumpliraacute las funciones de asesoriacutea y apoyo teacutecnico al Ministerio de la Proteccioacuten Social en todo lo relacionado con la red de microscopiacutea adquisicioacuten de equipos e insumos definir los estaacutendares de calidad para el diagnoacutestico de malaria supervisar el cumplimiento de dichos estaacutendares de calidad por parte de los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del distrito capital vigilar la calidad del diagnoacutestico de malaria de las laacuteminas remitidas por los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del Distrito Capital participar en programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo con instituciones nacionales e internacionales aplicar las normas de bioseguridad en los procedimientos de laboratorio realizar la validacioacuten de reactivos pruebas diagnoacutesticas y de teacutecnicas y procedimientos analiacuteticos para el diagnoacutestico de

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malaria procesamiento de muestras para deteccioacuten de mutaciones en el gen k13 de P falciparum apoyar y promover la realizacioacuten de investigaciones en salud y en biomedicina seguacuten las necesidades del paiacutes y directrices dadas por el Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social promover y realizar actividades de capacitacioacuten en malaria realizar transferencia tecnoloacutegica prestar asesoriacutea y asistencia teacutecnica a los laboratorios de salud puacuteblica en aspectos relacionados con sus competencias e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea de malaria

523 Direcciones Territoriales de Salud Las direcciones territoriales de salud asumiraacuten la direccioacuten y coordinacioacuten de la red de laboratorios en el aacutembito departamental o distrital para lo cual deberaacuten cumplir con las siguientes funciones organizar y controlar el funcionamiento de la Red en su jurisdiccioacuten adoptar las poliacuteticas nacionales de la Red de microscopiacutea establecer los objetivos metas y estrategias de la red a nivel departamental o distrital verificar el cumplimiento de los estaacutendares de calidad de los laboratorios y puestos de microscopiacutea brindar asistencia teacutecnica a los laboratorios de su aacuterea de influencia promover y realizar actividades de capacitacioacuten en temas de intereacutes para los integrantes de la red seguacuten las necesidades garantizar la infraestructura y el talento humano necesario para el manejo de la informacioacuten del Laboratorio de Salud Puacuteblica y en general de la Red de microscopiacutea en su jurisdiccioacuten

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) Los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del Distrito Capital como laboratorios de referencia en su jurisdiccioacuten seraacuten los actores intermedios de articulacioacuten en el aacuterea de su competencia entre el nivel nacional y municipal y tendraacuten las siguientes funciones adoptar e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea establecido por el nivel nacional en los temas de su competencia adoptar e implementar en su jurisdiccioacuten el sistema de monitoreo y evaluacioacuten (certificacioacuten) de la Red de microscopiacutea acorde con los lineamientos del Ministerio de la Proteccioacuten Social implementar el sistema de gestioacuten de la calidad para garantizar la oportunidad confiabilidad y veracidad del diagnoacutestico de malaria participar en los programas nacionales de evaluacioacuten externa del desempentildeo y desarrollar programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo a nivel municipal vigilar la calidad del diagnoacutestico de malaria consolidar y enviar mensualmente al INS todas las muestras recolectadas en papel filtro que reciban de los diferentes laboratorios que se encuentren bajo su jurisdiccioacuten para anaacutelisis molecular (gen k13) con la respectiva documentacioacuten implementar los programas de bioseguridad y manejo de residuos de acuerdo con la normatividad nacional vigente cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos apoyar la investigacioacuten y control de brotes epidemias y emergencias brindar capacitacioacuten y asistencia teacutecnica a los municipios y a otras entidades participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal Los laboratorios puacuteblicos y privados de la jurisdiccioacuten municipal y redes de microscopistas tendraacuten las siguientes funciones desarrollar la gestioacuten para su integracioacuten funcional a la Red Nacional de microscopiacutea apoyar a la entidad territorial en la realizacioacuten de pruebas de laboratorio seguacuten su

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capacidad y aacuterea de especializacioacuten adoptar las directrices nacionales y territoriales que permitan su articulacioacuten al Sistema de Vigilancia en Salud Puacuteblica y su participacioacuten en el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea informar de manera obligatoria y oportuna a la Direccioacuten Local de Salud los datos y resultados de pruebas de laboratorio de intereacutes en salud puacuteblica a los interesados para la toma de decisiones participar en los programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos prestar los servicios de toma de muestra incluida la toma de muestra de sangre por puncioacuten digital (pulpejo del dedo) o venopuncioacuten en una hoja de papel filtro de los pacientes que presenten gota gruesa positiva al diacutea 3 post-tratamiento con Coartem y enviacuteo de estas tarjetas al LSP procesamiento anaacutelisis e informe de resultados de laboratorio de manera oportuna eficiente y confiable participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas Los servicios de toma de muestras y los puestos de microscopia deberaacuten adoptar y cumplir con los estaacutendares de calidad de acuerdo con la complejidad del servicio que prestan bajo la supervisioacuten y monitoreo de laboratorios departamentales (12)

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6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 1 Chaparro-Narvaez PE Loacutepez-Peacuterez M Rengifo LM Padilla J Herrera S Areacutevalo-Herrera M Clinical and epidemiological aspects of complicated malaria in Colombia 2007ndash2013 Malar J 201615 (1)269 Disponible en httpdxdoiorg101186s12936-016-1323-5 2 Alano P The emerging role of the human bone marrow as a privileged developmental niche for the transmission stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum Ann Ist Super Sanita 2017 5396-99 Disponible en httpdxdoi104415ANN_17_02_03 3 Organizacioacuten Mundial de la Salud Paludismo informacioacuten para viajeros Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2017 Disponible en httpwwwwhointmalariatravellerses 4 Instituto Nacional de Salud Fondo Mundial MCP Manual para el diagnoacutestico de malaria no complicada en puestos de diagnoacutestico y tratamiento 2015 ISBN 978-958-13-0175-1 5 Snounou G Viriyakosol S Zhu XP Jarra W Pinheiro L do Rosario VE Thaithong S Brown KN High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction Mol Biochem Parasitol 1993 61315-20 6 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en situaciones de baja transmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwusaidamiorgextrasrecomendadaporlaOMSpdf 7 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en zonas de baja trasmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozmalaria-diagnosis-low-transmission-settings-sep2014pdf 8 Organizacioacuten Mundial de la Salud Accioacuten e inversioacuten para alaria 2016-2030 Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2015 ISBN 978 92 4 150897 1 Disponible en httprollbackmalariaorgwp-contentuploads201709RBM_AIM_Report_A4_EN-Sept2015-ORGpdf 9 World Health Organization Recommended selection criteria for procurement of malaria rapid diagnostic tests WHO 2016 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozrdt-selection-criteriapdf 10 Organizacioacuten Panamericana de la Salud Memorias Taller de Capacitacioacuten y Certificacioacuten de microscopistas para paiacuteses de la regioacuten de las Ameacutericas Meacutexico DF Organizacioacuten Panamericana de la Salud 2016 11 Instituto Nacional de Salud Protocolo Programas Evaluacioacuten del Desempentildeo Bogotaacute Instituto Nacional de Salud 2016 Disponible en httpwwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx

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malaria procesamiento de muestras para deteccioacuten de mutaciones en el gen k13 de P falciparum apoyar y promover la realizacioacuten de investigaciones en salud y en biomedicina seguacuten las necesidades del paiacutes y directrices dadas por el Ministerio de Salud y Proteccioacuten Social promover y realizar actividades de capacitacioacuten en malaria realizar transferencia tecnoloacutegica prestar asesoriacutea y asistencia teacutecnica a los laboratorios de salud puacuteblica en aspectos relacionados con sus competencias e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea de malaria

523 Direcciones Territoriales de Salud Las direcciones territoriales de salud asumiraacuten la direccioacuten y coordinacioacuten de la red de laboratorios en el aacutembito departamental o distrital para lo cual deberaacuten cumplir con las siguientes funciones organizar y controlar el funcionamiento de la Red en su jurisdiccioacuten adoptar las poliacuteticas nacionales de la Red de microscopiacutea establecer los objetivos metas y estrategias de la red a nivel departamental o distrital verificar el cumplimiento de los estaacutendares de calidad de los laboratorios y puestos de microscopiacutea brindar asistencia teacutecnica a los laboratorios de su aacuterea de influencia promover y realizar actividades de capacitacioacuten en temas de intereacutes para los integrantes de la red seguacuten las necesidades garantizar la infraestructura y el talento humano necesario para el manejo de la informacioacuten del Laboratorio de Salud Puacuteblica y en general de la Red de microscopiacutea en su jurisdiccioacuten

524 Laboratorios de Salud Puacuteblica Departamentales y del Distrito Capital (LSP) Los laboratorios de salud puacuteblica departamentales y del Distrito Capital como laboratorios de referencia en su jurisdiccioacuten seraacuten los actores intermedios de articulacioacuten en el aacuterea de su competencia entre el nivel nacional y municipal y tendraacuten las siguientes funciones adoptar e implementar el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea establecido por el nivel nacional en los temas de su competencia adoptar e implementar en su jurisdiccioacuten el sistema de monitoreo y evaluacioacuten (certificacioacuten) de la Red de microscopiacutea acorde con los lineamientos del Ministerio de la Proteccioacuten Social implementar el sistema de gestioacuten de la calidad para garantizar la oportunidad confiabilidad y veracidad del diagnoacutestico de malaria participar en los programas nacionales de evaluacioacuten externa del desempentildeo y desarrollar programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo a nivel municipal vigilar la calidad del diagnoacutestico de malaria consolidar y enviar mensualmente al INS todas las muestras recolectadas en papel filtro que reciban de los diferentes laboratorios que se encuentren bajo su jurisdiccioacuten para anaacutelisis molecular (gen k13) con la respectiva documentacioacuten implementar los programas de bioseguridad y manejo de residuos de acuerdo con la normatividad nacional vigente cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos apoyar la investigacioacuten y control de brotes epidemias y emergencias brindar capacitacioacuten y asistencia teacutecnica a los municipios y a otras entidades participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas

525 Red de microscopiacutea en el nivel municipal Los laboratorios puacuteblicos y privados de la jurisdiccioacuten municipal y redes de microscopistas tendraacuten las siguientes funciones desarrollar la gestioacuten para su integracioacuten funcional a la Red Nacional de microscopiacutea apoyar a la entidad territorial en la realizacioacuten de pruebas de laboratorio seguacuten su

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capacidad y aacuterea de especializacioacuten adoptar las directrices nacionales y territoriales que permitan su articulacioacuten al Sistema de Vigilancia en Salud Puacuteblica y su participacioacuten en el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea informar de manera obligatoria y oportuna a la Direccioacuten Local de Salud los datos y resultados de pruebas de laboratorio de intereacutes en salud puacuteblica a los interesados para la toma de decisiones participar en los programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos prestar los servicios de toma de muestra incluida la toma de muestra de sangre por puncioacuten digital (pulpejo del dedo) o venopuncioacuten en una hoja de papel filtro de los pacientes que presenten gota gruesa positiva al diacutea 3 post-tratamiento con Coartem y enviacuteo de estas tarjetas al LSP procesamiento anaacutelisis e informe de resultados de laboratorio de manera oportuna eficiente y confiable participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas Los servicios de toma de muestras y los puestos de microscopia deberaacuten adoptar y cumplir con los estaacutendares de calidad de acuerdo con la complejidad del servicio que prestan bajo la supervisioacuten y monitoreo de laboratorios departamentales (12)

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6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 1 Chaparro-Narvaez PE Loacutepez-Peacuterez M Rengifo LM Padilla J Herrera S Areacutevalo-Herrera M Clinical and epidemiological aspects of complicated malaria in Colombia 2007ndash2013 Malar J 201615 (1)269 Disponible en httpdxdoiorg101186s12936-016-1323-5 2 Alano P The emerging role of the human bone marrow as a privileged developmental niche for the transmission stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum Ann Ist Super Sanita 2017 5396-99 Disponible en httpdxdoi104415ANN_17_02_03 3 Organizacioacuten Mundial de la Salud Paludismo informacioacuten para viajeros Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2017 Disponible en httpwwwwhointmalariatravellerses 4 Instituto Nacional de Salud Fondo Mundial MCP Manual para el diagnoacutestico de malaria no complicada en puestos de diagnoacutestico y tratamiento 2015 ISBN 978-958-13-0175-1 5 Snounou G Viriyakosol S Zhu XP Jarra W Pinheiro L do Rosario VE Thaithong S Brown KN High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction Mol Biochem Parasitol 1993 61315-20 6 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en situaciones de baja transmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwusaidamiorgextrasrecomendadaporlaOMSpdf 7 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en zonas de baja trasmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozmalaria-diagnosis-low-transmission-settings-sep2014pdf 8 Organizacioacuten Mundial de la Salud Accioacuten e inversioacuten para alaria 2016-2030 Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2015 ISBN 978 92 4 150897 1 Disponible en httprollbackmalariaorgwp-contentuploads201709RBM_AIM_Report_A4_EN-Sept2015-ORGpdf 9 World Health Organization Recommended selection criteria for procurement of malaria rapid diagnostic tests WHO 2016 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozrdt-selection-criteriapdf 10 Organizacioacuten Panamericana de la Salud Memorias Taller de Capacitacioacuten y Certificacioacuten de microscopistas para paiacuteses de la regioacuten de las Ameacutericas Meacutexico DF Organizacioacuten Panamericana de la Salud 2016 11 Instituto Nacional de Salud Protocolo Programas Evaluacioacuten del Desempentildeo Bogotaacute Instituto Nacional de Salud 2016 Disponible en httpwwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx

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capacidad y aacuterea de especializacioacuten adoptar las directrices nacionales y territoriales que permitan su articulacioacuten al Sistema de Vigilancia en Salud Puacuteblica y su participacioacuten en el sistema de informacioacuten para la Red de microscopiacutea informar de manera obligatoria y oportuna a la Direccioacuten Local de Salud los datos y resultados de pruebas de laboratorio de intereacutes en salud puacuteblica a los interesados para la toma de decisiones participar en los programas de evaluacioacuten externa del desempentildeo cumplir con los estaacutendares de calidad y bioseguridad definidos prestar los servicios de toma de muestra incluida la toma de muestra de sangre por puncioacuten digital (pulpejo del dedo) o venopuncioacuten en una hoja de papel filtro de los pacientes que presenten gota gruesa positiva al diacutea 3 post-tratamiento con Coartem y enviacuteo de estas tarjetas al LSP procesamiento anaacutelisis e informe de resultados de laboratorio de manera oportuna eficiente y confiable participar en el sistema de referencia y contrarreferencia de muestras bioloacutegicas Los servicios de toma de muestras y los puestos de microscopia deberaacuten adoptar y cumplir con los estaacutendares de calidad de acuerdo con la complejidad del servicio que prestan bajo la supervisioacuten y monitoreo de laboratorios departamentales (12)

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6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 1 Chaparro-Narvaez PE Loacutepez-Peacuterez M Rengifo LM Padilla J Herrera S Areacutevalo-Herrera M Clinical and epidemiological aspects of complicated malaria in Colombia 2007ndash2013 Malar J 201615 (1)269 Disponible en httpdxdoiorg101186s12936-016-1323-5 2 Alano P The emerging role of the human bone marrow as a privileged developmental niche for the transmission stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum Ann Ist Super Sanita 2017 5396-99 Disponible en httpdxdoi104415ANN_17_02_03 3 Organizacioacuten Mundial de la Salud Paludismo informacioacuten para viajeros Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2017 Disponible en httpwwwwhointmalariatravellerses 4 Instituto Nacional de Salud Fondo Mundial MCP Manual para el diagnoacutestico de malaria no complicada en puestos de diagnoacutestico y tratamiento 2015 ISBN 978-958-13-0175-1 5 Snounou G Viriyakosol S Zhu XP Jarra W Pinheiro L do Rosario VE Thaithong S Brown KN High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction Mol Biochem Parasitol 1993 61315-20 6 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en situaciones de baja transmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwusaidamiorgextrasrecomendadaporlaOMSpdf 7 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en zonas de baja trasmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozmalaria-diagnosis-low-transmission-settings-sep2014pdf 8 Organizacioacuten Mundial de la Salud Accioacuten e inversioacuten para alaria 2016-2030 Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2015 ISBN 978 92 4 150897 1 Disponible en httprollbackmalariaorgwp-contentuploads201709RBM_AIM_Report_A4_EN-Sept2015-ORGpdf 9 World Health Organization Recommended selection criteria for procurement of malaria rapid diagnostic tests WHO 2016 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozrdt-selection-criteriapdf 10 Organizacioacuten Panamericana de la Salud Memorias Taller de Capacitacioacuten y Certificacioacuten de microscopistas para paiacuteses de la regioacuten de las Ameacutericas Meacutexico DF Organizacioacuten Panamericana de la Salud 2016 11 Instituto Nacional de Salud Protocolo Programas Evaluacioacuten del Desempentildeo Bogotaacute Instituto Nacional de Salud 2016 Disponible en httpwwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx

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6 REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 1 Chaparro-Narvaez PE Loacutepez-Peacuterez M Rengifo LM Padilla J Herrera S Areacutevalo-Herrera M Clinical and epidemiological aspects of complicated malaria in Colombia 2007ndash2013 Malar J 201615 (1)269 Disponible en httpdxdoiorg101186s12936-016-1323-5 2 Alano P The emerging role of the human bone marrow as a privileged developmental niche for the transmission stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum Ann Ist Super Sanita 2017 5396-99 Disponible en httpdxdoi104415ANN_17_02_03 3 Organizacioacuten Mundial de la Salud Paludismo informacioacuten para viajeros Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2017 Disponible en httpwwwwhointmalariatravellerses 4 Instituto Nacional de Salud Fondo Mundial MCP Manual para el diagnoacutestico de malaria no complicada en puestos de diagnoacutestico y tratamiento 2015 ISBN 978-958-13-0175-1 5 Snounou G Viriyakosol S Zhu XP Jarra W Pinheiro L do Rosario VE Thaithong S Brown KN High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction Mol Biochem Parasitol 1993 61315-20 6 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en situaciones de baja transmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwusaidamiorgextrasrecomendadaporlaOMSpdf 7 Organizacioacuten Mundial de la Salud Poliacutetica recomendada por la OMS para el diagnoacutestico de la malaria en zonas de baja trasmisioacuten Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2014 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozmalaria-diagnosis-low-transmission-settings-sep2014pdf 8 Organizacioacuten Mundial de la Salud Accioacuten e inversioacuten para alaria 2016-2030 Ginebra Organizacioacuten Mundial de la Salud 2015 ISBN 978 92 4 150897 1 Disponible en httprollbackmalariaorgwp-contentuploads201709RBM_AIM_Report_A4_EN-Sept2015-ORGpdf 9 World Health Organization Recommended selection criteria for procurement of malaria rapid diagnostic tests WHO 2016 Disponible en httpwwwwhointmalariapublicationsatozrdt-selection-criteriapdf 10 Organizacioacuten Panamericana de la Salud Memorias Taller de Capacitacioacuten y Certificacioacuten de microscopistas para paiacuteses de la regioacuten de las Ameacutericas Meacutexico DF Organizacioacuten Panamericana de la Salud 2016 11 Instituto Nacional de Salud Protocolo Programas Evaluacioacuten del Desempentildeo Bogotaacute Instituto Nacional de Salud 2016 Disponible en httpwwwinsgovcotramites-y-serviciosprogramas-de-calidadPaginasparasitologiaaspx

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12 Ministerio de la Proteccioacuten Social Decreto 2323 de 2006 Malaria Bogotaacute DC Ministerio de la proteccioacuten Social 2006 13 Instituto Nacional de Salud Programas de Evaluacioacuten Externa del Desempentildeo PEED Parasitologiacutea ndash Malaria Bogotaacute DC Instituto Nacional de Salud 2015 14 WHO Malaria microscopy quality assurance manual Manila Geneva World Health Organization 2009 Disponible en httpappswhointirisbitstream1066520426619789241549394_engpdf