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LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS

PRACTICA # 10

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PRACTICA # 10 MICROBIOLOGIA DEL AGUA

Recuento de Coliformes Totales Filtración a través de membrana 1. INTRODUCCIÓN Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC. Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo coliforme forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. Una elevada proporción de los coliformes que existen en los sistemas de distribución no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es difícil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario. Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella. Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. Pero el verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro. 2. OBJETIVOS

Conocer y aplicar la técnica de filtración de membrana para la identificación de microorganismos asociados a procesos de contaminación.

3. CONSULTAS PRELIMINARES

Consulte sobre el método denominada NMP (Numero más probable y haga una protocolo para levar a cabo este procedimiento.

¿Esta técnica se puede usar en alimentos? 4. MATERIALES Y REACTIVOS

4.1 Material que debe llevar cada estudiante

Muestra de agua de acuerdo a la guía anterior

4.2 Material suministrado por el laboratorio

Membranas filtrantes de 0,45 µm de tamaño de poro

Pipetas estériles de 10 y 1 mL.

Estufa de cultivo

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Soporte del filtro con embudo

Sistema de vacio

Asa de siembra

Pinzas estériles

4.3 Reactivos

Agar Endo

5. PROCEDIMIENTO El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de orientación:

Tipos de agua Coliformes totales

Potable de consumo público 100 ml

Envasadas 250 ml

Manantiales 15; 60; 100 ml

Lagos, depósitos 4; 15; 60; 100 ml

Acometidas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De playas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml

De ríos 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales cloradas 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml

Residuales sin tratar 0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml

Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente añadiéndolas al embudo de filtración. Para muestras entre 1 y 30 ml, se añaden primero al embudo 20-30 ml de solución tamponada estéril y, encima de ella, se vierte la muestra a filtrar. Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solución tamponada estéril. Preparación de diluciones Para realizar una dilución 1/10 (10

-1), se pipetea

asépticamente 1 ml de muestra en un tubo con 9 ml de solución tamponada estéril y se agita.

Muestra 1 ml

+ Diluyente 9 ml

= Dilución 1/10 (10

-1)

Para realizar una dilución 1/100 (10-2

), se pipetea 1 ml de la dilución 1/10 en otro tubo con 9 ml de solución tamponada estéril y se agita.

Dilución 1/10 (10

-1)

+ Diluyente 9 ml

= Dilución 1/100 (10

-2)

Así sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo del grado de contaminación esperado de la muestra.

5.1 Medio de cultivo selectivo para Coliformes Totales: Caldo Endo, MF Se utiliza el Caldo Endo para el recuento de coliformes totales. Este es un medio para el aislamiento selectivo de los coliformes totales pues lleva inhibidores para el resto de

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microorganismos. El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la fórmula del medio permite crecer a los coliformes lactosa positivo pero inhibe el crecimiento del resto de bacterias acompañantes. Las colonias lactosa positiva se colorean de rojo por la liberación de fucsina del sulfato de fucsina. Las colonias de E. coli y de los coliformes muestran generalmente un brillo metálico. Se utiliza este medio para la identificación y recuento de coliformes en agua, leche y otros líquidos mediante filtración sobre membrana y está incluido en las recomendaciones de la APHA "American Water Works Association and Water Pollution Control Federation: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 2004 ". 5.2 Técnica de filtración sobre membrana

Desenvolver el filtro de la envoltura con la que se ha esterilizado.

Separar el embudo de la base del filtro.

Colocar la membrana filtrante de 0,45 µm de tamaño de poro sobre el portafiltros de las base del mismo. El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta plana o guantes de goma para no lesionarlas.

Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y que esta quede bien centrada. La membrana filtrante queda ahora situado entre el embudo y la base-soporte del filtro.

Filtrar 100 mL de la muestra de agua a través del filtro. Poner en marcha el sistema de vacio.

Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vacio y separar el embudo de la base del filtro.

Retirar con pinzas estériles o flameadas la membrana filtrante.

Colocar la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el caldo Endo, de forma progresiva para evitar que queden burbujas entre la membrana y el medio y que quede asegurado el contacto entre la membrana y el medio.

Colocar la tapa de la placa de Petri, invertir la placa e incubar en estufa a 37ºC durante 24 horas

En este medio todos los coliformes crecen formando colonias de color rojo oscuro con el característico brillo metálico de Escherichia coli de color verde-azulado aunque en los géneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter no es tan intenso como en Escherichia y puede pasar desapercibido.

Los resultados se expresan en UFC/100 mL. 6. RESULTADOS Cuando se obtienen recuentos de más de 200 colonias sobre una misma membrana pueden dar resultados erróneos debido a la superpoblación, ya que lo que aparece como una colonia puede ser originado por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento. En estos casos debemos volver a muestrear el agua y analizar muestras más diluidas. Por otra parte, un número de colonias inferior a 10 ó 20 por membrana es poco fiable como base para establecer cuantitativamente la concentración bacteriana de la muestra. Por ejemplo, la obtención de 2 colonias a partir del análisis de 1 ml de un agua, no nos permite afirmar que esa agua contenía 200 colonias en 100 ml. En estos casos conviene repetir el análisis filtrando un volumen de muestra mayor.

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Cuando el recuento de colonias está entre 20-200, los resultados se expresan: Si hemos analizado una muestra sin diluir: Recuento de colonias = UFC / volumen de muestra filtrada. Si hemos analizado una muestra diluida: Recuento de colonias x Factor de dilución = UFC/ volumen de muestra filtrada. No olvide concluir y analizar los resultados. 7. BIBLIOGRAFIA

Standar Methods for the Examination of Water and Wastewater, 18th ed.

Pagina web http://virus.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/toma_muestra/toma_muestras.html#1 Revisada el 2 de noviembre de 2012.

Adaptado por: Revisado por:

Adriana Marcela Peña Quina Bióloga – Docente programa de Ecología

Arnol Arias Biólogo – Coordinador de laboratorio