Guía de Prácticas Inmunología Veterinaria UAP

7/21/2019 Gua de Prcticas Inmunologa Veterinaria UAP

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FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE MEDICINA

VETERINARIA

GUA DE PRCTICA

INMUNOLOGA VETERINARIA

AUTOR: MSc. MV. Hugo Castillo Doloriert

2015 1B


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INDICE

INTRODUCCIN 3

Prctica N1: Reconocimiento de rganos linfoides primarios y secundarios 4

Prctica N2: Aislamiento de clulas mononucleares de sangre perifrica 8

Prctica N3: Manipulacin y vas de inoculacin y sangra en conejos 11

Prctica N4: Preparacin de inculos inmunognicos en conejos 15

Prctica N5: Pruebas inmunolgicas de unin primaria 21

Prctica N6: Pruebas inmunolgicas de unin secundaria 26

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 31


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INTRODUCCIN

La presente gua tiene como finalidad organizar de manera secuencial las diferentes

actividades prcticas a realizar durante el desarrollo del curso de inmunologa veterinaria.

Las prcticas en base a muestras biolgicas (aislamiento de PBMC, pruebas de unin

primaria y secundaria), animales de laboratorio (reconocimiento de rganos linfoides,protocolo de inmunizacin), as como la exposicin de artculos cientficos de publicacin

reciente en revistas de impacto en el rea de la inmunologa veterinaria y comparada

complementarn la formacin del estudiante abarcando las temticas indicadas en el

silabo del curso.

Cada prctica est estructurada de la siguiente manera: Una introduccin general al

tema de la actividad, una lista de materiales a emplear, y los procedimientos a ejecutar

para el adecuado desarrollo de las diferentes tcnicas o mtodos. Al final de cada actividadse encuentra un formato de informe de prctica as como un cuestionario con dos a cuatro

preguntas que tienen como objetivo reforzar los conceptos ms importantes brindados

durante la sesin, as como evaluar el criterio y el aprendizaje del alumno.

Los informes de las prcticas sern entregados de manera grupal, por mesa de

trabajo, a la semana siguiente de haber concluido cada actividad para su respectiva

calificacin por los docentes responsables del curso.


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PRCTICA N 1: Reconocimiento de rganos linfoides primarios y secundarios

El sistema inmunitario comprende un conjunto de rganos y estructuras diversas en

cuanto a naturaleza, origen y funcin, localizados en lugares diferentes del organismo.

Funcionalmente, los rganos del sistema inmune se clasifican en primarios y secundarios.

Los primeros suministran el microambiente para la maduracin de los linfocitos, mientras

que los segundos se encargan de capturar el microorganismo o antgeno mediante clulas

presentadoras de antgeno, suministrando el entorno adecuado para que los linfocitos

interacten con l. Los distintos rganos linfoides estn interconectados por vasos

sanguneos y linfticos, de modo que se constituye un sistema entrelazado y biencomunicado. El papel fundamental de los rganos del sistema inmune es intervenir en los

procesos frente a agentes extraos, memorizarlos para reconocerlos ante una segunda

posible infeccin o invasin, y adems retener su integridad preservando sus propias

estructuras.

I. Animales y materiales

Animales: Cobayos y pollos menores de 4 semanas de edad.

Recipiente de vidrio con tapa

Instrumental de diseccin

Bandeja para necropsia

Contenedor material cortante

Cloroformo

Alcohol / desinfectante

Algodn

Microscopio

Estereoscopio

Estereoscopio


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II. Procedimiento

A) Procedimientos de extraccin de rganos linfoides en mamferos

1.

Sacrificar al animal por sobredosificacin de cloroformo en campana.

2.

Retirar al animal de la campana y colocarlo decbito dorsal.

3.

Disecar la piel y observar la presencia de ganglios linfticos superficiales

4.Realizar una incisin abdominal central y proceder a la apertura del peritoneo.

5.

Identificar el bazo y ganglios linfticos, relacionar la ubicacin anatmica con la

funcin.

6.Extraer los rganos linfoides y observarlos en el estereoscopio.

7.

Desprender el intestino, abrir el lumen intestinal e identificar y disecar las placas

de Peyer.

8.

Abrir la caja torcica e identificar el timo y los ganglios linfticos mediastnicos

9.

Extraer los rganos linfoides con ayuda de unas pinzas y observarlos en el

estereoscopio.

B) Procedimientos de extraccin de rganos linfoides en aves

1.Sacrificar al animal por sobredosificacin de cloroformo en campana

2.Con tijeras haga un corte longitudinal a travs de la piel del cuello hacia la entrada

del trax para observar el timo.

3.Realizar una incisin abdominal central y proceder a la apertura del peritoneo.

4.

Identificar el bazo y extraerlo para observarlo en el estereoscopio.

5.Diseccionar la porcin dorsal del recto para observar la bolsa de Fabricio, extraerla

y seccionarla para observar los lbulos

6.

Desprender el intestino, e identificar el divertculo de Meckel, las placas de Peyer y

las tonsilas cecales.

7.Localizar e diseccionar la glndula de Harder situada en la conjuntiva del prpado

inferior del ave.

8.

Extraer los rganos linfoides con ayuda de unas pinzas y observarlos en el

estereoscopio.


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Figura 1.1. Ubicacin anatmica de los rganos linfoides en aves

C) Observacin de glbulos blancos en frotis de sangre (opcional)

1) Durante las necropsias de los cobayos y las aves, tome una gota de sangre de

cada especie y colquela en uno de los extremos de una lmina porta-objetos

2)

Realice un frotis sanguneo con ayuda de otra lmina porta-objeto

3) Deje secar el frotis y cubra la lmina con el colorante Wright durante 2 minutos

y luego agregue el mismo volumen de solucin tampn y espere 5 minutos.Enjuague

4)

Observe los glbulos blancos o leucocitos al microscopio a 40X y 100X (con aceite

de inmersin)

D) Observacin y descripcin de cortes histolgicos de rganos linfoides

Observar al microscopio y describir las siguientes lminas histolgicas:

Timo

Bursa

Mdula sea

Ganglio linftico

Bazo

Placa de Peyer


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III. Formato de Informe

Ttulo de la prctica:

Seccin: Mesa: Fecha:

Integrantes:

tems a desarrollar:

Introduccin (Breve marco terico)

Metodologa

Resultados y discusin

Conclusiones

Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)

Cuestionario:

1. Cules son las principales funciones de los rganos linfoides primarios

y secundarios

2. Qu son y cul es la importancia del divertculo de Meckel y la

glndula de Harder?

3. Grafique y seale los principales rganos linfoides observados en

mamferos

4. Tienen las aves ndulos linfticos? Ample.


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PRCTICA N 2: Aislamiento y reconocimiento de clulas del sistema inmune

La primera etapa en el estudio de linfocitos u otras clulas mononucleares sanguneas es

su aislamiento para que sus propiedades puedan ser analizadas in vitro. Las clulas

mononucleares pueden ser fcilmente aisladas de sangre perifrica por centrifugacin en

un gradiente de densidad constituido por una mezcla de polmeros polisacridos (Ficoll).

Uno obtiene a la interfase una poblacin de clulas mononucleares separadas de glbulos

rojos y de las clulas polimorfonucleares (neutrfilos u eosinfilos principalmente). A la

poblacin celular obtenida se le conoce como clulas mononucleares de sangre perifrica,

comnmente abreviado como PBMC (peripheral blood mononuclear cells), y est incluye

a diferentes tipos celulares como los linfocitos T, linfocitos B, clulas natural killer,

monocitos y clulas dendrticas.

I. Materiales y equipos

Muestras de sangre

Tubos falcon x 15 50 ml

Micropipetas automticas

Puntas de 1000 ul

Histopaque

RPMI

Azul de tripn

Cmara de Neubauer

Centrfuga

Microspcopio

II. Procedimiento

1. Obtener muestras sanguneas con EDTA de animales o humanos

2. Transferir la muestra de sangre hacia un tubo de 15 ml y adicionar el mismo

volumen de RMPI.


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3. En otro tubo de 15 ml adicionar 1/3 de histopaque (5 ml)

4. Luego adicionar muy lentamente e inclinando el tubo, 2/3 de la sangre diluida en

el primer paso (10 ml), sobre el histopaque.

5.

Centrifugar a 1400 rpm (sin freno) durante 30 minutos

6. Recuperar el anillo de clulas blancas (Buffy coat) y transferirlos a otro tubo de 15

ml

7.

Aforar a 15 ml con RPMI

8.

Centrifugar a 900 rpm durante 10 minutos (primera vez)

9.

Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de RPMI

ANTES DE LA CENTRIFUGACIN DESPUS DE LA CENTRIFUGACIN

Figura 2.1.Orden de los estratos formados despus de la centrifugacin con histopaque

10.

Centrifugar a 900 rpm durante 10 minutos (segunda vez)

11.Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de RPMI.

12.

Realizar el conteo de clulas viables y muertas en una cmara de Neubauer. Diluir

2X en azul de tripn (0.4%).

Plasma

Buffy coat (PBMC)

Histopaque

Eritrocitos y

granulocitos

Histopaque

Sangre diluida

(v/v)


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III. Formato de informe



Integrantes:

tems a desarrollar:


Metodologa


Conclusiones


Cuestionario:

1. Cul es el fundamento de la tcnica de aislamiento de PBMC

realizada en clase?

2. Describa brevemente una tcnica alternativa para el aislamiento de

leucocitos

3. Referencie un artculo cientfico en el que se emplee alguna tcnica

de aislamiento de leucocitos, e indique la razn de su utilizacin.


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PRCTICA N 3: Manipulacin y vas de inoculacin y sangra en conejos

Sin los animales de laboratorio, el conocimiento de las ciencias biolgicas no estara al

nivel que se encuentra hoy en da. Los animales de experimentacin, como los ratones y

conejos, han proporcionado modelos para la realizacin de diferentes investigaciones en

diferentes reas de las ciencias de la vida.

La inoculacin de sustancias es una prctica generalizada en la prctica veterinaria. En el

rea de la inmunologa las vacunaciones representan la prctica ms extendida, pero

tambin existen pruebas diagnsticas como la de reaccin de tuberculina o los test

alrgicos que demandan cierto conocimiento de las diferentes vas de inoculacin.

Asimismo, la toma de muestras sanguneas es un procedimiento de rutina en la mayor

parte de los laboratorios de inmunologa y en la prctica veterinaria en general, ya que a

travs de este procedimiento se obtienen clulas, fluidos y molculas tanto para la

investigacin como para el diagnstico.

La presente prctica tiene como objetivo conocer las diferentes vas de inoculacin y

sangra en conejos en congruencia con una apropiada manipulacin. Al finalizar la prctica

el alumno ser capaz de, sujetar y manipular correctamente los animales de laboratorio,

reconocer las diferentes vas de inoculacin en conejos e identificar los mtodos de sangra

ms frecuentes en la prctica inmunolgica veterinaria.

I. Animales y materiales

Animales: Conejas blancas de 3 kg.

Jeringas descartables de 1 y 3 ml.

Agujas de diferentes calibres (21, 23 y 25 G)

Contenedor para material punzocortante.

Promazil

Lidocaina 2% en jalea


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Termmetro y estetoscopio

Balanza romana

Gasa y algodn

Suero fisiolgico

Alcohol

II. Procedimiento

A) Sujecin de los conejos

Para proceder con la evaluacin clnica del animal, es necesario realizar una correcta

sujecin. Con la mano derecha sujetar tranquilamente al conejo de la parte trasera del

cuello, firme pero con suavidad, luego colocar la mano izquierda debajo de las ancas

del conejo para soportar su peso. Tambin se puede sujetar la piel de los hombros con

la mano izquierda y con la derecha sujetar al conejo de la piel del lomo. Nunca levantar

al animal de las orejas, ni cargarlo slo de los hombros, esto es muy doloroso para el

animal.

Figura 3.1. Izquierda: Sujecin del conejo por la nuca y ancas. Derecha: Sujecin del

conejo por el lomo con ambas manos *

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* Extrado del libro Prcticas de inmunologa general y aplicada a veterinaria

B) Evaluacin clnica del animal

Conocida la correcta sujecin del conejo, se proceder a la evaluacin clnica del animal,

para lo cual se medirn las constantes fisiolgicas (temperatura, frecuencia cardiaca yfrecuencia respiratoria) y se examinar externamente al animal a fin de descartar algn

posible problema infeccioso y/o parasitario. Finalmente, con ayuda de una balanza se

registrar el peso del animal.

C) Sangra a partir de la oreja marginal

1. Tranquilizar al animal mediante el uso de acepromazina va intramuscular (0.5

1 mg/kg).

2. Esperar de 5 a 10 minutos para que el tranquilizante haga efecto

3. Aplicar clorhidrato de lidocana 2% en jalea sobre la oreja del conejo

4.

Esperar 5 minutos para que el anestsico tpico haga efecto

5. Opcionalmente rasurar la piel sobre la vena marginal de ambas orejas

6. Desinfectar la zona con alcohol

7.

Inducir la hemostasia de la vena e introducir suavemente una aguja 21G x 1.5hasta que la sangre empiece a fluir

8.

Realizar la colecta inmediatamente en un tubo con EDTA.

Figura 3.2. Obtencin

de muestra sangunea

a travs de la vena

marginal o arteria

auricular en el conejo
http://www.google.com.pe/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=1spYZmqKKP7N2M&tbnid=VCfXlLoQ4s7abM:&ved=0CAUQjRw&url=http://ehs.uc.edu/lams/data/Rabbits/9003/03_018.html&ei=14BJUsD7BYKa9QSzmIDYDg&bvm=bv.53217764,d.eWU&psig=AFQjCNFq4e8JHrZoXZZFRLR1LbytgzoTQQ&ust=1380635143563325


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Integrantes:

tems a desarrollar:


Metodologa Resultados y discusin

Conclusiones


Cuestionario:

1. Realice un esquema comparativo entre las vas de inoculacin IM, SC

e ID. Brinde 2 ejemplos de sustancias que son inoculadas por esas

vas.

2.

Qu cantidad de volumen sanguneo se puede obtener de un

conejo adulto, y con qu frecuencia?

3. Cul es la diferencia entre suero y plasma sanguneo?


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por los linfocitos T colaboradores. En una respuesta primaria, se estimulan a los linfocitos

vrgenes productores principalmente de Ig M, y ante una estimulacin ulterior se

estimularn a los linfocitos de memoria, lo cuales tras su diferenciacin en clulas

plasmticas producirn Ig G en mayor proporcin.

El periodo latente entre la inoculacin inicial del antgeno y la aparicin de anticuerpos

vara segn la va, la dosis, la naturaleza del antgeno y el tipo de adyuvante utilizado. En

la prctica, se pueden detectar anticuerpos entre los 3 y 14 das despus de la inoculacin,

registrndose entre el noveno y el dcimo da en promedio una tasa mxima de

produccin. Los sueros pueden ser enteros o purificados, y la concentracin de

inmunoglobulina especfica es valorada a travs de pruebas de reaccin primaria y

secundaria.

El objetivo de esta prctica es reforzar los conceptos de respuesta inmune primaria y

secundaria, adyuvantes, los cuales son la base de las vacunaciones, as como familiarizar

al estudiante con la sueroterapia.

I. Animales, materiales y equipos

Animales: Conejas blancas de 3 kg.

Cepas bacterianas

Formaldehido

Albmina srica bovina (ASB)

Adyuvante completo de Freund (ACF)

Adyuvante incompleto de Freund (AIF)

Jeringa de 20 ml

Jeringas de tuberculina

Agujas hipodrmicas 18G x 1.5

Placa Petri

Tubos eppendorf 2 ml

Alcohol y algodn

Suero fisiolgico

Vrtex

Balanza analtica


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II. Procedimientos

A) Preparacin de inmungenos

Albmina srica bovina (ASB).-

1.

Disolver la ASB a razn de 50 mg en 2 ml de solucin salina fisiolgica.

2.

Verter en una placa petri o en un tubo plstico, 2 ml del ASB disuelto y 2 ml de

adyuvante completo de Freund.

3. Con una jeringa de 20 ml y una aguja 18G x 1.5 proceder a cargar y descargar la

mezcla repetidas veces hasta obtener una solucin cremosa.

4.

Confirmar que la emulsin ha sido completada colocando una gota de la suspensin

sobre un recipiente con agua. Si la gota no se diluye y flota o permanece intacta, la

emulsin estar lista para usarse, caso contrario repetir el paso 3.

5.

Para preparar la emulsin con adyuvante incompleto de Freund repetir los mismos

pasos cambiando el adyuvante completo de Freund por el incompleto.

Componentes estructurales bacterianos.-

1. Como primer paso se puede elegir entre el procedimiento a o b.

a.

Centrifugar un cultivo bacteriano en caldo a 6000 rpm x 10 minutos.

b. Realizar una suspensin antignica en solucin salina fisiolgica o agua

ultrapura a partir de cultivo bacteriano en placa, hasta alcanzar una

concentracin equivalente a 3 segn la escala de Mc Farland.

Posteriormente centrifugar la suspensin a 6000 rpm x 10 minutos.

2. Para ambos casos, descartar el sobrenadante y realizar 2 lavados (centrifugar y

decantar) consecutivos del sedimento con PBS.

3.

Resuspender el sedimento en 2 ml de agua ultra pura

4.

Lisar las bacterias obtenidas en el sedimento sometindolas a choque trmico

mediante cambios bruscos de temperaturas de - 80C a 100C (5 minutos en cada

temperatura). Repetir esta operacin de 34 veces.

5. Verter en una placa petri o en tubo plstico los 2 ml del lisado bacteriano y

mezclarlo con 2 ml de adyuvante completo de Freund.

6. Repetir los pasos 3, 4 y 5 del procedimiento A.


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Exotoxinas bacterianas.-

1. Centrifugar un cultivo en caldo de una especie bacteriana productora de exotoxinas

a 6000 rpm x 10 minutos.

2.

Tomar 2 ml del sobrenadante, 0,2 ml de formol 40% y 2 ml de adyuvante completode freund y mezclarlas en una placa petri o en un tubo plstico

3. Repetir los pasos 3, 4 y 5 del protocolo Antgeno I (A).

B) Inoculacin de inmungenos

1.

Inocular a los conejos la suspensin inmunognica emulsionada con adyuvante

completo de Freund o adyuvante saponina Quil A, por va intramuscular (0.25 ml)

subcutnea e intradrmica (0.05 - 0.1 ml, en 8 sitios diferentes sobre el dorso).

2.

A los 14 das post inoculacin se aplicar, va intramuscular (0.25 ml) y subcutnea

(0.25 ml), la segunda dosis de inmunizacin de las mismas suspensiones

inmunognicas pero esta vez emulsionadas con adyuvante incompleto de Freund.

3. Opcionalmente, a los 7 das despus de la segunda dosis, se aplicar va

intramuscular la tercera y ltima dosis (0.25 ml) de inmunizacin de las mismas

suspensiones inmunognicas emulsionadas con adyuvante incompleto de Freund.

4. A los 7 das despus de la ltima inoculacin realizar una sangra del conejo por

puncin cardiaca con una jeringa con anticoagulante (EDTA) de 15 a 20 ml de

sangre. Como alternativa a la puncin cardiaca se puede obtener las muestras de

sangre a partir de la puncin de la vena marginal de la oreja. Ver las indicaciones

de mtodos de sangra en la prctica anterior.

5. Centrifugar la sangre obtenida a 5000 rpm por 10 minutos y posteriormente con

ayuda de una pipeta pasteur transferir el plasma obtenido a un tubo estril.

6.

A partir del plasma obtenido se proceder purificar las gammaglobulinas para

posteriormente verificar la presencia de anticuerpos especficos mediante las

prueba de precipitacin y/o inmunodifusin doble en gel de agar.

Nota:Llevar un control minucioso de las dosis y vas de inoculacin de inmungenos,

das e intervalos entre inoculaciones, as como la alimentacin y limpieza de los animales

durante la experimentacin.


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Figura 4.1. Sitios anatmicos y ngulos referenciales para las inyecciones intramuscular,

subcutneo, endovenoso e intradrmica.

Figura 4.2. Vas de administracin y volmenes recomendados (ml/kg) en diferentes

especies animales.

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* Extrado del libro Prcticas de inmunologa general y aplicada a veterinaria


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Integrantes:

Items a desarrollar:


Metodologa


Conclusiones


Cuestionario:

1.

Cules son los efectos que los adyuvantes producen en el sistema

inmunitario?

2. Liste 5 adyuvantes empleados en vacunas de uso veterinario

3.

Cules son las diferencias entre los anticuerpos policlonales ymonoclonales?


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PRCTICA N 5: Pruebas inmunolgicas de unin primaria

La inmunologa utiliza las tcnicas comunes a varios dominios de la biologa. Sin embargo,

las tcnicas ms especficas han sido desarrolladas a la iniciativa de inmunlogos y son

particularmente utilizados por estos ltimos. Estas tcnicas de inmunodiagnstico han

sido divididas clsicamente en pruebas de unin primaria, secundaria y terciaria. Las

pruebas de unin primaria miden o cuantifican la cantidad de inmunocomplejos (Ag-Ac) a

travs de radioistopos, fluorocromos o enzimas. En las pruebas de unin secundarias la

reaccin antgeno-anticuerpo va seguida de una segunda reaccin como la precipitacin o

la aglutinacin, perceptibles visualmente. Por ltimo, las pruebas de unin terciariaevalan la capacidad de los anticuerpos de neutralizar la actividad biolgica de antgenos

como los virales o toxinas bacterianas.

Dentro de las pruebas de unin primaria ms importantes tenemos al ELISA,

radioinmunoanlisis, western blot, inmunofluorescencia, inmunohistoqumica, citometra

de flujo, inmunofiltracin, inmunocromatografa, entre otras. En la presente prctica se

conocern las tcnicas de inmunofluorescencia directa, as como pruebas de diagnstico

rpido de uso en la clnica veterinaria para la deteccin de antgenos o anticuerpos

especficos contra patgenos de importancia en peros y gatos.

El test SNAP, de laboratorios IDEXX, es una de las prueba rpidas ms empleadas en

veterinaria y se basa en la tecnologa de ELISA, lo que permite realizar anlisis de calidad

de una manera fcil y rpida sin tener que recurrir al anlisis de un laboratorio. Esta prueba

se basa en la bsqueda de antgenos y/o anticuerpos en diferentes medios: heces, sangre,

suero. Este mtodo es bsicamente referencial, por lo que se debe complementar el

resultado con pruebas adicionales y/o con los hallazgos a la evaluacin clnica.

El diagnstico de laboratorio de rabia est orientado hacia el examen del tejido nervioso

de animales muertos bajos sospecha de infeccin rbica. Para esto se examinan

conjuntamente el cerebro, cerebelo y Asta de Ammon o hipocampo, en busca de

antgenos del virus de la rabia. Estos antgenos son detectados a partir de improntas

mediante el empleo de anticuerpos especficos marcados con fluorocromos como el

isoticionato de fluorescena (FITC). Esta tcnica se conoce como inmunofluorescencia

directa (IFD).

El objetivo de la prctica es familiarizar al alumno con los mtodos de inmunodiagnstico

primario utilizados en medicina de animales de compaa.


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I. Materiales y equipos

Canine SNAP 4Dx (IDEXX)

Botella de 8 ml de conjugado anti-HW/AP/LY/EC:HRPO

Soporte de reactivos

Pipetas cuentagotas

Tubos de ensayos

Dispositivos SNAP

Suero canino positivo para Ehrlichia, Anaplasma o Borrelia

Micropipetas automticas y puntas para 10, 200 y 1000 ul

Impronta de cerebro positivo para rabia

Microscopio de inmunofluorescencia

II. Procedimiento

A) Kit para la deteccin de antgeno de Dirofilaria immitis, anticuerpos frente a

Anaplasma phagocytophilum

Borrelia burgdorferi- Ehrlichia canis (SNAP 4Dx Canino)

1)

Equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos

2)

Con la pipeta del kit verter 3 gotas de muestra en un tubo de ensayo nuevo

3) Agregar 4 gotas de conjugado al tubo de ensayo sosteniendo la botella en posicin

vertical

4) Tapar el tubo de ensayo y mezclarlo a fondo invirtindolo entre 3 y 5 veces

5) Colocar el dispositivo sobre una superficie horizontal. Agregar todo el contenido

del tubo de ensayo en el pocillo de muestras (Ver figura abajo). La muestra fluir a

travs de la ventana de resultados, alcanzando el crculo de activacin en unos 30

60 segundos.

6) En cuanto la muestra aparezca en el crculo de activacin, presione con fuerza el

activador hasta que quede alineado con el cuerpo del dispositivo.

7) Leer los resultados del anlisis cuando hayan pasado 8 minutos. Ver el cuadro a

continuacin para la interpretacin de los datos.


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Cuadro de referencia para la utilizacin y anlisis del tests:

Agentes transmitidos por vectoresAg/Ac y Sensibilidad +

Especificidad

Cundo llevar a cabo el

test

Imgenes del

test positivo

Detecta Anticuerpo contra:

- Anaplasma phagocytophilum

- Anaplasma platys

Sensibilidad: 99.1%

Especificidad: 100%

3 6 semanas desde la

exposicin. Si el perro es

sintomtico y el test es

negativo, confirmar

resultado con PCR (en fase

aguda todava no hay

anticuerpos)

Detecta Antgeno de:

- Dirofilaria immitis

Sensibilidad: 99.2%

Especificidad: 100%

5 7 meses tras la

exposicin


- Borrelia burgdorferi

Sensibilidad: 98.8%

Especificidad: 100%

3-6 semanas tras la

exposicin


- Ehrlichia canis

Sensibilidad: 96.2%

Especificidad: 100%

1-3 semanas tras la

exposicin

Fuente IDEXX


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B) Diagnstico de rabia por la tcnica de inmunofluorescencia directa (IFD)

1) El primer paso cuando se realiza la IFD es la preparacin de lminas de impronta de

cerebro. Para realizar un examen completo deben evaluarse tres reas del cerebro:

Corteza cerebral, cerebelo e hipocampo o Asta de Ammon

2) Los cortes de tejido de cada una de las reas mencionadas se colocan sobre un

bajalengua o en papel filtro

3)

Se efectan improntas sobre lminas portaobjetos de cada una de las reas

mencionadas. El exceso de tejido puede quitarse utilizando papel filtro.

4) Las lminas se secan al medio ambiente. Esto normalmente toma 30 minutos.

5) Despus de secar, las lminas son sumergidas en bastidores con acetona para fijar

la impronta durante 1-4 horas. La fijacin facilita la adherencia y la reaccin del

antgeno con el conjugado que posteriormente ser utilizado.

6) Aplicacin del conjugado especfico sobre las lminas fijadas. Luego son incubadas

en una cmara hmeda a 37C por 30 minutos para facilitar la reaccin inmune.

7)

Lavado de las lminas con PBS para quitar el conjugado que no ha reaccionado.

Luego se enjuaga con agua destilada para eliminar los residuos de sal de PBS.

Proceder al montaje de las improntas usando lminas cubreobjetos y glicerina

fosfatada.

8)

Las lminas se observan en con un microscopio de inmunofluorescencia en un

cuarto oscuro.

9) Si la muestra es positiva, el antgeno de la rabia aparecer coloreado de verde

luminoso bajo el microscopio fluorescente.

Figura 5.1.Esquema de utilizacin del

dispositivo SNAP 4Dx. Inserto IDEXX


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III. Informe de la prctica



Integrantes:

tems a desarrollar:


Metodologa


Conclusiones


Cuestionario:

1. Cul es el fundamento de las pruebas de diagnstico rpido tipo SNAP?

2. En las pruebas serolgicas, qu es un anticuerpo secundario?

3.

Grafique las diferentes etapas de la tcnica de IFD desarrollada en la

sesin

4.

En la prueba de inmunofluorescencia, qu es un fluorocromo y para

que sirve?


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PRCTICA N 6: Pruebas inmunolgicas de unin secundaria

La reaccin antgeno anticuerpo constituye el fenmeno central del diagnstico

inmunolgico. En esta reaccin se distinguen dos fases, la primera consiste en la unin del

antgeno con el anticuerpo (la cual es reversible) y la segunda en las manifestaciones que

resultan de dicha unin (la cual es irreversible). Para estudiar la segunda fase de la reaccin

antgeno - anticuerpo se dispone de pruebas llamadas de reaccin secundaria.

Si el antgeno es soluble, el complejo antgeno-anticuerpo puede precipitar, pero si el

antgeno es particulado, el antgeno se aglutinar en forma de agregados al unirse al

anticuerpo; en otros casos, el complemento en presencia de complejo anticuerpo-

eritrocito provocar la hemlisis con la consiguiente liberacin de hemoglobina.

Dentro de las tcnicas de reaccin secundaria tenemos a la prueba de precipitacin,

inmunodifusin radial, inmunoelectroforesis, pruebas de aglutinacin, entre otras. En la

presente prctica desarrollaremos las pruebas de Rosa de Bengala, adems se realizar la

evaluacin de los sueros hiperinmunes obtenidos en prcticas anteriores mediante las

tcnicas de precipitacin capilar e inmunodifusin en gel de agar.

En breve, la prueba de Rosa de Bengala es una tcnica rpida para la deteccin de

anticuerpos anti-Brucella en suero bovino. La suspensin bacteriana es reactiva tanto con

anticuerpos IgG como IgM. La determinacin se efecta ensayando la suspensin

tamponada de Brucella coloreada con Rosa de Bengala (pH 3.6) frente a los sueros

problemas. La presencia o ausencia de aglutinacin visible es indicativa de la presencia o

ausencia de anticuerpos en las muestras ensayadas.

Por otro lado, la prueba de precipitacin capilar es una tcnica simple utilizada como un

test de precipitacin cualitativo en el diagnstico de enfermedades infecciosas, y la tcnica

de inmunodifusin doble es un mtodo que permite al antgeno y al anticuerpo difundirseuno hacia otro a travs de un soporte agar, formando de esta manera una lnea de

precipitacin en la zona de equivalencia. Estas pruebas sern empleadas para la

evaluacin de la seroconversin de anticuerpos en los conejos inmunizados en la prctica

N 4.

El objetivo de la presente prctica es familiarizar al estudiante con las diversas tcnicas de

reaccin secundarias, las cuales en su mayora son rpidas y de fcil implementacin, en

el diagnstico de enfermedades y valoracin de anticuerpos, as como reforzar los

conceptos de interaccin antgeno anticuerpo.


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I. Materiales

Antgeno Brucella abortus+ Rosa de Bengala

Placa de vidrio para aglutinacin

Suero obtenido de bovinos positivos a Brucella abortus

Platos de inmunodifusin radial (IDR)

Sueros de referencia para kit IDR

Sueros de alpacas para la cuantificacin

Capilares

Lminas portaobjetos

Agar noble / Agarosa

Placas Petri

Pipetas automticas de 200 ul

Puntas de 200 ul

III. Procedimiento

A) Prueba de rosa de bengala (Brucella abortus)

1) Llevar las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 + 4C).

2) Colocar 25-30 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada

o de plstico, o en una placa para aglutinacin.

3)

Agitar suavemente la botella de antgeno, y colocar el mismo volumen de antgeno

prximo a la gota de suero.

4)

Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la placa, mezclar

cuidadosamente el suero y el antgeno hasta producir una zona circular u oval de

aproximadamente 2 cm de dimetro.

5)

La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un

agitador circular o manualmente.

6) Comprobar la aglutinacin tan pronto como se completa el perodo de 4 minutos.

Cualquier reaccin visible se considera positiva.

7)

Lectura:


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Reaccin negativa: Suspensin uniforme sin cambio visible alguno, tal como se

presenta en el control negativo.

Reaccin positiva: Aglutinacin dbil o intensa, fcilmente visible

macroscpicamente.

B) Tcnica de precipitacin capilar (A partir de los sueros de conejos inmunizados)

1) Equilibre a temperatura ambiente las muestras de suero y de suspensin antignica

2)

Llene por capilaridad hasta la mitad de un tubo capilar con la muestra de suero

3) Complete la otra mitad del tubo capilar, llenando por capilaridad con la suspensin

antignica

4)

Invierta varias veces el tubo capilar cuidadosamente, soportndolo en ambos

extremos con la yema de los dedos

5) Coloque el tubo capilar sobre un soporte de plastilina de tal manera que la

suspensin antignica quede sobre el suero conteniendo los anticuerpos

6) Repita los pasos 2 4 pero enfrentando al suero sanguneo y a la suspensin

antignica con el suero fisiolgico. Cada uno por separado

7) Incubar en la estufa durante una hora a 37C

8)

Observar la precipitacin que se har evidente por la aparicin de pequeos

precipitados blanquecinos en los tubos capilares donde se enfrentaron los

antgenos con los anticuerpos

Figura 6.1.Resultados positivos y

negativos a la prueba de Rosa de

Bengala en suero y plasma

sanguneo. Tomada de: Rev.

per. med. exp. salud pblica


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C) Inmunodifusin doble (A partir de los sueros de conejos inmunizados)

1. Disolver mediante calentamiento 1 gr de agar noble, en 100 ml de solucin tampn

fosfato pH 7.4, 0.15 M.

2.

Sobre una lmina portaobjeto aada 5 ml de agar noble. Dejar que se gelifique

3. Forme los pocillos sobre agar empleando un sacabocado

4. Llene el pocillo central con la muestra de suero conteniendo los anticuerpos

5. Llene los pocillos de alrededor con diferentes suspensiones antignicas

6. Incube a temperatura ambiente por 24 horas

7. Realice la lectura observando las bandas de precipitacin y determinando la

ausencia o presencia total o parcial de identidad de los antgenos evaluados.

Figura 6.2.Evaluacin de identidad inmunoqumica en la inmunodifusin doble o de Ouchterlony.


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III. Informe de la prctica



Integrantes:

tems a desarrollar:


Metodologa


Conclusiones


Cuestionario:

1. Cul es la diferencia entre una precipitacin y una aglutinacin?

2. Qu es el fenmeno de prozona?

3.

Cules son las principales ventajas y desventajas de la prueba Rosa de

Bengala en el diagnstico de brucelosis?


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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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Departamento de Asuntos Cientficos de la OEA. Mxico, 1973.

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6. Mouquet H. Les techniques en immunologie. Fiche technique N 1. Universit Sidi

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Documents

Guía de Prácticas Inmunología Veterinaria UAP